CN103394131A

CN103394131A - 一种新型双层复合引导组织再生膜及其制备方法

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Publication number: CN103394131A
Application number: CN2013103194076A
Authority: CN
Inventors: 张华林
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: CN103394131B

Abstract

本发明涉及一种新型双层复合引导组织再生膜及其制备方法，该双层复合引导组织再生膜是由外层PLGA/羟基磷灰石无孔致密膜和内层PLGA/羊毛角蛋白静电纺丝多孔膜构成。本发明利用溶剂浇铸法和高压静电纺丝法，将合成材料PLGA与天然成分羊毛角蛋白和无机成分羟基磷灰石复合在一起形成复合材料，优势互补，构建了性能优良又相对便宜的较理想的PLGA/羟基磷灰石/羊毛角蛋白双层复合引导组织再生膜。本发明的双层引导组织再生膜制备方法简单，成膜条件温和，具有良好的细胞生物相容性，符合生物体内应用的要求，作为一种新型引导组织再生膜具有良好的应用前景。

Description

一种新型双层复合引导组织再生膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种新型双层复合引导组织再生膜及其制备方法。

背景技术

引导组织再生(Guided Tissue Regeneration, GTR)是20世纪80年代初由Nyman等提出的生物学概念，最初应用于牙周病治疗。它指在龈瓣与根骨面之间放置一种屏障膜，以阻挡牙龈上皮、结缔组织与根面接触，而使具有形成新附着能力的牙周膜前体细胞在愈合过程中沿着根面生长，重新形成牙骨质、牙槽骨以及牙周纤维，建立新附着，进而达到牙周组织再生。Urist和Mclean发现，骨受损后，不同组织细胞向缺损处迁移速度不同，来自周围组织的成纤维细胞较成骨潜能细胞向缺损内迁移快，这是导致骨不连的主要原因之一。通过对骨缺损处放置GTR材料，作为一种机械屏障，将周围结缔组织阻挡于缺损外，使骨生成细胞优先生长，产生新骨，起到促进骨性愈合之目的。GTR膜产生出特殊的再生空间，一方面引导来自骨膜、骨髓的骨生成细胞向空间内迁移，增生分化，另一方面促进内源性生长活性物质的不断浓集，参与对骨生成细胞分泌活动的调控。

随着GTR技术的发展，其治疗范围已涉及到口腔种植、牙槽嵴重建、颅颌面骨骨折修复、颞下颌关节损伤修复、骨缺损修复以及生物医学等诸多方面。这一技术的产生与发展为牙周病的治疗、牙种植区骨量不足及其它骨缺损的修复提供了一个新的有效途径。

在GTR中，引导组织再生膜材料是这项技术的关键。膜的性能在一定程度上决定了引导组织再生技术的成败。理想的GTR材料，首先应是组织相容性好，无细胞毒性，不引起排斥反应。植入体内能被组织吸收，并能完全被骨组织所替代，膜的降解速度应与组织再生时间相匹配，降解产物不会抑制骨形成或加速骨吸收。另外，膜应具备一定的机械强度，利于塑型成三维结构及支撑再生空间。此外，膜易于加工消毒，便于制成临床上所需的各种形状。

总体上，GTR膜材料根据其能否被机体降解可分为两大类：不可降解性材料和可降解性材料。

不可降解材料中研究最多的是聚四氟乙烯(e-PTFE)。e-PTFE具有易操作性、柔韧性和良好的生物相容性，但在一些研究中发现植入的e-PTFE膜暴露和病菌感染导致软组织开裂的现象，是导致GTR失败的一个主要原因。此外，不可降解材料的一个显著缺点是作为异物需要二次手术取出，不但延长了治疗时间、增加了花费，而且再次手术可能对牙龈组织造成损伤。所以，目前关于引导组织再生材料的研究主要集中在可降解性材料上。

