CN112336920B - 一种多细胞生物复合支架及其制备方法和应用 - Google Patents
一种多细胞生物复合支架及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种多细胞生物复合支架及其制备方法和应用。所述支架包括形成(A‑B‑A)m的循环排列模式的下层结构和形成(C‑D‑C)n的循环排列模式的上层结构，其中A为包含Li、Mg、Si三种元素的生物活性陶瓷粉体和具有生物相容性的有机材料的下层复合材料，B为具有成骨分化潜力的干细胞，C为包含具有生物相容性的有机材料的上层有机材料，D为软骨细胞，m、n是1‑100间的正整数。所述多细胞生物复合支架能够模拟骨‑软骨复杂组织的生理结构，高效促进骨‑软骨缺损一体化修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种含多细胞的生物复合支架及其制备方法和应用，具体涉及一种结构上分层的含细胞的无机-有机材料复合生物活性支架，该复合支架可以模拟骨-软骨的复杂结构和生理环境，可以有效促进骨-软骨相关细胞定向分化，是治疗骨-软骨复杂组织缺损的潜在治疗手段。同时提供了上述复合支架的制备方法，细胞在该复合支架上黏附率高，增殖、分化活性好。属于生物技术领域。
背景技术
在日常生活中骨关节炎、运动损伤、肥胖等原因均可能引起关节骨-软骨病变乃至缺损，由于骨-软骨组织及其界面结构、生理环境的复杂性，临床上的治疗方法还不能达到完整、高效、大面积修复骨-软骨缺损的目标，目前仍然是医学上亟需解决的难题。开发出与骨-软骨复杂组织的结构及生理环境相匹配的一体化再生支架具有很大的现实意义。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种多细胞生物复合支架及其制备方法和应用。能够模拟骨-软骨复杂组织的生理结构，高效促进骨-软骨缺损一体化修复。
第一方面，本发明提供了一种上下结构分层的多细胞复合支架，所述支架包括形成(A-B-A)m的循环排列模式的下层结构和形成(C-D-C)n的循环排列模式的上层结构，其中A为包含Li、Mg、Si三种元素的生物活性陶瓷粉体和具有生物相容性的有机材料的下层复合材料，B为干细胞，C为包含具有生物相容性的有机材料的上层有机材料，D为软骨细胞，m、n是1-100间的正整数。优选地m和n的比例m:n＝3：7～7：3。
本发明所述支架模拟骨软骨组织的软骨-软骨下骨分层结构，上下层分别对应软骨和软骨下骨的组成和组织细胞进行设计。下层支架中包括Li、Mg、Si三种元素的生物活性离子的陶瓷粉体和具有良好生物相容性的有机材料以及具有成骨分化潜能的干细胞，这与人体骨组织中的组成相似，通过材料和细胞的仿生设计，分别模拟了有机无机复合的骨基质和骨髓中分布的具有成骨潜能的干细胞。所述上层支架中包括具有良好生物相容性的有机材料以及软骨细胞，这与人体软骨组织的组成相类似，仿生了有机的软骨基质和软骨基质中分布的软骨细胞。上下层结合后构成了本发明所述的复合支架，通过上层模拟软骨组织下层模拟骨组织的方法，构建了仿生模拟骨软骨组织结构和组成的多细胞生物复合支架。在仿生组成和结构的基础上，下层支架中的生物活性陶瓷粉体在降解过程中能够向生理环境中释放出Li、Mg、Si三种有益元素，有益元素传递给支架内部和周围的软骨细胞和干细胞，促进软骨细胞成熟和维持软骨表型的相关基因以及干细胞向成骨细胞分化的相关基因的表达，诱导两种细胞定向分化，同时促进软骨和骨的形成，由此达到软骨组织和骨组织同时再生的目的。所述兼具结构和功能的多细胞复合支架，在骨-软骨缺损的修复上具有非常大的应用潜力。
所述具有良好生物相容性的有机材料应具有①良好的剪切变稀性能和打印性能，通过挤出式3D打印能够制备出具有稳定、完整的形状和结构。②具有良好的强度，在体外培养至少20天内能够保持支架结构和形态。②良好的细胞相容性，能够在体外培养至少20天内支持细胞的黏附和增殖等生命活动。所述具有上述特性的有机材料为结冷胶、海藻酸钠、甲基纤维素、明胶、壳聚糖中的至少一种。更优选地，所述具有生物相容性的有机材料为包括结冷胶、海藻酸钠和甲基纤维素的复合水凝胶，所述复合水凝胶材料相对于单种水凝胶材料，能够提供更优的打印性能和材料强度，且维持了良好的细胞相容性。将所述有机材料与水混合形成水凝胶材料；所述水凝胶的质量浓度为1-50wt％，为兼顾细胞相容性，打印性能和力学性能，优选其质量浓度为1-12wt％。
所述具有成骨分化潜力的干细胞，具体包括胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞的中至少一种。
所述生物活性陶瓷粉体直径为1～100μm，优选为含Li、Mg、Si的Li2MgSi2O4陶瓷粉体。支架中Li2MgSi2O4粉体的含量为支架中结冷胶质量的1-10％。如果Li2MgSi2O4粉体含量过高，则会释放出过量的Li、Mg、Si离子，对细胞产生毒副作用。
本发明提供的生物复合支架采用3D打印方法将细胞直接在打印过程中以“材料-细胞-材料”循环的方式引入细胞，即将细胞直接逐层分布在材料内。具体为：并先制备所述(A-B-A)m循环排列模式的下层结构和所述(C-D-C)n循环排列模式的上层结构，加入的Ca2+离子会引发结冷胶的双螺旋间的聚合交联，促进分子内的交联作用、稳定双螺旋结构和加速双螺旋形成三维网络状结构，从而使支架的结构完整、稳定，最终获得所述生物复合支架；所述阳离子包括Ca2+、Mn2+、Mg2+、Sr2+的一种，由于结冷胶对Ca2+敏感，用量小且结构更稳定，优选Ca2+溶液。利用质量浓度为1％-5％的CaCl2溶液(溶剂为细胞培养基)将所述上层结构和下层结构交联。所述“材料-细胞-材料”的打印方法进一步确保了细胞上下空间都具有足够的水凝胶材料，增强了水凝胶材料对支架中细胞的保护作用，更好地完成外源细胞的植入。
第二方面，本发明提供了上述多细胞生物复合支架的制备方法。所述制备方法包括：步骤一：浆料的制备：将所述生物活性陶瓷粉体和具有生物相容性的有机材料制备成均匀混合的高粘度水溶液作为所述下层复合材料用的浆料1；将具有生物相容性的有机材料制备成均匀混合的高粘度水溶液作为所述上层有机材料用的浆料2。
步骤二：细胞悬液的制备：将干细胞分散于细胞相容性液体中制成细胞的浓度为1000-30000个/μL的细胞悬液1；将软骨细胞分散于细胞相容性液体中制成细胞的浓度为1000-30000个/μL的细胞悬液2。所述细胞相容性液体优选为干细胞培养基、低糖DMEM培养基中至少一种。由于干细胞培养基中的营养成分更加丰富，有利于干细胞活性的维持，且便于支架制备完成后体外培养，故优选为干细胞培养基。细胞悬液中细胞的浓度可为1000-30000个/μL。
