CN114053486B - 一种可吸收生物活性膜及其制备方法和用途 - Google Patents

一种可吸收生物活性膜及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可吸收生物活性膜及其制备方法和用途，所述可吸收生物活性膜包括致密层和疏松多孔层，所述疏松多孔层附着在所述致密层的表面；所述致密层的材料包括纳米纤维素和海藻酸钠；所述疏松多孔层的材料包括纳米级钙源和壳聚糖，所述纳米级钙源选自纳米磷酸钙、碳酸钙和纳米硅酸钙中的一种或多种。本申请中的可吸收生物活性膜在机械性能、水稳定性、抑菌性、诱导成骨性和体内外降解性方面均显示出优良的效果。

Description

一种可吸收生物活性膜及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，特别是涉及一种可吸收生物活性膜及其制备方法和用途。
背景技术
对创伤、炎症、先天性疾病和肿瘤切除引起的骨缺损治疗一直是临床研究中的热点。引导骨再生(GBR)技术是实现骨生成的常用方法。在GBR技术中，利用GBR生物膜作为膜屏障，阻止结缔组织和上皮细胞长入骨缺损区，同时引导成骨细胞占据骨缺损空间，从而促进骨缺损的修复。通过外科手术将GBR生物膜置于骨缺损区上方，与软组织接触的一面可以阻挡上皮细胞和成纤维细胞进入骨缺损区，与骨组织接触的一面能引导骨生成细胞在其表面进行黏附、增殖进而分化为成骨细胞。GBR生物膜为骨缺损区的修复提供了一个相对封闭的、稳定的组织环境，起到一个选择性组织再生的作用，有利于骨缺损区骨组织的再生修复。
根据GBR生物膜在体内是否可被吸收降解的特性分为不可吸收性膜和可吸收性膜。常用的不可吸收性膜有聚四氟乙烯膜、钛膜等等，临床应用表明此类不可吸收性膜具有良好的机械性能和引导骨再生能力，但由于在体内不可吸收降解，需要二次手术取出，这不仅会增加患者的痛苦和感染风险、延长治疗时间、增加治疗费用，还可能引起组织的再次损伤，且不可吸收性膜应用后常有伤口裂开和膜暴露的并发症，这些都限制了不可吸收性膜的应用。可吸收性膜主要由可吸收降解的聚合物组成。Bio-Gide胶原膜是临床上应用最广泛的可吸收生物膜之一，具有双层结构，一层排列致密，具有良好的细胞阻隔作用，一层疏松多孔，利于成骨细胞粘附。然而，Bio-Gide仍然存在例如降解速度过快、抗菌性能较差和机械性能薄弱等缺点。
理想的GBR膜应除必要的生物相容性与双层结构外，还应具有以下特点：(1)具有足够的机械强度、柔韧性和可操作性，同时可以在湿态环境下保存结构和性能稳定；(2)一定的抑菌能力；(3)膜的降解周期应当与骨再生的时间相协调；(4)良好的生物相容性；(5)促进骨缺损区域成骨细胞粘附与增殖的同时阻止非成骨细胞对骨再生过程的干扰；(6)一定的诱导成骨性。当前研究的GBR膜主要由各种天然或合成聚合物组成，如壳聚糖(CS)、明胶、生物活性玻璃纳米颗粒和聚己内酯等。通过自蒸发、浸渍-沉淀、静电纺丝以及溶剂浇铸等技术已经得到了一些具有优异性能的GBR膜。然而，这些GBR膜的综合性能仍然难以满足实际应用需求。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种可吸收生物活性膜及其制备方法和用途，用于解决现有技术中引导骨再生膜中存在的问题，以同时具有优异的力学性能、水稳定性、抑菌性、生物相容性、生物可降解性和诱导成骨性。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过以下技术方案获得的。
本发明提供一种可吸收生物活性膜，所述可吸收生物活性膜包括致密层和疏松多孔层，所述疏松多孔层附着在所述致密层的表面；所述致密层的材料包括纳米纤维素和海藻酸钠；所述疏松多孔层的材料包括纳米级钙源和壳聚糖，所述纳米级钙源选自纳米磷酸钙、纳米碳酸钙和纳米硅酸钙中的一种或多种。
根据上述所述的可吸收生物活性膜，所述致密层呈纳米尺度的层状堆积结构。
根据上述所述的可吸收生物活性膜，所述疏松多孔层的孔隙率为80～99％，孔径为10～500μm。