可降解性材料主要有天然的胶原和人工高分子聚合物(聚乳酸（PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)、聚羟基丁酸酯等)等,它们的生物学性能和降解性能可满足GTR的需要,且无需二次手术的痛苦和花费,保证了组织再生过程不被打扰，且临床效果与不可降解材料相当或更好，所以应用可降解膜己成为GTR的一种发展趋势，但可降解膜普遍存在着材料亲水性不足，对细胞粘附性弱，组织接合性差；降解产物偏酸性，不利于细胞生长增殖及组织修复等缺点。如胶原膜具有良好的细胞亲和性和生物相容性，已经在医学中被用来修复牙龈、骨等组织的缺损，但是胶原膜的缺陷在于：机械性能欠佳，力学强度比较低，价格昂贵，并且降解速率不易调节，无法与不同组织修复速率相匹配，会在新骨形成之前发生破裂，引起早期上皮细胞下潜而导致GTR治疗失败。因此引导组织再生膜的研究又转移到了可吸收的合成聚合物膜。目前研究最多的可吸收的聚合物膜是PLA或PLGA，这类聚合物可以通过改变其分子量和组成来调节降解速率并且具有良好的组织相容性，但是PLA和PLGA为疏水材料，降解速度过于缓慢，可能影响骨细胞的增殖与迁移，而且，其降解产物产生的乳酸易引起周围组织的炎症反应，对新骨的形成产生不利的影响。聚-β-羟丁酸具有良好的机械性能和生物相容性，降解时间为3个月，将聚-β-羟丁酸膜应用于狗的种植手术及下领骨扩大实验均表现了良好的引导骨组织再生能力，但是不足之处在于只能起到机械阻挡和隔离作用而不具备主动诱导分化和促进生长作用，从而影响和限制了其应用。

由于单一材料一般都存在一些不足，很难满足理想的GTR材料所要求的特性，所以可以通过合适的方法将几种单一材料复合，形成复合材料，取长补短，以期解决较理想的GTR材料的问题。越来越多的研究人员也开始研究复合膜，制备满足不同组织再生需求的理想的引导组织再生膜。比如，合成材料可以容易地加工成不同的形态和结构，设计制造过程中能对材料的许多性能进行控制，包括机械强度、亲水性、降解速率等。与之相比，天然材料不易加工，物理性能受限，但天然材料具有特殊的生物活性，并且通常不易引发受体的免疫排斥反应。因此实现材料优化设计的途径之一，是将合成材料与天然成分复合在一起形成复合材料，这对于构建较理想的GTR膜具有重要作用。

GTR技术经历了一个逐渐发展的过程，由于不可吸收膜存在明显的缺点，人们寄希望于可吸收膜。传统的引导组织再生膜主要是利用某些生物材料形成隔膜作用，使得受损组织局部免受周围纤维结缔组织等的影响，促进组织再生修复。利用现有的材料通过合理的设计，研制新型的引导组织再生材料，使其不但具有可生物降解、吸收的性能，并能阻止成纤维细胞等向缺损处的长入，还可以促进缺损处组织的再生修复，具有一定的生物学活性，成为正如 Susan Letal所提到的功能级材料，是引导组织再生材料研究的新方向。通过特定的方法制备具有不同组成的多层结构的材料可能实现具有上述特性，成为一类新型引导组织再生材料。因此，现在研究的热点已发展到了功能性复合膜，研究人员开始尝试采用多种材料复合与结构梯度化的研究思路，以制备出满足GTR各项要求的生物膜。

目前，以Bio-Gide为主要代表的胶原膜在国外得到广泛应用，由于价格昂贵，在国内尚难大量使用，而国内生产的引导组织再生膜存在工艺复杂、价格高、不具有骨诱导作用、材料亲水性不足，对细胞粘附性弱，组织接合性差、降解产物偏酸性，不利于细胞生长增殖及组织修复以及成骨效果不稳定等缺陷。因此，研制开发一种理想的适宜中国国情的可降解性GTR膜材料势在必行。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种具有良好亲水性能，骨诱导作用显著，细胞粘附性强，组织接合性好的双层复合引导组织再生膜；

本发明的另一目的是提供上述双层复合引导组织再生膜的制备方法。

为实现上述发明目的所采取的技术方案为：

一种新型双层复合引导组织再生膜，其特征在于是由外层PLGA/羟基磷灰石无孔致密膜和内层PLGA/羊毛角蛋白静电纺丝多孔膜构成。

上述新型双层复合引导组织再生膜的制备方法，其特征在于其工艺步骤为：首先采用浇铸法将由PLGA和羟基磷灰石构成的浇铸液制备成外层PLGA/羟基磷灰石无孔致密膜，然后采用静电纺丝法将由PLGA和羊毛角蛋白构成的纺丝液制备成的内层PLGA/羊毛角蛋白多孔膜复合到外层PLGA/羟基磷灰石无孔致密膜上。

