CN114410574B - 一种软骨细胞体外三维培养体系的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种软骨细胞体外三维培养体系的制备方法，其特征在于，软骨细胞体外三维培养体系由PBS缓冲溶液、青链霉素、氯化钙、氯化钠、海藻酸钠、明胶颗粒以及合适浓度的软骨细胞组成，该三维培养体系，能够极大的提高体外细胞三维培养的成功率和效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种软骨细胞体外三维培养体系的制备方法。
背景技术
体外细胞培养是指通过模拟机体内的生理条件，将从生物机体内取出的器官、组织或细胞等，在体外进行培养，并使其继续生存、生长和繁殖的过程。体外细胞培养已经成为现代生物研究的基本技术之一，广泛应用于现代生物医学和生物科学研究的各个方面。
目前，体外细胞水平的研究很大程度上是在二维培养条件下完成的。当细胞在二维条件下生长时，由于细胞与其基质之间复杂的细胞信号无法再现，细胞逐渐丧失了其体内原有的性状，在形态、结构和功能方面都与其在体内自然生长的状态相去甚远，因此体外实验数据无法完全转化为临床试验。而水凝胶作为一类重要的高分子材料，其重要特点是能模拟细胞生长环境，能直接影响着细胞粘附、生长等行为，进行体外细胞三维培养。适宜的水凝胶培养体系，能够极大的提高体外细胞三维培养的成功率和效率。
现有专利基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法专利号为 2014107242904，公布了通过藻朊酸钠与钙离子形成离子键、明胶与甲基丙烯酸酐形成共价键使3D打印软骨具有优异的力学性能且不易破裂，其中的明胶的作用是与甲基丙烯酸酐形成共价键，解决的技术问题是使3D打印软骨具有优异的力学性能，达到的技术效果是不易破裂，因此其并不需要制备明胶微粒，本申请制备明胶颗粒，其作用是作为造孔剂。明胶微粒在37℃培养环境下溶解在培养基中从而在充满细胞的水凝胶中自发产生空腔。随后，软骨细胞不断扩增，并不断向空腔内生长与填充，最终在第35天左右形成一个新生组织与海藻酸钠水凝胶的互穿网络，明胶微粒的水解保证了后续获取的生物材料的内容物的单一性，这显著区别于基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法中明胶的作用。
目前我们按照现有参数所制备的水凝胶培养体系后续培养成功的概率极低，存在软骨细胞基质分泌少，细胞非自然脱落，死亡等问题，导致最终的生物软骨材料质地薄甚至无法成型，不能承担有效的科研或治疗功能。故而我们寻求一组新的水凝胶培养体系的构建参数，提高后续培养的成功率。
发明内容
本发明提供一种软骨细胞体外三维培养体系的制备方法，解决技术问题是1) 现有参数所制备的水凝胶培养体系后续培养成功的概率极低，存在软骨细胞基质分泌少，细胞非自然脱落，死亡等问题；2)生物软骨材料质地薄甚至无法成型，不能承担有效的科研或治疗功能。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种软骨细胞体外三维培养体系的制备方法，软骨细胞体外三维培养体系由 PBS缓冲溶液、青链霉素、氯化钙、氯化钠、海藻酸钠、明胶颗粒以及软骨细胞组成，其制备方法按照以下步骤进行：
明胶微粒悬浮液的制备：
将明胶颗粒研磨至细度为150目，得明胶微粒；
称取0.5g明胶微粒置于50ml离心管中，管盖半松，在温度为110℃条件下烘干2h后取出盖紧管盖，骤冷处理至-20℃后，倒入50ml温度为4℃含青链霉素的PBS 缓冲溶液，使用漩涡混合器在转速为2800rpm条件下处理3min，即得单个分散的明胶微粒悬浮液；
海藻酸钠溶液的制备：
将0.75g海藻酸钠加入到50ml氯化钠水溶液中，在压力为0.217Mpa，温度为 121℃条件下，保持20min，冷却至4℃，得海藻酸钠溶液；
明胶氯化钙溶液的制备：
将30g明胶加入到150ml 0.1mol/L的氯化钙水溶液中，在压力为0.217Mpa，温度为121℃条件下，保持20min，得液态明胶氯化钙溶液；
将液态明胶氯化钙溶液平铺于培养皿中，冷却凝固，得明胶氯化钙层；
将灭菌过的圆孔直径为24mm高度为4mm的聚四氟乙烯模具放置于明胶氯化钙层上，备用；
混合液b的制备：
将制备好的明胶微粒悬浮液用一次性孔径为100um的无菌滤网过滤出明胶微粒，按照0.3g-0.45g/ml的比例将明胶微粒与海藻酸钠溶液混合，得混合液a；
将活的个体分散的1代软骨细胞，按照6x106-9x106个/ml的比例将软骨细胞与混合液a混合，得混合液b；
生物软骨材料的制备：
