ES2626567T3 - Células sobre una matriz de soporte para reparación tisular - Google Patents

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ES2626567T3 ES03750654.0T ES03750654T ES2626567T3 ES 2626567 T3 ES2626567 T3 ES 2626567T3 ES 03750654 T ES03750654 T ES 03750654T ES 2626567 T3 ES2626567 T3 ES 2626567T3
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Abstract

Estructura de reparación tisular para su uso en el tratamiento de cualquier defecto tisular o para regenerar cualquier tejido in vivo, que comprende a) una membrana de colágeno libre de células y b) células madre adheridas a una superficie de dicha membrana, en la que la superficie es porosa de manera que las células madre pueden migrar al interior de la membrana y del tejido.

Description

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DESCRIPCION
Celulas sobre una matriz de soporte para reparacion tisular
Se producen algunos tipos de defectos tisulares en todas las personas en un aspecto u otro. Quemaduras, rasgunos, desgarros del musculo, cardlago o tendon, dano a los nervios, huesos rotos, y similares son habituales en personas con estilos de vida activos.
Usando la reparacion del cartflago como ejemplo tipico, se realizan cada ano mas de 500.000 procedimientos artroplasticos y reemplazos articulares totales en los Estados Unidos. Se realiza aproximadamente el mismo numero de procedimientos similares en Europa. Se incluyen en estos numeros aproximadamente 90.000 reemplazos totales de rodilla y cerca de 50.000 procedimientos para reparar defectos en la rodilla al ano (en: Praemer A., Fumer S., Rice, D. P., Musculoskeletal conditions in the United States, Park Ridge, Ill.: American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1992, 125).
Las patentes estadounidenses n.os 5.759.190; 5.989.269; 6.120.514; 6.283.980; 6.379.367; 6.569.172; 6.592.598; 6.592.599; y 6.599.300, describen diversas realizaciones de metodos y composiciones para el tratamiento de defectos del cartflago implantando un componente sembrado con condrocitos en el sitio de un defecto del cartflago. El documento WO 99/19005 describe un implante de membrana de colageno para su uso en la regeneracion tisular guiada.
Actualmente existe la necesidad de metodos eficientes y eficaces para reparar y/o regenerar tejidos defectuosos distintos de cartflago. Las ensenanzas de la presente invencion proporcionan medios eficaces y eficientes de promover la reparacion y regeneracion de tejidos defectuosos usando matrices de soporte sembradas con celulas.
La presente invencion se define segun las reivindicaciones adjuntas. Tambien se describen en el presente documento metodos para el tratamiento eficaz de defectos tisulares y para la regeneracion de tejidos usando celulas, preferiblemente celulas autologas, sembradas sobre una matriz de soporte. La presente invencion se refiere a estructuras de reparacion tisular que comprenden una membrana sembrada con celulas de uno o mas tipos espedficos para su uso en la reparacion y/o regeneracion de uno o mas tejidos espedficos.
Se describen en el presente documento metodos y productos para el tratamiento eficaz de cualquier tipo de defecto tisular incluyendo, pero sin limitarse a, musculo, tejido blando, hueso, tendon, nervio y tejido del cartflago, o para regeneracion tisular, mediante el trasplante de celulas (por ejemplo, autologas) sembradas sobre una matriz de soporte. Los metodos tambien pueden incluir el uso de celulas madre no autologas, un parche de recubrimiento y/o una barrera hemostatica.
El parche de recubrimiento y/o la barrera hemostatica pueden ser cualquier material de matriz o adhesivo descritos en el presente documento. Se proporcionan una descripcion detallada de trasplante autologo y varias matrices de soporte, parches de recubrimiento, y/o barreras hemostaticas en la patente estadounidense n.° 6.379.367, concedida el 30 de abril de 2002.
A. Celulas y tejidos de la presente invencion
La presente invencion contempla composiciones que incluyen celulas, preferiblemente celulas autologas, sembradas sobre una matriz de soporte para su uso en la reparacion y/o regeneracion tisular. Por “sembrar” se quiere decir que se ponen las celulas en contacto con una matriz de soporte, y se adhieren (con o sin un adhesivo) a la matriz de soporte durante un periodo de tiempo antes del trasplante. En una realizacion, las celulas se adhieren a y proliferan y se diferencian para dar un tipo celular deseado sobre la matriz de soporte antes del trasplante.
En una realizacion de la invencion, las celulas se retienen unicamente sobre una superficie o un borde de, o a una profundidad espedfica (tal como se describe en el presente documento) de la matriz de soporte, es decir, las celulas se adhieren a una superficie o son adyacentes a la matriz de soporte, tal como se describe en la publicacion estadounidense n.° 20020173806.
En la presente invencion, es preferible una siembra uniforme. Se cree que el numero de celulas sembradas no limita el tejido final producido, sin embargo, una siembra optima puede aumentar la tasa de generacion. Las cantidades de siembra optima dependeran de las condiciones de cultivo espedficas. La matriz se siembra con desde aproximadamente 0,05 hasta aproximadamente 5 veces la densidad celular fisiologica de un tipo de tejido nativo, es decir, en nervio o tendon. La densidad celular puede ser menor de aproximadamente 1x105 a 1x108 celulas, o mas, por ml, normalmente de aproximadamente 1x106 celulas por ml.
A modo de ejemplo y no como limitacion, las celulas adecuadas incluyen tenocitos, miocitos, celulas madre, osteocitos, condrocitos, celulas epiteliales, queratinocitos, celulas nerviosas (incluyendo, pero sin limitarse a, neurocitos, astrocitos, celulas dendnticas y celulas de la glfa), fibroblastos, odontocitos, sinoviocitos, adipocitos y cementocitos. Ademas, tambien son utiles en la presente invencion celulas precursoras de estos tipos de celulas. En
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una realizacion, por ejemplo, los mioblastos, que son precursores de miocitos; osteoblastos, que son precursores de osteocitos; y neuroblastos, que son precursores de neurocitos, son todos utiles en la presente invencion. En una realizacion, preferiblemente las celulas y los precursores celulares son celulas autologas y precursores celulares autologos.
Los tejidos que se beneficianan de los metodos y composiciones de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, tendones, musculos, cartflago, hueso y dientes, piel, tejido nervioso, tejido epitelial, y otros tejidos.
B. Metodos de la presente invencion
En un aspecto de la presente invencion, la presente invencion contempla el uso de celulas autologas para el tratamiento de muchos defectos tisulares diferentes y para la regeneracion del tejido.
A modo de ejemplo, y no como limitacion, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento de desgarros de tendones trasplantando tenocitos autologos sobre una matriz de soporte. Un ejemplo representativo de un desgarro del tendon es tendinitis del manguito rotador, provocado por un desgarro parcial del tendon. La presente invencion tambien incluye metodos para el cultivo de tenocitos, la siembra de tenocitos sobre una matriz de soporte e la implantacion de la matriz de soporte sembrada con tenocitos en o sobre el sitio de trasplante.
La presente divulgacion tambien contempla el uso de los metodos ensenados para el tratamiento de defectos de los huesos y para la regeneracion de los huesos. En una realizacion, se siembran osteoblastos autologos sobre una matriz de soporte y se implanta la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante. Tales ejemplos representativos de defectos de los huesos incluyen fracturas pseudoartrosicas, defecto segmentario del hueso o cirugfa reconstructiva usando tejido oseo. Tambien se describe un metodo para el cultivo de osteoblastos, la siembra de osteoblastos sobre una matriz de soporte e la implantacion de la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante.
