CN110665063A - 3d生物打印墨水及其制备方法、组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

3d生物打印墨水及其制备方法、组织工程支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种3D生物打印墨水及其制备方法、组织工程支架及其制备方法，含有明胶、海藻酸钠、纳米级硅酸镁锂、去离子水以及人骨髓间充质干细胞五种成分：首先，依次将无菌明胶、海藻酸钠溶于无菌去离子水，配成浓度为140～200mg/mL明胶和20～60mg/mL海藻酸钠的混合预聚物溶液；同时，将无菌硅酸镁锂溶于无菌去离子水配成20～60mg/mL的硅酸镁锂胶体；然后，将两种凝胶等体积混合，制得一种可3D生物打印的纳米复合水凝胶；最后，将预先培养的人骨髓间充质干细胞与纳米复合水凝胶混合均匀，制得终细胞浓度为3×106/mL的纳米复合生物墨水，将该生物墨水作为原料采用挤压式3D生物打印机打印制得具有自身成骨诱导能力的功能化、生物仿生组织工程骨支架，具有潜在临床应用价值。

Description

3D生物打印墨水及其制备方法、组织工程支架及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种3D生物打印墨水及其制备方法、组织工程支架及其制备方法。
背景技术
先天畸形、创伤、外科手术切除等原因导致的骨缺失，通常需要采用特定的移植物来恢复其结构和功能。这一直是骨科领域的一项世界性难题，至今仍未得到有效解决。目前，临床上多采用自体或异体移植物，但这两种方法均存在诸如供区骨量有限、较多的供区并发症以及免疫排斥反应、潜在的疾病传播风险等问题。合成的生物材料作为一种骨替代物近年来引起了广泛关注，但由于缺乏自然骨组织的生物仿生结构而很难与移植部位的骨组织整合到一起，进而导致了诸如骨不连等严重并发症；另外，其生物相容性、生物活性、生物可降解性等方面都存有各自缺点，限制了其临床应用，难以达到满意的效果。
组织工程学的提出、建立和发展是对外科领域中组织、器官缺损和功能障碍传统治疗方法和模式的一次革命。利用组织工程学方法和手段修复组织缺损是全新的治疗模式，具有广阔的应用前景，是目前医学界研究的热点问题；其最终目的就在于提供理想的、来源广泛、应用简便、疗效确定的生物活性骨组织，骨组织工程学是其中极为重要的具有代表意义的领域，对于从根本上提高各种临床常见原因造成的骨缺损等疾病的治疗效果而言，骨组织工程突破了以往的治疗模式，提供了全新的思路和方法。
由于骨缺损形状多呈现不规则形状，体外预成型植骨材料难以适应骨缺损形状，与正常骨质间形成间隔，从而影响组织工程骨支架传导作用，3D打印技术的出现可以很好的解决个体化治疗这一难题。目前，已可以利用该技术生产三维支架，然后将细胞种植到支架表面。但该传统的3D打印方法存在诸如细胞分布不均一、细胞粘附不良等问题。近年来，3D生物打印技术因其能够将负载的细胞和生物活性材料直接混合制备成“生物墨水”来进行精准的打印，从而制备出具有可控模式和生物仿生功能的结构而受到越来越多人的青睐。其有如下几方面的优势：1)消除了传统3D打印后细胞种植的步骤，且使细胞分布更加均匀；2)能够精确控制结构中的孔隙度、孔隙大小和孔隙关联性；3)能够加速生物材料和细胞的沉积，诱导诸如血管网的形成，提高支架与周围自体骨之间的整合；4)该技术还可以在术中直接打印所需要的填充支架，使原位打印成为一种可能，这在术前无法确定骨缺损大小和形状的情况下尤其重要。
传统的骨组织工程支架材料通常会复合生长因子或者药物以提高植入支架材料骨修复效果，这不仅增加了生产过程的复杂性，也提高了其制备成本。现有的研究结果表明，我们所采用的硅酸镁锂在体外培养过程中即具有成骨诱导能力而无需额外添加相应的成骨诱导因子，采用此种生物材料元素诱导成骨的策略可以大大降低组织工程骨制备的复杂性及成本，提高临床应用的安全性。
