KR20030003977A

KR20030003977A - 인공 연골배양 구조체 및 그것을 이용한 인공 연골 구조의제조방법

Info

Publication number: KR20030003977A
Application number: KR1020010039856A
Authority: KR
Inventors: 이훈범
Original assignee: (주)에이치비메디컬스; 이훈범
Priority date: 2001-07-04
Filing date: 2001-07-04
Publication date: 2003-01-14

Abstract

본 발명은 인공 연골배양 구조체 및 그것을 이용한 인공 연골 구조의 제조방법에 관한 것으로, 상기 인공 연골배양 구조체는 평균 공극이 50 내지 300㎛이고, 폴리비닐알코올이나 그것의 공중합체와 같이 친수성 및 비분해성의 다공성 물질에 연골 세포, 연골막 세포, 배양액 등과 같은 연골배양 조성물을 함유시키는 것으로 구성되어 있다.

본 발명에 따른 인공 연골은 손상된 인체의 연골을 대체하여 사용될 수 있으며, 특히 연골에 영양을 공급하는 연부조직을 함께 재생할 수 있으며 경우에 따라서는 피부도 이식하여, 연골 자체뿐만 아니라 그에 관련된 주변 조직의 일부 또는 전부가 손실된 경우에도 이를 회복시킬 수 있다.

Description

인공 연골배양 구조체 및 그것을 이용한 인공 연골 구조의 제조방법 {Artificial Cartilage-Cultivating Scaffolds and Methods of Preparing Artificial Cartilage Structure Using Them}

본 발명은 인공 연골배양 구조체 및 그것을 이용한 인공 연골 구조의 제조방법에 관한 것이다.

연골(cartilage)이란 연골세포와 그것을 둘러싸고 있는 다량의 기질로 이루어진 조직으로서, 칼슘을 주성분으로 한 뼈인 경골(또는 골조직)과 대응되는 개념이다. 연골의 작용에는 관절의 골단을 덮는 관절연골에서 볼 수 있는 것처럼 골단의 마찰을 방지하는 이외에 기관·귓바퀴와 같이 탄력을 유지하거나, 늑연골·치골결합 연골과 같이 압력에 대한 저항력을 주는 것 등을 들 수 있다. 연골은 무신경, 무혈관, 무임파성이며, 한번 손상되면 원래대로 복구되지 않는다.

연골 조직은 발생과정에서 미분화성 간충질 세포인 메센시말(mesenchymal) 세포가 TGF-β, BMP 등의 세포외부 분화인자에 의해 연골세포로 분화되며 (chondrogenesis), 연골세포 분화는 연골원성세포의 증식, 세포-세포 간 그리고 세포-세포외 기질(extracellular matrix: ECM)간의 부착(adhesion)에 의한 세포응축 (precartilage condensation), 그리고 연골결절 (cartilage nodule)을 형성함으로서 연골세포로 분화(chondrogenesis)된다. 분화된 연골세포는 II 및 X형 콜라겐(collagen) 등의 연골 특이적인 세포외 기질(ECM)을 분비하여 연골을 형성하고, 분화된 연골세포의 증식 및 사멸과 연골조직 특이적 ECM 합성 및 분해 과정의 항상성(homeostasis)이 건강한 연골조직을 유지한다.

이러한 항상성의 파괴는 퇴행성 관절염 등의 직접적인 원인이 되는 연골 퇴화(cartilage degeneration)를 유발하고, 연골세포의 분화 이상은 연골비대증, 연골발육부전증, 연골암, 연골이형성증 등의 질병들을 유발한다. 특히, 퇴행성 관절염 등의 원인이 되는 연골세포의 퇴행은 연골세포의 증식 이상, 연골세포의 탈분화에 의한 표현형의 소실, ECM의 합성의 이상, ECM 분해를 조절하는 메트릭스 메탈프로테아제(matrix metalloprotease)의 합성 및 활성조절의 이상 등에 기인한다.

연골의 퇴행은 퇴행성관절염, 외상 등에 의해 연골세포 또는 조직이 손상되는 것으로, 정상적인 연골과는 생화학적. 기계적 성질이 다른 조직으로 변형된 기능을 유발한다. 즉, 연골세포의 세포 증식 및 이동에 제한이 나타나고, 연골의 장력과 견고함을 제공하는 콜라겐 구조나 연골의 압축성을 제공하는 프로테오글리칸(proteoglycan: PG) 성분이 소실되는 등 연골의 조직화된 기질구성에 필요한 거대분자가 분해되거나 생성이 저해되어 연골의 섬유화가 나타난다. 연골의 퇴행과정에 대한 기전은 아직까지 규명된바 없으며, 주로 관절염 등의 질병과 관련하여 연골세포의 세포사멸(apoptosis) 또는 연골 기질성분의 소실이 나타나는 것으로 알려져 있다.

앞서의 설명과 같이, 연골은 무혈관 영역(avascular zone)으로서 연골세포로의 영영공급은 확산(diffusion) 과정으로 이루어진다. 즉, 지방과 혈관이 포함되어 있는 연부조직과 연골을 덮고 있는 연골막에 존재하는 혈관으로부터, 연골세포와 간질조직(대부분이 물로 이루어짐)쪽으로 산소 및 영양분이 확산되어 들어감으로써 공급 과정이 이루어진다. 따라서, 연골이 외상 또는 퇴행성 관절염 등에 의해 전체 또는 부분적으로 손상되었을 때는, 다른 인체 조직과는 달리 이를 회복하는 방법이 용이하지 않다.