所述浇铸液的制备方法为：将PLGA溶解在三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，使PLGA的浓度为8-15%，加入0.25%-5%g/ML的羟基磷灰石，充分搅拌并超声震荡30-60min即可。

所述浇铸法为首先将浇铸液倒入平板上，静置于通风橱中，缓慢挥发溶剂48-72h后揭膜。

所述纺丝液的制备方法为：首先将PLGA溶解在三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，使PLGA的浓度为15-20%，然后加入羊毛角蛋白粉末0.25%-5% g/ML，充分搅拌并超声震荡30-60min即可。

所述三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为8:2-5:5。

所述静电纺丝法中控制接收距离13-18cm。

所述静电纺丝法中控制纺丝液流量为0.2-0.5ml/h。

所述静电纺丝法中控制高压电压到达为15-20KV。

本发明将合成材料---聚乙交酯-丙交酯共聚物（PLGA）与天然成分---羊毛角蛋白和无机成分羟基磷灰石（HA）复合在一起形成复合材料，优势互补，构建PLGA/羟基磷灰石/羊毛角蛋白双层复合引导组织再生膜。一方面，羊毛角蛋白、羟基磷灰石可能改善PLGA的细胞亲和性和生物活性，减轻PLGA引起的无菌性炎症反应的发生率，另一方面，PLGA可以提高羊毛角蛋白的机械性能，从而更加符合理想的引导组织再生材料的要求。本发明的复合膜材料不仅能综合了羊毛角蛋白的生物相容性，HA的骨引导性和PLGA的力学性能等优势，有效避免了PLGA降解过程中而引起的无菌炎症反应，还能够充分发挥引导组织再生的功能，这种材料复合和结构体度化的概念在其它生物材料里也同样得到了应用。

静电纺丝(electrospinning)，是一种利用聚合物溶液或熔体在强电场作用下形成喷射流进行纺丝加工的工艺。由静电纺丝制备出的纳米纤维由于具有小尺寸、大比表面积和特殊的表面与界面效应，从而表现出传统纤维材料所不具备的独特性能，成为当今材料科学技术的前沿和研究热点。

目前，静电纺丝纳米纤维的另一重要应用集中在组织工程方面。由于静电纺丝制备的纳米纤维支架与细胞外基质在形态结构上非常相似，作为组织工程支架材料不仅能起到支撑细胞的作用，还能发挥模板的功能，为细胞提供赖以寄宿、生长、分化和增殖的场所，引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。因此，由胶原、明胶、丝素蛋白、壳聚糖等天然高分子材料和聚乳酸、聚己内酯等人工合成生物高分子材料均可以通过静电纺丝制备成纳米纤维材料，广泛应用于软骨、骨、皮肤、血管、神经等组织工程和修复再生方面。

因此，本发明依据材料优化设计和结构梯度化的研究思路进行生物材料的合成设计，利用溶剂浇铸法和高压静电纺丝法，将合成材料---PLGA与天然成分---羊毛角蛋白和无机成分羟基磷灰石复合在一起形成复合材料，优势互补，构建了性能优良又相对便宜的较理想的PLGA/羟基磷灰石/羊毛角蛋白双层复合引导组织再生膜。该再生膜，其外层为PLGA/羟基磷灰石无孔致密膜材料，内层为PLGA/羊毛角蛋白静电纺丝多孔膜材料。外层的致密层可以阻挡来自周围组织的成纤维细胞向缺损区内迁移，而内层的多孔层可以作为一种支架，使源自骨膜、骨髓的骨生成细胞在其表面贴附、增殖分化为成骨细胞，成骨细胞沿膜内壁爬行，使骨缺损由两端向中央生长，膜起架桥连接作用，产生新骨，起到促进骨性愈合之目的。