La presente divulgacion tambien contempla el uso de los metodos ensenados en la invencion para el tratamiento de defectos de los musculos y para la regeneracion del musculo. Se siembran mioblastos autologos sobre una matriz de soporte y se implanta la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante. Los ejemplos representativos de un defecto del musculo incluyen degeneracion del musculo y desgarros del musculo. Tambien se describe un metodo para el cultivo de mioblastos, la siembra de mioblastos sobre una matriz de soporte e la implantacion de la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante.
La presente divulgacion tambien contempla el uso de los metodos ensenados en la invencion para el tratamiento de defectos del cartflago y para la regeneracion del cartflago. Se siembran condrocitos autologos sobre una matriz de soporte y se implanta la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante. Un ejemplo representativo de un defecto del cartflago incluye el deterioro o lesion del cartflago en una articulacion, tal como la rodilla, el hombro, el codo, la cadera o el tobillo. Tambien se describe un metodo para el cultivo de condrocitos, la siembra de condrocitos sobre una matriz de soporte e la implantacion de la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante.
La presente divulgacion tambien contempla el uso de los metodos ensenados en la invencion para el tratamiento de defectos de la piel y para la regeneracion de la piel. Se siembran queratinocitos autologos sobre una matriz de soporte y se implanta la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante. Algunos ejemplos representativos de defectos de la piel incluyen heridas de espesor parcial y total debido a quemaduras, no cicatrizacion cronica, estasis venosa y ulceras diabeticas. Tambien se describe un metodo para el cultivo de queratinocitos, la siembra de queratinocitos sobre una matriz de soporte e la implantacion de la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante.
La presente divulgacion tambien contempla el uso de los metodos ensenados en la invencion para el tratamiento de defectos y enfermedades de las vfas urinarias (por ejemplo, incontinencia), y para la regeneracion del tejido epitelial. Se siembran celulas epiteliales autologas sobre una matriz de soporte y se implanta la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante en las vfas urinarias. Tambien se describe un metodo para el cultivo de celulas epiteliales, la siembra de celulas epiteliales sobre una matriz de soporte e la implantacion de la matriz sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante.
La presente divulgacion tambien contempla el uso de los metodos ensenados en la invencion para el tratamiento de defectos de los nervios y para la regeneracion de los nervios. Se siembran celulas nerviosas autologas sobre una matriz de soporte y se implanta la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante. Un ejemplo representativo de un defecto de los nervios incluye lesion de la medula espinal o dano de los nervios provocado por golpes.
Tambien se describe un metodo para el cultivo de celulas nerviosas, la siembra de celulas nerviosas sobre una matriz de soporte e la implantacion de la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante.
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La presente divulgacion tambien contempla un metodo para aumentar la cantidad de tejido adiposo en un paciente. A modo de ejemplo, puede desearse un aumento de tejido adiposo durante cirugfa plastica o reconstructiva, tal como, aumento o reconstruccion de las mamas.
La presente divulgacion tambien contempla el uso de los metodos ensenados en la invencion para la produccion de adipocitos para su uso en cirugfa plastica o reconstructiva (por ejemplo, cirugfa de aumento o reconstruccion de las mamas). Se siembran adipocitos autologos sobre una matriz de soporte y se implanta la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante. Tambien se describe un metodo para el cultivo de adipocitos, la siembra de adipocitos sobre una matriz de soporte e la implantacion de la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante.
La presente divulgacion tambien contempla el uso de los metodos ensenados en la invencion para el tratamiento de cualquier defecto tisular o para la regeneracion de cualquier tejido. Las celulas madre autologas estan diferenciadas, parcialmente diferenciadas o no diferenciadas antes de la siembra en la matriz de soporte, y entonces se siembran sobre una matriz de soporte y se implanta la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante. Opcionalmente, pueden usarse factores que ayudan en la diferenciacion antes, durante o tras el trasplante de la matriz de soporte sembrada con celulas. Tambien se describe un metodo para el cultivo y la diferenciacion de las celulas madre, la siembra de las celulas madre o celulas diferenciadas sobre una matriz de soporte e la implantacion de la matriz de soporte sembrada con celulas en o sobre el sitio de trasplante.
C. Composiciones de la presente invencion
En una realizacion, se ponen las celulas en contacto con una o mas partes predeterminadas de una matriz de soporte, por ejemplo, con una superficie o parte de una superficie de una matriz de soporte, de manera que una parte sustancial de las celulas o sustancialmente todas las celulas migran al interior de una o mas de las superficies de la matriz de soporte hasta una profundidad maxima predeterminada de la matriz de soporte. Por ejemplo, en una realizacion, esa profundidad es hasta aproximadamente el 50 por ciento, preferiblemente hasta el 25 por ciento, mas preferiblemente hasta aproximadamente el 10 por ciento e incluso mas preferiblemente hasta aproximadamente el 35 por ciento de la profundidad de la matriz de soporte. Tal siembra controlada de las celulas en y/o cerca de una superficie de la matriz de soporte permite que las celulas migren libremente y pueblen un sitio de trasplante y conduce a proliferacion potenciada de las celulas y regeneracion de tejido en el sitio de trasplante. En una realizacion, tal siembra puede conseguirse con o sin vacfo vertiendo las celulas en o cerca de una superficie de la matriz de soporte, tal como se describe en la publicacion estadounidense n.° 20030134411, o mezclando o colocando celulas en una parte de la matriz de soporte. Las celulas pueden obtenerse de cualquier modo adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, celulas obtenidas a partir de una biopsia. Las celulas asf obtenidas pueden entonces aislarse, cultivarse y sembrarse sobre una matriz de soporte, formando una composicion de la presente invencion, tal como se describe a continuacion.
1. Obtencion de celulas para su uso con la presente invencion
Pueden aislarse celulas de tejido de distintas maneras, las cuales son todas conocidas para un experto en la tecnica. En una realizacion, pueden aislarse celulas de un material de biopsia mediante metodos convencionales. El material de biopsia puede extraerse de cualquier tejido del paciente relacionado con el tipo de tejido del defecto o regeneracion tisular. Por ejemplo, un paciente que requiere tratamiento o regeneracion de un tendon puede tener una biopsia tomada de cualquier tendon en el cuerpo. Tales tendones incluyen, pero no se limitan a, un tendon del flexor radial del carpo y el tendon calcaneo. De la biopsia de tendones, se afslan tenocitos y se cultivan mediante metodos convencionales.
Asimismo, un paciente que requiere tratamiento de tendinitis del manguito rotador puede tener una biopsia tomada de cualquier tendon. Tales tendones incluyen, pero no se limitan a, flexor radial del carpo y el tendon calcaneo. De la biopsia de tendones, se afslan osteoblastos y se cultivan mediante metodos convencionales.
Para el tratamiento de defectos de tejidos blandos, tales como un defecto de la piel (por ejemplo, una quemadura, corte o laceracion), puede tomarse una biopsia de piel de cualquier parte de la epidermis del paciente que contiene queratinocitos. De la biopsia de piel, se afslan queratinocitos y se cultivan mediante metodos convencionales.