이러한 연골의 대체 재료로서 실리콘이 많이 사용되고 있는데, 인체는 이러한 실리콘을 이물질로 인식하여 반응하므로, 특히 병균의 감염에 의한 질병시 인체의 면역 반응은 실리콘에 집중되는 경향이 있어서, 이식된 실리콘 주위로 염증이 발생하는 경우가 많다. 그러한 현상은 경골의 성형 수술시에도 나타나는데, 일 예로, 코뼈를 높이는 성형수술의 경우에, 실리콘 소재를 사용하면 나이가 들어감에 따라 외부 물질인 실리콘 소재의 인조 코뼈 상부 피부는 매우 얇아져 염증 발생이 잦아지고 결국에는 실리콘 소재의 코뼈가 피부를 뚫고 외부로 노출되는 부작용이 발생한다. 따라서, 이상적인 대체 재료로는 인체내의 다른 자가조직인 경골의 사용이 요망되고 있으나, 인체의 다른 경골을 사용하는 것은 수술 자체가 매우 번거롭고, 공여부의 합병증 또는 병적상태(morbidity)의 가능성이 높으며, 채취된 본래의 경골조직은 수혜부로부터 생존을 위한 재혈행화가 재대로 이루어지지 않아 흡수되거나 매우 약해지는 문제점이 발생할 수 있다.

관절 연골의 재생방법으로는, 예를 들어, 환자 자신의 자가 연골이식 이외에 연골 유도인자와 적당한 담체와의 조합에 의한 연골 결손부의 보철제를 환부에 집어넣은 방법이 사용되고 있다. 그러한 내용들은 미국특허 5,876,452호 등에 개시되어 있다. 여기에서 사용되는 다공성 구조체는 생분해성인 고분자 재료로 이루어져 있는데, 연골의 경우 이러한 구조체에 연골 유도인자를 함유시킨 상태로 해당 연골에 이식하게 되면, 무혈관 조직이라는 연골의 특성상 연골 조직은 서서히 분해되어 인체내로 흡수되게 되며, 연골이 다 성장하기 전에 외형을 유지하는 구조체가생분해되거나, 또는 비록 삼차원적인 구조를 갖추고 있다고 하더라도 생체에 이식된 후에는 pH 2~3의 강산성 물질로 변하여 이미 형성된 연골세포에 치명적인 영향을 주게된다. 결국, 이식한 삼차원적인 구조는 서서히 그 모양 및 형태가 변형되어 흡수가 진행되거나 본래의 형상을 유지하지 못하는 문제점이 있다. 또한, 외상 등에 의해 연골 자체가 상당 부분 손실된 경우에는 전혀 사용할 수 없다는 문제점이 있다.

이와 관련하여, 최근에는 생체 조직 일부를 실험실(in vitro)에서 합성하여 손상 부위에 이식하는 조직 공학의 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러한 예로서 생분해성 구조체에 연골세포 등을 시드(seed)하여 구조체-연골세포 복합체를 제조하고 이를 손상 부위에 이식함으로써, 구조체가 서서히 분해/흡수되는 동안에 연골 세포가 재생할 수 있도록 한다. 그러나, 앞서 설명한 바와 같이, 자가분해될 때 발생하는 강산성 물질에 의해 연골세포가 손상되지 않고 계속적인 영양공급이 이루어져야 항상성이 유지되므로, 연골 조직의 재생만으로는 부족하고, 여기에 영양분을 공급할 수 있는 생체 조직의 재생도 필요하다.

따라서, 본 발명은 이러한 종래 기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 일거에 해결하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 첫 번째 목적은 연골세포 및 연골막세포의 배양이 용이하고 이식 후에도 형태 유지성이 뛰어난 인공 연골배양 구조체를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 연골뿐만 아니라 그것의 외면을 둘러싸고 있는 연부조직 등을 함께 배양할 수 있는 인공 연골 구조의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 귀바퀴 연골과 같이 연골, 연부조직 및 피부로 구성된 연골 구조를 인공적으로 제조하여 이식할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 기타 목적은 연골뿐만 아니라 동일한 구성에 의해 인공 경골조직 배양 구조체를 제공하는 것이다.

도 1a 내지 도 1g는 본 발명의 하나의 실시예에 따른 인공 연골 구조의 제조방법의 개략적 단계도이고;

도 2는 연부조직의 생성 및 피부 이식과 관련된 동물 실험의 개요도이고;

도 3a 내지 도 3d와 도 4a 및 도 4b는 본 발명의 동물 실험과 관련된 사진들이고,

도 5는 본 발명에 따른 2차 주형을 위치시킬 인체 복벽의 부분 간략도이다.

도면의 주요 부호에 대한 설명:

100: 다공성 구조체200: 1차 주형

300: 시험관400: 인공 연골

500: 2차 주형600: 동맥/정맥

700: 복벽800: 실

900: 연부조직1000: 인공 연골 구조

1100: 피부조직

이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인공 연골배양 구조체(scaffold)는, 평균 공극이 50 내지 300㎛이고 비분해성 및 친수성의 다공성 구조체에 연골세포, 연골막세포, 배양액 등과 같은 연골배양 조성물을 함유시키는 것으로 구성된다.

상기 다공성 구조체는 개방형 공극(open pore)들로 구성되어 있어서, 그 내부에 위치하는 연골세포, 연골막세포 등이 배양액을 영양원으로 하여 성장 및 증식, 분열할 수 있는 공간을 제공한다. 이러한 기공들의 평균 공극은 앞서의 설명과 같이 50 내지 300㎛이며, 바람직하게는 150 내지 250㎛이다. 평균 공극이 50㎛ 이하이면, 구조체의 구조골격을 따라 성장하는 세포들에 의해 기공의 내부가 밀폐되어 영양분 등의 공급이 차단되고, 또한 접촉금지(contact inhibition) 현상에 의해 세포들의 성장이 억제되는 문제점이 있다. 한편, 평균 공극이 300㎛ 이상이면, 구조체의 강도가 약화되어 외부의 압력에 의해 형태가 유지되지 못하는 문제점이 있다.