因此，研制能够通过骨缺损患者的影像学资料，经由3D生物打印机打印出功能性、生物仿生性、可生物降解的组织工程骨结构具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种3D生物打印墨水及其制备方法、具有生物活性的组织工程支架及其制备方法，3D生物打印墨水及其制备方法可通过构建纳米复合水凝胶的策略提高生物墨水的强度，进而提高其在Z轴方向上的打印高度(可打印高度超过1cm)，以便打印出具有临床解剖结构大小的组织工程骨结构；本发明提供的具有生物活性的组织工程支架可在无成骨诱导因子的情况下，成功诱导其封装的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，大大降低了治疗成本。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种3D生物打印墨水，包括纳米复合水凝胶以及人骨髓间充质干细胞，其中复合水凝胶包括明胶、海藻酸钠、纳米级硅酸镁锂以及去离子水；纳米复合水凝胶中明胶终浓度为70mg/mL～100mg/mL，海藻酸钠终浓度为10mg/mL～30mg/mL，硅酸镁锂终浓度为10mg/mL～30mg/mL；其中，人骨髓间充质干细胞悬液与纳米复合水凝胶的体积比为1:400。
纳米级硅酸镁锂为直径25～30nm，厚度为0.9～1.0nm的纳米薄片。
一种3D生物打印墨水的制备方法，包括以下步骤：
S1，称取原料
按照设定量称量明胶颗粒、海藻酸钠粉末和硅酸镁锂粉末，对明胶颗粒、海藻酸钠粉末和硅酸镁锂粉末杀菌和消毒；
S2，配制原料
将S1所得明胶颗粒用无菌去离子水溶解，得到明胶溶液，向明胶溶液中加入海藻酸钠粉末，溶解后得到明胶-海藻酸钠的混合预聚物溶液，将硅酸镁锂粉末溶于无菌去离子水中，得到硅酸镁锂胶体；
S3，混合
将S2所得明胶-海藻酸钠的混合预聚物溶液和硅酸镁锂胶体等体积混合均匀，得到纳米复合水凝胶，将预先培养的人骨髓间充质干细胞悬液与所述复合水凝胶按体积比1:400混合均匀，得到细胞浓度为3×106/mL的3D生物打印墨水。
S1中，采用环氧乙烷消毒。
S2中，将明胶颗粒加入无菌去离子水中，在水浴加热以及磁力搅拌器条件下溶解，水浴的温度和溶解海藻酸钠粉末时的温度均为40℃；S3在混合明胶-海藻酸钠的混合预聚物溶液与硅酸镁锂胶体时在37℃下进行搅拌混合。
S2中，溶解明胶和海藻酸钠粉末时均在无菌条件下进行磁力搅拌。
S2所得明胶-海藻酸钠混合预聚物溶液中明胶的浓度为140mg/mL～200mg/mL，海藻酸钠的浓度为20mg/mL～60mg/mL，硅酸镁锂胶体的浓度为20mg/mL～60mg/mL。
一种组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤10，将需要制备的组织工程支架三维模型文件载入3D生物打印机；
步骤11，取纳米复合生物墨水注入3D生物打印机中并开启3D生物打印机，打印完成后得到组织工程支架；
步骤12，采用CaCl2溶液对组织工程支架进行交联；
步骤13，将交联后的组织工程支架用α-MEM细胞培养基漂洗得到负载人骨髓间充质干细胞具有生物活性的组织工程支架。
步骤12中，CaCl2溶液的浓度为20mg/mL，交联时间为5-10分钟。
采用本发明所述组织工程支架的制备方法制备的组织工程支架。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：本发明具有生物活性的组织工程骨支架的配方以及制备方法，添加了带正负电荷的纳米级硅酸镁锂，可与带正电荷的明胶和带负电荷的海藻酸钠预聚物反应，显著提高了该生物墨水的强度，能够提高其在Z轴方向上所能进行3D打印的高度(可打印高度超过1cm)；硅酸镁锂降解后产生的无毒降解产物如Mg2+、Li+、SiO2-等具有明显的诱导人骨髓间充质干细胞成骨、成血管的特性，制备出具有自发性成骨诱导作用的3D生物打印明胶-海藻酸钠-硅酸镁锂-人骨髓间充质干细胞组织工程骨支架；按照本发明所述组织工程支架材料制备的3D生物打印明胶-海藻酸钠-硅酸镁锂-人骨髓间充质干细胞组织工程骨支架具有显著的促成骨作用，且在不含任何成骨诱导因子的普通培养基中即可诱导所封装的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，最终起到促进骨愈合的作用，能大大降低治疗成本，减轻病患痛苦，为解决骨缺损患者个体化治疗这一难题提供一个方向。
附图说明
图1是采用本发明所述实施例制备组织工程支架的流程图；
图2是本发明中所使用的纳米级硅酸镁锂冷冻透射电镜图像；
图3是本发明中纳米复合水凝胶成分表征的XRD结果；
图4是本发明中纳米复合水凝胶行3D打印后扫描电镜表征图像；
图5是本发明中纳米复合水凝胶内部微孔分布的扫描电镜图像；
图6a是SD大鼠颅骨8mm临界骨缺损模型空白对照组3个月的显微CT三维重建图像；
图6b是采用本发明所述具有生物活性的组织工程骨支架修复SD大鼠颅骨8mm临界骨缺损3个月的显微CT三维重建图像；
