CN110975007A - 一种具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜及其制备方法 - Google Patents

一种具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜及其制备方法，该引导组织再生膜是由碱性成纤维细胞生长因子与合成高分子化合物聚乳酸‑羟基乙酸共聚物、天然成分羊毛角蛋白构建而成。本发明复合膜不仅可以阻挡来自周围组织的成纤维细胞向缺损区内迁移，使牙周膜细胞优先在牙根面迁移、附着、增殖和分化；而且生长因子的持续释放可主动调控细胞功能，加速诱导细胞的生长、增殖和分化，以期获得更多的牙周组织再生。本发明的引导组织再生膜，制备方法简单，成膜条件温和，具有良好的细胞相容性和主动诱导牙周组织的再生的性能，符合生物体内应用的要求，作为一种有诱导组织再生作用的生物膜具有良好的应用前景。

Description

一种具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜及其制备方法。
背景技术
牙周病是一种可引起牙齿支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质) 的破坏，最终导致牙齿松动脱落的慢性、非特异性、感染性疾病。它是人类最常见的口腔疾病之一，也是成年人牙齿缺失的首要病因。牙周病不仅会影响口腔健康，对全身健康也有一定的影响。
牙周病治疗的目标一是阻止的疾病进展，二是使丧失的牙周组织再生。其中实现牙周组织的再生是治疗成功的关键。传统的治疗方法如刮治、根面平整及植骨术等都只能恢复部分牙周组织的结构并会残留牙周袋，难以实现牙周组织的完全再生，而牙周引导组织再生术(Guided Tissue Regeneration，GTR)为解决这一难题带来了希望。牙周引导组织再生术是利用GTR膜的物理屏障作用，将不同类型的组织隔离开，使牙周膜细胞优先在牙根面迁移、附着、增殖和分化，从而诱导牙周组织的再生。
尽管大量的随机对照临床试验和病例报告研究等都已证实GTR技术对于牙周和骨缺损再生修复的疗效是肯定的，但对于严重破坏的牙周炎和大面积的牙周骨缺损，GTR 术组织再生量有限，达不到修复要求是影响其疗效的重要原因之一。
众所周知，GTR术中，GTR膜材料是这项技术的关键，直接影响到最终的修复效果。但是，单纯的GTR膜只是起到了机械性阻挡和隔离作用，缺乏主动诱导组织再生修复的能力。因此，如能将 GTR 膜材料与诱导剂或生长因子等结合，改善 GTR 膜材料的性能，有望解决以上提到的GTR术组织再生量有限的问题。
一般来说，理想的GTR膜应具备以下几个特点：(1)能满足GTR的基本要求，即有效地抑制上皮细胞和结缔组织细胞的移动，促进牙周膜细胞生长；(2)具有良好的生物相容性和细胞亲和性，同时无细胞毒性及免疫原性；(3)在体内可降解，降解产物对组织无副作用，降解速率可调节，并与组织再生速率相协调；(4)加工性能好，易塑形，具有一定的机械强度、柔韧性和外科手术可操作性。
由于单一材料一般都存在一些不足，很难满足理想的GTR材料所要求的特性，所以可以通过合适的方法将几种单一材料复合，形成复合材料，取长补短，以期解决较理想的GTR材料的问题。越来越多的研究人员也开始研究复合膜，制备满足不同组织再生需求的理想的引导组织再生膜。比如，合成材料可以容易地加工成不同的形态和结构，设计制造过程中能对材料的许多性能进行控制，包括机械强度、亲水性、降解速率等。与之相比，天然材料不易加工，物理性能受限，但天然材料具有特殊的生物活性，并且通常不易引发受体的免疫排斥反应。因此实现材料优化设计的途径之一，是将合成材料与天然成分复合在一起形成复合材料，这对于构建较理想的GTR膜具有重要作用。
目前，以Bio-Gide为主要代表的胶原膜在国外得到广泛应用，由于价格昂贵，在国内尚难大量使用，而国内生产的引导组织再生膜存在工艺复杂、价格高、不利于细胞生长增殖及组织修复以及成骨效果不稳定等缺陷。此外，国内外商品化的GTR膜没有主动诱导组织再生的作用。因此，研制开发一种理想的载生长因子具有主动诱导组织再生作用的GTR膜材料势在必行。
碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）广泛存在于神经外胚层和中胚层来源的细胞中，是一种多态生长因子，是细胞的主要有丝分裂原和形态发生因子。bFGF 具有促进新生血管形成、促进软骨、骨组织损伤修复以及促进软组织损伤修复的作用。
药物递送系统是利用某些制剂或装置将治疗药物引入体内，并通过控制体内释放的部位、速率和时间来增强其功效和安全性。通过静电纺丝法制备的纳米纤维材料具有高比表面积、高孔隙率以及与细胞外基质结构相似等优势，被广泛应用于组织再生和药物递送系统中。传统的静电纺丝技术将药物和有机高分子聚合物物理共混制备复合纳米纤维作为药物递送系统，然而当运输的药物为活性大分子时，这种混纺的方式不仅会对蛋白的分子结构造成破坏，而且混纺纤维不具备药物控释的能力，在药物释放初期容易产生“突释”现象。