그러한 다공성 구조체의 재료로는 생체 적합성이 우수할 뿐만 아니라 친수성이 높아 세포의 성장에 적합한 소재이어야 한다. 그러한 대표적인 예로는 폴리비닐알코올 또는 그것의 공중합체를 들 수 있다. 상기 폴리비닐알코올은 생체 적합성이 있는 소재로서, 폴리비닐알코올 장쇄 분자의 측쇄에 다수의 알코올기가 붙어있어서 친수성이 강하다. 따라서, 연골세포 등의 배양에 좋은 환경을 제공하게 된다. 상기 폴리비닐알코올의 공중합체의 대표적인 예로는 폴리비닐알코올에 포름알데히드, 아세트알데히드와 같은 알데히드류의 화합물을 반응시켜 폴리비닐알코올의 일부 알코올기를 분자내(intra) 또는 분자간(inter) 연결한 공중합체를 들 수 있다.

상기 다공성 구조체는 해당 기관(organ) 또는 조직(tissue) 연골의 구조와 거의 동일한 형상을 가지도록 제조하여 연골이 배양된 후에도 동일한 형태가 유지될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 폴리비닐알코올 등의 친수성 고분자는 배양조건하에서 물과 같은 성분에 의해 팽윤되므로 건조상태와 습윤상태의 형상에 차이가 있다. 따라서, 배양조건 및 인체내에 이식되는 상태는 습윤상태이므로, 이를 고려하여 다공성 구조체의 형상은 습윤상태의 형상이 인공 연골의 형상과 동일하도록 만드는 것이 필요하다.

상기 다공성 구조체는 종래의 기술과는 달리 전혀 분해되지 않는다는 특징을 갖는다. 따라서, 배양이 완료된 상태 또는 미완된 상태의 상기 구조체를 인체의 해당 부위에 이식할 경우 본래의 형태를 그대로 유지할 수 있고, 연골세포는 이러한 다공성 구조체를 따라 성장하여 그곳에서 자리잡고 삼차원적인 구조체를 이루며 이웃 공극과의 개방된 통로를 통해 외부(다공성 구조체의 외부)로부터 산소 및 영양분을 받아 생존하게 된다.

인체의 연골 조직에는 연골을 둘러싸고 있는 연골막이 존재하는데, 그것은 연부조직과 연계하여 연골세포에 산소 및 영양분을 공급하고 연골아세포를 제공하여 연골세포의 발생을 위한 기원으로 작용한다. 본 발명의 구조체에는 그러한 연골막이 인공 연골의 외면을 감싸지는 않지만, 다공성 구조체를 따라 연골세포와 함께 증식·분열하는 연골막세포를 함유하고 있어서 동일한 역할을 한다. 즉, 일부 연골세포가 일정기간이 지나 퇴화되면, 연골막세포의 연골막종(perichondroma)이 연골아세포로 분화되고 이것이 연골세포로 성장하여 연골의 항상성이 유지될 수 있다.

상기 연골세포 및 연골막세포는 바람직하게는 인공 연골배양 구조체를 이식하려는 특정인(환자)의 해당 조직에서 채취하여 사용할 수 있다. 최근에는 유전공학의 발전으로 특정인의 DNA를 추출하여 이를 유전자 재조합 기술에 의해 E. Coli와 같은 미생물에서 발현시켜 인공적으로 제조하는 기술도 개발되고 있으므로 이러한 방식의 결과물도 사용될 수 있다.

상기 배양액은 연골세포 등의 배양 및 성장을 위한 영양원으로서, 바람직하게는 TGF-β(Transforming Growth Factor), FGF(Fibroblast Growth Factor), IGF(Insulin-like Growth Factor), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 등의 성장인자(growth factor)를 포함한다. 이와 같이, 연골세포를 배양하기 위하여 연골 조직을 처치하는 하나의 예를 살펴보면 다음과 같다.

(1) 2㎎/㎖ 히알우론산 분해효소(Hyaluronidase) : 병에 PBS(Phosphate Buffered Solution) 15㎖를 첨가하여 -20℃에서 저장

(2) 2㎎/㎖ 트립신(Trypsin) : 2.5% 트립신 2.56㎖와 PBS 29.44㎖를 혼합한 후 필터링하고 이를 10㎖/튜브로 분할

(3) 4㎎/㎖ 교원질 분해효소(Collagenase) : 교원질 분해효소 240㎎을 정량하여 PBS 60㎖에 혼합한 후 필터링하고 이를 12㎖/튜브로 분할

(4) 20% FCS 햄 용액(Ham's soultion) : 햄 용액 27.2㎖에 FCS(Fetal Calf Serum) 6.8㎖를 혼합하여 8.5㎖/튜브로 분할

(5) 12% FBS 햄 용액 : 햄 용액 44㎖를 FBS(Fetal Bovine Serum) 6㎖와 25㎕ 겐타마이신(Gentamycin)에 혼합하여 12.5㎖/튜브로 분할

(6) 인간 TGF-β1 : 기질(기질: 4mM HCl 1.61㎖와 혈청 알부민 1.6㎎을 혼합하여 튜브내로 필터링) 1.5㎖에 혼합

(7) 소 FGF : 기질(기질: PBS 1.61㎖와 소 혈청 알부민 1.6㎎을 혼합하여 튜브내로 필터링) 1.5㎖에 혼합

(8) 성장인자가 포함되어 있는 기질 : 햄 용액 98㎖ + FCS 2㎖ + TGF-β1 100㎕ + bFGF 60㎕ + 겐타마이신 50㎕

상기 예는 하나의 설명적인 예시일 뿐, 본 발명의 내용이 상기의 것으로 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 제조되어 배양이 완료된 인공 연골은 인체의 해당 부위에 바로 이식하여 사용할 수 있다. 따라서, 손상된 기존의 관절 연골이나 코 연골 등을 제거하고 상기 인공 연골을 이식하면, 이식된 상태의 본래 형태를 유지하면서 기존 조직에 친화적으로 생착되게 된다. 생착되는 과정에서 일부 인공 연골은 분해되어인체에 흡수되기도 하지만 연골에 영양을 공급하는 연부조직이 형성되는 시기까지도 연골의 외형이 다공성 물질에 의해 유지될 수 있으므로 바람직하다. 경우에 따라서는, 손상된 연골을 제거하고 실리콘을 삽입한 뒤 일정기간 유지하여 인공 연골이 삽입될 공간을 확보한 뒤, 상기와 같은 인공 연골배양 구조체나, 배양이 완료된 인공 연골을 실리콘에 대체하여 삽입함으로써 이식을 완료할 수 있다.