本发明分别用扫描电镜、红外光谱、热重分析以及万能力学测试机等对复合膜进行了理化性能表征。本发明还观察了大鼠骨髓间充质干细胞在复合支架上的粘附、增殖能力。结果表明PLGA/羟基磷灰石/羊毛角蛋白双层复合引导组织再生膜具有优良的力学性能、降解性能等，同时还具有良好的细胞生物相容性，符合生物体内应用的要求，作为一种新型生物膜具有良好的应用前景。通过溶剂浇铸法和高压静电纺丝技术制备的PLGA/羟基磷灰石/羊毛角蛋白双层复合引导组织再生膜在组织工程领域有较大的应用潜力，尤其是作为组织工程的支架用于组织再生。本发明对以后可降解性引导组织再生膜材料的合成与应用的将会提供更广阔的前景，以适应各种临床硬组织缺损再生的需要。

一、 PLGA/HA/羊毛角蛋白双层复合引导组织再生膜的表征

（1）仪器与设备扫描电子显微镜（JSM-5900LV，JEOL，日本）；透射电子显微镜 (JEOL JEM-100CX, Japan)；傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet 560, Nicolet Co., 美国）；差示扫描量热仪（TA Instruments DSC, Q100, 美国）；万能力学测试机（Instron 4302 Microtester, 美国）。

（2）实验方法

用扫描电子显微镜（SEM）、傅立叶变换红外光谱仪、万能力学测试机、差示扫描量热仪等检测复合膜的表面形貌、机械性能、热学性能、降解性能等：双层复合膜在通风橱中放置2-3天，使复合物中残留的溶剂挥发完全后，取复合膜样本，将其表面经离子溅射仪喷金镀膜后，用扫描电镜观察复合膜的表面形态，然后采用Smile View 图像分析软件进行扫描电镜照片中纤维直径的统计；用傅立叶变换红外光谱仪分析复合支架在4000cm^-1到200cm^-1区间的红外光谱图；用差示量热扫描仪观察复合膜的玻璃化温度和分解温度。样品从30℃加热到400℃，升温速度为10℃/min，氮气通入速度为30ml/min；用万能力学测试机测试复合膜的抗张强度，弹性模量以及断裂伸长率。用螺旋测微仪测量复合膜的厚度，并将复合膜制成10mm×70mm的长条形试样进行拉伸测试，每一种试样的数量为5个，拉力机的拉伸速度为5mm/min；用PBS浸泡法检测复合膜的降解性能。将20片内层为PLGA/1%羊毛角蛋白的双层膜分成四组，每组五个样，每个剪成约15×15mm大小。每组样品都被放在37°C水浴的50ml的磷酸盐缓冲液中（PBS，pH 7.4），共4周。PBS液每3-4天更换一次。在1,2,3,4周时，将样本取出，蒸馏水清洗样品，用红外光谱检测羊毛角蛋白的释放情况。

结果显示，外层PLGA/HA膜为无孔、致密结构的复合膜，PLGA基质表面有散在的分布均匀的HA颗粒，内层的PLGA/羊毛角蛋白膜为长而连续的电纺纤维构成。PLGA/羊毛角蛋白膜是由超细纤维构成的三维多孔结构。羊毛角蛋白的加入增大了复合纤维的直径，例如，纯PLGA纤维的直径仅为717nm，而含1.0%羊毛角蛋白的PLGA/羊毛角蛋白复合纤维的直径为2194nm。红外光谱分析显示，羊毛角蛋白粉末出现了特征性的–CONH–吸收峰（氨基I-III）。其中，N–H伸缩振动峰位于3300–3500 cm^-1，另外，位于1650, 1534, 和1230 cm^-1的吸收峰分别对应 C=O 伸缩( 氨基I)，N-H 变形和C–H 伸缩( 氨基II)，C–N伸缩和N-H 变形( 氨基III)。此外，在1650, 1630–1520, 和1230 cm^-1处的吸收峰分别对应α-螺旋，β-折叠和无规卷曲结构。外层PLGA/羊毛角蛋白膜的红外曲线与PLGA膜非常相似，推断是因为羊毛角蛋白含量很少，又被包裹在PLGA基质内的缘故。热重分析结果显示，将羊毛角蛋白加入到PLGA中增加了复合膜的热稳定性,加入少量的羊毛角蛋白则可使复合膜的分解温度提高15-16度。机械性能分析表明，加入角蛋白后，双层膜的机械性能（弹性模量，抗张强度和断裂伸长率）明显优于内层为纯PLGA的双层膜。如内层为PLGA/0.25%羊毛角蛋白的双层膜的抗张强度比内层为纯PLGA的双层膜提高了13.8%，而断裂伸长率则提高了6倍。双层膜降解的第一天，羊毛角蛋白颗粒释放速度很快，约50%，这是由于位于膜表面的角蛋白颗粒的丢失，接下来的降解过程中，羊毛角蛋白释放速度减缓，4周后，双层膜中仍有约11%的羊毛角蛋白存在。