步骤三：采用3D打印，包括：(1)打印浆料1，再将细胞悬液1喷涂于打印浆料1，循环打印得到具有(A-B-A)m的循环排列模式的下层结构；浆料1与细胞悬液1的比例约为5：1(2)打印浆料2，再吸取细胞悬液2喷涂于打印浆料2，循环打印形成(C-D-C)n的循环排列模式的上层结构；浆料2与细胞悬液2的比例约为5：1(3)再利用质量浓度为1％-5％的CaCl2溶液(溶剂为细胞培养基)交联支架材料，获得所述生物复合支架。
优选地，用气动式挤出针头1挤出打印浆料1，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液1喷涂于打印浆料1，循环打印得到具有(A-B-A)m的循环排列模式的下层结构(支架材料1)；用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液2喷涂于打印浆料2，循环打印形成(C-D-C)n的循环排列模式的上层结构(支架材料2)。更优选地，支架材料1的挤出压力为180-240Kpa，支架材料2的挤出压力为220-260Kpa。微型压电点样针头的喷涂频率设置为160-200Hz。整个打印过程均在室温下进行。
本公开首次使用上述方法进行多细胞生物复合支架的制备，通过细胞逐层沉积于材料之间的打印方法，实现了细胞在空间上的分布可控，进而能够控制两种细胞以上下层的模式分层分布，天然骨软骨组织中软骨和软骨下骨上下层分布的生理特点，从结构和成分上实现了仿生，同时该方法打印后细胞位于支架的表面，利于细胞吸收养分，并且有足够的空间增殖和黏附，因此支架中细胞活性好，有良好的黏附、增殖性能。通过设计生物复合支架上下分层(分别对应软骨层和软骨下骨层)的组分和结构以及相应的细胞种类，仿生骨软骨组织的软骨-软骨下骨分层结构，构建了既能模拟天然生理结构，同时具有修复功能的多细胞组织工程构建体。由于细胞装载于支架中完成外源细胞植入的同时，显著改变病变区域的细胞密度，因此克服了位于骨髓的祖细胞不能直接进入缺损，尤其是缺损的表层区域，同时，病变区域的原生细胞迁移活性低，不足以填补缺损的困难，并提供了缺损组织修复的基础。
所述有机材料溶于水可制备成高粘度的液体(水凝胶材料)，作为支架打印用浆料。作为下层复合材料用浆料时，优选将所述生物活性陶瓷粉体和具有生物相容性的有机材料一起溶解于水以制备成高粘度的液体。结冷胶是一种具有良好生物相容性的非动物性水凝胶，具有低浓度下高强度，交联温度和交联条件温和等优点，因此优选为打印的主体胶，为了改善其可打印性，向结冷胶中添加了甲基纤维素和海藻酸钠，这两种材料均具有良好生物相容性并且已在生物3D打印中具有广泛的应用。其中甲基纤维素用于增强打印胶体的硬度，海藻酸钠改善了胶体的顺滑性能，更便于挤出稳定的形状。作为一个优选方案，首先取结冷胶溶解于去离子水中，加热至65-100℃使其溶解，搅拌至完全溶解后，再取海藻酸钠、甲基纤维素、Li2MgSi2O4粉体等溶解于结冷胶的水溶液中，继续搅拌至完全溶解，得到均匀的高粘度液体。加热温度优选为70-100℃。在一优选方案中，作为下层结构用的水凝胶材料，为含有质量浓度为1-4wt％的结冷胶，质量浓度为1-3wt％海藻酸钠，质量浓度为1-5wt％甲基纤维素和质量浓度为0.001-5％的生物活性陶瓷粉体的复合水凝胶材料。在另一优选方案中，作为上层结构用的水凝胶材料，为含有质量浓度为1-4wt％的结冷胶，质量浓度为1-3wt％海藻酸钠，和质量浓度为1-5wt％甲基纤维素的复合水凝胶材料。
所述Li2MgSi2O4粉体通过溶胶凝胶法制备。将Si源、Li源、Mg源与溶剂混合，经干燥、球磨、烧结，得到Li2MgSi2O4粉体。其中所述Si源为正硅酸四乙酯；所述Li源为含Li的酸类，优选为LiNO3、LiCl的至少一种；所述Mg源为含Mg的酸类，优选为Mg(NO3)2、MgCl2的至少一种；所述溶剂为去离子水、纯水、超纯水的至少一种。其中干燥温度为100-150℃，干燥时间为10-24小时，滚动球磨机上球磨8-24小时，转速50-150rpm烧结温度为800℃-1350℃，烧结时间3-8小时。
较佳的，上述溶胶凝胶法制备Li2MgSi2O4粉体方法包括：将Si源加入部分溶剂中，得到Si源溶液。向所得Si源溶液中加入Li源和Mg源，搅拌至全溶；待成溶胶状后进行干燥、球磨和烧结，得到Li2MgSi2O4粉体。
本发明首次使用上述方法制备Li2MgSi2O4粉体，得到了纯相的Li2MgSi2O4，与通常用于制备Li2MgSi2O4粉体的固相法相比，上述方法所需的合成温度较低，合成条件更温和。同时，得到的颗粒产物纯度更高，颗粒更加均匀，导致制备出的Li2MgSi2O4陶瓷粉体具有稳定地释放离子的优异性能，进而能够同时诱导软骨细胞的成熟以及干细胞向成骨细胞的分化，从而同时促进软骨和骨组织的再生。因此，Li2MgSi2O4粉体与所述支架引入的外源细胞可以产生协同作用，并且生物墨水中的Li2MgSi2O4粉体的生物效应不仅作用于支架中引入的外源细胞，对于缺损附近的内源细胞也有相应的作用。
第三方面，本发明提供了通过上述方法制备出的Li2MgSi2O4粉体在骨软骨组织修复领域的应用。
第四方面，本发明提供了上述多细胞复合支架在骨-软骨复杂组织修复中的应用，尤其是上述多细胞复合支架在体外培养骨-软骨组织工程构建体的应用。
附图说明
图1为本发明中合成的Li2MgSi2O4粉体的X射线衍射分析；
图2为Li2MgSi2O4粉体浸提液(从左至右依次为：Blank、3.2mg/mL、1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.4mg/mL)对软骨细胞和胎盘间充质干细胞增殖活性的影响；
图3为Li2MgSi2O4粉体浸提液(从左至右依次为：Blank、3.2mg/mL、0.4mg/mL)对软骨细胞和胎盘间充质干细胞定向分化活性的影响；
图4为含有不同浓度Li2MgSi2O4粉体(0％、2％、5％、10％)的多细胞生物复合支架的光学照片；
图5为含有不同浓度Li2MgSi2O4粉体(从左至右依次为：0％、2％、5％、10％)的多细胞(胎盘间充质干细胞和软骨细胞)生物复合支架的增殖活性；