나이를 먹어감에 따라 연골에는 칼슘이 침적되어 경화되는 반면에, 칼슘은 연골세포의 성장을 촉진하는 기능도 가지고 있다. 따라서, 상기 인공 연골배양 구조체가 관절 연골용으로 사용될 때에는 칼슘의 침적을 막기 위하여 항칼슘 제제(Anti-Calcium Drug)를 다공성 구조체에 더 포함시키는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 항칼슘 제제가 장기간에 걸쳐 서서히 분비(서방성)될 수 있도록 포함시킬 수 있는데, 예를 들어, 다공성 구조체의 일부 공극 표면에 코팅하거나 표면 다공성 담체에 상기 제제를 담은 상태로 다공성 구조체의 내부에 포함시킬 수 있다. 한편, 상기 인공 연골배양 구조체가 코, 귀와 같이 인체의 형태유지 연골용으로 사용되는 경우에는 오히려 연골세포의 성장을 촉진하기 위하여 칼슘 성분을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 칼슘 성분을 연골세포 등과 함께 다공성 구조체에 함유시켜, 연골의 성장 촉진뿐만 아니라 다공성 구조체의 외형을 유지하는 충진제의 역할을 부여한다. 이러한 칼슘 성분 또는 항칼슘 제제의 부가와 그에 따른 효과는 기존의 인공 연골배양 구조체에서는 전혀 이룰 수 없는 본 발명만의 또다른 효과이기도 하다.

본 발명은 또한 인공 경골조직배양 구조체에 관한 것이다. 인공 경골조직배양 구조체는 상기 인공 연골배양 구조체와 동일하며, 다만 연골세포와 연골막세포 대신에 골세포(Osteocyte)와 골아세포(Osteoblast)를 함유하며, 칼슘 성분이 필수 성분으로 함유되어 있다는 점에서만 차이가 난다. 기타 앞서 설명한 인공 연골배양 구조체에 대한 내용은 인공 경골조직배양 구조체에도 적용되므로 그에 관한 설명은 생략한다.

본 발명은 또한 상기 인공 연골배양 구조체를 이용하여 인공 연골 구조를 형성하는 방법에 관한 것이다. 여기서, "연골 구조"란 연골과, 그것의 외부를 둘러싸고 있으면서 연골에 산소 및 영양분을 공급하는 연골막 및 연부조직을 포함하는 개념이다. 앞서 설명한 바와 같이, 연골은 무혈관 조직이므로 연골막과 연부조직에 존재하는 혈관으로부터의 확산에 의해 연골세포에 영양분이 공급되게 된다. 따라서, 연골뿐만 아니라 연골막 및 연부조직이 손상된 경우에는 이러한 모든 조직을 재생해 주어야 한다. 이러한 모든 관련 조직의 재생방법은 지금까지 보고된 바가 없는 전혀 새로운 기술이다. 특히, 연부조직의 재생 방법은 본 발명자에 의해 새롭게 밝혀진 생체 현상에 기초하고 있다.

따라서, 본 발명의 인공 연골 구조의 제조 방법은,

(A) 인체의 해당 연골과 동일한 형태의 외형을 가지며, 평균 공극이 50 내지 300㎛이고 비분해성 및 친수성의 다공성 구조체에 연골세포, 연골막세포 및 배양액을 함유시켜 인공 연골배양 구조체를 형성하고;

(B) 상기 다공성 구조체와 동일한 형상이 내부에 각인되어 있고 내부와 외부를 연결하는 다수의 미세한 관통공이 형성되어 있는 주형(이하, "1차 주형"이라함)의 내부에 상기 인공 연골배양 구조체를 넣고 생체외(in vitro)에서 배양하여, 인공 연골을 제조하고;

(C) 상기 인공 연골보다 다소 큰 형상이 내부에 각인되어 있고, 전후 또는 상하로 관통로가 형성되어 있는 주형(이하, "2차 주형"이라 함)의 내부에 상기 인공 연골을 넣고 상기 관통로를 통해 주형의 내부를 관통하여 연결되는 동맥/정맥 또는 이에 상응하는 혈행이 우수한 조직을 혈관경으로 위치시켜 인공 연골구조 전구체를 형성하고;

(D) 상기 인공 연골구조 전구체를 생체내(in vivo)에서 일정기간 배양하여 인공 연골의 외부에 연부조직이 생성된 인공 연골 구조를 제조하는 과정을 포함한다.

상기 방법의 특징은 인공 연골의 외부에 연부조직이 함께 형성되어 있는 인공 연골 구조를 제조할 수 있다는 것이고, 그러한 기술의 완성은 이하의 실시예에서도 설명하는 바와 같이, 밀폐된 공간내에서 동맥/정맥 또는 이에 상응하는 혈행이 우수한 조직(이하, "동맥/정맥"이라고 약칭하기도 함)을 혈관경으로 위치시킬 경우에는 동맥/정맥을 중심으로 신생 연부조직이 형성될 수 있음을 확인한 본 발명자의 발견에 기초한 것이다.

단계(A)에서 다공성 구조체의 외면은 추후에 연부조직에 의해 뒤덮이고 그러한 연부조직으로부터 산소 및 영양분을 공급받게 되므로, 가능하면 접촉 계면의 면적을 넓게 하는 것이 바람직하다. 하나의 예로서, 다공성 구조체의 표면에 굴곡을 준 구성을 들 수 있다.