图7a是SD大鼠颅骨8mm临界骨缺损模型空白对照组3个月的硬组织VG染色切片；
图7b是采用本发明所述具有生物活性的组织工程骨支架修复SD大鼠颅骨8mm临界骨缺损3个月的硬组织VG染色切片。
具体实施方式
在下文中，阐述了多种特定细节，以便提供对构成所描述实施例基础的概念的透彻理解。然而，对本领域的技术人员来说，很显然所描述的实施例可以在没有这些特定细节中的一些或者全部的情况下来实践。在其他情况下，没有具体描述众所周知的处理步骤。
一种3D生物打印墨水，包括纳米复合水凝胶以及人骨髓间充质干细胞，其中复合水凝胶包括明胶、海藻酸钠、纳米级硅酸镁锂以及去离子水；纳米复合水凝胶中明胶终浓度为70mg/mL～100mg/mL，海藻酸钠终浓度为10mg/mL～30mg/mL，硅酸镁锂终浓度为10mg/mL～30mg/mL；其中，人骨髓间充质干细胞悬液与纳米复合水凝胶的体积比为1:400。
人骨髓间充质干细胞：HMSC-bm ScienCell#7500
纳米级硅酸镁锂为直径25～30nm，厚度为0.9～1.0nm的纳米薄片。
一种3D生物打印墨水的制备方法，包括以下步骤：
S1，称取原料
按照设定量称量明胶颗粒、海藻酸钠粉末和硅酸镁锂粉末，对明胶颗粒、海藻酸钠粉末和硅酸镁锂粉末杀菌和消毒；
S2，配制原料
将S1所得明胶颗粒用无菌去离子水溶解，得到明胶溶液，向明胶溶液中加入海藻酸钠粉末，溶解后得到明胶-海藻酸钠的混合预聚物溶液，将硅酸镁锂粉末溶于无菌去离子水中，得到硅酸镁锂胶体；
S3，混合
将S2所得明胶-海藻酸钠的混合预聚物溶液和硅酸镁锂胶体等体积混合均匀，得到纳米复合水凝胶，将预先培养的人骨髓间充质干细胞悬液与所述复合水凝胶按体积比1:400混合均匀，得到细胞浓度为3×106/mL的生物墨水，即组织工程支架材料。
S1中，采用环氧乙烷消毒。
S2中，将明胶颗粒加入无菌去离子水中，在水浴加热以及磁力搅拌器条件下溶解，水浴的温度和溶解海藻酸钠粉末时的温度均为40℃；S3在混合明胶-海藻酸钠的混合预聚物溶液与硅酸镁锂胶体时在37℃下进行搅拌混合。
S2中，溶解明胶和海藻酸钠粉末时均在无菌条件下进行磁力搅拌。
S2所得明胶-海藻酸钠混合预聚物溶液中明胶的浓度为140mg/mL～200mg/mL，海藻酸钠的浓度为20mg/mL～60mg/mL，硅酸镁锂胶体的浓度为20mg/mL～60mg/mL。
一种组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤10，将需要制备的组织工程支架三维模型文件载入3D生物打印机；
步骤11，取纳米复合生物墨水注入3D生物打印机中并开启3D生物打印机，打印完成后得到组织工程支架；
步骤12，采用CaCl2溶液对组织工程支架进行交联；海藻酸钠的基团能与钙离子络合而起到温和的物理交联作用。其中，G单元与钙离子络合交联，形成蛋盒结构，G基团堆积而形成交联网络结构；
步骤13，将交联后的组织工程支架用α-MEM细胞培养基漂洗得到负载人骨髓间充质干细胞具有生物活性的组织组织工程支架。
步骤12中，CaCl2溶液的浓度为20mg/mL，交联时间为5-10分钟。
实施例1
本实施例列举的具有生物活性的组织工程骨支架的配方，包括纳米复合水凝胶以及人骨髓间充质干细胞，其中纳米复合水凝胶包括明胶、海藻酸钠、纳米级硅酸镁锂以及去离子水；纳米复合水凝胶包括明胶70mg/mL～100mg/mL、海藻酸钠10mg/mL～30mg/mL、硅酸镁锂10mg/mL～30mg/mL，其中，人骨髓间充质干细胞悬液与纳米复合水凝胶的体积比为1:400。
如图1所示，作为本发明一个优选实施例，具体按以下步骤进行：
步骤1、配制原料：首先，将预先称量好的明胶颗粒、海藻酸钠粉末和硅酸镁锂粉末置于无菌的离心管中，环氧乙烷消毒，备用；将明胶颗粒加入盛有相应体积无菌去离子水的烧杯中，置于水浴加热的磁力搅拌器上，温度设定为40℃，搅拌1小时，得到明胶溶液；然后，直接往上述明胶溶液中加入海藻酸钠粉末，温度设定为40℃，继续搅拌2小时，最后，获得明胶-海藻酸钠预聚物溶液；同时，将硅酸镁锂溶于无菌去离子水中，室温下搅拌1小时，配成硅酸镁锂胶体；其中，海藻酸钠采用低粘度海藻酸钠；
步骤2、混合：将步骤1中获得的明胶-海藻酸钠预聚物溶液和硅酸镁锂胶体等体积混合，置于水浴加热的磁力搅拌器上，温度设定为37℃，搅拌1小时，制得一种可3D生物打印的纳米复合水凝胶，所述复合水凝胶中各组分的终浓度分别为：明胶100mg/mL；海藻酸钠10mg/mL；硅酸镁锂20mg/mL；然后，将预先培养的人骨髓间充质干细胞悬液与所述纳米复合水凝胶按体积比1:400混合，用移液器枪头轻轻将细胞搅拌均匀，最终制得终细胞浓度为3×106/mL的纳米复合生物墨水；
