CN109395175B - 引导组织再生膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种引导组织再生膜及其制备方法，该引导组织再生膜，包括基质为壳聚糖的致密层和基质为壳聚糖与钙磷盐复合物的疏松多孔层。采用三电极体系，先在阴极附近沉积致密的壳聚糖水凝胶，后再其上沉积疏松的壳聚糖与钙磷盐水凝胶得到双层水凝胶，再经干燥得到本发明的引导组织再生膜。本发明引导组织再生膜的疏松多孔层具备促成骨活性，可为细胞生长提供更多的结构空间及增殖和分化的良好微环境促进骨细胞的融合，同时致密层可对纤维组织起屏蔽作用。本发明提供的制备方法简单快捷，过程绿色，对膜结构可控。

Description

引导组织再生膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种引导组织再生膜及快速制备具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的方法。
背景技术
引导组织再生术(Guide Tissue Regeneration,GTR)是临床上牙周组织常规的修复手段，原理是根据各类组织细胞迁移速度不同的特点，制造出骨组织优势生长的环境，即：将屏障膜置于软组织和骨缺损之间建立生物屏障，制造一个相对封闭的组织环境，阻止干扰骨形成且迁移速度较快的纤维结缔组织细胞和上皮细胞进入骨缺损区，允许有潜在生长能力、迁移速度较慢的前体成骨细胞优先进入骨缺损区，优势生长，同时保护血凝块，减缓覆盖组织的压力，实现缺损区的骨修复性再生。GTR技术的成败取决于屏障膜材料的性能，屏障膜在引导骨再生中起着至关重要的作用。其中，可吸收膜由于优异的生物相容性及无需二次手术取出等优点，在临床上已广泛应用。
壳聚糖是自然界中少见的一种带正电荷的碱性多糖，是甲壳素的脱乙酰化产物，壳聚糖具有良好的生物降解性和生物相容性，而且无毒性、无刺激性，是已被FDA批准使用的可降解医用材料。但是壳聚糖缺乏骨键合生物活性，从而限制了其在骨组织工程中的应用。钙磷系材料，如纳米羟基磷灰石、β-TCP 等与自然骨矿物相组分的相似性，具有良好的生物相容性、骨传导性和骨诱导性，从而在众多的人工合成骨替代物中脱颖而出。但是单纯的钙磷系材料作为粉体或浆料成形困难，自然界中一些生物体(如动物骨组织、贝壳、珍珠等)是通过无机相呈纳米状态分散在有机相中这一奇特的相互作用而成的具有优异性能的生物复合物，这为屏障膜的化学组成提供了思路。
屏障膜作为软组织和骨缺损组织之间建立的生物屏障，其结构也应当有利于组织的修复。阻隔纤维细胞并能提供良好环境有利于成骨细胞增殖、分化。而国内外产品存在生产工艺复杂，价格高昂且结构、功能单一等缺陷，已无法满足组织再生对膜材料的要求。
因此，需要研发出制备方法便捷，同时具备不对称结构及功能的引导组织再生膜。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有成骨活性的结构不对称的引导组织再生膜及其制备方法。
本发明的第一方面，提供一种具有成骨活性的结构不对称的引导组织再生膜，所述引导组织再生膜包括致密层和复合在所述致密层上的疏松多孔层，其中，
所述致密层的基质为壳聚糖；
所述疏松多孔层的基质为壳聚糖与钙磷盐复合物。
在另一优选例中，所述钙磷盐选自：羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸八钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、氟磷灰石或者其他钙磷的无机物。
本发明中，其他钙磷的无机物是指掺杂其他微量元素(包括硅、镁、锶、锌，铁等离子)及其他粒子(包括生物玻璃、聚多巴胺等)的复合型钙磷盐。
在另一优选例中，所述壳聚糖的重均分子量范围为5万-50万，较佳地为 10万-40万或8万-22万，更佳地为20万-30万。
在另一优选例中，所述壳聚糖的脱乙酰化程度为75％-99％，较佳地为85％-98％，更佳地为90％-95％。
在另一优选例中，所述钙磷盐的钙磷比为1.0-2.0，较佳地为1.2-1.8，更佳地为1.5-1.7。
在另一优选例中，所述致密层的厚度为1μm-150μm。
在另一优选例中，所述致密层的厚度为10μm-120μm，较佳地为30μm- 100μm,更佳地为50μm-180μm。
在另一优选例中，所述疏松多孔层中壳聚糖与钙磷盐质量比范围为99:1- 0.25:1。
在另一优选例中，壳聚糖与钙磷盐质量比范围为75:1-0.5:1，较佳地为 50:1-0.8:1或25:1-1:1，更佳地为4:1-1.5:1。
在另一优选例中，所述疏松多孔层中壳聚糖与钙磷盐复合物的红外光谱，在570cm-1左右，1100cm-1左右出现磷酸基团的特征吸收峰。
在另一优选例中，相对于致密层的基质壳聚糖，所述疏松多孔层中壳聚糖与钙磷盐复合物在10°及20°处附近的X射线衍射结晶峰大幅削减或消失。
在另一优选例中，所述疏松多孔层的厚度为120μm-3mm。
在另一优选例中，所述疏松多孔层的厚度为110μm-2mm，更佳地为 100μm-1mm。
在另一优选例中，所述疏松多孔层的孔隙率为70％-99％。
在另一优选例中，所述疏松多孔层的孔隙率为80％-96％，较佳地为85％- 95％。
在另一优选例中，所述疏松多孔层的孔径为50μm-500μm。