图6为含有不同浓度Li2MgSi2O4粉体(0％、2％、5％、10％)的多细胞(胎盘间充质干细胞和软骨细胞)生物复合支架的活死细胞染色荧光显微镜照片。从图中可知细胞在支架上分布均匀，紧密附着在支架上，并且随着培养时间的延长(从1天到5天)，细胞数量增多，可知细胞存活状态良好，有一定的增殖活性。
图7为含有不同浓度Li2MgSi2O4粉体(从左至右依次为：0％、2％、5％、10％)的多细胞(胎盘间充质干细胞和软骨细胞)生物复合支架的定向分化活性；
图8为含有Li2MgSi2O4粉体(从左至右依次为：0％、5％)的多细胞(骨髓间充质干细胞和软骨细胞)生物复合支架的增殖活性；
图9为含有Li2MgSi2O4粉体(从左至右依次为：0％、5％)的多细胞(骨髓间充质干细胞和软骨细胞)生物复合支架的定向分化活性；
图10为种植细胞支架和生物3D打印支架中细胞黏附和分布情况，支架培养1天和5天后的光学照片及荧光显微照片；
图11为体内实验样品的组织切片染色照片；从图11的A中可知，Co-5LMS-GAM组中新形成的软骨具有天然软骨组织相似结构并且可以覆盖缺损部位。在空白对照组中，在病变区域的表面上形成了没有软骨结构的异常薄层组织。Co-GAM组和5LMS-GAM组缺损表面没有闭合；从图11的B中可知，Co-5LMS-GAM组具有更多新形成的骨组织。首先，缺损的浅层区域形成了无缝的致密骨组织。其次，在缺损的深处形成了新的组织完全覆盖了支架的边缘。在空白组中，仅仅在缺陷表面上产生了薄薄一层新骨；Co-GAM组在缺损的浅层区域产生新骨，而在缺损的深度形成了大的空腔。无细胞的5LMS-GAM组仅在缺损的底部以及支架的边缘形成了一些新的骨骼。
具体实施方式
以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。以下各百分含量如无特别说明均指质量百分含量。
本公开涉及一种多细胞的生物复合支架，所述支架包括形成(A-B-A)m的循环排列模式的下层结构和形成(C-D-C)n的循环排列模式的上层结构，其中A为包含Li、Mg、Si三种元素的生物活性陶瓷粉体和具有生物相容性的有机材料的下层复合材料，B为间充质干细胞，C为包含具有生物相容性的有机材料的上层有机材料，D为软骨细胞，m、n是1-100间的正整数。本发明的支架可用于模拟骨-软骨复杂组织生理状态，治疗骨-软骨复杂组织缺损。所述生物复合支架通过控制材料和细胞在空间上的分布，制备出上下分层的支架，其成分和结构均模拟了骨-软骨复杂组织的生理状态。支架中下层包含的细胞为具有成骨分化潜力的干细胞，上层中细胞为软骨中不可或缺的软骨细胞。支架中的水凝胶成分可以给细胞提供支撑，便于细胞吸收养分，同时模拟了人体骨软骨中的有机成分。支架中的生物活性陶瓷粉体能够释放出Li、Mg、Si等有益元素，促进细胞定向分化，同时模拟了人体骨组织中的无机成分。从而得到与真实骨-软骨生理情况相匹配的生物复合支架，能够协同作用高效促进骨-软骨缺损再生。
上述复合支架中，支架上层细胞B可以为软骨细胞。支架下层细胞D可以为包括胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞中至少一种。上述m、n是1-100间的正整数，为兼顾打印精度和骨软骨缺陷的尺寸范围，优选为5-50，具体根据不同物种以及不同个体骨软骨组织生理尺寸，具体的骨软骨缺损深度进行相应的层数设计。其中m和n的比例优选为m:n＝3：7～7：3，更优选为m:n＝7:3。干细胞的数量是软骨细胞的2到3倍时，不仅可以加速软骨细胞的增殖活性和成熟，还可以启动干细胞的成骨作用。
上述含多细胞的复合支架中，下层复合材料A和上层有机材料C均形成水凝胶材料。作为上层结构用的水凝胶材料为结冷胶、海藻酸钠、甲基纤维素、明胶、壳聚糖中的至少一种与水混合形成的水凝胶材料。作为下层结构用的水凝胶材料，其中还包括包含Li、Mg、Si三种元素的生物活性陶瓷粉体，例如Li2MgSi2O4陶瓷粉体。在本发明一实施方式中，作为上层结构用的水凝胶材料优选为含有一定浓度结冷胶，海藻酸钠、甲基纤维素的复合水凝胶。复合水凝胶的质量浓度为1-12％。作为下层结构用的水凝胶材料，为含有一定浓度的结冷胶，海藻酸钠，甲基纤维素和质量浓度为0.001-5％的生物活性陶瓷粉体的复合水凝胶材料，其中结冷胶，海藻酸钠，甲基纤维素的复合水凝胶的质量浓度为1-12％，生物活性陶瓷粉体的质量浓度为0.001-5％。即包括陶瓷粉体的复合水凝胶质量浓度可以为1.001-17％。
其中所述结冷胶的浓度1-4wt％，如果结冷胶浓度过高，会使得水凝胶过硬，不适合细胞存活，如果浓度过低则难以交联成为稳定的水凝胶。优选地，所述结冷胶浓度为2.8wt％。
另所述海藻酸钠的浓度为1-3wt％，如果海藻酸钠浓度过高，会使得水凝胶过硬，不适合细胞存活，如果浓度过低会使得支架易碎。优选地，所述海藻酸钠的浓度为1.4wt％。
所述甲基纤维素的浓度为1-5wt％，如果甲基纤维素浓度过高，会使得水凝胶粘度过高无法挤出，如果浓度过低则粘度过低导致支架形状无法维持。优选地，所述甲基纤维素的浓度为2.8wt％。
在本发明的一实施方式中，支架中包含的生物活性陶瓷优选为Li2MgSi2O4粉体，采用溶胶凝胶法制备上述Li2MgSi2O4陶瓷粉体。将Si源、Li源、Mg源与溶剂混合，经干燥、球磨、烧结，得到Li2MgSi2O4粉体。其中Si源为正硅酸四乙酯(TEOS)；其中Li源可为LiNO3、LiCl等；Mg源可Mg(NO3)2、MgCl2等。溶剂可为去离子水、纯水、超纯水等。
以下示例性说明本发明所述Li2MgSi2O4陶瓷粉体的制备方法。
通过溶胶凝胶法制备，具体制备方法如下：将正硅酸四乙酯溶解在一定量的去离子水(H2O)中，加入浓度为2M的HNO3促其水解，待溶液澄清后分别加入一定量的LiNO3和Mg(NO3)2并搅拌至完全溶解；其中正硅酸四乙酯(TEOS)与LiNO3和Mg(NO3)2的物质的量比TEOS：LiNO3：Mg(NO3)2＝1：2：1，正硅酸四乙酯(TEOS)与去离子水(H2O)和HNO3的物质的量比为TEOS：H2O：HNO3＝1：8：0.08；搅拌后将得到的溶胶在120℃的烘箱中烘干10-24小时至干凝胶的状态，放入球磨罐以50-150rpm的转速进行球磨8-24小时，球磨后将得到的粉体烧结即得到Li2MgSi2O4粉体(烧结温度为800℃-1350℃，烧结时间3-8小时)。
在一些实施方式中，支架中Li2MgSi2O4粉体的含量为支架中结冷胶质量的1-10％，如果Li2MgSi2O4粉体含量过高，则会释放出过量的Li、Mg、Si离子，对细胞产生毒副作用。