将混合液b置于模具中，每孔0.5ml，将混合液b铺匀在模具内，4min后，每孔使用0.5ml无菌0.1mol/L的氯化钙水溶液固化海藻酸钠，4min后脱离模具，得软骨细胞凝胶；
逐一将单个软骨细胞凝胶转入到提前预加20mlCC培养基的100mm培养皿中，每个培养皿盛放一个凝胶体系，待全部转移完毕后，将培养皿转移至培养箱中，在温度为37℃，CO2浓度为5％的条件下进行体外培养35d，得培养体系；
还包括制备生物软骨材料：
将16.1755g柠檬酸三钠溶解于1000ml 0.15mol/L的氯化钠水溶液中，得到溶液c；
用溶液c洗脱培养体系，每个培养体系加入20ml c溶液，获得生物软骨材料。
含有青链霉素的PBS缓冲溶液中青链霉素和PBS缓冲溶液的体积比为5:45。
所述CC培养基是以1000ml计，DMEM10.0275g、碳酸氢钠2.775g、血清200ml、双抗10ml、维生素C液5ml、脯氨酸液4ml、非必需氨基酸液10ml、4-羟乙基哌嗪乙磺酸液10ml和丙酮酸钠液10ml，余量为纯化水。
所述模具为圆孔直径为24mm，高度为4mm的聚四氟乙烯模具。
发明具有以下有益技术效果：
1.由于软骨细胞具有粘附性并且一旦粘附会产生纤维化去分化现象，所以我们选择了非细胞粘附性水凝胶基质海藻酸钠作为培养体系的主体材料。为保证水凝胶培养体系的坚固性，我们采用氯化钙溶液进行离子交换，形成海藻酸钙。等到生物材料分泌构建完成后，使用柠檬酸钠溶液与海草酸钙发生配位作用，达到除掉海草酸盐的目的，保证了后续获取的生物材料的内容物的单一性。
2.在细胞培养过程中，营养的交换是及其重要的因素。为了给细胞提供养分传输通道以及生长空间，我们在培养体系的构造过程中选择了水溶性微粒 ---明胶微粒来作为造孔剂。明胶微粒在37℃培养环境下溶解在培养基中从而在充满细胞的水凝胶中自发产生空腔。随后，软骨细胞不断扩增，并不断向空腔内生长与填充，最终在第35天左右形成一个新生组织与海藻酸钠水凝胶的互穿网络，明胶微粒的水解保证了后续获取的生物材料的内容物的单一性。
3.已知软骨细胞存于软骨陷窝中，为模拟软骨细胞生存环境，我们的造孔剂明胶微粒与海藻酸钠溶液的比例为0.3g-0.45g/ml，大小定为150目。采用研磨明胶颗粒，后用梯度筛网筛取的方法获取合适大小的造孔剂。
4.获取合适的明胶微粒后，因细胞培养前提是无菌，且明胶微粒在培养体系中直接与细胞接触，故将明胶微粒置于110℃干热环境中2h进行干热消毒，再将明胶微粒置于含青链霉素的PBS溶液中二次杀菌。又因明胶在液体环境中融点较低，为保证明胶微粒在进入到PBS溶液过程中不融化，所以在干热消毒后，迅速将明胶微粒用干燥且密封的容器冷却，置于-20℃低温环境下冷却 30min。
5.为了保证培养体系的营养传输效率足够支持体系内细胞生长，体系内接种细胞的数量为6x106-9x106/ml。且培养体系为直径为24mm，厚度不超过2mm 的饼状形态。
附图说明
图1为凝胶体系构建
图2为凝胶体系脱模成功转移至培养皿过程
图3为凝胶体系培养2周后效果图
图4为本申请实施例1至5制备的生物软骨材料
图5为对比例1至8制备的生物软骨材料。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实施例1
步骤一，取新鲜猪后腿骨，获取软骨后消化取原代软骨细胞二维扩增培养。
步骤二，使用研磨机将猪皮材料的明胶颗粒研磨，使用标准筛网筛取足量150 目大小的明胶微粒备用。
步骤二，将筛取的明胶微粒进行110℃高温烘干2h，马上-20℃低温骤冷处理，待冷却30min后泡入含青链霉素混合液的PBS溶液中，漩涡振荡器2800rpm震荡 3min，制备成单个分散的明胶微粒悬浮液备用。
步骤三，制备0.15mol/L的氯化钠溶液，每50ml氯化钠溶液中放入0.75g海藻酸钠，使用高压灭菌锅0.217MPa，121℃20min高温高压溶解消毒，冷却至4℃备用。
步骤四，制备0.1mol/L的氯化钙溶液，取150ml该氯化钙溶液放入30g明胶颗粒后使用高压灭菌锅0.217MPa，121℃20min高温高压溶解消毒。
步骤五，将液态明胶氯化钙溶液取适量平铺培养皿中，冷却凝固，将无菌，圆孔，直径为24mm高度为4mm的聚四氟乙烯模具平放在上方，备用。
步骤六，将制备好的明胶微粒悬浮液用滤网过滤出明胶微粒，按照0.4g/ml 的比例将明胶微粒与海藻酸钠溶液充分混合，制备成混合液a。
步骤七，消化提取活的都是个体分散的1代软骨细胞，按照8x106/ml的比例将软骨细胞与混合液a充分混合，制备成混合液b。