在另一优选例中，所述疏松多孔层的孔径为100μm-480μm或200μm- 450μm，较佳地为300μm-400μm。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的引导组织再生膜的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供壳聚糖溶液和壳聚糖-钙磷盐溶液；
(b)在三电极体系中，将壳聚糖溶液作为电解液，在阴极附近沉积得到致密的壳聚糖水凝胶；
(c)将壳聚糖-钙磷盐溶液作为电解液，在步骤b)得到的致密的壳聚糖水凝胶上沉积疏松的壳聚糖与钙磷盐水凝胶得到双层水凝胶；
(d)将步骤c)得到的双层水凝胶干燥得到所述引导组织再生膜。
本发明的方法，是一种由磷酸根离子诱导壳聚糖构象变化产生疏松多孔结构并可通过电流密度调节的一种快速制备具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的方法。
在另一优选例中，所述方法具有以下一个或多个特征：
(1)所述壳聚糖溶液的浓度为5-20mg/ml；
(2)在恒电流密度为1-20mA/cm2下进行沉积；
(3)在恒电压密度为0.1-9V/cm2下进行沉积；
(4)沉积时间为100-2000s。
在另一优选例中，所述壳聚糖溶液为壳聚糖的盐酸溶液。
在另一优选例中，所述壳聚糖溶液的浓度为6-15mg/ml，较佳地为8-10 mg/ml。
在另一优选例中，所述壳聚糖溶液的pH为4.0-6.0，较佳地为4.2-5.5，更佳地为4.4-5.0。
在另一优选例中，所述壳聚糖溶液中含有过氧化氢。在另一优选例中，过氧化氢为20％-40％；较佳为30％过氧化氢。在另一优选例中，所述过氧化氢用量为5-50μl/ml，较佳地为10-40μl/ml，更佳地为20-30μl/ml。
在另一优选例中，所述壳聚糖-钙磷盐溶液通过以下过程制备：将钙磷盐分散至壳聚糖溶液中，搅拌均匀，再加入过氧化氢均匀搅拌。
在另一优选例中，所述壳聚糖-钙磷盐溶液中，钙磷盐质量浓度为0.1- 20mg/ml，较佳地为0.5-10mg/ml，更佳地为1-5mg/ml。
在另一优选例中，所述壳聚糖-钙磷盐溶液中，所述磷酸根离子浓度为1- 99mM，较佳地为2-70mM，更佳地为5-50mM。
在另一优选例中，所述壳聚糖-钙磷盐溶液中，所述过氧化氢用量5-50μl/ml，较佳地为10-40μl/ml，更佳地为20-30μl/ml。
在另一优选例中，所述壳聚糖-钙磷盐溶液的pH为4.5-6.0，较佳地为4.8- 5.8，更佳地为5.0-5.5。
在另一优选例中，所述步骤(b)、(c)中，所述恒电流密度为4-18mA/cm2，更佳地为10-18mA/cm2。
在另一优选例中，所述步骤(b)、(c)中，所述恒电压密度为0.5-1.8V/cm2或 1-1.7V/cm2，更佳地为1.3-1.6V/cm2。
在另一优选例中，所述步骤(b)、(c)中，所述沉积时间为300-1500s，更佳地为500s-1000s。
在另一优选例中，所述干燥为冷冻干燥。
本发明的第三方面，提供第一方面所述的引导组织再生膜的用途，用于制备组织修复制品。
在另一优选例中，所述组织修复制品选自：牙周组织再生膜、骨引导再生膜、人工皮肤、人工血管、人工神经导管、人工韧带。
在另一优选例中，所述引导组织再生膜用于引导牙周组织再生。
本发明的第四方面，提供一种引导牙周组织再生的方法，使用第一方面所述的引导组织再生膜。
本申请具有成骨活性的引导组织再生膜具有双层非对称结构，其一侧为致密层，另一侧为疏松多孔层。其致密层可对其他细胞(尤其是增殖速度较快的成纤维细胞)起到一定的阻隔作用，阻止牙龈上皮和牙龈结缔组织向根面生长，为成骨细胞(osteoblast)的增殖分化留出足够的空间；其疏松多孔层为疏松多孔的三维立体结构，孔隙排列规则，孔隙之间相互贯通，利于营养物吸收与代谢废物的排出，利于osteoblast的增殖与分化。
本申请的引导组织再生膜，其非对称结构可以通过电沉积参数调控，包括致密层及疏松多孔层的厚度，疏松多孔层的孔隙率及孔径的调节。可根据缺损部位的不同情况，需求的降解时间调控致密层和疏松多孔层的膜厚以及疏松多孔层的孔隙率大小。
本申请的方法，操作步骤简单、快速，具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的制备过程中没有添加醛类等有毒试剂，反应体系温和，能较好保留天然高分子材料以及添加无机钙磷盐的生物活性。各组分均具有不同的生物活性，通过功能互补和协同作用，以及设计成具有致密层和疏松多孔层的双层非对称结构，使得该类屏障膜除了作为一种生物相容性好，能在体内降解和具有分隔屏障作用外，同时还具有诱导组织再生的作用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
图1为电沉积过程分步的水凝胶膜及冻干后的双层膜实物图：
A)致密的壳聚糖水凝胶；
B)疏松的壳聚糖与钙磷盐水凝胶水凝胶膜；
C)致密壳聚糖/疏松壳聚糖和钙磷盐双层冻干膜。
图2为壳聚糖/壳聚糖和钙磷盐致密/疏松双层冻干膜的两面的物理化学表征：
A)傅里叶全反射红外图谱；
B)X射线衍射图谱。
图3为壳聚糖/壳聚糖和钙磷盐致密/疏松双层冻干膜的两侧表面及断面的扫描电镜图片。
图4为不同电流密度及不同沉积时间条件下得到的致密层及疏松多孔层的厚度增长曲线。
图5为不同电流密度条件下得到的壳聚糖和钙磷盐疏松多孔层的实物图及对应表面和断面的扫面电镜图片。