Para otros defectos de tejidos blandos, tales como defectos en el revestimiento epitelial de la vejiga, puede tomarse una biopsia de las vfas urinarias, de la que pueden aislarse celulas epiteliales. Pueden aislarse celulas epiteliales de tejidos que incluyen, pero no se limitan a, fosa navicular de la uretra. De la biopsia uretral, se afslan celulas epiteliales y se cultivan mediante metodos convencionales.
Para el tratamiento de defectos de los huesos, puede tomarse una biopsia de cualquier hueso en el cuerpo. Tales huesos incluyen, pero no se limitan a, la cresta ilfaca. De la biopsia de hueso, se afslan osteoblastos y se cultivan mediante metodos convencionales.
Para el tratamiento de un defecto del cartflago, puede tomarse una biopsia de cartflago de cualquier tipo de cartflago
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en el cuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, cartflago articular y cardlago del menisco, dependiendo del tipo de cartflago del sitio del defecto o que va a regenerarse. En el caso de cardlago, el tipo de cartflago no es relevante para el metodo de tratamiento del defecto. Por tanto, pueden usarse celulas en una biopsia de cartflago articular para el tratamiento de un defecto del cartflago del menisco y viceversa. Puede obtenerse cartflago del menisco de, por ejemplo, la rodilla. El cartflago articular es un tipo mas especializado de cartflago hialino y puede hallarse en cualquier superficie de las articulaciones. Pueden usarse condrocitos obtenidos de cualquier superficie articular para el tratamiento de cualquier defecto del cartflago. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a, la articulacion de la rodilla.
Para el tratamiento de un defecto de los nervios, puede tomarse una biopsia de una celula nerviosa de cualquier nervio periferico o medula espinal. De la biopsia, se afslan celulas nerviosas y se cultivan mediante metodos convencionales.
Alternativamente, para el tratamiento de cualquier tipo de defecto tisular, puede tomarse una biopsia que contiene celulas madre de medula osea, sangre de cordon umbilical, piel o cartflago de un paciente. De la biopsia, se afslan y se cultivan celulas madre del paciente. Las celulas madre se diferencian para dar las celulas espedficas para su uso en el tratamiento del defecto tisular espedfico.
Tambien se afslan celulas madre de tejido fetal y cordon umbilical mediante metodos convencionales. Las celulas madre pueden ser autologas o no autologas puesto que determinadas celulas madre estan solamente disponibles en sangre de cordon umbilical, pero pueden diferenciarse para dar un tipo de celula requerida. Cualquier tipo de celula madre, incluyendo celulas madre hematopoyeticas, celulas madre mesenquimatosas, celulas madre no humanas totipotentes y celulas madre pluripotentes, puede usarse en la presente invencion, dependiendo del defecto particular que va a repararse o tejido que va a regenerarse.
2. Incubacion, aislamiento y cultivo de celulas
Una vez que se extrae la biopsia, se lava la biopsia y se incuba en un medio de crecimiento celular que contiene una enzima adecuada que disolvera el material de biopsia que rodea las celulas dentro del tejido sin danar las celulas, durante un periodo de tiempo recomendado. El medio de crecimiento celular es espedfico para el tipo de celula que se esta extrayendo de la biopsia. En una realizacion de la invencion, el medio de crecimiento celular incluye suero de ternero fetal al 20%, y opcionalmente un antibiotico, un antifungico, y factor(es) necesario(s) para la induccion de la diferenciacion de la linaje celular (a continuacion en el presente documento “medio de crecimiento celular”). Por ejemplo, un factor necesario para la diferenciacion de condrocitos en cultivo a partir de un cultivo de condrocitos primario aislado de una biopsia de cartflago es el acido ascorbico. Otro factor necesario para la diferenciacion de condrocitos a partir de celulas madre en cultivo es el factor de crecimiento transformante beta.
En una realizacion, la enzima incluida en el medio de crecimiento celular es preferiblemente una disolucion de tripsina/EDTA. Alternativamente, la enzima puede ser colagenasa.
En una realizacion, tras la incubacion, el material de biopsia se lava de nuevo, y se pesa. Con el fin de obtener un numero adecuado de celulas para empezar un cultivo celular, el material de biopsia pesa entre 80 y 300 miligramos. Preferiblemente, el material de biopsia pesa al menos entre 200 y 300 miligramos.
En una realizacion, entonces se digiere el material de biopsia, preferiblemente con una enzima digestiva que no danara las celulas, incubando el material de biopsia en una disolucion de la enzima digestiva y medio de cultivo celular durante aproximadamente de 5 a aproximadamente 30 horas, preferiblemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 horas a 37 grados centfgrados en una atmosfera del 5% de CO2. La enzima digestiva puede ser, por ejemplo, colagenasa en bruto, para la digestion de cualquier tipo de colageno. En una realizacion, el material de biopsia se desmenuza preferiblemente para ayudar en la digestion del material.
En una realizacion, tras la digestion, las celulas del material de biopsia se afslan centrifugando la disolucion de biopsia, y lavando el sedimento resultante con medio de crecimiento celular. Alternativamente, el material desmenuzado puede colarse en primer lugar a traves de una malla que tiene un tamano de poro adecuado para el tipo de celula particular para eliminar residuos mas grandes y aislar las celulas. Las celulas aisladas se cuentan entonces y se evaluan para determinar su viabilidad.
En una realizacion, tras el aislamiento, las celulas se cultivan en medio de crecimiento celular durante aproximadamente 3 dfas hasta aproximadamente cinco semanas, a 37 grados centfgrados en una atmosfera del 5% de CO2. El periodo de tiempo para el cultivo de celulas puede variar con el tipo de celula. El tiempo de cultivo puede variar con diferentes tipos de celulas puesto que diferentes tipos de celulas tienen tasas de proliferacion diferentes.
3. Matrices de soporte de la presente invencion
Una vez que las celulas se han cultivado hasta una densidad adecuada, entonces se siembran las celulas sobre una matriz de soporte.
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La matriz de soporte puede estar en cualquier forma adecuada para la adherencia de celulas con o sin un adhesivo. A modo de ejemplo y no como limitacion, la matriz de soporte puede estar en forma de una membrana, microperlas, felpa, hilos, o un gel, y/o mezclas de los mismos. El material de la matriz de soporte puede tener otros atributos ffsicos o mecanicos, tales como actuar como barrera hemostatica. Una barrera hemostatica inhibe la penetracion de celulas y tejido adjuntos en el area de defecto tratado.
La matriz de soporte es un material semipermeable que puede incluir colageno reticulado o no reticulado, preferiblemente de tipo I en combinacion con tipo III o tipo II. La matriz de soporte tambien puede incluir polipeptidos o protemas obtenidos de fuentes naturales o mediante smtesis, tales como acido hialuronico, submucosa de intestino delgado (SIS), peritoneo, pericardio, poli(acidos lacticos) y acidos relacionados, sangre (es decir, que es un tejido circulante que incluye una parte fluida (plasma) con elementos formados en suspension (globulos rojos, globulos blancos, plaquetas), u otro material que sea bioreabsorbible. Tambien son utiles en la presente invencion polfmeros bioabsorbibles, tales como elastina, fibrina, laminina y fibronectina. Tambien son utiles en la presente invencion materiales de matriz de soporte tal como se describe en la publicacion estadounidense n.° 20020173806.