步骤八，取500ul混合液b置于模具中，4min后使用0.15mol/L氯化钙溶液固化表面，4min后脱离模具，体系制备完成，转移至培养基中，培养箱37℃，5％CO2 体外培养。间隔更换培养基，培养约35d。此步骤设三次重复实验，每次实验凝胶体系制备数量为16个。
步骤九，制备0.15mol/L的氯化钠溶液，每1000ml氯化钠溶液溶解16.1755g 柠檬酸钠制备成溶液c，待体系内的软骨细胞经过35d培养生长后，用溶液c洗脱体系，溶解海藻酸盐，获得生物软骨材料。
2、实施例2
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.3g/ml，细胞接种量为9x106/ml 外，其他均与实施例1一致。
3、实施例3
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.45g/ml，细胞接种量为9x106/ml 外，其他均与实施例1一致。
4、实施例4
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.3g/ml，细胞接种量为6x106/ml 外，其他均与实施例1一致。
5、实施例5
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.45g/ml，细胞接种量为6x106/ml 外，其他均与实施例1一致。
下面结合实验数据进一步说明本发明的有益效果：
试验地点
山东国际生物科技园6号楼2层细胞室VII
实验目的
为探索适宜软骨细胞体外生长的培养体系的构建参数
实验方法
通过试验不同的培养体系的构建参数，最终以培养成功的个体数量占样本量的百分比变化即成功率变化，来验证构建培养体系的参数的优劣。
检测标准
使用柠檬酸钠溶液洗脱培养体系后，没有散架且镜下观察内部依旧存活软骨细胞的个体即可判定为成功个体。
实验器材
健康的分散的1代猪软骨细胞悬液、明胶微粒、明胶溶液、海藻酸钠、氯化钙溶液、PBS溶液、氯化钠柠檬酸钠溶液、聚四氟乙烯模具、110um一次性筛网、电子天平、CC培养基、不锈钢勺子、组织镊、100mm培养皿、多种量程移液枪、多规格移液枪头，50ml离心管。
实验设计
(1)对比例1
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.15g/ml，细胞接种量为1x107/ml 外，其他均与实施例1一致。
(2)对比例2
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.3g/ml，细胞接种量为 1x107/ml外，其他均与实施例1一致。
(3)对比例3
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.45g/ml，细胞接种量为 1x107/ml外，其他均与实施例1一致。
(4)对比例4
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.6g/ml，细胞接种量为 1x107/ml外，其他均与实施例1一致。
(5)对比例5
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.15g/ml，细胞接种量为 5x106/ml外，其他均与实施例1一致。
(6)对比例6
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.3g/ml，细胞接种量为 5x106/ml外，其他均与实施例1一致。
(7)对比例7
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.45/ml，细胞接种量为 5x106/ml外，其他均与实施例1一致。
(8)对比例8
除明胶微粒与海藻酸钠溶液的混合比例为0.6g/ml，细胞接种量为 5x106/ml外，其他均与实施例1一致。
实施例1至5。
实验结果统计
结论
根据实验结果，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5的成功率基本可达50％及以上，且总体较为稳定。而对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7、对比例8的成功率都比较低，且不稳定。所以本凝胶体系构建参数方法较适宜软骨细胞体外三维培养。
Claims (2)
1.一种软骨细胞体外三维培养体系的制备方法，其特征在于，软骨细胞体外三维培养体系由PBS缓冲溶液、青链霉素、氯化钙、氯化钠、海藻酸钠、明胶颗粒以及软骨细胞组成，其制备方法按照以下步骤进行：
明胶微粒悬浮液的制备：
将明胶颗粒研磨至细度为150目，得明胶微粒；