图6为Image Pro Plus软件定量分析得到不同电流密度条件下得到的壳聚糖和钙磷盐疏松层多孔结构的孔径分布频率直方图。
图7为不同电流密度条件制备疏松多孔层得到的双层膜的孔隙度结果。
图8为不同电流密度条件制备疏松多孔层得到的双层膜的湿态力学拉伸的应力应变曲线。
图9为不同电流密度条件制备疏松多孔层得到的双层膜的吸水性能测试结果。
图10为不同电流密度条件制备疏松多孔层得到的双层膜的蛋白吸附性能测试结果图。
图11为不同电流密度条件制备疏松多孔层得到的双层膜在培基中的钙离子释放曲线。
图12为不同电流密度条件制备疏松多孔层得到的双层膜在磷酸盐-溶菌酶的缓冲液中的质量降解情况及28天后双层膜的致密面和17.8mA/cm2条件下的疏松多孔面的扫描电镜图片。
图13为MC3T3细胞在17.8mA/cm2条件下的疏松多孔面的24小时细胞黏附的扫描电镜图片及不同电流密度条件下的膜表面的细胞增殖图。
图14为MC3T3细胞在不同电流密度条件下的疏松多孔面及致密面的碱性磷酸酶的不同时期表达和14天的碱性磷酸酶染色图片。
图15为壳聚糖-磷酸三钙(β-TCP)复合水凝胶膜的实物图。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜，其中一层为致密的壳聚糖层，而另一层为疏松多孔的壳聚糖和钙磷盐的复合层。本发明利用壳聚糖阴极去质子化发生溶胶- 凝胶转变的方法，通过在电解液体系中加入羟基磷灰石(nHAps)或其他具备溶解性的钙磷盐，如磷酸三钙(β-TCP)等，利用磷酸根对壳聚糖构象的改变，进而去质子化得到高含水量的钙磷盐和壳聚糖复合水凝胶膜，经冷冻干燥后产生疏松多孔结构，孔径和孔隙率及厚度可通过电沉积参数(电流，电压和时间)调控，其不对称结构能提供作为引导再生膜的优异性能。在此基础上，完成了本发明。
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，Chitosan代表壳聚糖，nHAps代表纳米羟基磷灰石，β-TCP代表磷酸三钙，CS代表壳聚糖膜，CS-nHAPs代表壳聚糖纳米羟基磷灰石膜， CS/CS-nHAPs代表壳聚糖/壳聚糖-纳米羟基磷灰石不对称双层膜。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：一种具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的制备
(1)壳聚糖溶液的配置：
称取10g壳聚糖粉末在900ml超纯水中搅拌均匀分散，随后加入32mL的 1.2M的稀盐酸溶液，定容至1000mL。搅拌过夜至完全溶解，稀盐酸调节PH至 4.5-5.5之间，4℃下7500rpm/min离心去除不溶性杂质得到1％的壳聚糖溶液备用。
(2)壳聚糖-纳米羟基磷灰石复合溶液的配置：
称取400mg的纳米羟基磷灰石粉末加入100ml步骤(1)所述的壳聚糖溶液中，搅拌过夜至完全分散后备用。
(3)壳聚糖/壳聚糖-纳米羟基磷灰石不对称双层膜的制备：
制膜前，在步骤(1)、(2)所述的的溶液中分别加入过氧化氢25μl/ml搅拌均匀后静止脱气，以防止由于电沉积过程中阴极出现大量气泡对材料造成的缺陷。
利用电化学工作站CHI660E在三电极系统中以步骤(1)所述壳聚糖溶液为电解液，选取钛片作为工极电极，铂丝作为辅助电极，银/氯化银作为参比电极，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度17.8mA/cm2，电压变化范围在 1-1.5V/cm2沉积时间800秒，在阴极沉积一层壳聚糖水凝胶膜，如实物图1中A 所示。超纯水清洗带壳聚糖水凝胶膜的工作电极。
随后放入步骤(2)所述壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合溶液中，以其为电解液，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度17.8mA/cm2，沉积时间500秒，在壳聚糖水凝胶膜表面沉积一层壳聚糖-纳米羟基磷灰石复合水凝胶膜，实物图1中B所示。
将双层膜从电极表面小心揭下后转入-80℃冷冻30min，取出，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥可得到CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2)不对称双层膜，如实物图1中C所示。
实施例2：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的物化表征
CS/CS-nHAps双面的傅里叶全反射红外光谱图及X射线衍射图谱如图2中 A中所示。
相对于CS面，加入了nHAps之后的CS-nHAps面，在红外图谱上出现了在 573cm-1、601cm-1和1084cm-1处分别出现PO3- 4的弯曲变形的特征吸收峰及伸缩振动峰，同时也出现了1590cm-1、1562cm-1及1658cm-1处-NH2与C＝O的特征吸收峰。
同时，如图2中B所示X射线图谱上，CS-nHAps层出现了一系列nHAps的特征衍射峰，表明疏松多孔层是壳聚糖与纳米羟基磷灰石的复合层。
实施例3：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的形貌表征