根据上述所述的可吸收生物活性膜，所述纳米纤维素和海藻酸钠的质量比为1：(0.1～10)。
根据上述所述的可吸收生物活性膜，所述纳米级钙源和壳聚糖的质量比为1：(0.1～10)。
根据上述所述的可吸收生物活性膜，所述可吸收生物活性膜的湿态抗拉强度为50～150Mpa，优选为70～100Mpa。其中，湿态抗拉强度的检测方法为利用万能力学试验机进行拉伸应力应变测试。
根据上述所述的可吸收生物活性膜，所述可吸收生物活性膜的韧性为15～50MJ/m3，优选为15～25MJ/m3。其中，韧性的检测方法为通过对拉伸测试获得的应力应变曲线下的面积进行积分获得。
根据上述所述的可吸收生物活性膜，所述纳米纤维素可以采用纤维素的纳米晶、纤维素的纳米纤丝、细菌合成纳米级纤维素纤维和静电纺丝纳米纤维素纤维。
根据上述所述的可吸收生物活性膜，所述疏松多孔层的厚度为10～200μm。
根据上述所述的可吸收生物活性膜，所述致密层的厚度为10～200μm。
本发明还提供如上述所述的可吸收生物活性膜的制备方法，包括如下步骤：
A)将致密层的材料中各组分溶于水中形成第一水溶液，然后经干燥铸膜形成致密层；
B)将疏松多孔层的各组分溶于水中形成第二水溶液，然后涂覆在致密层表面进行冷冻；
C)置于预冷的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡，然后清洗；
D)再置于氯化钙水溶液中浸泡，然后清洗并灭菌。
本申请的制备方法中，步骤C)中，置于预冷的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡，是为了去除冰晶，保留多孔结构；步骤D)中，再置于氯化钙水溶液中浸泡，是为了对海藻酸钠进行钙离子交联。
根据上述所述的制备方法，步骤A)中，以所述第一水溶液中水的质量为基准计，纳米纤维素的浓度为0.1～5wt％，海藻酸钠的浓度为0.1～5wt％。
根据上述所述的制备方法，步骤B)中，以第二水溶液中水的质量为基准计，所述纳米级钙源的浓度为0.1wt％～5wt％，所述壳聚糖的浓度为0.1wt％～5wt％。
根据上述所述的制备方法，步骤B)中，冷冻可以采用冷冻台冷冻、低温冰箱冷冻、干冰冷冻、液氮冷冻等。优选地，步骤B)中，冷冻温度为-196℃～-5℃。
根据上述所述的制备方法，步骤C)中，氢氧化钠的乙醇溶液的浓度为(0.1～1.0)mol/L。
根据上述所述的制备方法，步骤C)中，氢氧化钙的乙醇溶液的温度为不超过0℃，优选为-20～0℃。
根据上述所述的制备方法，步骤D)中，氯化钙水溶液的浓度为(0.1～1.0)mol/L。
本发明还公开了如上述所述的可吸收生物活性膜用于制备诱导成骨产品中的用途。
本申请中上述技术方案的有益效果为：
1)本申请中可吸收生物活性膜的致密层表面平滑，用于提供生物膜的机械强度和韧性，同时用于阻隔成纤维细胞渗入；其疏松多孔层主要用于骨细胞粘附，提供生物膜的诱导成骨性。
2)生物膜的整体具有优异的机械强度和韧性，并且可以在水溶液中长期保持结构和性能稳定性；
3)可吸收生物活性膜同时具有良好的抑菌性能和优异的生物相容性，体外与细胞共培养显示对细胞无毒性；
4)本申请中的可吸收生物活性膜具有优异的生物可降解性，体内可以通过生物酶降解吸收；
5)本申请中的可吸收生物活性膜具有优异的诱导成骨性，用于引导骨缺损区域骨再生修复，所述骨缺损区域包括牙槽骨、颅骨、股骨、胫骨、肱骨、肋骨等。
附图说明
图1显示为本发明中的可吸收生物活性膜的结构示意图，其中，1为疏松多孔层，2为致密层
图2显示为本发明实施例1中所制备的致密层的截面的扫描电镜照片
图3显示为本发明实施例1中所制备的可吸收生物活性膜的湿态应力应变曲线
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明实施例中公开了一种可吸收生物活性膜，所述可吸收生物活性膜包括致密层和疏松多孔层的双层结构，所述疏松多孔层附着在所述致密层的表面；所述致密层的材料包括纳米纤维素和海藻酸钠；所述疏松多孔层的材料包括纳米级钙源和壳聚糖，所述纳米级钙源选自纳米磷酸钙和纳米硅酸钙中的一种或两种。图1为本发明中所述可吸收生物活性膜的结构示意图。