二、 PLGA/HA/羊毛角蛋白双层复合引导组织再生膜的体外细胞生物相容性

（1）主要试剂

α-MEM，胰蛋白酶，MTT，胎牛血清(Sigma 公司，美国)，其余试剂均为分析纯。

（2）仪器与设备

CO₂ 培养箱(Heraeus 公司，德国)，酶联免疫检测仪(Benchmark, Bio-Rad, 美国)，超净工作台( 苏州安泰空气技术有限公司，中国苏州)。

（3）实验方法

① 骨髓间充质干细胞的分离与培养：取6-8周龄SD雄性大鼠，体重150～200g，戊巴比妥钠（0.3～0.6mg/100g）腹腔注射麻醉。双下肢备皮，将大鼠胸部以下浸泡在75％酒精中10～15min，无菌切取其双下肢。超净工作台内剥除其股骨、胫骨上附着的肌肉组织，咬骨钳咬除其干骺端后，用注射器装入无血清的α-MEM培养液反复冲洗骨髓腔。将所得的冲洗液置于25ml的培养瓶内，向瓶内加入约5ml的α-MEM培养基（含15%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素）。然后，将培养瓶置于37°C含5%CO₂饱和湿度的培养箱中恒温培养。1天后于倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，3天后更换培养基，弃去未贴壁的细胞，以后每三天更换一次培养基。待贴壁细胞接近铺满瓶底时，0.5%胰蛋白酶消化，按1:2或1：3比例传代培养，获得原代骨髓间充质干细胞。取P3细胞待用。

② 骨髓间充质干细胞的接种：实验组为内层膜羊毛角蛋白含量分别为1%g/ML的双层膜，空白对照组为内层为纯PLGA膜的双层膜。将消毒后的材料放入六孔板中，向培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶溶液约1 ml消化，倒置相差显微镜下观察，当细胞逐渐变圆，并开始脱离瓶壁时，加入α–MEM培养基中止消化，用吸管轻轻吹打成细胞悬液并在光镜下计数，用培养基调整细胞浓度。将浓度为5×10⁴个/ml的细胞悬液常规接种于材料表面，每孔加入2ml，进行SEM，MTT测定；将浓度为1×10⁵个/ml的细胞悬液常规接种于材料表面，每孔加入2ml，进行碱性磷酸酶ALP测定。

细胞形态学观察

在倒置相差显微镜下观察样本侧壁及周边细胞的生长，并在培养8小时和72小时后，从各组分别取出一块材料，PBS漂洗3遍，2.5%戊二醛固定过夜，40-100%乙醇梯度脱水约20min，醋酸异戊脂置换，临界点干燥，样品喷金后扫描电镜观察细胞形态。

细胞增殖情况测定-MTT法

将实验组和对照组的样品置于6孔板内，加入α–MEM培养基，然后将培养的细胞以5×10⁴个/ml的密度接种于放有试样的培养板内（回答：培养板内有α–MEM培养基），分别在第1，3，5，7天取每组试样加入MTT溶液(5mg/m1)40μl，37°C下继续培养4小时，终止培养，小心吸弃孔内的上清液，每孔加入420μl的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。吸取每孔中液体100ml到96孔板内，492nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，记录结果。

细胞碱性磷酸酶ALP检测样本的收集

将实验组和对照组材料放入六孔板中，加入α–MEM培养基，然后将培养的细胞以1×10⁵个/ml的密度接种于样品上，培养第3，7，10天后分别取出样品，收集细胞。先用PBS漂洗3遍，洗净未附着的细胞，0.25%胰蛋白酶消化。然后将每个样本的细胞悬液加入离心管，1000转/分离心8分钟。用PBS液反复冲洗，吹打，再次离心，重复两次，去除胰酶影响。最后一次去上清液后将离心管倒置，待管壁液体去尽后在管中加入120μl的PBS液，反复吹打形成细胞悬液，移入EP管中，密封，-20°C低温保存备用。收集完所有样本后，将其置于-70°C的冰箱中反复冻融三次，使骨髓间充质干细胞破裂形成冻溶液。