上述CS/CS-nHAps不对称双层膜经真空冻干24h后，分别将样品的疏松面和致密面粘贴于铜台上，经离子溅射仪喷金镀膜后，用扫描电子显微镜观察样品的疏松多孔面和致密面形态(加速电压为20kV)，如图3所示。
疏松多孔面均为三维网状结构，其厚度在450±30μm，孔隙之间相互贯通，孔隙规则，平均孔径大小约390μm，孔隙率为90±2％。有利于营养吸收与代谢废物的排出，利于成骨细胞的增殖与分化。
致密面较平整光滑、其厚度在82±6μm，无明显孔隙结构，孔隙率为5±1％。将对增殖速度较快的成纤维细胞起到一定的阻隔作用。
实施例4：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的厚度及疏松多孔层结构控制
上述实施例1，步骤(3)中在形成CS致密层及CS-nHAps疏松多孔层的过程中，改变恒电流密度(4.4mA/cm2、8.9mA/cm2、13.3mA/cm2和17.8mA/cm2)以及时间(200，400，600，800，1000，1200s)，得到不同条件下的壳聚糖水凝胶膜及壳聚糖-纳米羟基磷灰石复合水凝胶膜，经冻干后得到的壳聚糖单层膜和壳聚糖-纳米羟基磷灰石复合单层膜。
通过扫描电子显微镜观察样品厚度可分别得到致密层和疏松多孔层的厚度随恒电流密度及时间的关系。
致密层的厚度通过电流密度及时间的改变,其调节范围可从0μm到112μm：
控制时间0秒到1200秒条件下，电流密度为4.4mA/cm2，致密层厚度范围可从0μm到66μm；
电流密度为8.9mA/cm2，致密层厚度范围可从0μm到81μm；
电流密度为13.3mA/cm2，致密层厚度范围可从0μm到97μm；
电流密度为17.8mA/cm2，致密层厚度范围可从0μm到112μm。
疏松多孔层的厚度通过电流密度及时间的改变,其调节范围可从0μm到 1000μm：
控制时间0秒到1200秒条件下，电流密度为4.4mA/cm2，疏松多孔层厚度范围可从0μm到548μm；
电流密度为8.9mA/cm2，疏松多孔层厚度范围可从0μm到725μm；
电流密度为13.3mA/cm2，疏松多孔层厚度范围可从0μm到848μm；
电流密度为17.8mA/cm2，单层膜厚度范围可从0μm到1012μm。
分别如图4中A)和B)所示，表明可通过改变恒电流密度以及时间来控制不对称双层膜的致密部分及疏松多孔部分的厚度。
同时在上述实施例1，步骤(3)中调节形成壳聚糖-纳米羟基磷灰石水凝胶的恒电流密度(4.4mA/cm2、8.9mA/cm2、13.3mA/cm2和17.8mA/cm2)而得到的不同条件下的壳聚糖-纳米羟基磷灰石水凝胶经冻干后得到的不同的壳聚糖/壳聚糖-纳米羟基磷灰石不对称双层膜对应为：
CS/CS-nHAps(4.4mA/cm2)、CS/CS-nHAps(8.9mA/cm2)、CS/CS- nHAps(13.3mA/cm2)和CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2)。通过扫描电子显微镜观察样品疏松多孔层表面及断面，如图5所示。
结果表明疏松多孔层表面的多孔结构随电流密度的提高，孔结构变多且孔径变大，具体数值为：
CS/CS-nHAps(4.4mA/cm2)的疏松多孔层的平均孔径为120μm，孔隙率为 72±2％；
CS/CS-nHAps(8.9mA/cm2)的疏松多孔层的平均孔径为150μm，孔隙率为 79±4％；
CS/CS-nHAps(13.3mA/cm2)的疏松多孔层的平均孔径为235μm，孔隙率为86±1％；
CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2)的疏松多孔层的平均孔径为390μm，孔隙率为90±2％。
实施例5：不同电流密度下，疏松多孔层的孔径分布统计
结合上述实施例1的制备方法及实施例4调节方法中所述得到的CS/CS- nHAps(4.4mA/cm2)、CS/CS-nHAps(8.9mA/cm2)、CS/CS-nHAps(13.3mA/cm2) 和CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2)，分别通过扫描电子显微镜观察样品疏松多孔层表面及断面，在视野范围2.5ⅹ2.5mm区域选择不同位置各自拍摄10张图片，通过Image Plus 5.0软件随机选择200个孔测量孔径进行统计得到孔径分布的百分比直方图，如图6所示。
统计结果表明，随电流密度的提高，孔径大小由均值在100μm逐渐扩大到 400μm左右，具体的为：
CS/CS-nHAps(4.4mA/cm2)的疏松多孔层的孔径分布在80μm到190μm；
CS/CS-nHAps(8.9mA/cm2)的疏松多孔层的孔径分布在80μm到220μm；
CS/CS-nHAps(13.3mA/cm2)的疏松多孔层的孔径分布在190μm到300μm；
CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2)的疏松多孔层的孔径分布在320μm到500μm。
表明可以通过调节制备疏松多孔层的电流密度调节孔径范围。
实施例6：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的疏松多孔层的孔隙率测试