实施例1
本实施例中可吸收生物活性膜的制备方法如下：
A)将纳米纤维素与水混合形成0.5wt％的水溶液，将海藻酸钠与水混合形成2wt％的水溶液，将前者和后者按体积比2:1混和均匀，得到第一水溶液；将50ml第一水溶液倒入100ml的塑料培养皿中，置于40℃烘箱自蒸发干燥，得到致密层；
B)将羟基磷灰石纳米颗粒与水混合形成0.5wt％的水溶液，将壳聚糖与水混合形成2wt％的水溶液，前者与后者按体积比2:1混和均匀，得到第二水溶液；取上述第二水溶液按照厚度约50μm涂覆在所述致密层表面，然后迅速置于液氮中冷冻；
C)将上述冷冻后的样品迅速置于温度为-5℃的浓度为0.5M的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡10min，在蒸馏水中清洗；
D)再置于浓度为0.5M的氯化钙的水溶液中浸泡10min，最后蒸馏水清洗并灭菌后得到所需生物活性膜。
图2显示为本实施例中制备的致密层的截面的扫描电镜照片，由图上可以看出致密层界面呈纳米尺度的层状堆积结构。
图3显示为本实施例中制备的可吸收生物活性膜利用万能力学试验机进行拉伸测试获得的湿态应力应变曲线，由图上可以看出，所获得生物膜的湿态拉伸强度可达约110MPa，拉伸应变约40％，计算曲线下积分面积得该生物膜的韧性约为38MJ/m3。
实施例2
本实施例中可吸收生物活性膜的制备方法如下：
A)制备第一水溶液：将纳米纤维素和海藻酸钠加入水中混合得到第一水溶液，其中，以第一水溶液中水的质量为基准计，所述纳米纤维素的质量百分含量为0.5wt％；以第一水溶液中水的质量为基准计，所述海藻酸钠的质量百分含量为3.5wt％；将50ml第一水溶液倒入100ml的塑料培养皿中，置于40℃烘箱自蒸发干燥，得到致密层；
B)制备第二水溶液：将羟基磷灰石纳米颗粒和壳聚糖加入水中混合得到第二水溶液，其中，以第二水溶液中水的质量为基准计，所述羟基磷灰石纳米颗粒的质量百分含量为1wt％；以第二水溶液中水的质量为基准计，所述壳聚糖的质量百分含量为4wt％；；取上述第二水溶液按照厚度约50μm涂覆在所述致密层表面，然后迅速置于液氮中冷冻；
C)将上述冷冻后的样品迅速置于温度为-10℃的浓度为0.5M的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡10min，在蒸馏水中清洗；
D)再置于浓度为0.5M的氯化钙的水溶液中浸泡10min，最后蒸馏水清洗并灭菌后得到所需生物活性膜。
采用如实施例1中方法测试应力应变曲线，本实施例中获得的可吸收生物活性膜的湿态拉伸强度为112MPa。
实施例3
本实施例中可吸收生物活性膜的制备方法如下：
A)制备第一水溶液：将纳米纤维素和海藻酸钠加入水中混合得到第一水溶液，其中，以第一水溶液中水的质量为基准计，所述纳米纤维素的质量百分含量为0.5wt％，所述海藻酸钠的质量百分含量为5wt％；将50ml第一水溶液倒入100ml的塑料培养皿中，置于40℃烘箱自蒸发干燥，得到致密层；
B)制备第二水溶液：将羟基磷灰石纳米颗粒和壳聚糖加入水中混合得到第二水溶液，其中，以第二水溶液中水的质量为基准计，所述羟基磷灰石纳米颗粒的质量百分含量为2wt％，壳聚糖的质量百分含量为4wt％；取上述第二水溶液按照厚度约50μm涂覆在所述致密层表面，然后迅速置于液氮中冷冻；
C)将上述冷冻后的样品迅速置于温度为-20℃浓度为0.5M的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡10min，在蒸馏水中清洗；
D)再置于浓度为0.5M的氯化钙的水溶液中浸泡10min，最后蒸馏水清洗并灭菌后得到所需生物活性膜。
采用如实施例1中方法测试应力应变曲线，本实施例中获得的可吸收生物活性膜的湿态拉伸强度为105MPa。
实施例4
本实施例中可吸收生物活性膜的制备方法如下：
A)制备第一水溶液：将纳米纤维素与海藻酸钠加入水中混合得到第一水溶液，其中，以第一水溶液中水的质量为基准计，所述纳米纤维素的质量百分含量为1wt％，海藻酸钠的质量百分含量为5wt％；将50ml第一水溶液倒入100ml的塑料培养皿中，置于40℃烘箱自蒸发干燥，得到致密层；