结果显示，培养8小时后，在内层为纯PLGA的双层膜（对照组）表面，粘附细胞数量较少，胞体呈细长梭形，面积较小，表明细胞尚未发生铺展。而在实验组表面，细胞数量明显较对照组多，细胞分布均匀，细胞己经开始铺展，部分呈多突起状借伪足附着于材料表面。这些结果说明加入羊毛角蛋白的膜更有利于细胞与材料间初始的相互粘附作用，也表明双层膜具有良好的细胞细胞相容性。培养3天后，内层为PLGA/羊毛角蛋白的双层膜组细胞已经相互融合，基本铺满整个支架表面，而对照组尚未完铺满支架表面。从培养的第一天到第七天，两组细胞的数量都随培养时间的增加而增加。培养第一天和第三天时，实验组细胞的数量都比对照组高，但彼此之间差异不大，各组之间无统计学差异(P>0.05)。培养第五天和第七天时，实验组细胞的数量与对照组相比有了显著的增加，均具有统计学差异(P<0.05)。这也意味着培养在内层为PLGA/羊毛角蛋白双层膜上的细胞增殖的速度和活性明显高于对照组。ALP结果显示，随着时间的延长，实验组细胞ALP活性有明显增高，其ALP值在第10d时(4.86±0.50)比培养3d时(1.47±0.42)提高三倍余。与对照组相比较，实验组在各时间点ALP活性均有统计学差异，说明细胞在实验组膜表面功能分化活力比对照组旺盛。SD大鼠骨髓间充质干细胞在外层PLGA/0.5%HA膜上培养72h后，细胞之间相互融合，完全铺满材料表面。结果表明，双层膜材料对细胞没有毒性，且能明显促进细胞的体外增殖，具有良好的细胞生物相容性。

附图说明

图 1为电纺的PLGA/1.0%羊毛角蛋白膜的扫描电镜图；

图 2为SD大鼠骨髓间充质干细胞在外层PLGA/0.5%HA膜上培养72h的扫描电镜图；

图3为SD大鼠骨髓间充质干细胞在内层PLGA/1.0%羊毛角蛋白膜上培养72h的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

1、羊毛角蛋白的提取

制备方法如下：

① 过醋酸溶解：羊毛洗净烘干，按过醋酸：水= 2：1的比例配成过醋酸溶液，用于羊毛的溶解，温度在90～95℃，处理40-60 min后基本溶解。

② 氨水中和：把氨水滴入溶解液中，当溶液的pH值为6．0左右时有淡黄色物质析出。

③ 过滤：用涤纶筛网过滤溶液，滤掉淡黄色物质。

④ 透析：将过滤后的溶液装入透析袋，在流动水中透析24-48h，滤去溶液中的小分子。

⑤ 盐酸滴定：用盐酸滴人溶液至pH值为4．0左右，此时pH值在羊毛角蛋白的等电点附近，蛋白质溶解度最小，因此出现大量白色沉淀物。

⑥ 提取沉淀物：将含有白色沉淀物的溶液用离心沉淀器沉淀，倒去溶液，用蒸馏水洗涤沉淀物后，离心沉淀，取出沉淀物，通过旋转真空蒸发器和喷雾干燥器得到羊毛角蛋白粉末。

2、用溶剂浇铸法和高压静电纺丝法制备PLGA/HA/羊毛角蛋白双层复合膜

（1）主要试剂

PLGA(分子量1×10⁵g/mol，PLA:PGA=75:25，山东岱罡生物技术有限公司，济南)；水热合成的HA纳米颗粒（平均直径20-40nm）由四川大学材料与工程学院提供；羊毛购于昆山三利羊毛碳化有限公司（中国江苏）；其余试剂均为分析纯。（2）仪器与设备高压静电纺丝机（永清华源生物材料科技有限公司）；超声波清洗机（KQ-100DE，昆山舒美超声仪器有限公司，中国上海）。（3）实验方法