如实施例4所述的所有膜都通过1cm直径的打孔器修剪成直径D＝1cm的圆形小片,膜片的厚度H是由螺旋测微器测量得到，对膜的体积Vw进行了计算, Vw体积包括膜内部的孔体积以及膜的基质体积。
在30摄氏度时，称量充满乙醇(密度为ρe)的密度瓶重量为W1。然后将重量为Ws的膜片样品浸入在密度瓶中。密度瓶继续在30摄氏度下保持30分钟；所有溢出的乙醇都被仔细的清除。然后，密度瓶重新称量重量为W2。其余膜的参数包括Vs-膜的基质体积以及膜的孔隙率(ε)可通过下列公式计算得到，(每个样品设3个平行样)：
Vw＝(D/2)2Hπ
Vs＝(W1-W2+Ws)/ρe
ε＝1-(Vs/Vw)
对通过不同电流密度制备疏松多孔层的CS/CS-nHAps双层膜及CS单层膜通过上述方法测得的孔隙率(ε)对比，如图7所示。数据表明，CS/CS-nHAps双层膜由于存在CS-nHAps疏松多孔层，因此相对与单层的CS的孔隙率(5％左右) 有明显的提升，通过不同电流密度制备疏松多孔层的CS/CS-nHAps双层膜随着电流密度的提高孔隙率有所上升：
CS/CS-nHAps(4.4mA/cm2)—72％+2％；
CS/CS-nHAps(8.9mA/cm2)—79％+4％；
CS/CS-nHAps(13.3mA/cm2)—86％+1％；
CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2)—90％+2％。
实施例7：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的湿态力学性能
如实施例4所述的所有膜重新浸泡于37摄氏度的PH＝7.2的PBS溶液中，在 1h达到饱和的吸收后。通过国际标准4#型裁刀，裁剪为长度35mm，窄距2mm 的哑铃型样条，厚度H通过螺旋测微器测量得到。通过力学拉伸机(型号 CMT6104)，拉伸速率为2mm/min条件下测试得到应力-应变曲线。
CS致密单层膜的拉伸强度在4.39±0.89MPa，杨氏模量为0.16±0.05MPa，断裂伸长率在42±10％；
CS/CS-nHAps(4.4mA/cm2)双层膜的拉伸强度在2.07±0.61MPa，杨氏模量为0.074±0.03MPa，断裂伸长率在49±8％；
CS/CS-nHAps(8.9mA/cm2)双层膜的拉伸强度在1.89±0.29MPa，杨氏模量为0.040±0.02MPa，断裂伸长率在65±11％；
CS/CS-nHAps(13.3mA/cm2)双层膜的拉伸强度在1.30±0.59MPa，杨氏模量为0.022±0.008MPa，断裂伸长率在81±9％；
CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2)双层膜的拉伸强度在1.20±0.40MPa，杨氏模量为0.028±0.01MPa，断裂伸长率在96±13％。
如图8所示。结果表明，随着电流密度的提高，得到的具备较大孔径及孔隙率的疏松多孔层的CS/CS-nHAps不对称双层膜(CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2)) 在力学性能上有所下降，但仍然能满足GBR膜使用的力学性能要求。
实施例8：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的吸水性测试
如实施例4所述的所有膜在干态情况下，裁剪直径D＝1cm的圆形小片，测试得到重量M1，随后浸泡于37摄氏度的PH＝7.2的PBS溶液中，于37摄氏度的恒温培养箱孵育不同的时间点，用滤纸小心吸干表面残存的水分，称量得到湿态重量M2，通过公式计算：
吸水率(％)＝(M2-M1)/M1×100％(每个样品设3个平行样)
结果如图9所示。
结果表明所有的膜都能够快速的吸水，15min-30min左右吸水基本达到饱和，同时具备较大孔径及孔隙率的疏松多孔层的CS/CS-nHAps不对称双层膜 (CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2))具备更高的吸水率，约为280％。为这类膜作为 GBR膜的临床使用具备较短的软化时间，便于医生操作提供实验支持。
实施例9：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的蛋白吸附性能
如实施例4所述的所有膜，裁剪直径D＝1cm的圆形小片，浸泡于含有50％胎牛血清(FBS)的杜尔贝科改性基本培养基(DMEM-Gibco,USA)中，37℃恒温培养4h.随后所有样品在室温下，浸泡于PH＝7.2的PBS溶液中。再用1％的十二烷基磺酸钠洗脱液洗脱15min，将吸附的蛋白洗下来。通过通用的BCA方法检测蛋白量(每个样品设3个平行样)。
如图10所示，相比于CS致密单层膜(25±12μg/cm2)和浇铸形成的CS/CS- nHAps双层膜(55±10μg/cm2)的蛋白吸附能力，不同电流密度下得到的CS/CS- nHAps不对称双层膜对蛋白的吸附能力有明显的提升，同时随着电流密度的提高，得到的具备较大孔径及孔隙率的疏松多孔层的CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2) 不对称双层膜(595±56μg/cm2)对蛋白的吸附能力相对其他CS/CS-nHAps不对称双层膜(CS/CS-nHAps(4.4mA/cm2)为335±38μg/cm2；CS/CS-nHAps(8.7 mA/cm2)为410±27μg/cm2；CS/CS-nHAps(13.3mA/cm2)为520±64μg/cm2)有更优异的表现，这说明疏松多孔的结构更有利于蛋白的吸附，故而能够提供更高的比表面积吸附蛋白，具备在体内展现出优异的生物活性的潜力。