步骤3、载入：将患者骨缺损模型三维文件载入挤压式3D生物打印机；
步骤4、打印：将步骤2中制得的纳米复合生物墨水注入3D生物打印机的无菌料管中，开启3D生物打印机，制备功能化和生物仿生性组织工程骨支架；所述组织工程骨支架自身具有成骨诱导能力；
步骤5、交联：采用无菌去离子水配制的浓度为20mg/mL的CaCl2溶液将步骤4得到的组织工程骨支架进行交联，时间控制在5-10分钟；
步骤6、洗涤：将步骤5交联后得到的3D生物打印组织工程骨支架采用α-MEM细胞培养基漂洗三次，得到负载人骨髓间充质干细胞具有生物活性的组织工程骨支架；
将步骤6中制备的具有生物活性的组织工程骨支架植入到相应的骨缺损处，促进骨修复愈合，达到个体化治疗的效果。
步骤2中，明胶-海藻酸钠混合预聚物溶液与硅酸镁锂胶体按照1:1的体积比进行混合，形成具有可打印性的明胶-海藻酸钠-硅酸镁锂纳米复合水凝胶；混合步骤中，将预先培养的人骨髓间充质干细胞悬液与所述纳米复合水凝胶按体积比1:400混合，用移液器枪头轻轻将细胞搅拌均匀，最终制得终细胞浓度为3×106/mL的纳米复合生物墨水，即3D生物打印组织工程骨支架材料；
采用本发明所述方法制备负载SD大鼠骨髓间充质干细胞具有生物活性的组织工程骨支架(支架为直径为8mm，厚度1.5mm网格状薄片)，植入SD大鼠颅骨的8mm临界骨缺损处；同时将未放支架的颅骨8mm临界骨缺损大鼠作为空白对照组；在植入3个月后分别取出带有部分周围骨组织的样本，放入4％多聚甲醛固定3天后，行显微CT扫描，并重建出三维模型，如图6a和图6b所示，图6a为空白对照组，图6b表示具有生物活性的组织工程骨支架组，由图可见，具有生物活性的组织工程骨支架能够很好的促进缺损处的骨愈合，而未放置支架的空白对照组几乎无新生骨形成。然后，将样本进行脱水和树脂包埋处理，行硬组织切片，切片厚度为15μm，最后对切片进行VG染色，染色结果如图7a和图7b所示，图7a为空白对照组，图7b表示具有生物活性的组织工程骨支架组，由图可见，具有生物活性的组织工程骨支架组中，支架材料已几乎降解完全，缺损处被新生的骨组织填充，且已形成完整的骨桥，而未放置支架的空白对照组的缺损处则被纤维组织填充，无新生骨组织。表明本发明所制备的具有生物活性的组织工程骨支架内部诱导出了新生的骨组织，证明了按照本发明所述配方以及方法制备的具有生物活性的组织工程骨支架有良好的骨诱导性，适合应用于骨缺损修复。
按着本发明所述方法和步骤，还针对不同组织工程支架材料组分实施更多的实施例，各步骤中按照表1中各组分的不同配比，采用优选实施例中相同的步骤进行实施。
表1本发明其他实施例各步骤中的参数
Figure BDA0002250518930000091
明胶颗粒为胶原经部分降解处理后的产物，极安全的高分子有机物，具有良好的生物相容性，可为细胞的粘附、迁移提供位点；
海藻酸钠粉末来源于藻类的有机化合物，极安全的高分子有机物，价格低，且具有良好的生物相容性，易于交联；
硅酸镁锂粉末(Laponite XLG)为一种人工合成的纳米级表面带正负电荷的生物材料，降解产物硅酸根、锂离子以及镁离子等具有良好的成骨诱导能力，且无毒；另外，硅酸镁锂粉末具有增稠特性，可与带正电荷的明胶和带负电荷的海藻酸钠预聚物反应，提高纳米复合水凝胶的强度。
采用去离子水作为融合剂。
人骨髓间充质干细胞为一种具有多向分化潜能的干细胞，能分化为成骨细胞，是组织工程骨中最常用的一类种子细胞。
图2为本发明中所使用的纳米级硅酸镁锂冷冻透射电镜图像；冷冻-透射电镜下的纳米级硅酸镁锂，直径在25-30nm之间；本发明中纳米复合水凝胶成分表征的XRD结果如图3所示，Gel+Alg代表明胶-海藻酸钠水凝胶，Nanocomposite代表实施例1中所配制的明胶-海藻酸钠-硅酸镁锂纳米复合水凝胶，Nanosilicates代表硅酸镁锂粉末，XRD结果表明我们实施例1中配制的纳米复合水凝胶的成分为硅酸镁锂、明胶和海藻酸钠；如图4所示，本发明中纳米复合水凝胶行3D打印后扫描电镜表征图像；采用实施例1中所配制的明胶-海藻酸钠-硅酸镁锂纳米复合水凝胶3D打印获得网格状支架进行扫描电镜观察，结果表明本发明所采用的配方可成功打印出结构良好、层间粘合度高、精确度高以及具有高保真性的组织工程骨支架；图5本发明中纳米复合水凝胶内部微孔分布的扫描电镜图像，扫描电镜下观察实施例1中所配制的明胶-海藻酸钠-硅酸镁锂纳米复合水凝胶的内部结构，结果表明本发明所配制的纳米复合水凝胶不仅具有良好的可打印性，而且其内部具有适当的微米级孔分布，这有利于负载其中的细胞的生存、迁移和分化，能够起到在无成骨诱导因子的情况下，诱导负载的人骨髓间充质干细胞成骨分化的效果。