단계(C)에서 동맥/정맥을 2차 주형에 통과시키는 방식은 2가지 형태가 가능하다. 첫 번째 방식은 동맥/정맥이 2차 주형의 한쪽 관통로((A) 관통로)로 들어와서 반대쪽 관통로((B) 관통로)로 나가도록 구성하고, 일정 시간이 경과한 후에 (B) 관통로상의 혈관을 묶는 방식이다. 두 번째 방식은 2차 주형에 하나의 관통로만을 형성하고 이곳으로 들어온 동맥/정맥의 단부를 상호 문합하여 동맥을 통해 유입된 혈액이 정맥을 통해 배출되도록 하는 방식이다. 여기서의 문합은 상기 동맥과 정맥을 직접 연결하는 방식일 수도 있고, 다른 부위에서 채취한 정맥으로 동맥 및 정맥을 문합하는 방식(Arteriovenous shunt)일 수도 있다.

상기 방법에 사용되는 주형들은 일정한 형태를 유지할 수 있으면서 생체 적합한 소재로 만들어지며, 그러한 예로는 실리콘을 들 수 있다.

단계(A) 및 단계(B)에서 사용되는 1차 주형에는 그것의 내부와 외부를 연결하는 다수의 관통공이 존재하므로 1차 주형의 외부, 즉 시험관 등에 배양액을 위치시켜 주형 내부에서 소모된 배양액이 연속적으로 공급될 수 있도록 한다. 결국, 단계(A)와 (B)는 상기 인공 연골배양 구조체의 연골 배양과 동일하다고 할 수 있다.

단계(C)와 단계(D)는 인체내에서 실행되는 과정들로서, 2차 주형을 일례로 복벽(피부와 복막 사이)에 삽입하여 연부조직이 형성될 수 있는 기간동안 유지할 수 있다. 이때, 단계(C)에서 사용되는 동맥/정맥은 동맥과 정맥이 일련으로 함께 존재하는 인체내의 혈관 부위를 채취하여 사용하게 된다. 그러한 혈관의 예로는 심부하복벽동정맥(Deep inferior epigastric artery & vein) 등을 들 수 있다. 이러한 혈관은 유방재건성형수술 등에도 사용되는 혈관들이다. 또는, 요골동맥과 같은 동맥은 동맥에 바로 인접하여 정맥들이 위치하므로 이를 채취하여 사용할 수도 있다. 따라서, 2차 주형을 인체의 복벽에 위치시키고 인체의 다른 부위에서 동맥/정맥을 채취하여 2차 주형의 관통로를 통해 연결하고 복벽내의 다른 혈관에 문합하는 수술에 의해 이들 단계를 실행하거나, 또는 복벽내의 혈관을 직접 2차 주형의 관통로에 도입하여 사용할 수도 있다. 경우에 따라서는, 다공성 구조체의 내부에 관통로를 만들어 동맥/정맥이 그곳을 통과하도록 할 수도 있고, 인체의 다른 부위에서 동맥/정맥을 채취할 때, 그러한 혈관 주위의 일부 연부조직도 함께 포함되도록 박리하여 본 발명의 동맥/정맥으로 사용할 수도 있다. 동맥/정맥에 상응하는 혈행이 우수한 조직인 골막조직이나 근육 또는 근막(fascia)을 혈관경으로 사용할 수도 있다.

단계(D)가 완료된 시점에서는 인공 연골과 2차 주형 내벽 사이의 공간에 연부조직이 생성되어 있으므로, 동맥/정맥과 복벽내의 다른 혈관과의 문합을 끊고 2차 주형을 복벽으로부터 제거하게 된다.

이러한 방법으로 얻어진 인공 연골 구조는, 인체의 손상된 연골 부위를 제거한 다음 대체하여 사용할 수 있으며, 이때 손상된 연골 구조체의 동맥/정맥에 상기 인공 연골 구조의 동맥/정맥을 문합하는 과정에 의해 연골 구조체의 생착을 완료할 수 있다. 이러한 인공 연골 구조에는 인체의 연골 구조에서와는 달리 연골막이 별도로 존재하지 않지만, 앞서의 설명과 같이, 연골막의 첫 번째 역할인 산소 및 영양분의 공급은 연부조직이 담당하고, 두 번째 역할인 연골아세포의 생성은 다공성구조체의 내부에 함유되어 있는 연골막세포가 담당하므로 전혀 문제가 되지 않는다.

상기 인공 연골 구조가 귀바퀴 연골과 같이 연부조직 외부에 피부가 별도로 존재하는 경우에는, 단계(D)의 다음 단계로서,

(E) 제조된 인공 연골 구조의 외부를 덮고 있는 2차 주형을 제거하고 인체의 다른 부위에서 채취한 피부를 그것의 외면에 이식하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 얻어진 인공 연골 구조에 대한 피부의 생착 정도는 매우 우수한 것으로 확인되었다.

상기 방법은 본 발명의 범주내에서 다양한 형태로 변형되거나 기타의 부수적인 단계가 부가될 수 있다. 그에 관한 구체적인 예를 몇가지 들어보면 다음과 같다.

(가) 단계(B)에서 1차 주형을 별도로 사용하지 않고 인공 연골배양 구조체를 생체외, 즉, 실험실상에서 직접 배양하는 방식일 수 있다.

(나) 단계(B) 및 단계(D)를 동시에 진행하는 방식이다. 즉, 1차 주형을 사용하지 않고 2차 주형만을 사용하며, 2차 주형의 내부에 삽입하는 대상물을 단계(B)의 인공 연골이 아니라 단계(A)의 인공 연골배양 구조체로 하는 방식이다. 따라서, 상기 단계(B)에서의 인공 연골의 배양과 단계(D)에서의 연부조직의 배양이 동시에 진행된다. 이러한 방식하에서의 연골 배양은 상기 단계(A)~(D)의 방법과 비교하여, 연부조직의 배양 중에 배양된 연골의 일부가 분해/흡수되는 문제점이 있다. 즉, 장시간의 배양 조건하에서 영양공급을 받지 못한 연골조직이 더많이 분해되어 인체내로 흡수될 수 있다. 그러나, 비분해성의 다공성 구조체에 의해 전체 형태는 바람직하게 유지되며, 연부조직의 배양이 완료된 상태에서는 연부조직의 모세혈관으로부터의 확산에 의해 공급되는 영양분에 의해 연부조직이 다시 성장할 수 있게 된다.