B)制备第二水溶液：将羟基磷灰石纳米颗粒与壳聚糖加入水中混合得到第二水溶液，其中，以第二水溶液中水的质量为基准计，所述羟基磷灰石纳米颗粒的质量百分含量为1wt％，所述壳聚糖的质量百分含量为1wt％；取上述第二水溶液按照厚度约50μm涂覆在所述致密层表面，然后迅速置于液氮中冷冻；
C)将上述冷冻后的样品迅速置于-5℃、浓度为0.5M的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡10min，在蒸馏水中清洗；
D)再置于浓度为0.5M的氯化钙的水溶液中浸泡10min，最后蒸馏水清洗并灭菌后得到所需生物活性膜。
采用如实施例1中方法测试应力应变曲线，本实施例中获得的可吸收生物活性膜的湿态拉伸强度为113MPa。
实施例5
本实施例中可吸收生物活性膜的制备方法如下：
A)制备第一水溶液：将纳米纤维素与海藻酸钠加入水中混合得到第一水溶液，其中，以第一水溶液中水的质量为基准计，所述纳米纤维素的质量百分含量为1wt％，海藻酸钠的质量百分含量为4wt％；将50ml第一水溶液倒入100ml的塑料培养皿中，置于40℃烘箱自蒸发干燥，得到致密层；
B)制备第二水溶液：将羟基磷灰石纳米颗粒与壳聚糖加入水中混合得到第二水溶液，其中，以第二水溶液中水的质量为基准计，所述羟基磷灰石纳米颗粒的质量百分含量为0.5wt％，所述壳聚糖的质量百分含量为3.5wt％；取上述第二水溶液按照厚度约50μm涂覆在所述致密层表面，然后迅速置于液氮中冷冻；
C)将上述冷冻后的样品迅速置于-5℃、浓度为0.5M的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡10min，在蒸馏水中清洗；
D)再置于浓度为0.5M的氯化钙的水溶液中浸泡10min，最后蒸馏水清洗并灭菌后得到所需生物活性膜。
采用如实施例1中方法测试应力应变曲线，本实施例中获得的可吸收生物活性膜的湿态拉伸强度为109MPa。
实施例6
本实施例中可吸收生物活性膜的制备方法如下：
A)制备第一水溶液：将纳米纤维素与海藻酸钠加入水中混合得到第一水溶液，其中，以第一水溶液中水的质量为基准计，所述纳米纤维素的质量百分含量为1wt％，海藻酸钠的质量百分含量为1wt％；将50ml第一水溶液倒入100ml的塑料培养皿中，置于40℃烘箱自蒸发干燥，得到致密层；
B)制备第二水溶液：将羟基磷灰石纳米颗粒与壳聚糖加入水中混合得到第二水溶液，其中，以第二水溶液中水的质量为基准计，所述羟基磷灰石纳米颗粒的质量百分含量为0.5wt％，所述壳聚糖的质量百分含量为5wt％；取上述第二水溶液按照厚度约50μm涂覆在所述致密层表面，然后迅速置于液氮中冷冻；
C)将上述冷冻后的样品迅速置于-5℃、浓度为0.5M的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡10min，在蒸馏水中清洗；
D)再置于浓度为0.5M的氯化钙的水溶液中浸泡10min，最后蒸馏水清洗并灭菌后得到所需生物活性膜。
采用如实施例1中方法测试应力应变曲线，本实施例中获得的可吸收生物活性膜的湿态拉伸强度为114MPa。
细胞相容性实验
将实施例1～6中制备的可吸收生物活性膜在与MC3T3-E1细胞共培养6h、12h、24h后，相对空白培养板的细胞活性。
其中，选取样品直径为10mm，厚度为200μm，细胞毒性实验的具体方法如下。
根据ISO：10993-5细胞毒性标准测试复合材料的生物安全性。在37℃下，实施例1～6中样品在无血清细胞培养基中(200mg/mL)浸泡24小时，过滤得浸提液。以3102/孔的浓度将成骨细胞接种到96孔组织培养板，继续孵育1天后，弃去培养基，PBS清洗3遍；加入含10％胎牛血清(FBS)的浸提液，继续培养1天；未加含10％FBS的材料浸提液作为实验对照组。在测试时间点时，每孔加入30微升四甲基偶氮唑盐溶液，继续孵育培养4小时后，弃去培养液，PBS清洗3遍，每孔加入100微升二甲基亚砜，室温静置10分钟，酶标仪490nm测试吸光度，并将其与空白组对比得到相对活性。