称取0.5g明胶微粒置于50ml离心管中，管盖半松，在温度为110℃条件下烘干2h后取出盖紧管盖，骤冷处理至-20℃后，倒入50ml温度为4℃含青链霉素的PBS缓冲溶液，使用漩涡混合器在转速为2800rpm条件下处理3min，即得单个分散的明胶微粒悬浮液；
海藻酸钠溶液的制备：
将0.75g海藻酸钠加入到50ml氯化钠水溶液中，在压力为0.217Mpa，温度为121℃条件下，保持20min，冷却至4℃，得海藻酸钠溶液；
明胶氯化钙溶液的制备：
将30g明胶加入到150ml 0.1mol/L的氯化钙水溶液中，在压力为0.217Mpa，温度为121℃条件下，保持20min，得液态明胶氯化钙溶液；
将液态明胶氯化钙溶液平铺于培养皿中，冷却凝固，得明胶氯化钙层；
将灭菌过的圆孔直径为24mm高度为4mm的聚四氟乙烯模具放置于明胶氯化钙层上，备用；
混合液b的制备：
将制备好的明胶微粒悬浮液用一次性孔径为100μm的无菌滤网过滤出明胶微粒，按照0.3g-0.45g/ml的比例将明胶微粒与海藻酸钠溶液混合，得混合液a；
将活的个体分散的1代软骨细胞，按照6x106-9x106个/ml的比例将软骨细胞与混合液a混合，得混合液b；
生物软骨材料的制备：
将混合液b置于模具中，每孔0.5ml，将混合液b铺匀在模具内，4min后，每孔使用0.5ml无菌0.1mol/L的氯化钙水溶液固化海藻酸钠，4min后脱离模具，得软骨细胞凝胶；
逐一将单个软骨细胞凝胶转入到提前预加20mlCC培养基的100mm培养皿中，每个培养皿盛放一个凝胶体系，待全部转移完毕后，将培养皿转移至培养箱中，在温度为37℃，CO2浓度为5%的条件下进行体外培养35d，得培养体系；
还包括制备生物软骨材料：
将16.1755g柠檬酸三钠溶解于1000ml 0.15mol/L的氯化钠水溶液中，得到溶液c；
用溶液c洗脱培养体系，每个培养体系加入20ml溶液c，获得生物软骨材料；
所述CC培养基是以1000ml计，DMEM10.0275g、碳酸氢钠2.775g、血清200ml、双抗10ml、维生素C液5ml、脯氨酸液4ml、非必需氨基酸液10ml、4-羟乙基哌嗪乙磺酸液10ml和丙酮酸钠液10ml，余量为纯化水。
2.如权利要求1所述的软骨细胞体外三维培养体系的制备方法，其特征在于，
含有青链霉素的PBS缓冲溶液中青链霉素和PBS缓冲溶液的体积比为5:45。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102344905A (zh) * | 2010-08-04 | 2012-02-08 | 北京大学 | 软骨细胞仿生培养模型及其制备方法 |
| CN102458496A (zh) * | 2009-05-15 | 2012-05-16 | 新加坡南洋理工大学 | 用于制造组织工程用支架的组合物及其生产方法 |
| CN104399119A (zh) * | 2014-12-02 | 2015-03-11 | 淮安皓运生物科技有限公司 | 基于3d生物打印制备高力学性能软骨的方法 |
| CN104582747A (zh) * | 2012-08-08 | 2015-04-29 | 南洋理工大学 | 用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织工程支架的组合物 |
| CN106350482A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-01-25 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法 |
| CN107320778A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-11-07 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种软骨脱细胞基质的制备方法 |
| CN107823714A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-03-23 | 上海大学 | 用于制备组织工程骨软骨支架的成形系统及生物3d打印成形方法 |
| CN113388659A (zh) * | 2021-07-09 | 2021-09-14 | 烟台鼎昊生物科技有限公司 | 一种评估生物材料对周边软骨细胞诱导迁移性的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10026789B4 (de) * | 2000-05-31 | 2004-09-02 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Knorpelersatz und Verfahren zu dessen Herstellung |