(다) 인공 연골 구조를 인체의 해당 부위에 이식할 때 단계(B)의 결과물과 단계(D)의 결과물을 결합하는 방식이다. 즉, 2차 주형을 형성함에 있어서 주형의 내부에 단계(B)의 결과물인 인공 연골과 동일한 형상의 내부주형("양각물")을 위치시켜 2차 주형의 내벽과 상기 양각물 사이의 공간에서 연부조직이 생성되도록 하여, 인공 연골이 포함되지 않은 인공 연골 구조를 제조하고, 상기 단계(B)로부터의 인공 연골과 상기 단계(D)로부터의 인공 연골 구조(내부에 인공 연골이 존재하지 않음)를 인체의 해당 부위에 함께 이식하는 방식이다. 이 경우는 연부조직의 배양 과정에서 연골의 분해/흡수의 정도를 줄일 수 있는 장점이 있다.

이하에서는, 본 발명의 하나의 실시예를 도시한 도면을 참조하여 발명의 내용을 상술하지만 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되도록 해석되어서는 안된다.

우선, 도 1a에는 인공 연골의 이식을 원하는 특정인의 연골세포, 연골막세포 및 배양액 등이 함유하고 있고 비분해성 및 친수성인 다공성 구조체(100)의 단면 형상이 도시되어 있다. 다공성 구조체(100)는 다수의 개방형 기공(110)을 포함하고 있다. 설명의 편의를 위하여, 연골의 형상을 럭비공 모양으로 단순화시켜 표현하였다.

도 1b에서 이러한 다공성 구조체(100)의 형상이 내면에 각인된 1차주형(200)에 다공성 구조체(100)를 삽입하여 배양액이 포함되어 있는 실험실 용기(300)에 넣어 인공 연골을 배양한다. 1차 주형(200)는 상부 주형(210)과 하부 주형(220)으로 구성되어 있고 내부와 외부를 연결하는 다수의 관통공(230)이 형성되어 있다. 따라서, 연골의 성장과 함께 소모되는 배양액(310)이 관통공(230)을 통해 1차 주형(200)의 외부로부터 내부로 유입되게 된다.

도 1c에는 일정한 기간이 경과하여 배양이 완료된 인공 연골(400)이 도시되어 있다. 이렇게 제조된 인공 연골(400)을 도 1d에서와 같이 2차 주형(500)에 삽입하고 동맥/정맥(600)을 인공 연골(400)과 2차 주형(500)의 사이 공간내에 위치시키고, 이를 인체의 복벽(700)에 삽입한다. 동맥/정맥(600)은 복벽내의 다른 혈관에 문합되어 있고, 일정한 시간이 경과하였을 때 동맥/정맥(600)을 실(800)로 묶는다.

도 1e에는 일정한 기간이 경과하여 인공 연골(400)과 2차 주형(500)의 사이 공간에서 동맥/정맥(600)을 중심으로 새로운 연부조직(900)이 형성되었음을 보여주고 있다. 그런 다음, 2차 주형(500)을 제거하면, 도 1f에서와 같은 인공 연골 구조(1000)가 얻어진다.

귀 바퀴와 같이 연부조직의 외면에 피부가 있는 경우, 도 1f에서와 같은 피부조직(1100)을 인공 연골 구조(1000)의 외면에 이식하여, 도 1g에서와 같이 생착시키게 된다.

이하에서는, 도 2에 도시되어 있는 바와 같이, 두 개의 실리콘 판 사이에 동맥/정맥을 위치시켜 이들 혈관 주위에 새로운 연부조직을 생성한 뒤, 상부 실리콘판을 제거하고 여기에 피부를 이식하여 피부의 생착이 완료되는지를 확인하는 동물 실험의 예를 개시한다.

동물 실험예:

체중 250g 내외의 스프랴규-더뤼(Sprague-Dawley)계의 백서(쥐) 25 마리를 실험동물로 하였으며, 매 백서 1 마리당 양측 서혜부에서 실험을 시행하여 전체 실험 모델의 피판의 개수를 50으로 하였다. 마취는 엔토발(Entobal)을 30㎎/㎏ 용량으로 복강내 주사하였고, 항생제는 엠피실핀(Ampicilline)을 50㎎/㎏/일씩 주사하여 감염을 예방하였다.

백서의 서혜부 및 내측 대퇴부에 제모제를 바르고 10분 경과후 제모제를 물로 씻은 다음 베타딘(betadine)으로 서혜부와 내측 대퇴부를 소독한 후, 15번 수술도로 서혜부에서 슬관절에 이르는 긴 선상절개를 시행하고 대퇴동맥과 대퇴정맥을 박리하였다. 1.5 ×2.0㎝ 크기의 실리콘 시트를 대퇴부의 근육층위에 삽입하고 대퇴동맥과 대퇴정맥을 실리콘 시트의 중앙에 올려놓은 다음, 프로라인(Proline) 5-0으로 실리콘 판의 양측에 각각 5개씩 봉합고정하되, 시트와 시트 사이의 간격을 일정하게 벌린 상태로 유지하기 위하여 10번씩 매듭지었다. 그런 다음, 같은 크기의 실리콘 시트를 혈관조직 위에 올려놓고 프로라인 5-0으로 봉합고정한 후 피부봉합을 시행하였다.

