CN110078979A - 一种用于引导骨再生的双层纳米复合膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于引导骨再生的双层纳米复合膜的制备方法，包括以下步骤：A)将生物相容性有机高分子和纳米材料在水溶液中混合，得到纳米复合溶液；B)将所述纳米复合溶液经过蒸发作用，得到致密的纳米复合薄膜；C)在所述纳米复合薄膜的表面喷涂一层纳米复合溶液，将得到的产品进行低温处理，得到双层纳米复合膜。本申请利用蒸发自组装技术制备了具有良好力学性能的仿生结构薄膜，再通过冷冻冰模板法在已制备的薄膜表面制备了一层疏松多孔层，即可获得具有良好机械性能、抑菌性、体外降解性和细胞粘附性的引导骨再生的多功能双层纳米复合膜。

Description

一种用于引导骨再生的双层纳米复合膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及仿生结构薄膜材料的制备技术领域，尤其涉及一种用于引导骨再生的双层纳米复合膜及其制备方法。
背景技术
创伤、炎症、先天性疾病和肿瘤切除引起的骨缺损治疗一直是临床研究中的热点。引导骨再生(GBR)技术是实现骨生成的常用方法。在GBR技术中，膜材料是关键因素，它是通过在骨缺损处放置GBR膜，在膜下形成一个稳定空间，阻止结缔组织的长入，使骨生成细胞优先生长，充分调动组织自身的愈合能力，达到骨性愈合。
根据是否可降解的特性，常用于临床治疗的GBR膜可分为生物不可降解膜和生物可降解膜。不可降解膜有较高的机械强度和空间维持能力，但需二次手术摘除，易造成感染等并发症发生；可生物降解膜主要由可降解的聚合物组成。Bio-Gide胶原膜是临床上最广泛使用的可生物降解膜之一，具有双层结构，一层排列致密，具有良好的细胞阻隔作用，一层疏松多孔，利于成骨细胞粘附。然而，Bio-Gide仍然存在例如降解速度过快、抗菌性能较差和机械性能薄弱等缺点。
因此，除必要的生物相容性与双层结构外，理想的GBR膜应具有以下特点：(1)膜具有足够的机械强度、柔韧性和可操作性；(2)膜的降解周期应当与骨再生的时间相协调；(3)一定的抑菌能力；(4)促进骨缺损区域成骨细胞粘附与增殖的同时阻止非成骨细胞对骨再生过程的干扰；(5)一定的诱导成骨性。当前研究的GBR膜主要由各种天然或合成聚合物组成，如壳聚糖(CS)、明胶、生物活性玻璃纳米颗粒和聚己内酯等。通过自蒸发、浸渍-沉淀、静电纺丝以及溶剂浇铸等技术已经得到了一些具有优异性能的GBR膜。然而，如何同时实现理想GBR膜的其他功能，如何实现其结构和功能的统一，仍然是一项重大的挑战。
近年来，纳米科学和纳米技术取得了令人瞩目的进展，纳米结构极大地促进了功能材料在各个领域的发展。其中，多种纳米材料被报道具有良好的诱导成骨性和抑菌性。
天然贝壳具有特殊的“砖-泥”层状结构和精确的界面调控，同时实现了卓越的机械强度与韧性，是一种理想的无机-有机材料结构模型。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种用于引导骨再生的双层纳米复合膜，该复合膜在机械性能、抑菌性、体外降解性和细胞粘附性等方面显示出优良的效果。
有鉴于此，本申请提供了一种用于引导骨再生的双层纳米复合膜的制备方法，包括以下步骤：
A)将生物相容性有机高分子和纳米材料在水溶液中混合，得到纳米复合溶液；
B)将所述纳米复合溶液经过蒸发作用，得到致密的纳米复合薄膜；
C)在所述纳米复合薄膜的表面喷涂一层纳米复合溶液，将得到的产品于-198℃～-10℃下进行低温处理，得到双层纳米复合膜。
优选的，所述生物相容性有机高分子选自胶原蛋白、蚕丝蛋白、明胶、壳聚糖和海藻酸钠中的一种或多种，所述纳米材料选自纳米β-磷酸三钙、羟基磷灰石纳米颗粒、透钙磷石纳米片、羟基磷灰石纳米纤维、硅酸钙纳米纤维、石墨烯和纳米黏土片中的一种或多种。