Ademas, de manera preferible la matriz de soporte esta inicialmente (es decir, antes de ponerse en contacto con las celulas que van a trasplantarse) libre de celulas intactas y es reabsorbible dentro del paciente. La matriz de soporte puede tener una o varias superficies, tales como una superficie porosa, una superficie densa, o una combinacion de ambas. La matriz de soporte tambien puede incluir superficies semipermeables, impermeables o totalmente permeables. Se describen matrices de soporte que tienen una superficie porosa, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.569.172.
La matriz de soporte es autologa o alogena. En una realizacion, se forma una matriz de soporte autologa adecuada a partir de sangre, tal como se ejemplifica en la patente estadounidense n.° 6.368.298, concedida a Berretta, et al. el 9 de abril de 2002.
Una matriz de soporte adecuada sera un soporte solido, semisolido, gel o de tipo gel caracterizado por ser capaces de mantener una forma estable durante un periodo de tiempo para permitir la adherencia y/o el crecimiento de celulas en los mismos, tanto antes del trasplante como despues del trasplante, y para proporcionar un sistema similar al medio natural de las celulas para optimizar el crecimiento y diferenciacion celulares. Se dan a conocer ejemplos de matrices de soporte adecuadas en la publicacion estadounidense n.° 20020173806.
En una realizacion, la matriz de soporte y/o celulas, o bien individualmente o bien en combinacion, pueden combinarse con un adhesivo (por ejemplo, un pegamento biocompatible tal como pegamento de fibrina que puede ser autologo o alogeno) o medios de retencion ffsica o mecanica tal como una aguja reabsorbible para ayudar en la conservacion de las estructuras de reparacion segun la presente invencion en o sobre el sitio de trasplante. Los ejemplos adicionales de matrices de soporte incluyen los descritos en la solicitud de patente estadounidense n.° 10/427.463, presentada el 1 de mayo de 2003.
La matriz de soporte puede cortarse o formase para dar cualquier forma regular o irregular. En una realizacion preferida, la matriz de soporte puede cortarse para que corresponda con la forma del defecto. La matriz de soporte puede ser de forma plana, redonda y/o cilmdrica. La forma de la matriz de soporte tambien puede moldearse para ajustarse a la forma de un defecto tisular particular. Si la matriz de soporte es un material fibroso, o tiene las caractensticas de una fibra, la matriz de soporte puede tejarse para dar una forma deseada. Alternativamente, la matriz de soporte puede ser un material de gel, de tipo gel, o material no tejido.
En una realizacion, una matriz de soporte de la presente invencion puede sembrarse con multiples tipos de celulas y tener diferentes tipos de celulas sobre y/o en y/o a lo largo y/o adyacentes a diferentes partes de la matriz de soporte. A modo de ejemplo, una parte de la matriz de soporte puede incluir un primer tipo de celula (por ejemplo, celulas de tendon) y otra parte de la matriz puede incluir un segundo tipo de celula (por ejemplo, celulas musculares). Por ejemplo, para reparar un defecto de los huesos o del cartflago en la interseccion del hueso y el cartflago, una parte de la matriz de soporte puede incluir condrocitos y otra parte de la matriz puede incluir osteocitos.
A modo de ejemplo adicional, si la matriz tiene forma de disco, que tiene dos lados y un borde, un primer lado puede incluir un primer tipo de celula (por ejemplo, celulas de tendon) en el mismo y el segundo lado o borde puede incluir un segundo tipo de celula (por ejemplo, celulas musculares) en el mismo. Alternativamente, cada superficie de una matriz de soporte puede incluir el mismo tipo de celula en y/o sobre y/o a lo largo y/o adyacente a una superficie. Preferiblemente, se siembran las celulas de tal modo que se impide que las celulas migren de un lado a otro. Por tanto, en algunas realizaciones, los tipos de celulas no interactuaran entre sf
En otra realizacion, dos o mas matrices de soporte pueden estar en contacto entre sf En una realizacion de este tipo, una primera matriz de soporte puede estar en contacto con una segunda matriz de soporte antes, durante o despues de que cualquiera de las matrices de soporte se ponga en contacto con uno o mas tipos de celulas.
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D. Implantacion de la composicion de la presente invencion
Despues de que las celulas se siembren sobre la matriz de soporte, la matriz de soporte y las celulas se trasplantan en el defecto tisular, con las celulas enfrentandose a la superficie que va a tratarse. En una realizacion, se sujeta un parche de recubrimiento (por ejemplo, adhesivo o sutura biocompatibles) sobre el defecto tal como se describe en el presente documento, y se deja que cicatrice el defecto por sf mismo.
En una realizacion, un parche de recubrimiento sirve para recubrir el defecto para impedir adicionalmente la infiltracion de materiales no deseados, tales como fibroblastos o macrofagos, del medio circundante. En una realizacion, el parche de recubrimiento puede ser cualquier de las matrices de soporte descritas en el presente documento, y/o puede incluir colageno (tipo I/III), acido hialuronico, fibrina y poli(acido lactico). Preferiblemente, el parche de recubrimiento esta libre de celulas y es reabsorbible, y puede ser semipermeable.
En una realizacion, la matriz de soporte y las celulas pueden inyectarse al sitio de trasplante, con o sin un adhesivo o pegamento.
E. Otros materiales
Una matriz de soporte o matriz de soporte sembrada de la presente invencion tambien puede incluir diversos principios activos farmacologicos incluyendo, pero sin limitarse a, antimicrobianos, antivmcos, antibioticos, factores de crecimiento adecuados para el tipo de tejido que va a regenerarse y/o repararse, moduladores de la coagulacion sangumea tales como heparina y similares, adicionalmente pueden anadirse mezclas y capas compuestas de los mismos al material de matriz de soporte biocompatible y biodegradable, antes de impregnarlos en la matriz de soporte.
Una matriz de soporte o matriz de soporte sembrada de la presente invencion tambien puede incluir factores de crecimiento tales como factores de crecimiento autologos y no autologos adecuados para el tipo de tejido que va a regenerarse y/o repararse, incluyendo, pero sin limitarse a, factor de crecimiento transformante (tal como TGF-beta- 3), protema morfogenetica osea (tal como BMP-2), PTHxP, osteoprotegerina (OPG), Indian Hedgehog (“erizo indio”), RANKL, y factor de crecimiento similar a insulina (IgF1), tal como se describe en la publicacion estadounidense n.° 20030144197.
Tal como se indico anteriormente, la presente invencion tambien puede incluir un pegamento biocompatible en contacto con un sustrato y/o material biodegradable y/o celulas. Tales pegamentos o adhesivos biocompatibles pueden incluir un pegamento organico de fibrina (por ejemplo, Tisseel®, adhesivo a base de fibrina disponible de Baxter, Austria, o un pegamento de fibrina preparado en el quirofano usando muestras de sangre autologas). En una realizacion, pueden mezclarse celulas de la presente invencion con un pegamento apropiado antes, durante y/o despues del contacto con una matriz de soporte de la presente invencion. Alternativamente, puede colocarse un pegamento apropiado en un defecto o disponerse en capas encima de celulas o como una capa por debajo de celulas sobre una superficie o borde o impregnarse en una matriz de soporte de la presente invencion.