与空白对照组相比，实施例1～6中的吸光度没有显著性差异，表明实施例1～6中的可吸收生物活性膜对成纤维细胞的生长没有负面影响。实施例1～6中可吸收生物活性膜的浸提液中的细胞与空白对照组的细胞存活率的比值都在90％左右，证明实施例1～6中的可吸收生物活性膜对成骨细胞没有毒性。
诱导成骨性的实验
本申请中采用的大鼠模型为:成年大鼠，体重为200～250克，雄性。
大鼠被随机分成6组，每组数量为2只，分别对应空白组和实验组，在每组中每个大鼠的右侧股骨中段构建单侧3mm圆形缺损。
将实施例1～6中的可吸收生物活性膜覆盖在实验组的圆形缺损上并缝合，进行体内成骨实验，以形成实验组；对骨缺损处直接缝合，不覆盖任何膜，作为空白组。分别在4周和8周取材，然后通过micro-CT测试新骨量，具体实验结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002617717340000081
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种可吸收生物活性膜，其特征在于，所述可吸收生物活性膜包括致密层和疏松多孔层，所述疏松多孔层附着在所述致密层的表面；所述致密层的材料包括纳米纤维素和海藻酸钠；所述疏松多孔层的材料包括纳米级钙源和壳聚糖，所述纳米级钙源选自纳米磷酸钙、碳酸钙和纳米硅酸钙中的一种或多种；
所述致密层呈纳米尺度的层状堆积结构；
所述疏松多孔层的孔隙率为80～99％，孔径为10～500μm；
所述可吸收生物活性膜的湿态抗拉强度为50～150MPa；
所述可吸收生物活性膜的韧性为15～50MJ/m3；
所述可吸收生物活性膜采用包括如下步骤的方法制备获得：
A)将致密层的材料中各组分溶于水中形成第一水溶液，然后经干燥铸膜形成致密层；
B)将疏松多孔层的各组分溶于水中形成第二水溶液，然后涂覆在致密层表面进行冷冻；
C)置于预冷的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡，然后清洗；
D)再置于氯化钙水溶液中浸泡，然后清洗并灭菌。
2.根据权利要求1所述的可吸收生物活性膜，其特征在于，
所述纳米纤维素和海藻酸钠的质量比为1：(0.1～10)；
和/或，所述纳米级钙源和壳聚糖的质量比为1：(0.1～10)。
3.根据权利要求1所述的可吸收生物活性膜，其特征在于，所述疏松多孔层的厚度为10～200μm。
4.根据权利要求1所述的可吸收生物活性膜，其特征在于，所述致密层的厚度为10～200μm。
5.如权利要求1～4任一项所述的可吸收生物活性膜的制备方法，包括如下步骤：
A)将致密层的材料中各组分溶于水中形成第一水溶液，然后经干燥铸膜形成致密层；
B)将疏松多孔层的各组分溶于水中形成第二水溶液，然后涂覆在致密层表面进行冷冻；
C)置于预冷的氢氧化钠的乙醇溶液中浸泡，然后清洗；
D)再置于氯化钙水溶液中浸泡，然后清洗并灭菌。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤A)中，以第一水溶液中水的质量为基准计，所述第一水溶液中纳米纤维素和海藻酸钠的浓度均为0.1wt％～5wt％。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
步骤B)中，以第二水溶液中水的质量为基准计，所述第二水溶液中纳米级钙源和壳聚糖的浓度均为0.1wt％～5wt％；
和/或，冷冻温度为-196℃～-5℃；
和/或，步骤C)中，氢氧化钠的乙醇溶液的浓度为0.1～1.0mol/L。
8.根据权利要求5的制备方法，其特征在于，
步骤C)中，氢氧化钠的乙醇溶液的温度为-20～0℃；
和/或，步骤D)中，氯化钙水溶液的浓度为(0.1～1.0)mol/L。
9.如权利要求1～4任一项所述的可吸收生物活性膜用于制备诱导成骨产品中的用途。
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