目前，因所选择的生物材料自身性质的问题，大多数的生物墨水存在强度低的缺陷，限制了3D生物打印在Z轴方向上的打印高度，进而影响了具有临床解剖结构大小的组织或器官的生物制造。本发明具有生物活性的组织工程骨支架的配方以及制备方法，添加了带正负电荷的纳米级硅酸镁锂，显著提高了该生物墨水的强度，提高了其在Z轴方向上所能进行3D打印的高度(可打印高度超过1cm)；能够根据临床患者的骨缺损尺寸、形状和内部空隙等参数，精确定制出理化特征、外观结构及负载细胞所处微环境仿生的可生物降解组织工程骨；另外，硅酸镁锂降解后产生的无毒降解产物如Mg2+、Li+、SiO32-等具有明显的诱导人骨髓间充质干细胞成骨、成血管的特性，因而制备出了具有自发性成骨诱导作用的3D生物打印明胶-海藻酸钠-硅酸镁锂-人骨髓间充质干细胞组织工程骨支架。经研究发现按照此成分比例构建的3D生物打印明胶-海藻酸钠-硅酸镁锂-人骨髓间充质干细胞组织工程骨支架具有显著的促成骨作用，且在不含任何成骨诱导因子的普通培养基中即可诱导所封装的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，最终起到促进骨愈合的作用，本发明可以很好的解决骨缺损患者个体化治疗这一难题。
本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种3D生物打印墨水，其特征在于，包括纳米复合水凝胶以及人骨髓间充质干细胞，其中纳米复合水凝胶包括明胶、海藻酸钠、纳米级硅酸镁锂以及去离子水；纳米复合水凝胶中明胶终浓度为70mg/mL～100mg/mL，海藻酸钠终浓度为10mg/mL～30mg/mL，硅酸镁锂终浓度为10mg/mL～30mg/mL；其中，人骨髓间充质干细胞悬液与纳米复合水凝胶的体积比为1:400。
2.根据权利要求1所述的3D生物打印墨水，其特征在于，纳米复合水凝胶中的硅酸镁锂为直径25～30nm，厚度为0.9～1.0nm的纳米薄片。
3.一种3D生物打印墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，称取原料
按照设定量称量明胶颗粒、海藻酸钠粉末和硅酸镁锂粉末，对明胶颗粒、海藻酸钠粉末和硅酸镁锂粉末杀菌和消毒；
S2，配制原料
将S1所得明胶颗粒用无菌去离子水溶解，得到明胶溶液，向明胶溶液中加入海藻酸钠粉末，溶解后得到明胶-海藻酸钠的混合预聚物溶液，将硅酸镁锂粉末溶于无菌去离子水中，得到硅酸镁锂胶体；
S3，混合
将S2所得明胶-海藻酸钠的混合预聚物溶液和硅酸镁锂胶体等体积混合均匀，得到纳米复合水凝胶，将预先培养的人骨髓间充质干细胞悬液与所述复合水凝胶按体积比1:400混合均匀，得到细胞浓度为3×106/mL的3D生物打印墨水。
4.根据权利要求3所述的3D生物打印墨水的制备方法，其特征在于，S1中，采用环氧乙烷消毒。
5.根据权利要求3所述的3D生物打印墨水的制备方法，其特征在于，S2中，将明胶颗粒加入无菌去离子水中，在水浴加热以及磁力搅拌器条件下溶解，水浴的温度和溶解海藻酸钠粉末时的温度均为40℃；S3在混合明胶-海藻酸钠的混合预聚物溶液与硅酸镁锂胶体时在37℃下进行搅拌混合。
6.根据权利要求3所述的3D生物打印墨水的制备方法，其特征在于，S2中，溶解明胶和海藻酸钠粉末时均在无菌条件下进行磁力搅拌。
7.根据权利要求3所述的3D生物打印墨水的制备方法，其特征在于，S2所得明胶-海藻酸钠混合预聚物溶液中明胶的浓度为140mg/mL～200mg/mL，海藻酸钠的浓度为20mg/mL～60mg/mL，硅酸镁锂胶体的浓度为20mg/mL～60mg/mL。
8.一种组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤10，将需要制备的组织工程支架三维模型文件载入3D生物打印机；
步骤11，取纳米复合生物墨水注入3D生物打印机中并开启3D生物打印机，打印完成后得到组织工程支架；
步骤12，采用CaCl2溶液对组织工程支架进行交联；