优选的，所述纳米复合溶液中所述生物相容性有机高分子的浓度为10～40mg/ml，所述纳米材料的浓度为0.1～20mg/ml。
优选的，所述蒸发作用的方式为自然蒸发作用或喷涂热蒸发作用。
优选的，所述低温处理具体为低温冷冻后经冷冻干燥或低温冷冻后浸入低温氢氧化钠的乙醇溶液中的处理方式。
优选的，所述低温冷冻的温度为-198℃～-10℃。
优选的，所述低温氢氧化钠的乙醇溶液的温度为-50～-5℃，所述低温氢氧化钠的乙醇溶液中氢氧化钠的浓度为0.1M～1M。
本申请还提供了一种双层纳米复合膜，由仿生致密层和形成于仿生致密层表面的疏松多孔层组成，所述仿生致密层由生物相容性有机高分子和纳米材料通过蒸发自组装技术制备得到，所述疏松多孔层由生物相容性有机高分子和纳米材料通过冷冻冰模板法制备得到。
优选的，所述仿生致密层的厚度为10～200μm，所述疏松多孔层的厚度为5～50μm。
本申请提供了一种用于引导骨再生的双层纳米复合膜的制备方法，其首先制备了纳米复合溶液，再依次进行蒸发自组装法和冷冻模板法制备了仿生致密层和疏松多孔层，由此得到了双层纳米复合膜；本申请中的双层纳米复合膜中的仿生致密层提供较好的力学性能，同时由于其内部致密、表面光滑，还可起到屏障作用，阻隔应用时膜一侧的非成骨细胞迁移到骨缺损区域而干扰成骨，疏松多孔层由于纳米组分而具有诱导骨再生的活性，同时由于其表面结构疏松多孔而利于成骨细胞的粘附，从而对骨缺损修复起到促进作用。综上，本申请制备的双层纳米复合膜在机械性能、抑菌性、体外降解性和细胞粘附性等方面显示出优良的效果。
附图说明
图1为实施方式3中所制备的单层仿生纳米复合膜的数码照片和扫描电镜照片(截面和表面)；
图2为实施方式5中所制备的多功能双层纳米复合膜的数码照片和扫描电镜照片(截面和表面)；
图3为实施方式1～3所制备不同薄膜在干态情况下的拉伸应力-应变曲线对比图；
图4为实施方式1、4和5中所制备的不同薄膜的抑菌曲线对比图；
图5为实施方式3和5中所制备的不同薄膜表面的细胞粘附曲线对比图；
图6为实施方式3和5中所制备的不同薄膜表面的粘附细胞染色对比图；
图7为实施方式3和5中所制备的不同薄膜表面的细胞粘附情况扫描电镜观察对比图；
图8为实施方式5中所制备的多功能双层纳米复合膜体外降解曲线图；
图9为实施方式1、4和5中所制备的不同薄膜的细胞相容性对比图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
鉴于引骨再生膜的现状，本发明实施例公开了一种用于引导骨再生的双层纳米复合膜的制备方法，该方法制备的复合膜具有仿生致密层和疏松多孔层的两层结构，该结构共同作用使得复合膜具有良好的力学性能、生物相容性、抑菌性和生物可降解性。具体的，本申请所述双层纳米复合膜的制备方法，包括以下步骤：
A)将生物相容性有机高分子和纳米材料在水溶液中混合，得到纳米复合溶液；
B)将所述纳米复合溶液经过蒸发作用，得到纳米复合薄膜；
C)在所述纳米复合薄膜的表面喷涂一层所述纳米复合溶液，将得到的产品于-198℃～-10℃下进行低温处理，得到双层纳米复合膜。
在上述制备双层纳米复合膜的过程中，本申请首先将配制原料，即将生物相容性有机高分子和纳米材料在水溶液中混合，得到纳米复合溶液。所述生物相容性有机高分子为本领域技术人员熟知的材料，示例的，所述生物相容性有机高分子选自胶原蛋白、蚕丝蛋白、明胶、壳聚糖和海藻酸钠中的一种或多种，其提供复合膜的生物相容性与生物活性，所述纳米材料也为本领域技术人员熟知的纳米材料，具体选自纳米β-磷酸三钙、羟基磷灰石纳米颗粒、透钙磷石纳米片、羟基磷灰石纳米纤维、硅酸钙纳米纤维、石墨烯和纳米黏土片中的一种或多种，为了实现复合膜的功能性，可以根据需求选择加入不同功能的纳米材料和生物相容性有机高分子；示例的，为了实现成骨功能，添加羟基磷灰石纳米纤维。在所述纳米复合溶液中，所述生物相容性有机高分子的浓度为10～40mg/ml，所述纳米材料的浓度为0.1～20mg/ml；更具体的，所述生物相容性有机高分子的浓度为20～35mg/ml，所述纳米材料的浓度为0.5～10mg/ml。上述生物相容性有机高分子与纳米材料的浓度会影响双层纳米复合膜的力学性能。