上述生物复合支架中，两种细胞的浓度为1000-30000个/μL，这样可以良好的维持细胞的增殖和分化状态；如果细胞浓度过高，则会因为细胞密度过高而难以获得足够的黏附空间和生存必需的充足的养分，导致大部分细胞从支架上脱落，难以长时间维持其活性；如果细胞浓度过低，则会因为细胞密度低而难以维持其增殖活性，难以获得细胞分布均匀的支架。优选地，细胞的浓度为10000个/μL。
以下出示本发明一实施方式中多细胞生物复合支架的具体制备方法：
通过3D打印方法制备，包括以下步骤：首先取结冷胶溶解于去离子水中，密封65-100℃加热搅拌30-60分钟至完全溶解，停止加热，待温度降至70-80℃取海藻酸钠、甲基纤维素、Li2MgSi2O4粉体溶解于结冷胶的水溶液中，继续搅拌至完全溶解，得到均匀的高粘度液体，降至室温得到打印浆料1，即支架下层的打印浆料。其次取结冷胶溶解于去离子水中，密封于65-100℃热搅拌30-60分钟至完全溶解，停止加热，待温度降至70-80℃左右取海藻酸钠和甲基纤维素溶解于结冷胶的水溶液中，继续搅拌至完全溶解，得到均匀的高粘度液体，降至室温得到打印浆料2，即支架上层的打印浆料。
一些实施方式中，结冷胶的浓度为1-4wt％，优选为2.8wt％；所述海藻酸钠的浓度为1-3wt％，优选为1.4wt％；所述甲基纤维素的浓度为1-5wt％，优选为2.8wt％；Li2MgSi2O4粉体的浓度为结冷胶质量的1-10％，在其优选浓度下，所述复合水凝胶材料的力学性能及细胞相容性更好。注意在本发明中其他未作专门说明的地方，Li2MgSi2O4粉体的浓度均指其相对于结冷胶的质量比。
1.细胞准备：准备胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞中至少一种，将其分散于细胞相容性液体中制成细胞悬液1，所述细胞相容性液体为干细胞培养基、低糖DMEM培养基中至少一种，由于干细胞培养基中的营养成分更加丰富，有利于干细胞活性的维持，故优选为干细胞培养基。细胞悬液中细胞的浓度可为1000-30000个/μL。准备软骨细胞，将其分散于细胞相容性液体中制成细胞悬液2，所述细胞相容性液体为干细胞培养基、低糖DMEM培养基中至少一种，为便于支架制备完成后体外培养，故优选为干细胞培养基。细胞悬液中细胞的浓度可为1000-30000个/μL。
2.打印过程：采用三通道同轴打印方法，在6孔培养板中进行打印。步骤1：用气动式挤出针头1挤出打印浆料1，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液1喷涂于打印浆料1。循环上述步骤1得到支架下层的(A-B-A)m结构。步骤2：用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液2喷涂于打印浆料2。循环上述步骤2得到支架上层的(C-D-C)n结构。打印结束后利用一定浓度的Ca2+离子交联，获得含多细胞的生物复合支架。一些实施方式中，支架材料1的挤出压力为180-240Kpa，支架材料2的挤出压力为220-260Kpa。微型压电点样针头的喷涂频率设置为180Hz。整个打印过程均在室温下进行。
在本公开中，制备的多细胞生物复合支架，细胞具有良好的黏附、增殖、分化性能，能够有效的模拟骨-软骨复杂组织生理状态，具有高效治疗骨-软骨缺损的潜力。
本公开还研究了所述的多细胞生物复合支架的体外培养方法。在本发明一实施方式中，按照上述制备方法将多细胞生物复合支架在六孔培养板中制备完成后，向放置支架的孔中加入2mL干细胞培养基，盖上培养板盖子，将培养板放置于37℃，含有5％CO2的细胞培养箱中进行培养，打印后2小时吸去培养液，加入新培养基继续培养，在之后的培养过程中每隔1天都进行一次换液操作。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
Li2MgSi2O4生物活性陶瓷粉体的制备：
向72mL去离子水中加入104.66g正硅酸四乙酯并搅拌，向其中加入20ml的2M HNO3使正硅酸四乙酯水解，持续搅拌至放热，溶液变澄清；
向其中加入68.95g LiNO3，搅拌至完全溶解后再加入128.205g Mg(NO3)2，继续搅拌至完全溶解；
形成溶胶后将其放入60℃烘箱，待成凝胶后转移至120℃烘干至完全成干凝胶；
将干凝胶迅速球磨8小时，而后过40目筛；
将过筛后的干凝胶在1000℃烧结3小时，烧结后过200目筛即得到Li2MgSi2O4生物活性陶瓷粉体。
图1为按照上述方法制备出的Li2MgSi2O4粉体的X射线衍射分析结果，可以看到制备出了纯相的Li2MgSi2O4。
实施例2
Li2MgSi2O4生物活性陶瓷粉体对软骨细胞和胎盘间充质干细胞增殖、分化活性的影响：为探究Li2MgSi2O4生物活性陶瓷粉体对于骨-软骨修复的生物活性，按照ISO 10993-5标准制备Li2MgSi2O4浸提液，具体为将质量体积比200mg/mL的Li2MgSi2O4粉体和干细胞专用培养基混合，密封置于37℃恒温摇床中浸提24h，4000rpm离心10min，取其上清液得到200mg/mL Li2MgSi2O4浸提原液并用干细胞专用培养基进行梯度稀释，得到0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL四个梯度浓度的Li2MgSi2O4浸提液。
向不同梯度的Li2MgSi2O4浸提液(0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL)中按照比例添加胎牛血清、青霉素和链霉素得到不同梯度的Li2MgSi2O4浸提培养液。将软骨细胞和胎盘间充质干细胞按照1000个/孔的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后将培养基更换为Li2MgSi2O4浸提培养液继续培养，在预先设定的1.3.5天通过CCK-8(Cell Counting Kit)试剂盒的方法，在450nm下测量所有样品的吸光度来评估细胞的增殖情况。
图2显示，一定浓度的Li2MgSi2O4浸提培养液在培养第5天显示出支持和促进软骨细胞(图2a)和胎盘间充质干细胞(图2b)增殖的作用。证明Li2MgSi2O4陶瓷粉具有良好促进细胞增殖的生物活性。