步骤13，将交联后的组织工程支架用α-MEM细胞培养基漂洗得到负载人骨髓间充质干细胞具有生物活性的组织工程支架。
9.根据权利要求8所述的组织工程支架的制备方法，其特征在于步骤12中，CaCl2溶液的浓度为20mg/mL，交联时间为5-10分钟。
10.采用权利要求8或9所述组织工程支架的制备方法制备的组织工程支架。
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111320767A (zh) * 2020-03-04 2020-06-23 西南交通大学 一种用于3d生物打印的可触变性水凝胶的制备方法
CN111388765A (zh) * 2020-04-03 2020-07-10 北京臻溪谷医学研究中心（有限合伙） 一种治疗动脉瘤和血管畸形的高分子材料与干细胞复合支架及其制法
CN111808474A (zh) * 2020-07-31 2020-10-23 陕西科技大学 一种基于纳米纤维素的生物3d打印墨水的制备方法
CN112336920A (zh) * 2020-11-03 2021-02-09 中国科学院上海硅酸盐研究所 一种多细胞生物复合支架及其制备方法和应用
CN112494711A (zh) * 2020-11-23 2021-03-16 杭州英健生物科技有限公司 高粘附性双组分自交联消化道粘膜保护胶及其应用
CN113181419A (zh) * 2021-03-23 2021-07-30 中山大学 一种由3d生物打印技术制备的新型复合水凝胶支架及其应用
CN113559327A (zh) * 2021-07-22 2021-10-29 上海市第六人民医院 一种3d打印尿道修复重建的支架及其制备方法
CN114474708A (zh) * 2021-09-16 2022-05-13 兰州大学 一种用于压电促愈合型伤口敷料制备的3d打印技术
CN114887116A (zh) * 2022-03-23 2022-08-12 广州医科大学附属口腔医院（广州医科大学羊城医院） 一种负载间充质干细胞外基质的3d打印骨缺损修复支架及其制备方法
CN115040694A (zh) * 2022-05-25 2022-09-13 中国科学院上海硅酸盐研究所 具有血管和神经双功能的骨再生生物复合支架及其制备方法和应用
CN115054729A (zh) * 2022-07-07 2022-09-16 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 一种双网络水凝胶及其制备方法和应用
CN115137876A (zh) * 2022-06-27 2022-10-04 点云生物(杭州)有限公司 一种锂皂石生物陶瓷人工骨及制备方法
WO2022252526A1 (zh) * 2021-05-31 2022-12-08 大连理工大学 一种无机非金属纳米颗粒组装的水凝胶材料及其在增材制造技术中的应用
CN115607729A (zh) * 2022-11-01 2023-01-17 吉林大学 一种生物墨水、3d打印水凝胶支架及制备方法和应用
CN115845150A (zh) * 2021-09-24 2023-03-28 中国科学院理化技术研究所 一种活性粘土/磷酸镁/明胶复合多孔支架及其制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020039875A1 (en) * 2000-10-02 2002-04-04 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Polishing agent for processing semiconductor, dispersant used therefor and process for preparing semiconductor device using above polishing agent for processing semiconductor
CN102718928A (zh) * 2012-07-04 2012-10-10 天津工业大学 一种细胞片层智能脱附水凝胶及其应用
CN105796478A (zh) * 2016-03-22 2016-07-27 王华楠 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用