按照本发明，然后将上述纳米复合溶液经过蒸发作用，以得到纳米复合薄膜即得到仿生致密层。上述蒸发作用为自然蒸发或喷涂热蒸发，以通过自蒸发组装法或喷涂组装法形成具有仿生结构的致密层。所述自然蒸发或所述喷涂热蒸发均为本领域技术人员熟知的蒸发方式，对其具体实现手段本申请不进行特别的限制。
本申请然后在上述纳米复合薄膜表面喷涂一层纳米复合溶液，再于-198℃～-10℃下进行低温处理，即得到疏松多孔层；在上述过程中，所述纳米复合溶液可以与得到纳米复合薄膜采用的纳米复合溶液相同，也可以不同，对此本申请没有特别的限制。所述低温处理以保证在上述纳米复合薄膜表面通过冷冻冰模板法形成疏松多孔层，最终得到双层纳米复合膜。本申请所述低温处理具体为低温冷冻后经冷冻干燥或低温冷冻后浸入低温氢氧化钠的乙醇溶液中的处理方式，所述冷冻干燥的方式为本领域技术人员熟知的方式，对此本申请没有特别的限制；在本申请中，所述低温冷冻的温度为-198℃～-10℃。所述低温氢氧化钠的乙醇溶液的温度为-50～-5℃，所述低温氢氧化钠的乙醇溶液中氢氧化钠的浓度为0.1M～1M。所述低温冷冻后经冷冻干燥与所述低温冷冻后浸入低温氢氧化钠的乙醇溶液中均是以冷冻冰模板的方法在上述仿生致密层上形成疏松多孔层。
本申请还提供了一种上述方法制备的双层纳米复合膜，其由仿生致密层和形成于仿生致密层表面的疏松多孔层组成，所述仿生致密层由生物相容性有机高分子和纳米材料通过蒸发自组装技术制备得到，所述疏松多孔层由生物相容性有机高分子和纳米材料通过冷冻冰模板法制备得到。
在上述复合膜中，所述生物相容性有机高分子与所述纳米材料在本申请制备方法的技术方法中已进行了详细说明，此处不进行赘述；需要指出的是，在所述仿生致密层与所述疏松多孔层中，两层所述生物相容性有机高分子可以相同，也可以不同，同样，两层疏松多孔层中，所述纳米材料可以相同，也可以不同。
在本申请提供的双层纳米复合膜中，所述仿生致密层的厚度为10～200μm，所述疏松多孔层的厚度为5～50μm。
本申请通过将蒸发组装方法和冷冻冰模板法相结合，将原材料混合溶液制备成双层纳米复合膜，首次制备了具有良好力学性能、生物相容性、抑菌性和生物可降解性的多功能双层纳米复合膜材料。本发明所用方法具有高效率、低消耗、膜结构和厚度可控等优势；所用原料具有廉价、生物安全、可降解等特点；同时，制备条件绿色环保。该发明所制备的双层纳米复合膜具有良好的机械性能、抑菌性和生物可降解性，同时在体外细胞培养测试中疏松多孔层表面表现出良好的细胞粘附特性，因此在骨组织再生医学等生物工程领域有着广泛的应用前景。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的双层纳米复合膜的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
将一定质量的壳聚糖(CS)配成CS水溶液，溶液中CS的质量体积浓度为20mg/ml；超声除去气泡后将混合溶液倾倒于培养皿中，待自然蒸发后形成单层致密膜；对所得单层纳米复合膜进行结构、机械性能、体外降解性、细胞相容性、抑菌性等表征。
实施例2