① 外层浇铸液的配置：将PLGA溶解在三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中（三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为8:2-5:5），使PLGA的浓度为8-15%，体积为15-25ml,加入0.25%-5%g/ML的羟基磷灰石（HA)，充分搅拌并超声震荡30-60min，作为浇铸液备用。

② 浇铸法得到外层PLGA/HA膜：将浇铸液倒入特制的玻璃平板上，静置于通风橱中，缓慢挥发溶剂48-72h后揭膜。此溶剂浇铸法形成一层无孔、致密结构的PLGA/HA膜。

③ 内层纺丝液的配置：将PLGA溶解在三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂中（三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为8:2-7:3），使PLGA的浓度为15-20%，,加入羊毛角蛋白粉末浓度分别为0.25-5%g/ML，充分搅拌并超声震荡30-60min，作为纺丝液备用。

④ 静电纺丝法制得内层PLGA/羊毛角蛋白膜：使用高压静电纺丝设备，将纺丝液装入注射器，将一个7号金属针头尖端磨平并与注射器相连，将注射器安放在螺杆驱动器上，同时使注射器的金属针头与高压电源相连，将用溶剂浇铸法得到的致密结构的PLGA/HA膜放在接地的转鼓上作为接收装置，金属针头与接收装置之间的距离为接收距离，接收距离13-18cm。开启螺杆驱动器电源，装有纺丝液的注射器便由螺杆驱动器推动并控制流量，将流量均设定为0.2-0.5 ml/h，纺丝液供给到喷丝头然后流入毛细管后形成滴液；开启高压静电发生器电源，喷丝头上即加载了高压静电，电压到达一定值时（15-20KV)，纺丝液射流即从喷丝头中喷出，开始静电纺丝。在高压静电纺丝过程中，疏松多孔，具有三维纤维结构的PLGA/羊毛角蛋白超细纤维不断沉积在接收装置（PLGA/HA致密单层膜）上形成纤维复合膜，纺丝结束后，即可制备得到双层结构的引导组织再生复合膜。将制得双层复合膜置于干燥器中过夜。

Claims

1.一种新型双层复合引导组织再生膜，其特征在于是由外层PLGA/羟基磷灰石无孔致密膜和内层PLGA/羊毛角蛋白静电纺丝多孔膜构成。

2. 一种如权利要求1所述的新型双层复合引导组织再生膜的制备方法，其特征在于其工艺步骤为：首先采用浇铸法将由PLGA和羟基磷灰石构成的浇铸液制备成外层PLGA/羟基磷灰石无孔致密膜，然后采用静电纺丝法将由PLGA和羊毛角蛋白构成的纺丝液制备成的内层PLGA/羊毛角蛋白多孔膜复合到外层PLGA/羟基磷灰石无孔致密膜上。

3. 按照权利要求2所述的新型双层复合引导组织再生膜的制备方法，其特征在于所述浇铸液的制备方法为：将PLGA溶解在三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，使PLGA的浓度为8-15%，加入0.25%-5%g/ML的羟基磷灰石，充分搅拌并超声震荡30-60min即可。

4. 按照权利要求2所述的新型双层复合引导组织再生膜的制备方法，其特征在于所述浇铸法为首先将浇铸液倒入平板上，静置于通风橱中，缓慢挥发溶剂48-72h后揭膜。

5. 按照权利要求2所述的新型双层复合引导组织再生膜的制备方法，其特征在于所述纺丝液的制备方法为：首先将PLGA溶解在三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，使PLGA的浓度为15-20%，然后加入羊毛角蛋白粉末0.25%-5% g/ML，充分搅拌并超声震荡30-60min即可。

6. 按照权利要求3或5所述的新型双层复合引导组织再生膜的制备方法，其特征在于所述三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为8:2-5:5。

7. 按照权利要求2所述的新型双层复合引导组织再生膜的制备方法，其特征在于所述静电纺丝法中控制接收距离13-18cm。

8. 按照权利要求2所述的新型双层复合引导组织再生膜的制备方法，其特征在于所述静电纺丝法中控制纺丝液流量为0.2-0.5ml/h。

9. 按照权利要求2所述的新型双层复合引导组织再生膜的制备方法，其特征在于所述静电纺丝法中控制高压电压到达为15-20KV。