8주 경과후 백서 내측 대퇴부에 제모제를 바르고 10분 경과후 제모제를 물로 씻은 다음 베타딘으로 소독하고 15번 수술도로 절개하고 실리콘 시트위에 노출된 대퇴동맥과 대퇴정맥의 원위부를 6-0 흑색봉합사로 결찰하고 동맥과 정맥만을 혈관경으로하는 도서형 피판으로 피판을 일차적으로 분리시켜 지연피판을 만든 다음 피부를 봉합하였다.

10일 경과 후(실험 시작일로부터 66일째)에 양측 서혜부에서 이미 만들어진 피막 피판을 도서형 피판으로 완전히 박리하고(도 3a 참조), 복부에서 피판과 같은 크기인 1.5 ×2.0㎝ 크기의 전층피부 2개를 채취하여 피막 피판위로 이식술을 시행하였다. 이때, 피판의 바닥에는 이미 사용한 실리콘 시이트를 다시 고정하여 밑으로부터 공급되는 혈행을 차단하였다. 백서가 긁는 것으로 인한 실험오차를 줄이기 위하여 다시 전층피부를 이식한 도서형 피막피판을 서혜부에 넣고 피부를 봉합하였다.

2주째에 이식한 전층피부의 생착 정도를 확인하고 조직학적 표본을 위하여 혈관경을 포함한 피판 전체를 채취하였다(도 3b 참조). 이식한 피부와 피막 피판간의 생착 관계를 알아보기 위하여 에이치 엔 이(H & E) 염색과 대퇴동맥에 인디안 잉크(Indian ink)를 주사한 후 피판 및 혈관경을 포함하는 생검물을 채취하였다. 채취한 생검물을 10% 버퍼 포름알데히드(buffered formaldehyde) 용액에 고정시키고 혈관경축과 수직으로 마이크로톰(microtome)으로 절편을 만들어 H & E 염색 후 현미경하에서 관찰하였다.

총 25 마리의 백서에서 3 마리는 실험기간 중에 사망하였으며, 2 마리에서는 창상감염으로 실험에 실패하여 실험을 마친 피판의 수는 20마리의 백서에서 40개였다. 피판에 이식한 피부의 생착률은 40개 모두에서 100% 생존하였으며(도 3c 참조), H & E 염색상 이식한 전층피부는 피판에 매우 잘 생착되었을 뿐만 아니라, 대퇴동맥과 대퇴정맥은 모두 잘 유지되어 있었고, 대퇴동맥과 정맥 사이에도 연결정맥이 새롭게 발달한 모습을 보여 주었으며, 매우 많은 신생혈관이 피판 전체에서 관찰되었다(도 3d 참조). 내피세포 특별 염색(endothelial cell specific stain)상 수많은 신생혈관들을 확인할 수 있었다(도 4a 참조). 또한, 인디안 잉크 주사후 H & E 염색을 시행한 표본에서도 수많은 인디안 잉크의 입자들이 이 피판의 혈관뿐만 아니라 이식한 전층피부의 진피내에 있는 모세혈관들에도 잘 침착되어 있었다(도 4b 참조).

도 5a에는 본 발명에 따라 인공 연골 구조를 제조하기 위하여 2차 주형을 삽입할 수 있는 복벽 부위의 위치가 도시되어 있다. 2차 주형이 삽입된 상태에서의 복벽은 복강쪽으로 다소 돌출될 수 있다. 도 5b에는 관통로를 통해 2차 주형의 내부에 도입될 동맥/정맥과 문합할 수 있는 혈관인 심부하복벽동맥(Deep inferior epigastric artery)이 도시되어 있는바, 그에 대응하는 정맥은 상기 동맥의 주위에 다수 존재한다. 경우에 따라서는, 다른 혈관을 사용함이 없이 상기 하부심복벽동맥과 그에 대응하는 정맥을 직접 2차 주형의 내부에 도입하여 사용할 수도 있다.

Claims

배양을 통해 인공 연골을 형성하기 위한 구조체(scaffold)로서, 평균 공극이 50 내지 300㎛이고 비분해성 및 친수성의 다공성 구조체에 연골세포, 연골막세포, 배양액 등과 같은 연골배양 조성물을 함유시키는 것을 특징으로 하는 인공 연골배양 구조체.
제 1 항에 있어서, 상기 다공성 구조체의 평균 공극이 150 내지 250㎛인 것을 특징으로 하는 인공 연골배양 구조체.
제 1 항에 있어서, 상기 다공성 구조체가 폴리비닐알코올 또는 그것의 공중합체인 것을 특징으로 하는 인공 연골배양 구조체.
제 1 항에 있어서, 상기 다공성 구조체에 연골세포의 성장을 촉진하는 성장인자들을 더 포함시키는 것을 특징으로 하는 인공 연골배양 구조체.
제 4 항에 있어서, 상기 인공 연골배양 구조체가 관절 연골용으로 사용되는 경우에 칼슘의 침적을 막기 위한 항칼슘 제제(Anti-Calcium Drug)를 다공성 구조체에 더 포함시키는 것을 특징으로 하는 인공 연골배양 구조체.
제 5 항에 있어서, 상기 인공 연골배양 구조체가 코, 귀와 같이 인체의 형태유지 연골용으로 사용되는 경우에 연골세포의 성장 촉진을 위한 칼슘 성분을 다공성 구조체에 더 포함시키는 것을 특징으로 하는 인공 연골배양 구조체.
평균 공극이 50 내지 300㎛인 친수성 및 비분해성 다공성 구조체에 골세포, 골아세포, 배양액, 칼슘 등과 같은 경골조직 배양 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 인공 경골조직배양 구조체.
(A) 인체의 해당 연골과 동일한 형태의 외형을 가지며, 평균 공극이 50 내지 300㎛이고 비분해성 및 친수성의 다공성 구조체에 연골세포, 연골막세포 및 배양액을 함유시켜 인공 연골배양 구조체를 형성하고;