将一定质量分数的壳聚糖(CS)、氧化石墨烯(GO)混合分散到水溶液中，超声破碎直至完全分散，配成CS-GO混合水溶液，溶液中CS和GO的质量体积浓度分别为20mg/ml和0.5mg/ml；超声除去气泡后将混合溶液倾倒于培养皿中，待自然蒸发后形成单层致密膜；对所得单层纳米复合膜进行结构、机械性能、体外降解性、细胞相容性、抑菌性等表征。
实施例3
将一定质量分数的壳聚糖(CS)、氧化石墨烯(GO)和硅酸钙纳米线(CaSi)混合分散到水溶液中，超声破碎直至完全分散，配成CS-GO-CaSi混合水溶液，溶液中CS、GO和CaSi的质量体积浓度分别为20mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml；超声除去气泡后将混合溶液倾倒于培养皿中，待自然蒸发后形成单层致密膜；对所得单层纳米复合膜进行结构、机械性能、体外降解性、细胞相容性、抑菌性等表征。如图1所示，图1为本实施例制备的单层致密膜的数码照片和扫描电镜照片。
如图3所示，图3为实施例1～实施例3制备的不同薄膜在干态情况下的拉伸应力-应变曲线图。由图3可知，加了GO的纳米复合薄膜的拉伸强度相比没有添GO的纯CS薄膜有所提高，同时加了GO和CaSi的纳米复合薄膜的拉伸强度继续得到了提高。
实施例4
将一定质量分数的壳聚糖(CS)、氧化石墨烯(GO)混合分散到水溶液中，超声破碎直至完全分散，配成CS-GO混合水溶液，溶液中CS和GO的质量体积浓度分别为20mg/ml和0.5mg/ml；超声除去气泡后将混合溶液倾倒于培养皿中，待自然蒸发后形成单层致密膜；在膜表面喷涂一层上述混合溶液后迅速经液氮冷冻，将所得冷冻样品放入冻干机进行冷冻干燥，从而获得具有双层结构的纳米复合薄膜；对所得双层纳米复合膜进行结构、机械性能、体外降解性、细胞相容性、抑菌性等表征。
实施例5
将一定质量分数的壳聚糖(CS)、氧化石墨烯(GO)和硅酸钙纳米线(CaSi)混合分散到水溶液中，超声破碎直至完全分散，配成CS-GO-CaSi混合水溶液，溶液中CS、GO和CaSi的质量体积浓度分别为20mg/ml,0.5mg/ml和1mg/ml；超声除去气泡后将混合溶液倾倒于培养皿中，待自然蒸发后形成单层致密膜；在膜表面喷涂一层上述混合溶液后迅速经液氮冷冻，将所得冷冻样品放入冻干机进行冷冻干燥，从而获得具有双层结构的纳米复合薄膜；对所得双层纳米复合膜进行结构、机械性能、体外降解性、细胞相容性、抑菌性等表征。
如图2所示，图2为本实施例制备的纳米复合薄膜的数码照片和扫描电镜照片。
如图4所示，图4为实施例1、实施例4和实施例5制备的不同薄膜的抑菌曲线对比图，由图4可知，纯CS薄膜组相比无材料对照组表现一定的抑菌效果，加了GO的纳米复合薄膜抑菌效果有所增强，而继续加热CaSi对其抑菌效果没有影响。
如图5所示，图5为实施例3和实施例5制备的不同薄膜表面的细胞粘附曲线对比图，由图5可知，多孔层表面的细胞黏附能力相比致密层的光滑表面要明显增强。
如图6所示，图6为实施例3和实施例5制备的不同薄膜表面的粘附细胞染色对比图，由图6可知，多孔层表面可观察到更多的细胞，说明其利于细胞黏附，致密层的光滑表面细胞数量明显较少，说明其不利于细胞黏附。
如图7所示，图7为实施例3和实施例5制备的不同薄膜表面的细胞粘附情况扫描电镜照片，由图7可知，多孔层表面细胞分布较为密集、形态良好、细胞伸展，说明其利于细胞黏附，致密层的光滑表面细胞分布较少、细胞形态差，说明其不利于细胞黏附。
如图8所示，图8为本实施例制备的纳米复合薄膜的体外降解曲线图，由图8可知，该复合薄膜在模拟的活体内环境中可以持续降解，具有良好生物可降解性。
如图9所示，图9为实施例1、实施例4和实施例5制备的不同薄膜的细胞相容性对比图，由图9可知，CS膜、CS+GO膜和CS+GO+CaSi膜均具有良好的生物相容性。
实施例6