CN106633121A (zh) * 2016-11-15 2017-05-10 深圳先进技术研究院 用于三维打印的粘土基水凝胶基质及其制备方法和应用
CN107029294A (zh) * 2017-03-21 2017-08-11 湖南未名三胞转化医学科技有限公司 一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物和三维生物打印人体骨组织的方法
WO2018169965A1 (en) * 2017-03-13 2018-09-20 The Texas A&M University System Nanocomposite ionic-covalent entanglement reinforcement mechanism and hydrogel
CN110368524A (zh) * 2019-07-30 2019-10-25 东南大学 一种生物活性骨修复支架及其制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020039875A1 (en) * 2000-10-02 2002-04-04 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Polishing agent for processing semiconductor, dispersant used therefor and process for preparing semiconductor device using above polishing agent for processing semiconductor
CN102718928A (zh) * 2012-07-04 2012-10-10 天津工业大学 一种细胞片层智能脱附水凝胶及其应用
CN105796478A (zh) * 2016-03-22 2016-07-27 王华楠 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用
CN109662941A (zh) * 2016-03-22 2019-04-23 深圳华诺生物科技有限公司 由纳米胶体颗粒组装的、高强度、自修复、可注射复合胶体凝胶材料及其制备方法和应用
CN106633121A (zh) * 2016-11-15 2017-05-10 深圳先进技术研究院 用于三维打印的粘土基水凝胶基质及其制备方法和应用
WO2018169965A1 (en) * 2017-03-13 2018-09-20 The Texas A&M University System Nanocomposite ionic-covalent entanglement reinforcement mechanism and hydrogel
CN107029294A (zh) * 2017-03-21 2017-08-11 湖南未名三胞转化医学科技有限公司 一种用于三维生物打印的人脂肪间充质干细胞共混物和三维生物打印人体骨组织的方法
CN110368524A (zh) * 2019-07-30 2019-10-25 东南大学 一种生物活性骨修复支架及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JANET R. XAVIER等: "Bioactive Nanoengineered Hydrogels for Bone Tissue Engineering: A Growth-Factor-Free Approach", 《ACS NANO》 *
LIUBIN等: "3D-bioprinted functional and biomimetic hydrogel scaffolds incorporated with nanosilicates to promote bone healing in rat calvarial defect model", 《MATERIALS SCIENCE & ENGINEERING C》 *
YIFEI JIN等: "Self-Supporting Nanoclay as Internal Scaffold Material for Direct Printing of Soft Hydrogel Composite Structures in Air", 《ACS APPL. MATER. INTERFACES》 *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111320767A (zh) * 2020-03-04 2020-06-23 西南交通大学 一种用于3d生物打印的可触变性水凝胶的制备方法