为探究Li2MgSi2O4促进两种细胞定向分化的作用，向不同梯度的Li2MgSi2O4浸提液(0.4mg/mL、3.2mg/mL)中按照比例添加胎牛血清、青霉素和链霉素得到不同梯度的Li2MgSi2O4浸提培养液，将软骨细胞和胎盘间充质干细胞按照12000个/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后将培养基更换为Li2MgSi2O4浸提培养液继续培养，培养5天后用Trizol法提取每组细胞的总RNA，并用ReverTra Ace-α试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green荧光实时定量PCR的方法探究其基因表达情况。
图3a为软骨细胞成熟和维持软骨表型相关基因Col-II、Sox-9、Aggracan的表达情况，可以看出Li2MgSi2O4浸提培养液对软骨细胞的相关基因的表达具有显著促进作用。图3b为胎盘间充质干细胞成骨相关基因Col-I、BMP-2、Runx-2、OCN的表达情况，可以看出Li2MgSi2O4浸提培养液对间充质干细胞的成骨相关基因的表达也具有显著促进作用。由此可以说明Li2MgSi2O4陶瓷具有良好的促进两种细胞定向分化的作用，在骨-软骨修复领域具有良好的应用前景。
实施例3
梯度无机粉体含量的多细胞生物复合支架的制备：
制备含有不用浓度Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1：称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml灭菌水，密封置于90℃水浴锅中加热搅拌30min至结冷胶完全溶解。关闭水浴锅加热开关使溶液缓慢降温。称取0.7g甲基纤维素和0.4g海藻酸钠以及Li2MgSi2O4粉体(根据其含量梯度，质量分别为0.07g、0.035g、0.014g)，待结冷胶溶液降温至80℃以下时将3种粉体加入，继续搅拌至粉体完全溶解，得到均匀高粘度溶液。待溶液冷却至室温即得到半固态打印浆料1。
制备不含Li2MgSi2O4粉体的打印浆料2：称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml灭菌水，密封置于90℃水浴锅中加热搅拌30min至结冷胶完全溶解。关闭水浴锅加热开关使溶液缓慢降温。称取0.7g甲基纤维素和0.4g海藻酸钠，待结冷胶溶液降温至80℃以下时将2种粉体加入，继续搅拌至粉体完全溶解，得到均匀高粘度溶液。待溶液冷却至室温即得到半固态打印浆料2。
准备两种细胞的细胞悬液——细胞悬液1和细胞悬液2：将胎盘间充质干细胞以10000个/μL的浓度分散于干细胞培养基并混合均匀，得到细胞悬液1。将软骨细胞以10000个/μL的浓度分散于干细胞培养基并混合均匀，得到细胞悬液2。
采用三通道同轴打印方法，在6孔培养板中进行打印：步骤一：用气动式挤出针头1挤出含有梯度浓度Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1，挤出压力设置为180-220Kpa，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液1喷涂于打印浆料1，喷涂频率设置为180Hz。循环上述步骤一7次得到支架下层的(A-B-A)7结构。步骤二：用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液2喷涂于打印浆料2。循环上述步骤二3次得到支架上层的(C-D-C)3结构。对于不含Li2MgSi2O4粉体的支架，则采用两通道进行打印，步骤一和步骤二中均由挤出针头2挤出不含Li2MgSi2O4粉体的打印浆料，其余步骤和参数不变。打印结束后向支架上加入1％的CaCl2溶液交联，获得含多细胞的生物复合支架。根据支架下层Li2MgSi2O4粉体的浓度(0％、2％、5％、10％)不同，制备所得的支架依次命名为Co-GAM、Co-2LMS、Co-5LMS、Co-10LMS。
图4是打印后支架的照片，可以看出，下层含有不同浓度Li2MgSi2O4粉体的多细胞复合支架具有相似且良好的结构。
实施例4
含胎盘间充质干细胞和软骨细胞的生物复合支架的制备及其活性表征：
实施例4制备含有不同浓度Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1、制备不含Li2MgSi2O4粉体的打印浆料2、准备两种细胞的细胞悬液——细胞悬液1和细胞悬液2以及3.采用三通道同轴打印方法，在6孔培养板中进行打印的各步骤与实施例3一致。制备所得的支架依次命名为Co-GAM、Co-2LMS、Co-5LMS、Co-10LMS。向孔板中每孔添加2mL干细胞培养基，将孔板移入37℃，含5％CO2的敷箱中进行培养。
使用CCk-8试剂盒测定支架在1、3、5、7天的增殖活性。为便于测试，打印后将每个支架平均切成4份，每1/4个支架作为一个平行样置于12孔板进行培养。在10％CCK-8的培养液中37℃孵育3.5小时，并在450nm下通过酶标仪测试培养基的吸光度以量化细胞数量。根据图5的数据显示，各组支架均表现出了良好的增殖活性，在培养期间细胞数量稳定增长。
同时，活细胞/死细胞染色法被用于表征支架上的细胞活性。具体为，支架打印后培养1天和5天后，用含0.2％Calcein-AM工作液和0.3％PI工作液的培养基在37℃孵育支架15分钟。在488nm的激发波长下观察被绿色荧光标记的活细胞，并在552nm的激发波长下观察被红色荧光标记的死细胞。图6为488nm和552nm通道叠加后的支架活死细胞染色图。
同时，RT-PCR方法被用于表征支架上细胞定向分化的情况。具体为，支架打印后培养4天，用Trizol法提取每组细胞的总RNA，并用ReverTra Ace-α试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green荧光实时定量PCR的方法探究两种细胞的基因表达情况。图7a为支架上软骨细胞成熟和维持软骨表型相关基因表达的情况，可以看出，含有Li2MgSi2O4陶瓷粉体的支架对于软骨细胞相关基因的表达具有促进作用，其中下层掺入5％Li2MgSi2O4粉体的支架促进作用最为明显。图7b为支架上胎盘间充质干细胞的成骨相关基因表达的情况，可以看出掺入5％Li2MgSi2O4粉体的支架对干细胞的成骨活性有显著的促进作用。综合以上结果表明，含有5％Li2MgSi2O4粉体的多细胞(软骨细胞和胎盘间充质干细胞)复合支架具有良好的定向分化的活性，可以分析得出其对于骨-软骨一体化修复具有有效的促进功能，根据此结果，Li2MgSi2O4粉体的掺入量可优选为结冷胶质量的5％。