En una realizacion, la presente invencion incluye celulas y pegamento combinados entre sf en una mezcla de pegamento y celulas o una o mas capas alternantes de celulas y pegamento sobre una superficie o borde de una matriz de soporte. Se contempla que pueden trasplantarse celulas que son autologas al interior de un defecto. Se mezclan celulas, o bien de manera homogenea o bien de manera no homogenea, con un pegamento adecuado antes de la aplicacion de la mezcla de celulas/pegamento a una matriz de soporte. Preferiblemente, el pegamento y las celulas se mezclan inmediatamente (es decir, en el quirofano) antes de aplicar el pegamento y las celulas a la matriz de soporte y la implantacion de la combinacion de pegamento, celulas y matriz de soporte a un defecto. Alternativamente, se aplican celulas y un pegamento de manera alternante en una o mas capas a una matriz de soporte. En una realizacion, un pegamento para su uso en la presente invencion es un pegamento biocompatible, tal como un pegamento de fibrina, y mas espedficamente o bien un pegamento de fibrina autologa o bien un pegamento de fibrina no autologa. Preferiblemente, se usa un pegamento de fibrina autologa.
Los siguientes ejemplos describen metodos adecuados para poner en practica varias realizaciones de la presente invencion.
F. Ejemplos
Ejemplo 1: Metodo de tratamiento de tendinitis
Se toma una biopsia del tendon del flexor radial del carpo o tendon calcaneo, y se lava en DMEM, despues se retira el tejido adiposo. Se desmenuza el tejido y se digiere en tripsina al 0,25% en DMEM libre de suero durante 1 hora a 37 grados centfgrados, seguido por una digestion de 5 horas en colagenasa 1 miligramo por mililitro en medio esencial modificado por Dulbecco (DMEM) libre de suero a 37 grados centfgrados. Se lava el sedimento celular de 2 a 3 veces (se centrifuga a 200g durante aproximadamente 10 minutos), y vuelve a suspenderse en medio de crecimiento (DMEM que contiene suero de ternero fetal (FCS) al 10%, acido ascorbico 50 microgramos por mililitro,
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sulfato de gentamicina 70 micromol/litro, anfotericina 2,2 micromol/litro). Se cuentan los tenocitos para determinar la viabilidad y despues se siembran. Se mantiene el cultivo en una atmosfera humidificada del 5% de CO2, el 95% de aire en una incubadora de CO2 a 37 grados centigrados y se manipula en un laboratorio de clase 100. Se cambia el medio cada de 2 a 3 dfas. Pueden usarse otras composiciones de medio de cultivo para cultivar las celulas. Despues se someten las celulas a tripsinizacion usando tripsina-EDTA durante de 5 a 10 minutos y se cuentan usando tincion de viabilidad con azul tnpano en una camara Buurker-Turk. Se ajusta el recuento de celulas a 7,5x105 celulas por mililitro.
Se usa una membrana de colageno de tipo I/III de Geistlich Sohne (Suiza) o Matricel GmbH, (Kaiserstr., Alemania) como matriz de soporte. Se corta la matriz a un tamano adecuado para ajustarse en el fondo del pocillo en la bandeja de cultivo tisular de 6 pocillos NUNCLON™ Delta y se coloca en el pocillo en condiciones asepticas (NUNC (InterMed) Roskilde, Dinamarca). Se aplica una pequena cantidad del medio de cultivo celular que contiene suero a la matriz para absorberse en la matriz y para mantener la matriz humeda en el fondo del pocillo.
Se colocan aproximadamente 106 celulas en 1 mililitro de medio de cultivo directamente encima de la matriz, se dispersan sobre la superficie de la matriz. Despues se incuba la placa de cultivo tisular en una incubadora de CO2 a 37 grados centigrados durante 60 minutos. Se anaden cuidadosamente desde 2 hasta 5 mililitros de medio de cultivo tisular que contiene suero a del 5 al 7,5% al pocillo de cultivo tisular que contiene las celulas. Se ajusta el pH a aproximadamente de 7,4 a 7,5 si es necesario. Se incuba la placa durante de 3 a 7 dfas con un cambio de medio en el dfa 3.
Al final del periodo de incubacion se decanta el medio y se lava la matriz de soporte sembrada con celulas. Despues se implanta la matriz de soporte, con el lado con celulas hacia abajo, en el sitio de defecto, y opcionalmente se recubre con un parche de recubrimiento. Despues se deja que cicatrice el defecto por sf mismo.
Ejemplo 2: Metodo de tratamiento de defectos de los huesos
Se toma una biopsia de la cresta ilfaca, y se corta en pequenos fragmentos antes de colocarla en un matraz de cultivo tisular. Las celulas que migraron desde los fragmentos de hueso se dispersaron mediante digestion con colagenasa. Se afslan los osteoblastos y se cuentan para determinar la viabilidad. Se mantienen los osteoblastos en cultivo monocapa con alfa-MEM que contiene suero bovino fetal (FBS) al 10%, 2 milimolar de beta-glicerofosfato y 50 microgramos por mililitro de acido L-ascorbico. Se mantiene el cultivo en una atmosfera humidificada del 5% de CO2, el 95% de aire a 37 grados centfgrados en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados y se manipula en un laboratorio de clase 100. Se cambia el medio cada 2-3 dfas. Pueden usarse otras composiciones de medio de cultivo para cultivar las celulas. Se someten las celulas a tripsinizacion usando tripsina y EDTA durante de 5 a 10 minutos y se cuentan usando tincion de viabilidad con azul tnpano en una camara Buurker-Turk. Se ajusta el recuento de celulas a 7,5x105 celulas por mililitro.
Se usa una membrana de colageno de tipo I/III de Geistlich Sohne (Suiza) o Matricel GmbH, (Kaiserstr., Alemania) como matriz de soporte. Se corta la matriz a un tamano adecuado para ajustarse en el fondo del pocillo en la bandeja de cultivo tisular de 6 pocillos NUNCLON™ Delta y se coloca en el pocillo en condiciones asepticas (NUNC (InterMed) Roskilde, Dinamarca). Se aplica una pequena cantidad del medio de cultivo celular que contiene suero a la matriz para absorberse en la matriz y para mantener la matriz humeda en el fondo del pocillo.
Se colocan aproximadamente 106 celulas en 1 mililitro de medio de cultivo directamente encima de la matriz, se dispersan sobre la superficie de la matriz. Despues se incuba la placa de cultivo tisular en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados durante 60 minutos. Se anaden cuidadosamente desde 2 hasta 5 mililitros de medio de cultivo tisular que contiene suero a del 5 al 7,5% al pocillo de cultivo tisular que contiene las celulas. Se ajusta el pH a aproximadamente de 7,4 a 7,5 si es necesario. Se incuba la placa durante de 3 a 7 dfas con un cambio de medio en el dfa 3.
Al final del periodo de incubacion se decanta el medio y se lava la matriz de soporte sembrada con celulas. Despues se implanta la matriz de soporte, con el lado con celulas hacia abajo, en el sitio de defecto, y opcionalmente se recubre con un parche de recubrimiento. Despues se deja que cicatrice el defecto por sf mismo.