实施例10：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的Ca2+释放能力
如实施例4所述的所有膜裁剪直径D＝1cm的圆形小片，灭菌后浸泡于杜尔贝科改性基本培养基(DMEM-Gibco,USA)中，37摄氏度恒温培养不同时间点(1 天，3天，5天，7天，11天，14天)(每个时间点设3个平行样)，取出浸泡后的培养基稀释后通过等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)检测培养基中钙离子的释放，如图11所示。不同电流密度下得到的CS/CS-nHAps不对称双层膜在一周以内都有明显的钙离子的释放，一周后逐渐变缓。同时随着电流密度的提高，得到的具备较大孔径及孔隙率的疏松多孔层的CS/CS-nHAps(17.8mA/cm2)不对称双层膜(5.25±0.10mM)在一周内对钙离子的释放量相对其他CS/CS-nHAps 不对称双层膜(CS/CS-nHAps(4.4mA/cm2)为(3.89±0.10mM)；CS/CS-nHAps(8.7 mA/cm2)为(4.31±0.07mM)；CS/CS-nHAps(13.3mA/cm2)为(4.91±0.22mM) 略高，主要由于随着在培养基中浸泡的时间延续，由于膜中的钙磷盐的缓慢溶出释放出钙离子，有报道称其有利于细胞增殖以及分化，有利于新骨的形成，有望能够在体内提供一个有利于成骨的微环境。
实施例11：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的体外降解
配制含溶菌酶的SBF模拟体液(溶菌酶，Sigma Aldrich，活性水平为 500U/mL)，过滤除菌置4℃备用。
如实施例4所述的所有膜裁剪直径D＝1cm的圆形小片,称重M1，经辐射灭菌；
在无菌操作下，离心管加入含溶菌酶的SBF溶液10mL，置于37℃恒温摇床低速摇动，每天半量换液，保证溶液pH相对稳定；
分别于3天、1周、2周、3周、4周取样检测(每个时间点设3个平行样)，将取出的样品轻轻用超纯水漂洗3次，放入烘箱60℃烘干至恒重后称重M2并记录；
按公式：
降解率＝(M1-M2)/M1×100％
计算出所有条件下不对称双层膜的体外降解率，试验结果如图12所示。
在4周结束后，相比于CS致密单层膜(降解质量百分数19.3％)的质量损失，不同电流密度下得到的CS/CS-nHAps不对称双层膜的降解速率更快，同时随着电流密度的提高，得到的具备较大孔径及孔隙率的疏松多孔层的CS/CS- nHAps(17.8mA/cm2)不对称双层膜(降解质量百分数31.8％)的降解情况相比于其他CS/CS-nHAps不对称双层膜(CS/CS-nHAps(4.4mA/cm2)(降解质量百分数22.7％)；CS/CS-nHAps(8.7mA/cm2)(降解质量百分数26.7％)；CS/CS- nHAps(13.3mA/cm2)(降解质量百分数28.3％)，主要考虑为在模拟体液中的溶菌酶对壳聚糖分子链的糖苷键的降解作用。疏松多孔部分由于更明显的孔结构，降解情况愈发明显。
可以看出，随时间延长，不对称双层膜的降解率逐渐增加，在4周内降解速度缓慢。以及处理4周后的复合屏障膜的扫描电镜照片，不对称双层膜的疏松层孔径增大，孔之间形成连通，但整体有所溃散。
但致密层并没有出现明显的破损或者孔洞的出现，表明仍然可起到阻隔纤维细胞张入的作用，同时可以支撑不对称双层膜维持空间形状的能力，符合作为牙周组织再生屏障膜的要求。
实施例12：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的成骨细胞贴附及增殖
将实施例1结合实施例1所得到的所有膜，通过辐射灭菌后放置在48孔板中备用，疏松多孔层面朝上。
取生长状态良好的MC3T3-E1，胰酶消化后，制备成密度为1×105/mL细胞悬液，分别接种至不对称双层膜的疏松多孔面(每孔1mL)，37℃5％CO2培养箱中培养，隔天换液。1D、4D及7D天后取出48孔板，每孔加MTT工作(5mg/mL)- 100μL，放入培养箱继续培养4h；
取出48孔板，轻轻吸出液体，每孔加入500μL DMSO溶解15min后，每孔取 200μl于96孔板中，酶标仪振荡3min后于492nm下检测各孔吸光度值。
取培养24h后，经戊二醛固定、酒精梯度脱水、60℃烘干后离子溅射仪喷金镀膜后，用扫描电子显微镜观察样品表面贴附的细胞形态。
结果如图13所示，MC3T3-E1细胞能在不对称双层膜的疏松多孔面较好贴附及增殖。
实施例13：具有成骨活性的结构不对称引导组织再生膜的成骨细胞分化能力
配置成骨诱导液(OI)，配置地塞米松乙醇溶液(1mM)、β-甘油磷酸钠水溶液(10M)及维生素C水溶液(10mM),按照比例配置为成骨诱导液。将定量的成骨诱导液按照比例7.5ml加入500ml细胞培养基中得到的成骨诱导定向培养基，备用；
同上述，细胞接板后，隔天用成骨诱导定向培养基换液。
在7天和14天的时间点，去除培基用PBS洗涤2次，每孔加入250μl的NP-40 细胞裂解液，37℃恒温孵育1h,取上述裂解液50μl于96孔板中，然后加入50μl对硝基苯酚磷酸盐(1mg/ml),随后孵育1h；