上述结果表明通过此方法制备出含胎盘间充质干细胞和软骨细胞的生物复合支架具有良好的活性和细胞定向分化的功能性，在骨-软骨修复领域具有很大的应用前景。
实施例5
含骨髓间充质干细胞和软骨细胞的生物复合支架的制备及其活性表征：
制备含有5％Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1：称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml灭菌水，密封置于90℃水浴锅中加热搅拌30min至结冷胶完全溶解。关闭水浴锅加热开关使溶液缓慢降温。称取0.7g甲基纤维素和0.4g海藻酸钠以及0.035g Li2MgSi2O4粉体，待结冷胶溶液降温至80℃以下时将3种粉体加入，继续搅拌至粉体完全溶解，得到均匀高粘度溶液。待溶液冷却至室温即得到半固态含有不同浓度Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1。
制备不含Li2MgSi2O4粉体的打印浆料2：称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml灭菌水，密封置于90℃水浴锅中加热搅拌30min至结冷胶完全溶解。关闭水浴锅加热开关使溶液缓慢降温。称取0.7g甲基纤维素和0.4g海藻酸钠，待结冷胶溶液降温至80℃以下时将2种粉体加入，继续搅拌至粉体完全溶解，得到均匀高粘度溶液。待溶液冷却至室温即得到半固态打印浆料2。
准备两种细胞的细胞悬液——含骨髓间充质干细胞的细胞悬液1和含软骨细胞的细胞悬液2：将骨髓间充质干细胞以10000个/μL的浓度分散于干细胞培养基并混合均匀，得到细胞悬液1。将软骨细胞以10000个/μL的浓度分散于干细胞培养基并混合均匀，得到细胞悬液2。
采用三通道同轴打印方法，在6孔培养板中进行打印：步骤一：用气动式挤出针头1挤出含有5％Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1，挤出压力设置为200Kpa，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液1喷涂于打印浆料1，喷涂频率设置为180Hz。循环上述步骤一7次得到支架下层的(A-B-A)7结构。步骤二：用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，挤出压力设置为240Kpa，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液2喷涂于打印浆料2，喷涂频率设置为180Hz。循环上述步骤二3次得到支架上层的(C-D-C)3结构。对于不含Li2MgSi2O4粉体的支架，则采用两通道进行打印，步骤一和步骤二中均由挤出针头2挤出不含Li2MgSi2O4粉体的打印浆料，其余步骤和参数不变。打印结束后在室温下加入1％的CaCl2溶液交联，获得含多细胞的生物复合支架。根据支架下层Li2MgSi2O4粉体的浓度(0％、5％)不同，制备所得的支架依次命名为Co-GAM、Co-5LMS。向孔板中每孔添加2mL干细胞培养基，将孔板移入37℃，含5％CO2的敷箱中进行培养。
使用CCk-8试剂盒测定支架在1、3、5、7天的增殖活性。为便于测试，打印后将每个支架平均切成4份，每1/4个支架作为一个平行样置于12孔板进行培养。在10％CCK-8的培养液中37℃孵育3.5小时，并在450nm下通过酶标仪测试培养基的吸光度以量化细胞数量。根据图8的数据显示，两组支架均表现出了良好的增殖活性，在培养期间细胞数量稳定增长。
同时，RT-PCR方法被用于表征支架上细胞定向分化的情况。具体为，支架打印后培养4天，用Trizol法提取每组细胞的总RNA，并用ReverTra Ace-α试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green荧光实时定量PCR的方法探究两种细胞的基因表达情况。图9a为支架上软骨细胞的软骨相关基因表达的情况，可以看出，含有Li2MgSi2O4陶瓷粉体的支架对于软骨细胞相关基因的表达具有促进作用。图9b为支架上骨髓间充质干细胞的成骨相关基因表达的情况，可以看出掺入5％Li2MgSi2O4粉体的支架对干细胞的成骨活性有显著的促进作用。综合以上结果表明，含有5％Li2MgSi2O4粉体的多细胞(软骨细胞和骨髓间充质干细胞)复合支架具有良好的定向分化的活性，表明通过此方法制备出含骨髓间充质干细胞和软骨细胞的生物复合支架也具有良好的活性和功能，在骨-软骨修复领域具有很大的应用前景。
实施例6
多细胞复合支架在体外培养组织工程构建体的应用：
制备含5％Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1：称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml灭菌水，密封置于90℃水浴锅中加热搅拌30min至结冷胶完全溶解。关闭水浴锅加热开关使溶液缓慢降温。称取0.7g甲基纤维素和0.4g海藻酸钠以及0.035g Li2MgSi2O4粉体，待结冷胶溶液降温至80℃以下时将3种粉体加入，继续搅拌至粉体完全溶解，得到均匀高粘度溶液。待溶液冷却至室温即得到半固态含有不同浓度Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1。
制备不含Li2MgSi2O4粉体的打印浆料2：称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml灭菌水，密封置于90℃水浴锅中加热搅拌30min至结冷胶完全溶解。关闭水浴锅加热开关使溶液缓慢降温。称取0.7g甲基纤维素和0.4g海藻酸钠，待结冷胶溶液降温至80℃以下时将两种粉体加入，继续搅拌至粉体完全溶解，得到均匀高粘度溶液。待溶液冷却至室温即得到半固态打印浆料2。
准备两种细胞的细胞悬液——含胎盘间充质干细胞的细胞悬液1和含软骨细胞的细胞悬液2：将胎盘间充质干细胞以10000个/μL的浓度分散于干细胞培养基并混合均匀，得到细胞悬液1。将软骨细胞以10000个/μL的浓度分散于干细胞培养基并混合均匀，得到细胞悬液2。