Ejemplo 3: Metodo de tratamiento de defectos musculares
Se toma una biopsia de musculo M. gastrocnemius. Se lava la biopsia en medio F12 de Ham suplementado con Hepes 10 milimolar/NaOH (pH 7,2), y se retiran los tendones y el tejido adiposo. Se corta el tejido en pequenos fragmentos, despues se incuba en el tampon de disociacion, que es el tampon anterior que contiene pronasa al 0,12% (p/v) y EDTA al 0,03% (p/v), durante 1 hora a 37 grados centfgrados en un bano de agua con agitacion. Tras la digestion, se filtra la suspension a traves de una malla de nailon de 100 micrometros al interior de un volumen igual del medio de cultivo que es F12 de Ham que contiene 2,2 gramos por litro de bicarbonato de sodio, suero de ternero fetal (FCS) al 20% y penicilina y estreptomicina. Se lava el sedimento celular centrifugando a 300g durante 10 minutos a 4 grados centfgrados y vuelve a suspenderse el sedimento en el medio de cultivo. Se afslan las celulas musculares y se cuentan para determinar la viabilidad. Se cultivan los mioblastos y se mantienen en una atmosfera
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humidificada del 5% de CO2, el 95% de aire en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados y se manipulan en un laboratorio de clase 100. Se cambia el medio 24 horas despues de la siembra y despues cada 4 d^as. Pueden usarse otras composiciones de medio de cultivo para cultivar las celulas. Se someten las celulas a tripsinizacion usando tripsina-EDTA durante de 5 a 10 minutos y se cuentan usando tincion de viabilidad con azul tnpano en una camara Buurker-Turk. Se ajusta el recuento de celulas a 7,5x105 celulas por mililitro.
Se usa una membrana de colageno de tipo I/III de Geistlich Sohne (Suiza) o Matricel GmbH, (Kaiserstr., Alemania) como matriz de soporte. Se corta la matriz a un tamano adecuado para ajustarse en el fondo del pocillo en la bandeja de cultivo tisular de 6 pocillos NUNCLON™ Delta y se coloca en el pocillo en condiciones asepticas (NUNC (InterMed) Roskilde, Dinamarca). Se aplica una pequena cantidad del medio de cultivo celular que contiene suero a la matriz para absorberse en la matriz y para mantener la matriz humeda en el fondo del pocillo.
Se colocan aproximadamente 106 celulas en 1 mililitro de medio de cultivo directamente encima de la matriz, se dispersan sobre la superficie de la matriz. Despues se incuba la placa de cultivo tisular en una incubadora de CO2 a 37 grados centigrados durante 60 minutos. Se anaden cuidadosamente desde 2 hasta 5 mililitros de medio de cultivo tisular que contiene suero a del 5 al 7,5% al pocillo de cultivo tisular que contiene las celulas. Se ajusta el pH a aproximadamente de 7,4 a 7,5 si es necesario. Se incuba la placa durante de 3 a 7 dfas con un cambio de medio en el dfa 3.
Al final del periodo de incubacion se decanta el medio y se lava la matriz de soporte sembrada con celulas. Despues se implanta la matriz de soporte, con el lado con celulas hacia abajo, en el sitio de defecto, y opcionalmente se recubre con un parche de recubrimiento. Despues se deja que cicatrice el defecto por sf mismo.
Ejemplo 4: Metodo de tratamiento de defectos de cartilago
Se toma una biopsia de la rodilla y se lava la biopsia una vez en medio de crecimiento celular. El medio de crecimiento contiene sulfato de gentomicina 70 micromol/litro, anfotericina 2,2 micromol/litro, acido ascorbico 0,3 millimol/litro y suero de ternero fetal al 20%. Se incuba la biopsia en medio de crecimiento celular que contiene tripsina-EDTA durante de 5 a 10 minutos a 37 grados centfgrados y al 5% de CO2. Se lava la biopsia dos o tres veces mas con medio de cultivo celular para eliminar cualquier tripsina-EDTA restante. Se pesa la biopsia y despues se digiere con colagenasa (aproximadamente 5000 unidades para una biopsia de 80-300 miligramos) durante aproximadamente de 3 a 12 horas a 37 grados centfgrados y al 5% de CO2. Alternativamente, se desmenuza la biopsia en este momento para ayudar a la digestion del material. Despues se centrifuga el material de biopsia a 700g durante aproximadamente 10 minutos, y se lava el sedimento con medio de crecimiento celular. Se afslan los condrocitos y se cuentan para determinar la viabilidad. Se cultivan los condrocitos.
Se hacen crecer condrocitos en medio de cultivo esencial mmimo que contiene F12 de HAM y tampon Hepes 15 milimolar y suero autologo a del 5 al 10% en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados y se manipulan en un laboratorio de clase 100. Pueden usarse otras composiciones de medio de cultivo para cultivar las celulas. Se someten las celulas a tripsinizacion usando tripsina-EDTA durante de 5 a 10 minutos y se cuentan usando tincion de viabilidad con azul tnpano en una camara Buurker-Turk. Se ajusta el recuento de celulas a 7,5x105 celulas por mililitro.
Se usa una membrana de colageno de tipo I/III de Geistlich Sohne (Suiza) o Matricel GmbH, (Alemania) como matriz de soporte. Se corta la matriz a un tamano adecuado para ajustarse en el fondo del pocillo en la bandeja de cultivo tisular de 6 pocillos NUNCLON™ Delta y se coloca en el pocillo en condiciones asepticas (NUNC (InterMed) Roskilde, Dinamarca). Se aplica una pequena cantidad del medio de cultivo celular que contiene suero a la matriz para absorberse en la matriz y para mantener la matriz humeda en el fondo del pocillo.
Se colocan aproximadamente 106 celulas en 1 mililitro de medio de cultivo directamente encima de la matriz, se dispersan sobre la superficie de la matriz. Despues se incuba la placa de cultivo tisular en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados durante 60 minutos. Se anaden cuidadosamente desde 2 hasta 5 mililitros de medio de cultivo tisular que contiene suero a del 5 al 7,5% al pocillo de cultivo tisular que contiene las celulas. Se ajusta el pH a aproximadamente de 7,4 a 7,5 si es necesario. Se incuba la placa durante de 3 a 7 dfas con un cambio de medio en el dfa 3.
Al final del periodo de incubacion se decanta el medio y se lava la matriz de soporte sembrada con celulas. Despues se implanta la matriz de soporte, con el lado con celulas hacia abajo, en el sitio de defecto, y opcionalmente se recubre con un parche de recubrimiento. Despues se deja que cicatrice el defecto por sf mismo.
Ejemplo 5: Metodo de tratamiento de defectos de la piel
Se toma una biopsia de piel humana. Se lava la biopsia una vez en medio de crecimiento celular. El medio de crecimiento contiene sulfato de gentomicina 70 micromol/litro, anfotericina 2,2 micromol/litro, acido ascorbico 0,3 millimol/litro y suero de ternero fetal al 20%. Se incuba la biopsia en medio de crecimiento celular que contiene tripsina-EDTA durante de 5 a 10 minutos a 37 grados centfgrados y al 5% de CO2. Se lava la biopsia dos o tres
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veces mas con medio de cultivo celular para eliminar cualquier tripsina-EDTA restante. Se pesa la biopsia y despues se digiere con colagenasa (aproximadamente 5000 unidades para una biopsia de 80-300 miligramos) durante aproximadamente de 17 a 21 horas a 37 grados centfgrados y al 5% de CO2. La biopsia puede desmenuzarse en este momento para ayudar a la digestion del material. Despues se centrifuga el material de biopsia a 700g durante aproximadamente 10 minutos, y se lava el sedimento con medio de crecimiento celular. Se afslan los queratinocitos y se cuentan para determinar la viabilidad. Se cultivan los queratinocitos.