ALP活性值是通过酶标仪在405nm处的读数/蛋白的总质量，蛋白总质量通过BCA显色法检测得到，如图14所示。
ALP染色通过BCIP/NBT试剂盒(碧云天,Shanghai,China).MC3T3-E1被接种在放置在48孔板中的不同的膜的疏松多孔面成骨诱导定向培养基培养14 天。去除培基，PBS洗涤两次后应用2.5％戊二醛固定,按比例混合BCIP/NBT试剂盒中的氮蓝四唑与缓冲液得到染色液，加入混合液后培养到一定时间拍照，如图14。
结果显示，细胞在疏松多孔层上通过成骨诱导定向培养基的培养，碱性磷酸酶的含量相对于致密层和孔板空白有所提升，表明该不对称双层膜的疏松多孔层可为成骨细胞提供良好的分化环境。
实施例14：
(1)壳聚糖-磷酸三钙(β-TCP)复合溶液的配置：
称取400mg的磷酸三钙粉末加入100ml实施例1步骤(1)所述的壳聚糖溶液中，搅拌过夜至完全分散后备用。
(2)壳聚糖/壳聚糖-磷酸三钙不对称双层膜的制备：
制膜前，在实施例1步骤(1)和上述步骤(1)所述的的溶液中分别加入过氧化氢25μl/ml搅拌均匀后静止脱气，以防止由于电沉积过程中阴极出现大量气泡对材料造成的缺陷。
利用电化学工作站CHI660E在三电极系统中以步骤(1)所述壳聚糖溶液为电解液，选取钛片作为工极电极，铂丝作为辅助电极，银/氯化银作为参比电极，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度17.8mA/cm2，沉积时间800秒，在阴极沉积一层壳聚糖水凝胶膜。超纯水清洗带壳聚糖水凝胶膜的工作电极。
随后放入上述步骤(1)所述壳聚糖/磷酸三钙(β-TCP)复合溶液中，以其为电解液，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度17.8mA/cm2，沉积时间500 秒，在壳聚糖水凝胶膜表面沉积一层壳聚糖-磷酸三钙(β-TCP)复合水凝胶膜，实物如图15所示。
将双层膜从电极表面小心揭下后转入-80℃冷冻30min，取出，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥可得到CS/CS-βTCP(17.8mA/cm2)不对称双层膜。
实施例15
本实施例方法同实施例1，不同之处在于采用磷酸八钙代替羟基磷灰石，采用恒电流沉积，电流密度15mA/cm2，沉积时间1000秒，在壳聚糖水凝胶膜表面沉积一层壳聚糖-磷酸八钙复合水凝胶膜，冷冻干燥后得到具有不对称结构的双层膜。
实施例16
本实施例方法同实施例14，不同之处在于采用磷酸氢钙代替羟基磷灰石，在壳聚糖水凝胶膜表面沉积一层壳聚糖-磷酸氢钙复合水凝胶膜，冷冻干燥后得到具有不对称结构的双层膜。
实施例17
本实施例方法同实施例14，不同之处在于采用磷酸四钙代替羟基磷灰石，在壳聚糖水凝胶膜表面沉积一层壳聚糖-磷酸四钙复合水凝胶膜，电流密度12 mA/cm2，沉积时间900秒，冷冻干燥后得到具有不对称结构的双层膜。
实施例18
本实施例方法同实施例1，不同之处在于采用氟磷灰石代替羟基磷灰石，电流密度10mA/cm2，沉积时间1100秒，在壳聚糖水凝胶膜表面沉积一层壳聚糖-氟磷灰石复合水凝胶膜，冷冻干燥后得到具有不对称结构的双层膜。
实施例19
本实施例方法同实施例1，不同之处在于采用恒电压模式沉积，电压密度 5V/cm2，沉积时间1100秒，在壳聚糖水凝胶膜表面沉积一层壳聚糖-羟基磷灰石复合水凝胶膜，冷冻干燥后得到具有不对称结构的双层膜。
采用实施例7-13的方法对实施例14-19制备的不对称双层膜进行性能检测，结果表明上述膜能满足引导组织再生膜使用的力学性能要求，具备较佳的吸水率，利于蛋白的吸附，钙离子缓慢溶出利于细胞增殖以及分化，有利于新骨的形成，MC3T3-E1细胞能在不对称双层膜的疏松多孔面较好贴附及增殖，且疏松多孔层可为成骨细胞提供良好的分化环境。
实施例20
动物实验以颅骨缺损模型评价其成骨效果，选取8周年龄的Wistar或者SD 大鼠，通过戊巴比妥钠麻醉以后，在颅骨部分的左右侧分别制造出5mm直径的圆形缺损，分别以实施例1中所述的不对称双层膜、致密的壳聚糖单层膜、Bio- Gide商业胶原膜及空白(无膜)放置在其缺损部分覆盖面积为8mm直径的圆形区域。缝合伤口培养，分别在手术后2周，4周及6周时间点分别在腹腔注射盐酸四环素，钙绿素及茜素红荧光标记物。8周后安乐死方式处死老鼠后，取颅骨部分进行Micro CT及组织切片分析缺损区域的新骨形成。
结果显示，8周后材料基本已经全部降解。
有膜覆盖组相比于不覆盖任何膜材料存在显著性差异，有大量的新骨生成。而其中相对于致密的壳聚糖单层膜，不对称双层膜及Bio-Gide商业胶原膜具有更好的新骨形成且效果相近。表明不对称双层膜具备作为引导组织再生膜的优良体内引导骨再生性能。
本发明的引导牙周组织再生屏障膜为致密层、疏松层双层非对称结构的组织再生屏障膜，其中，致密层基质为壳聚糖，疏松层基质为壳聚糖与钙磷盐(如羟基磷灰石，磷酸三钙等)的复合基质，其中疏松多孔层孔隙率及孔径可通过电流密度调控。本发明的疏松多孔层可为细胞生长提供更多的结构空间及增殖和分化的良好微环境，同时致密层可对纤维组织起屏蔽作用。制备方法简单快捷，成本低廉，生物相容性好且能在体内降解。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (24)