采用三通道同轴打印方法，在6孔培养板中进行打印：步骤一：用气动式挤出针头1挤出含有5％Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1，挤出压力设置为200Kpa，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液1喷涂于打印浆料1，喷涂频率设置为180Hz。循环上述步骤一7次得到支架下层的(A-B-A)7结构。步骤二：用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，挤出压力设置为240Kpa，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液2喷涂于打印浆料2，喷涂频率设置为180Hz，。循环上述步骤二3次得到支架上层的(C-D-C)3结构。打印结束后在室温下加入1％的CaCl2溶液交联，获得含多细胞的生物复合支架。所得支架命名为Co-5LMS-P。
制备手动接种细胞的支架作为对照组：步骤一：用气动式挤出针头1挤出含有5％Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1，挤出压力设置为200Kpa，循环上述步骤7次得到支架下层。步骤二：用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，挤出压力设置为240Kpa，循环上述步骤二3次得到支架上层。打印结束后在室温下加入1％的CaCl2溶液交联，获得无细胞的生物复合支架。再取相同浓度和数量的细胞悬液1和细胞悬液2，依次用移液枪接种于打印出的无细胞支架。所得支架命名为Co-5LMS-S。
以上两组支架在打印后均加入2mL干细胞培养基，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱进行培养，培养1天和5天后，将支架用浓度0.2％的钙黄绿素溶液和0.3％的PI溶液进行染色，通过荧光显微镜观察支架(图10)，其中，488nm激发光用于检测钙黄绿素染色的活细胞(绿色)。显微镜的明场相用于观察支架结构，与细胞分布对应观察。
可以看出，Co-5LMS-P支架和Co-5LMS-S支架具有相似的结构，但通过手动种植的方法构建的支架几乎没有细胞黏附，仅存的部分黏附的细胞增殖活性也较差，在培养5天后与第一天相比细胞数量没有明显差别。而通过打印方法制备的多细胞支架细胞黏附良好，分布均匀，培养5天后，支架中细胞数量明显变多。证明这种制备方式具有很大的优势，是一种十分具有潜力的制备组织工程构建体的方法。
实施例7
多细胞复合支架在体内修复骨软骨缺损的应用：使用重2.5-3kg的新西兰大白兔建立膝关节骨软骨缺损模型。动物样品被分为四组：1.空白对照(Blank)2.无细胞的双层支架(5LMS-GAM)3.含两种细胞的无LMS陶瓷粉支架(Co-GAM)4.双层多细胞复合支架(Co-5LMS-GAM)。
制备含5％Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1：称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml灭菌水，密封置于90℃水浴锅中加热搅拌30min至结冷胶完全溶解。关闭水浴锅加热开关使溶液缓慢降温。称取0.7g甲基纤维素和0.4g海藻酸钠以及0.035g Li2MgSi2O4粉体，待结冷胶溶液降温至80℃以下时将3种粉体加入，继续搅拌至粉体完全溶解，得到均匀高粘度溶液。待溶液冷却至室温即得到半固态含有不同浓度Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1。
制备不含Li2MgSi2O4粉体的打印浆料2：称取0.7g结冷胶粉体于广口瓶中，加入25ml灭菌水，密封置于90℃水浴锅中加热搅拌30min至结冷胶完全溶解。关闭水浴锅加热开关使溶液缓慢降温。称取0.7g甲基纤维素和0.4g海藻酸钠，待结冷胶溶液降温至80℃以下时将2种粉体加入，继续搅拌至粉体完全溶解，得到均匀高粘度溶液。待溶液冷却至室温即得到半固态打印浆料2。
准备两种细胞的细胞悬液——含骨髓间充质干细胞的细胞悬液1和含软骨细胞的细胞悬液2：将骨髓间充质干细胞以10000个/μL的浓度分散于干细胞培养基并混合均匀，得到细胞悬液1。将软骨细胞以10000个/μL的浓度分散于干细胞培养基并混合均匀，得到细胞悬液2。
双层细胞共培养复合支架(Co-5LMS-GAM)的打印支架直径设置为5mm，高度设置为6mm。步骤一：用气动式挤出针头1挤出含有5％Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1，挤出压力设置为200Kpa，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液1喷涂于打印浆料1，喷涂频率设置为180Hz。循环上述步骤一7次得到支架下层的(A-B-A)7结构。步骤二：用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，挤出压力设置为240Kpa，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液2喷涂于打印浆料2，喷涂频率设置为180Hz，。循环上述步骤二3次得到支架上层的(C-D-C)3结构。打印结束后在室温下加入1％的CaCl2溶液交联，获得含多细胞的生物复合支架。
无细胞双层支架(5LMS-GAM)的打印：支架直径设置为5mm，高度设置为6mm。步骤一：用气动式挤出针头1挤出含有5％Li2MgSi2O4粉体的打印浆料1，挤出压力设置为200Kpa。循环上述步骤一7次得到支架下层。步骤二：用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，挤出压力设置为240Kpa。循环上述步骤二3次得到支架上层。打印结束后在室温下加入1％的CaCl2溶液交联，获得无细胞的双层支架。