Se cultivan los queratinocitos en presencia de fibroblastos NIH 3T3 en medio de cultivo DMEM/F12 que contiene suero bovino fetal al 10%, hidrocortisona (0,4 microgramos por mililitro), factor de crecimiento epidermico humano (10 nanogramos por mililitro), toxina del colera 10-10 M y insulina libre de zinc 5 microgramos por mililitro, adenina 24 microgramos por mililitro y 3,3,5-triyodo-L-tironina 2x10'9 molar.
Se usa una membrana de colageno de tipo I/III de Geistlich Sohne (Suiza) o Matricel GmbH, (Alemania) como matriz de soporte. Se corta la matriz a un tamano adecuado para ajustarse en el fondo del pocillo en la bandeja de cultivo tisular de 6 pocillos NUNCLON™ Delta y se coloca en el pocillo en condiciones asepticas (NUNC (InterMed) Roskilde, Dinamarca). Se aplica una pequena cantidad del medio de cultivo celular que contiene suero a la matriz para absorberse en la matriz y para mantener la matriz humeda en el fondo del pocillo.
Se colocan aproximadamente 106 celulas en 1 mililitro de medio de cultivo directamente encima de la matriz, se dispersan sobre la superficie de la matriz. Despues se incuba la placa de cultivo tisular en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados durante 60 minutos. Se anaden cuidadosamente desde 2 hasta 5 mililitros de medio de cultivo tisular que contiene suero a del 5 al 7,5% al pocillo de cultivo tisular que contiene las celulas. Se ajusta el pH a aproximadamente de 7,4 a 7,5 si es necesario. Se incuba la placa durante 4 dfas con un cambio de medio en el dfa 2.
Al final del periodo de incubacion se decanta el medio y se implanta la matriz de soporte sembrada con celulas, con el lado con celulas hacia abajo, en el sitio de defecto, y opcionalmente se recubre con un parche de recubrimiento. Despues se deja que cicatrice el defecto por sf mismo.
Ejemplo 6: Metodo de tratamiento de defectos del epitelio
Se extrae una biopsia de las vfas urinarias altas o bajas y se transporta en HBSS (solucion salina equilibrada de Hank) libre de calcio, libre de magnesio con bicarbonato de sodio 0,35 gramos por litro que contiene tampon acido 4- (2-hidroxietil)-1-piperazin-etanosulfonico (HEPES) 10 milimolar y aprotinina 100 KUI por mililitro. Se lava la muestra dos veces en HBSs, y se elimina el tejido del estroma en exceso de manera aseptica. Despues se corta el tejido en fragmentos de 3 milfmetros cubicos antes de la digestion en EDTA al 0,1% durante la noche a 4 grados centfgrados Se aclara el sedimento celular de 2 a 3 veces (se centrifuga a 200g durante aproximadamente 10 minutos) en el medio de crecimiento que es un medio libre de suero, con bajo contenido en calcio, formulado para el cultivo de queratinocitos primario. Se suministran al este medio factor de crecimiento epidermico recombinante y extracto de hipofisis bovina como aditivos. Se anade toxina del colera al medio a una concentracion final de 30 nanogramos por mililitro. Se afslan las celulas uroepiteliales y se cuentan para determinar la viabilidad. Se siembran las celulas y se mantienen en una atmosfera humidificada del 5% de CO2, el 95% de aire en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados y se manipulan en un laboratorio de clase 100. Se cambia el medio 3 veces por semana. Pueden usarse otras composiciones de medio de cultivo para cultivar las celulas. Se someten las celulas a tripsinizacion usando tripsina-EDTA durante de 5 a 10 minutos y se cuentan usando tincion de viabilidad con azul tnpano en una camara Buurker-Turk. Se ajusta el recuento de celulas a 7,5x105 celulas por mililitro.
Se usa una membrana de colageno de tipo I/III de Geistlich Sohne (Suiza) o Matricel GmbH (Alemania) como matriz de soporte. Se corta la matriz a un tamano adecuado para ajustarse en el fondo del pocillo en la bandeja de cultivo tisular de 6 pocillos NUNCLON™ Delta y se coloca en el pocillo en condiciones asepticas (NUNC (InterMed) Roskilde, Dinamarca). En primer lugar se trata previamente esta matriz de soporte particular o bien con glutaraldehudo al 0,6% durante 1 minuto o bien con Tisseel ® (Immuno AG, Viena, Austria), que es un pegamento de fibrina. Estos tratamientos retrasan significativamente la resorcion de la matriz. Se lava esta matriz de soporte varias veces en agua destilada hasta que se elimina el glutaraldehudo que no ha reaccionado. Se aplica una pequena cantidad del medio de cultivo celular que contiene suero a la matriz para absorberse en la matriz y para mantener la matriz humeda en el fondo del pocillo.
Se colocan aproximadamente 106 celulas en 1 mililitro de medio de cultivo directamente encima de la matriz, se dispersan sobre la superficie de la matriz. Despues se incuba la placa de cultivo tisular en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados durante 60 minutos. Se anaden cuidadosamente desde 2 hasta 5 mililitros de medio de cultivo tisular que contiene suero a del 5 al 7,5% al pocillo de cultivo tisular que contiene las celulas. Se ajusta el pH a aproximadamente de 7,4 a 7,5 si es necesario. Se incuba la placa durante de 3 a 7 dfas con un cambio de medio en el dfa 3.
Al final del periodo de incubacion se decanta el medio y se lava la matriz de soporte sembrada con celulas. Despues se implanta la matriz de soporte, con el lado con celulas hacia abajo, en el sitio de defecto, y opcionalmente se
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Ejemplo 7: Metodo de tratamiento de defectos de medula espinal
Se toma una biopsia de cualquier nervio periferico o medula espinal. Se mantienen nervios perifericos humanos en DMEM con FBS al 10%, penicilina 100 microgramos por mililitro y estreptomicina 100 microgramos por mililitro. Se elimina el epineuro y se cortan los fasdculos nerviosos en segmentos de 1 a 2 milfmetros de longitud. Se mantienen explantes de los segmentos en el medio anterior para inducir una degeneracion walleriana in vitro durante 14 dfas. Durante este periodo, se cambia el medio cada dos dfas. Tras 14 dfas se digieren los explantes en colagenasa 1300 unidades por mililitro y dispasa 10 unidades por mililitro en DMEM con agitacion continua a 37 grados centfgrados durante 1 hora, despues se disocia adicionalmente el tejido digerido mediante trituracion repetida mediante una pipeta Pasteur. Se lava el sedimento celular y vuelve a suspenderse en DMEM con FBS al 10% antes de sembrarse en placas de cultivo que se habfan recubierto con colageno de cola de rata tipo I. Se mantienen los cultivos de celulas nerviosas en una atmosfera humidificada del 5% de CO2, el 95% de aire en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados y se manipulan en un laboratorio de clase 100. Pueden usarse otras composiciones de medio de cultivo para cultivar las celulas. Se someten las celulas a tripsinizacion usando tripsina-EDTA durante de 5 a 10 minutos y se cuentan usando tincion de viabilidad con azul tnpano en una camara Buurker-Turk. Se ajusta el recuento de celulas a 7,5x105 celulas por mililitro.