1.一种具有成骨活性的结构不对称的引导组织再生膜，其特征在于，所述引导组织再生膜包括致密层和疏松多孔层，其中，
所述致密层的基质为壳聚糖；
所述疏松多孔层的基质为壳聚糖与钙磷盐复合物，
非对称结构通过电沉积参数调控，
其中，所述致密层的厚度为1μm-150μm；
所述疏松多孔层的厚度为120μm-3mm；
所述疏松多孔层为三维网状结构，孔隙排列规则，孔隙之间相互贯通，孔径为50μm-500μm，孔隙率为70%-99%；
所述疏松多孔层中壳聚糖与钙磷盐质量比范围为99:1-0.25:1；
所述钙磷盐选自：羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸八钙、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、氟磷灰石或者复合钙磷盐。
2.如权利要求1所述的引导组织再生膜，其特征在于，所述壳聚糖的重均分子量范围为5万-50万。
3.如权利要求1所述的引导组织再生膜，其特征在于，所述壳聚糖的脱乙酰化程度为75%-99%。
4.如权利要求1所述的引导组织再生膜，其特征在于，所述钙磷盐的钙磷比为1.0-2.0。
5.如权利要求1所述的引导组织再生膜，其特征在于，所述致密层的厚度为10μm-120μm。
6.如权利要求1所述的引导组织再生膜，其特征在于，所述疏松多孔层中壳聚糖与钙磷盐质量比范围为75:1-0.5:1。
7.如权利要求1所述的引导组织再生膜，其特征在于，所述疏松多孔层的厚度为110μm-2mm。
8.如权利要求1所述的引导组织再生膜，其特征在于，所述疏松多孔层中壳聚糖与钙磷盐质量比范围为4:1-1.5:1。
9.如权利要求1所述的引导组织再生膜，其特征在于，所述疏松多孔层的孔隙率为80%-96%。
10.如权利要求1所述的引导组织再生膜，其特征在于，所述疏松多孔层的孔径为100 μm-480μm。
11.一种制备权利要求1所述的引导组织再生膜的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a) 提供含有过氧化氢的壳聚糖溶液，通过以下过程制备：向壳聚糖溶液中添加过氧化氢，所述过氧化氢用量为5-50μl/ml；
提供含有过氧化氢的壳聚糖-钙磷盐溶液，通过以下过程制备：将钙磷盐分散至壳聚糖溶液中，搅拌均匀，再加入过氧化氢均匀搅拌，所述壳聚糖-钙磷盐溶液中，所述过氧化氢用量5-50μl/ml；
(b) 在三电极体系中，将含有过氧化氢的壳聚糖溶液作为电解液，在阴极附近沉积得到致密的壳聚糖水凝胶；
(c) 将含有过氧化氢的壳聚糖-钙磷盐溶液作为电解液，在步骤b)得到的致密的壳聚糖水凝胶上沉积疏松的壳聚糖与钙磷盐水凝胶得到双层水凝胶；
(d) 将步骤c)得到的双层水凝胶干燥得到所述引导组织再生膜，
其中，所述方法具有以下特征：
(1) 所述壳聚糖溶液的浓度为5-20 mg/ml；
(2) 在恒电流密度为1-20 mA/cm2下进行沉积；
(3)在恒电压密度为0.1-9 V/cm2下进行沉积；
(4)沉积时间为100-2000 s。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液为壳聚糖的盐酸溶液。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的浓度为6-15 mg/ml。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的pH为4.0-6.0。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖-钙磷盐溶液中，钙磷盐的质量浓度为0.1-20mg/ml。
16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖-钙磷盐溶液中，磷酸根的离子浓度为1-99mM。
17.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖-钙磷盐溶液的pH为4.5-6.0。
18.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)、(c)中，在恒电流密度为4-18mA/cm2下进行沉积。
19.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)、(c)中，在恒电压密度为0.5-1.8 V/cm2下进行沉积。
20.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)、(c)中，沉积的时间为300-1500 s。
21.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述干燥为冷冻干燥。
22.如权利要求1所述的引导组织再生膜的用途，其特征在于，用于制备组织修复制品。
23.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述组织修复制品选自：牙周组织再生膜、骨引导再生膜、人工皮肤、人工血管、人工神经导管、人工韧带。
24.如权利要求1所述的引导组织再生膜的用途，其特征在于，用于制备引导牙周组织再生的材料。
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