含两种细胞的无LMS支架(Co-GAM)的打印：支架直径设置为5mm，高度设置为6mm。步骤一：用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，挤出压力设置为240Kpa，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液1喷涂于打印浆料2，喷涂频率设置为180Hz。循环上述步骤一7次得到支架下层的(C-B-C)7结构。步骤二：用气动式挤出针头2挤出打印浆料2，挤出压力设置为240Kpa，再通过微型压电点样针头吸取细胞悬液2喷涂于打印浆料2，喷涂频率设置为180Hz。循环上述步骤二3次得到支架上层的(C-D-C)3结构。打印结束后在室温下加入1％的CaCl2溶液交联。
兔膝关节骨软骨缺损的建立：
以1％戊巴比妥钠(35mg/kg)而静脉注射麻醉后，取健侧膝关节内侧切口，延切口逐层进入关节囊，使髌骨半脱位至外侧。用生物打孔器在股骨滑车面处作直径5mm，深6mm的骨软骨缺损。Blank组打孔后不做处理。其他三组分别植入打印的5LMS-GAM、Co-GAM、Co-5LMS-GAM支架。植入体内12周后取股骨关节并评估修复性能。
使用组织切片染色评估体内骨软骨组织的修复效果。用番红O-固绿染色法评估软骨和骨软骨界面的修复情况。Van Gieson(VG)染色评估骨组织修复情况。具体为，将所有样品脱水，包埋在甲基丙烯酸甲酯中，并使用硬组织切片机切成200μm的切片。将切片研磨和抛光后，将切片用番红O-固绿工作液染色，分别检查软骨下骨和软骨。其中番红O将软骨组织染成红色，而固绿将骨组织染成绿色，以便清晰的观察其界面和整合情况。此外，将亚甲基蓝和苦味酸-品红用于VG染色，以观察新形成的骨骼。其中细胞核被染成深蓝色，骨组织被染成红色，类骨质被染成紫红色。
图11A显示了各组被番红O-固绿染色的切片。Co-5LMS-GAM组中新形成的软骨具有天然软骨组织相似结构并且可以覆盖缺损部位。新形成的软骨组织能够与原本的软骨组织以及新形成的软骨下骨紧密结合。但是，其他组的软骨修复表现并不理想。在空白对照组中，由于极差的自我修复能力，在病变区域的表面上形成了没有软骨结构的异常薄层组织。此外，Co-GAM组和5LMS-GAM组缺损表面没有闭合。尽管载有细胞的Co-GAM组在缺损表面上也形成了具有典型软骨结构的新生软骨，比无细胞的5LMS-GAM组显示出了更好的软骨修复效果，但仍未能覆盖缺损区域，表明他们软骨再生的失败。图11B种展示了各组被VG染色的切片以评估软骨下骨再生情况。Co-5LMS-GAM组具有更多新形成的骨组织。首先，缺损的浅层区域形成了无缝的致密骨组织。其次，在缺损的深处形成了新的组织完全覆盖了支架的边缘。但是，在Blank组中，仅仅在缺陷表面上产生了薄薄一层新骨，从而导致缺损深度处的巨大空腔。与Blank组相似，Co-GAM组主要在缺损的浅层区域产生新骨，而在缺损的深度形成了大的空腔。无细胞的5LMS-GAM组在缺损的浅层区域表现出最差的修复行为，但是，在缺损的底部以及支架的边缘形成了一些新的骨骼。总之，这些结果表明，支架中印刷的外源细胞和生物墨水中的LMS生物陶瓷对缺陷的再生具有不同的促进作用，并表现出协同效应，展现了多细胞生物复合支架用于一体化修复骨软骨缺损的理想潜力。
Claims (9)
1.一种含多种细胞的生物复合支架，其特征在于，所述支架包括形成(A-B-A)m的循环排列模式的下层结构和形成(C-D-C)n的循环排列模式的上层结构，其中，A为包含Li、Mg、Si三种元素的Li2MgSi2O4生物活性陶瓷粉体和具有生物相容性的有机材料的下层复合材料，B为具有成骨分化潜力的干细胞，C为包含具有生物相容性的有机材料的上层有机材料，D为软骨细胞，m、n是1-100间的正整数；所述有机材料包括结冷胶、海藻酸钠、甲基纤维素、明胶、壳聚糖中的至少一种；
制备所述含多种细胞的生物复合支架时，先制备所述(A-B-A)m循环排列模式的下层结构和所述(C-D-C)n循环排列模式的上层结构，再利用含阳离子溶液使上层和下层交联形成为结构完整、稳定的支架，所述阳离子包括Ca2+、Mn2+、Mg2+、Sr2+中的一种。
2.根据权利要求1所述生物复合支架，其特征在于，所述具有成骨分化潜力的干细胞包括胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞中的至少一种。
3.根据权利1所述的生物复合支架，其特征在于，所述生物活性陶瓷粉体直径为1~100μm。
4.根据权利要求1所述的生物复合支架，其特征在于，m和n的比例m:n=3：7~7：3。
5.一种制备权利要求1-4中任一项所述的生物复合支架的方法，其特征在于，包括：
浆料的制备：将所述生物活性陶瓷粉体和具有生物相容性的有机材料制备成均匀混合的水溶液作为所述下层复合材料用的浆料1；将具有生物相容性的有机材料制备成均匀混合的水溶液作为所述上层有机材料用的浆料2；
细胞悬液的制备：将具有成骨分化潜力的干细胞分散于细胞相容性液体中制成细胞的浓度为1000-30000个/μL的细胞悬液1；将软骨细胞分散于细胞相容性液体中制成细胞的浓度为1000-30000个/μL的细胞悬液2；
采用3D打印，包括：（1）打印浆料1，再将细胞悬液1喷涂于打印浆料1，循环打印得到具有(A-B-A)m的循环排列模式的下层结构，浆料1和细胞悬液1的打印体积比例为5：1~10：1；（2）打印浆料2，再吸取细胞悬液2喷涂于打印浆料2，循环打印形成(C-D-C)n的循环排列模式的上层结构；浆料2和细胞悬液2的打印体积比例为5：1~10：1；（3）利用一定浓度的阳离子溶液交联，获得所述生物复合支架。
6.根据权利要求5所述生物复合支架的制备方法，其特征在于，通过将Si源、Li源、Mg源与溶剂混合，经干燥、球磨、烧结后得到所述Li2MgSi2O4生物活性陶瓷粉体；所述Si源为正硅酸四乙酯；所述Li源为含Li的酸类；所述Mg源为含Mg的酸类；所述溶剂为去离子水。
7.根据权利要求6所述生物复合支架的制备方法，其特征在于，所述Li源为LiNO3、LiCl的至少一种；所述Mg源为Mg(NO3)2、MgCl2的至少一种。
8.根据权利要求5所述的生物复合支架的制备方法，其特征在于，所述浆料1为含有质量浓度为1-4%的结冷胶、质量浓度为1-3%的海藻酸钠、质量浓度为1-5%的甲基纤维素和质量浓度为0.001-5%的生物活性陶瓷粉体的复合水凝胶1。
9.根据权利要求5所述的生物复合支架的制备方法，其特征在于，所述浆料2为含有质量浓度为1-4%的结冷胶、质量浓度为1-3%的海藻酸钠和质量浓度为1-5%的甲基纤维素的复合水凝胶2。
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