将一定质量分数的蚕丝蛋白(Fibroin)、氧化石墨烯(GO)和硅酸钙纳米线(CaSi)混合分散到水溶液中，超声破碎直至完全分散，配成Fibroin-GO-CaSi混合水溶液，溶液中Fibroin、GO和CaSi的质量体积浓度分别为20mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml；超声除去气泡后利用喷枪将混合溶液喷涂到加热的基底上形成单层致密膜；在膜表面喷涂一层上述混合溶液后迅速经液氮冷冻，将所得冷冻样品放入冻干机进行冷冻干燥，从而获得具有双层结构的纳米复合薄膜；对所得双层纳米复合膜进行结构、机械性能、体外降解性、细胞相容性、抑菌性等表征。
实施例7
将一定质量分数的壳聚糖(CS)、蒙脱土纳米片(MTM)和羟基磷灰石纳米线(HAP)混合分散到水溶液中，超声破碎直至完全分散，配成CS-MTM-HAP混合水溶液，溶液中CS、MTM和HAP的质量体积浓度分别为20mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml；超声除去气泡后利用喷枪将混合溶液喷涂到加热的基底上形成单层致密膜；在膜表面喷涂一层上述混合溶液后迅速经液氮冷冻，将所得冷冻样品放入冻干机进行冷冻干燥，从而获得具有双层结构的纳米复合薄膜；对所得双层纳米复合膜进行结构、机械性能、体外降解性、细胞相容性、抑菌性等表征。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种用于引导骨再生的双层纳米复合膜的制备方法，包括以下步骤：
A)将生物相容性有机高分子和纳米材料在水溶液中混合，得到纳米复合溶液；
B)将所述纳米复合溶液经过蒸发作用，得到致密的纳米复合薄膜；
C)在所述纳米复合薄膜的表面喷涂一层纳米复合溶液，将得到的产品于-198℃～-10℃下进行低温处理，得到双层纳米复合膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物相容性有机高分子选自胶原蛋白、蚕丝蛋白、明胶、壳聚糖和海藻酸钠中的一种或多种，所述纳米材料选自纳米β-磷酸三钙、羟基磷灰石纳米颗粒、透钙磷石纳米片、羟基磷灰石纳米纤维、硅酸钙纳米纤维、石墨烯和纳米黏土片中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳米复合溶液中所述生物相容性有机高分子的浓度为10～40mg/ml，所述纳米材料的浓度为0.1～20mg/ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蒸发作用的方式为自然蒸发作用或喷涂热蒸发作用。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低温处理具体为低温冷冻后经冷冻干燥或低温冷冻后浸入低温氢氧化钠的乙醇溶液中的处理方式。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述低温冷冻的温度为-198℃～-10℃。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述低温氢氧化钠的乙醇溶液的温度为-50～-5℃，所述低温氢氧化钠的乙醇溶液中氢氧化钠的浓度为0.1M～1M。
8.一种双层纳米复合膜，由仿生致密层和形成于仿生致密层表面的疏松多孔层组成，所述仿生致密层由生物相容性有机高分子和纳米材料通过蒸发自组装技术制备得到，所述疏松多孔层由生物相容性有机高分子和纳米材料通过冷冻冰模板法制备得到。
9.根据权利要求8所述的双层纳米复合膜，其特征在于，所述仿生致密层的厚度为10～200μm，所述疏松多孔层的厚度为5～50μm。
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