| KR101091084B1 (ko) * | 2008-11-07 | 2011-12-09 | 한국과학기술연구원 | 연골 손상의 치료를 위한 세포군집체-하이드로겔-고분자 지지체 복합체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 연골 손상 치료용 조성물 |
-
2022
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102458496A (zh) * | 2009-05-15 | 2012-05-16 | 新加坡南洋理工大学 | 用于制造组织工程用支架的组合物及其生产方法 |
| CN102344905A (zh) * | 2010-08-04 | 2012-02-08 | 北京大学 | 软骨细胞仿生培养模型及其制备方法 |
| CN104582747A (zh) * | 2012-08-08 | 2015-04-29 | 南洋理工大学 | 用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织工程支架的组合物 |
| CN104399119A (zh) * | 2014-12-02 | 2015-03-11 | 淮安皓运生物科技有限公司 | 基于3d生物打印制备高力学性能软骨的方法 |
| CN106350482A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-01-25 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法 |
| CN107320778A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-11-07 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种软骨脱细胞基质的制备方法 |
| CN107823714A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-03-23 | 上海大学 | 用于制备组织工程骨软骨支架的成形系统及生物3d打印成形方法 |
| CN113388659A (zh) * | 2021-07-09 | 2021-09-14 | 烟台鼎昊生物科技有限公司 | 一种评估生物材料对周边软骨细胞诱导迁移性的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A temperature-cured dissolvable gelatin microsphere-based cell carrier for chondrocyte delivery in a hydrogel scaffolding system;Wenyan Leong;Acta Biomaterialia;第9卷;摘要、实验部分小节 * |
| Creating a Living Hyaline Cartilage Graft Free from Non-Cartilaginous Constituents An Intermediate Role of a Biomaterial Scaffold;Kai Su et al.;Adv. Funct. Mater.;第22卷;摘要、材料和方法小节 * |
| Effect of microcavitary alginate hydrogel with different pore sizes on chondrocyte culture for cartilage tissue engineering;Lei Zeng et al.;Materials Science and Engineering C;第34卷;摘要、正文第二节材料和方法 * |
| 明胶-海藻酸盐复合微球与凝胶修复软骨损伤;蒋浩然等;中国组织工程研究;第26卷;第4452-4457页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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