CN111320767B (zh) * 2020-03-04 2023-01-10 西南交通大学 一种用于3d生物打印的可触变性水凝胶的制备方法
CN111388765A (zh) * 2020-04-03 2020-07-10 北京臻溪谷医学研究中心（有限合伙） 一种治疗动脉瘤和血管畸形的高分子材料与干细胞复合支架及其制法
CN111808474A (zh) * 2020-07-31 2020-10-23 陕西科技大学 一种基于纳米纤维素的生物3d打印墨水的制备方法
CN112336920B (zh) * 2020-11-03 2021-12-07 中国科学院上海硅酸盐研究所 一种多细胞生物复合支架及其制备方法和应用
CN112336920A (zh) * 2020-11-03 2021-02-09 中国科学院上海硅酸盐研究所 一种多细胞生物复合支架及其制备方法和应用
CN112494711A (zh) * 2020-11-23 2021-03-16 杭州英健生物科技有限公司 高粘附性双组分自交联消化道粘膜保护胶及其应用
CN113181419A (zh) * 2021-03-23 2021-07-30 中山大学 一种由3d生物打印技术制备的新型复合水凝胶支架及其应用
WO2022252526A1 (zh) * 2021-05-31 2022-12-08 大连理工大学 一种无机非金属纳米颗粒组装的水凝胶材料及其在增材制造技术中的应用
CN113559327B (zh) * 2021-07-22 2022-09-06 上海市第六人民医院 一种3d打印尿道修复重建的支架及其制备方法
CN113559327A (zh) * 2021-07-22 2021-10-29 上海市第六人民医院 一种3d打印尿道修复重建的支架及其制备方法
CN114474708A (zh) * 2021-09-16 2022-05-13 兰州大学 一种用于压电促愈合型伤口敷料制备的3d打印技术
CN115845150A (zh) * 2021-09-24 2023-03-28 中国科学院理化技术研究所 一种活性粘土/磷酸镁/明胶复合多孔支架及其制备方法和应用
CN114887116A (zh) * 2022-03-23 2022-08-12 广州医科大学附属口腔医院（广州医科大学羊城医院） 一种负载间充质干细胞外基质的3d打印骨缺损修复支架及其制备方法
CN114887116B (zh) * 2022-03-23 2023-04-07 广州医科大学附属口腔医院（广州医科大学羊城医院） 一种负载间充质干细胞外基质的3d打印骨缺损修复支架及其制备方法
WO2023179544A1 (zh) * 2022-03-23 2023-09-28 广州医科大学附属口腔医院（广州医科大学羊城医院） 一种负载间充质干细胞外基质的3d打印骨缺损修复支架及其制备方法
CN115040694A (zh) * 2022-05-25 2022-09-13 中国科学院上海硅酸盐研究所 具有血管和神经双功能的骨再生生物复合支架及其制备方法和应用
CN115040694B (zh) * 2022-05-25 2023-06-02 中国科学院上海硅酸盐研究所 具有血管和神经双功能的骨再生生物复合支架及其制备方法和应用
CN115137876A (zh) * 2022-06-27 2022-10-04 点云生物(杭州)有限公司 一种锂皂石生物陶瓷人工骨及制备方法
CN115054729A (zh) * 2022-07-07 2022-09-16 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 一种双网络水凝胶及其制备方法和应用
CN115607729A (zh) * 2022-11-01 2023-01-17 吉林大学 一种生物墨水、3d打印水凝胶支架及制备方法和应用
CN115607729B (zh) * 2022-11-01 2023-11-17 吉林大学 一种生物墨水、3d打印水凝胶支架及制备方法和应用

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