(B) 상기 다공성 구조체와 동일한 형상이 내부에 각인되어 있고 내부와 외부를 연결하는 다수의 미세한 관통공이 형성되어 있는 주형(이하, "1차 주형"이라 함)의 내부에 상기 인공 연골배양 구조체를 넣고 생체외(in vitro)에서 배양하여, 인공 연골을 제조하고;

(C) 상기 인공 연골보다 다소 큰 형상이 내부에 각인되어 있고, 전후 또는 상하로 관통로가 형성되어 있는 주형(이하, "2차 주형"이라 함)의 내부에 상기 인공 연골을 넣고 상기 관통로를 통해 주형의 내부를 관통하여 연결되는 동맥/정맥 또는 이에 상응하는 혈행이 우수한 조직을 혈관경으로 위치시켜 인공 연골구조 전구체를 형성하고;

(D) 상기 인공 연골구조 전구체를 생체내(in vivo)에서 일정기간 배양하여 인공 연골의 외부에 연부조직이 생성된 인공 연골 구조를 제조하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 인공 연골 구조의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 동맥/정맥 등을 2차 주형에 통과시키는 방식은 동맥/정맥이 2차 주형의 한쪽 관통로((A) 관통로) 들어와서 반대쪽 관통로((B) 관통로)로 나가도록 구성하고, 일정 시간이 경과한 후에 (B) 관통로상의 혈관을 묶는 방식이거나; 또는 2차 주형에 하나의 관통로만을 형성하고 이곳으로 들어온 동맥/정맥의 단부를 상호 문합하여 동맥을 통해 유입된 혈액이 정맥을 통해 배출되도록 하는 방식인 것을 특징으로 하는 인공 연골 구조의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 주형들이 실리콘으로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 8 항에 있어서, 단계(D)의 생체내가 복벽(피부와 복막 사이)이고, 단계(C)에서 사용되는 동맥/정맥은 동맥과 정맥이 일련으로 함께 존재하는 인체내의 혈관 부위를 채취하여 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 8 항에 있어서, 단계(D) 다음에,

(E) 제조된 인공 연골 구조의 외부를 덮고 있는 2차 주형을 제거하고 인체의다른 부위에서 채취한 피부를 그것의 외면에 이식하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
(A) 인체의 해당 연골과 동일한 형태의 외형을 가지며, 평균 공극이 50 내지 300㎛이고 친수성 및 비분해성의 다공성 구조체에 연골세포, 연골막세포 및 배양액을 함유시켜 인공 연골배양 구조체를 형성하고;

(B) 상기 인공 연골배양 구조체를 넣고 생체외(in vitro)에서 배양하여 인공 연골을 제조하고;

(C) 상기 인공 연골보다 다소 큰 형상이 내부에 각인되어 있고, 전후 또는 상하로 관통로가 형성되어 있는 주형(이하, "2차 주형"이라 함)의 내부에 상기 인공 연골을 넣고 상기 관통로를 통해 주형의 내부를 관통하여 연결되는 동맥/정맥 또는 이에 상응하는 혈행이 우수한 조직을 혈관경으로 위치시켜 인공 연골구조 전구체를 형성하고;

(D) 상기 인공 연골구조 전구체를 생체내(in vivo)에서 일정기간 배양하여 인공 연골의 외부에 연부조직이 생성된 인공 연골 구조를 제조하는 과정을 포함한다.
(A) 인체의 해당 연골과 동일한 형태의 외형을 가지며, 평균 공극이 50 내지 300㎛이고 친수성 및 비분해성의 다공성 구조체에 연골세포, 연골막세포 및 배양액을 함유시켜 인공 연골배양 구조체를 형성하고;

(B) 상기 인공 연골보다 다소 큰 형상이 내부에 각인되어 있고, 전후 또는 상하로 관통로가 형성되어 있는 주형의 내부에 상기 인공 연골배양 구조체를 넣고 상기 관통로를 통해 주형의 내부를 관통하여 연결되는 동맥/정맥 또는 이에 상응하는 혈행이 우수한 조직을 혈관경으로 위치시켜 인공 연골구조 전구체를 형성하고;

(C) 상기 인공 연골구조 전구체를 생체내(in vivo)에서 일정기간 배양하여 인공 연골의 외부에 연부조직이 생성된 인공 연골 구조를 제조하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 인공 연골 구조의 제조방법.
(A) 인체의 해당 연골과 동일한 형태의 외형을 가지며, 평균 공극이 50 내지 300㎛이고 친수성 및 비분해성의 다공성 구조체에 연골세포, 연골막세포 및 배양액을 함유시켜 인공 연골배양 구조체를 형성하고;

(B) 상기 다공성 구조체와 동일한 형상이 내부에 각인되어 있고 내부와 외부를 연결하는 다수의 미세한 관통공이 형성되어 있는 주형(이하, "1차 주형"이라 함)의 내부에 상기 인공 연골배양 구조체를 넣고 생체외(in vitro)에서 배양하여, 인공 연골을 제조하고;

(C) 상기 인공 연골과 동일한 형상의 내부주형("양각물")이 내부에 위치하고 인공 연골보다 다소 큰 형상이 내벽에 각인되어 있으며 전후 또는 상하로 관통로가 형성되어 있는 주형(이하, "2차 주형"이라 함)에, 상기 관통로를 통해 주형의 내부를 관통하여 연결되는 동맥/정맥 또는 이에 상응하는 혈행이 우수한 조직을 혈관경으로 위치시켜 인공구조 전구체를 형성하고;

(D) 상기 인공구조 전구체를 생체내(in vivo)에서 일정기간 배양하여 양각물과 2차 주형의 사이 공간에 연부조직이 생성된 인공 구조체(인공 연골이 포함되어 있지 않음)를 제조하고;

(E) 상기 (B)로부터의 인공 연골과 상기 (D)로부터의 인공 구조체를 상호 결합하여 제조하는 것을 특징으로 하는 인공 연골 구조의 제조방법.