Se usa una membrana de colageno tipo I/III de Geistlich Sohne (Suiza) o Matricel GmbH (Kaiserstr., Alemania) como matriz de soporte. Se corta la matriz a un tamano adecuado para ajustarse en el fondo del pocillo en la bandeja de cultivo tisular de 6 pocillos NUNCLON™ Delta y se coloca en el pocillo en condiciones asepticas (NUNC (InterMed) Roskilde, Dinamarca). En primer lugar se trata previamente esta matriz de soporte particular o bien con glutaraldehndo al 0,6% durante 1 minuto o bien con Tisseel® (Immuno AG, Viena, Austria), que es un pegamento de fibrina. Estos tratamientos retrasan significativamente la resorcion de la matriz. Se lava esta matriz de soporte varias veces en agua destilada hasta que se elimina el glutaraldehndo que no ha reaccionado. Se aplica una pequena cantidad del medio de cultivo celular que contiene suero a la matriz para absorberse en la matriz y para mantener la matriz humeda en el fondo del pocillo.
Se colocan aproximadamente 106 celulas en 1 mililitro de medio de cultivo directamente encima de la matriz, se dispersan sobre la superficie de la matriz. Despues se incuba la placa de cultivo tisular en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados durante 60 minutos. Se anaden cuidadosamente desde 2 hasta 5 mililitros de medio de cultivo tisular que contiene suero a del 5 al 7,5% al pocillo de cultivo tisular que contiene las celulas. Se ajusta el pH a aproximadamente de 7,4 a 7,5 si es necesario. Se incuba la placa durante de 3 a 7 dfas con un cambio de medio en el dfa 3.
Al final del periodo de incubacion se decanta el medio y se lava la matriz de soporte sembrada con celulas. Despues se implanta la matriz de soporte, con el lado con celulas hacia abajo, en el sitio de defecto, y opcionalmente se recubre con un parche de recubrimiento. Despues se deja que cicatrice el defecto por sf mismo.
Ejemplo 8: Metodo de tratamiento de cualquier defecto tisular
Se toma una biopsia de medula osea y se lava la biopsia una vez en medio de crecimiento celular. El medio de crecimiento contiene F12 de HAM y tampon Hepes 15 milimolar, sulfato de gentomicina 70 micromol/litro, anfotericina 2,2 micromol/litro, acido ascorbico 0,3 millimol/litro y suero de ternero fetal al 20%. Se incluyen factor(es) de crecimiento espedfico(s) en el medio de crecimiento para la induccion de linaje celular espedfico. Por ejemplo, se incluye factor de crecimiento transformante beta en el medio para la induccion de diferenciacion de condrocitos mientras que se incluye factor de crecimiento de fibroblastos en el medio para la induccion de diferenciacion de tenocitos. Se cultivan las celulas madre en el medio y se cuentan para determinar la viabilidad. Se hacen crecer las celulas diferenciadas en medio de cultivo esencial mmimo que contiene F12 de HAM y tampon Hepes 15 milimolar y suero autologo a del 5 al 7,5% en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados y se manipulan en un laboratorio de clase 100. Pueden usarse otras composiciones de medio de cultivo para cultivar las celulas. Se someten las celulas a tripsinizacion usando tripsina-EDTA durante de 5 a 10 minutos y se cuentan usando tincion de viabilidad con azul tnpano en una camara Buurker-Turk. Se ajusta el recuento de celulas a 7,5x105 celulas por mililitro.
Se usa una membrana de colageno tipo I/III de Geistlich Sohne (Suiza) o Matricel GmbH (Kaiserstr., Alemania) como matriz de soporte. Se corta la matriz a un tamano adecuado para ajustarse en el fondo del pocillo en la bandeja de cultivo tisular de 6 pocillos NUNCLON™ Delta y se coloca en el pocillo en condiciones asepticas (NUNC (InterMed) Roskilde, Dinamarca). Se aplica una pequena cantidad del medio de cultivo celular que contiene suero a la matriz para absorberse en la matriz y para mantener la matriz humeda en el fondo del pocillo.
Se colocan aproximadamente 106 celulas en 1 mililitro de medio de cultivo directamente encima de la matriz, se dispersan sobre la superficie de la matriz. Despues se incuba la placa de cultivo tisular en una incubadora de CO2 a 37 grados centfgrados durante 60 minutos. Se anaden cuidadosamente desde 2 hasta 5 mililitros de medio de cultivo tisular que contiene suero a del 5 al 7,5% al pocillo de cultivo tisular que contiene las celulas. Se ajusta el pH a aproximadamente de 7,4 a 7,5 si es necesario. Se incuba la placa durante de 3 a 7 dfas con un cambio de medio
en el dfa 3.
Al final del periodo de incubacion se decanta el medio y se lava la matriz de soporte sembrada con celulas. Despues se implanta la matriz de soporte, con el lado con celulas hacia abajo, en el sitio de defecto, y opcionalmente se 5 recubre con un parche de recubrimiento. Despues se deja que cicatrice el defecto por sf mismo.
Los expertos en la tecnica apreciaran que pueden realizarse numerosas variaciones y modificacion a la invencion mostrada en las realizaciones espedficas.
10 Por tanto, debe considerarse que las presentes realizaciones y ejemplos son ilustrativos y no restrictivos en todos los aspectos.

Claims (8)

  1. 10
  2. 2.
    15
  3. 3.
  4. 4.
    20
  5. 5.
    25 6.
  6. 7. 30
  7. 8.
  8. 9.
    35
    REIVINDICACIONES
    Estructura de reparacion tisular para su uso en el tratamiento de cualquier defecto tisular o para regenerar cualquier tejido in vivo, que comprende
    a) una membrana de colageno libre de celulas y
    b) celulas madre adheridas a una superficie de dicha membrana,
    en la que la superficie es porosa de manera que las celulas madre pueden migrar al interior de la membrana y del tejido.
    Estructura de reparacion tisular para su uso segun la reivindicacion 1, en la que dicha membrana de colageno es reabsorbible.
    Estructura de reparacion tisular para su uso segun la reivindicacion 1, en la que dicha membrana de colageno tiene una superficie densa.
    Estructura de reparacion tisular para su uso segun la reivindicacion 1, en la que dicha membrana de colageno es autologa.
    Estructura de reparacion tisular para su uso segun la reivindicacion 1, en la que dicha membrana de colageno es alogenica.
    Estructura de reparacion tisular para su uso segun la reivindicacion 1, en la que dicha membrana de colageno comprende una combinacion de colageno de tipo I y colageno de tipo III.
    Estructura de reparacion tisular para su uso segun la reivindicacion 1, en la que dicha membrana de colageno comprende colageno de tipo II.
    Estructura de reparacion tisular para su uso segun la reivindicacion 1, en la que dicha estructura se puede implantar.
    Estructura de reparacion tisular para su uso segun la reivindicacion 4, en la que dichas celulas madre estan parcialmente diferenciadas, o no diferenciadas.
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