静电纺丝技术的发展，使得制备具有芯壳结构的纳米纤维成为可能。通过乳液静电纺丝法，将有活性的生物大分子包裹于纤维的芯层，不仅能够有效减少电纺过程中对分子结构的破坏，还能够通过壳层物质降解速率的不同有效控制负载药物的释放。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种载生长因子bFGF、具有主动诱导组织再生作用的引导组织再生膜；
本发明的另一目的是提供上述引导组织再生膜的制备方法。
为实现本发明目的所采取的技术方案为：
一种具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜，其特征在于该引导组织再生膜中是由碱性成纤维细胞生长因子与合成高分子化合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物、天然成分羊毛角蛋白构建而成。
上述具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜的制备方法，其特征在于其工艺步骤为：
1）水相溶液的配置：将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）冻干粉溶解于含牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，形成碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液，其中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）含量为0.5～4g/L，牛血清白蛋白含量为0.1%～0.5%（w/v）；
将右旋糖酐(DEX)溶解于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，充分搅拌均匀形成浓度为0.12～0.15g/mL 的右旋糖酐溶液；
将碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液同右旋糖酐溶液按照体积比1:13～1:15比例混合，得到右旋糖酐/碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白混合溶液，作为水相溶液备用，最终水相溶液中bFGF的浓度为0.03～0.3g/L；
2）油相溶液的配置：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶解于三氯甲烷（CHCl3）与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶剂中，然后加入羊毛角蛋白，充分震荡混匀，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羊毛角蛋白混合溶液，作为油相溶液备用，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）浓度为15～20%，羊毛角蛋白浓度为1.0%～1.5%（w/v）；
3）复合膜制备：将上述水相溶液按照体积比1:11～1:13的比例逐滴加入到油相溶液中，在0～4℃下高速搅拌，形成电纺液，然后将纺丝液采用静电纺丝技术复合成纤维复合膜。
过程2）中，所述三氯甲烷（CHCl3）与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶剂的体积比为8:2～5:5。
过程3）中，所述静电纺丝技术参数为：电压15～20 kV，接收距离14～16cm，流量0.2～0.3mm/min。
本发明依据材料优化设计的思想，采用乳液静电纺丝法，将碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）与合成高分子化合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]及天然成分羊毛角蛋白复合，构建了具有芯壳结构、理化性能优良、将bFGF包裹在芯层并能持续缓释bFGF以及细胞相容性好的复合引导组织再生膜。该复合膜不仅可以阻挡来自周围组织的成纤维细胞向缺损区内迁移，使牙周膜细胞优先在牙根面迁移、附着、增殖和分化；而且生长因子的持续释放可主动调控细胞功能，加速诱导细胞的生长、增殖和分化，以期获得更多的牙周组织再生。
本发明的引导组织再生膜其制备方法简单，成膜条件温和，具有良好的细胞相容性和主动诱导牙周组织的再生的性能，符合生物体内应用的要求，作为一种有诱导组织再生作用的生物膜具有良好的应用前景。
本发明为具有药物缓释功能的载生长因子引导组织再生膜的开发以及牙周病的再生治疗提供实验基础和理论依据。且将来组织工程的发展方向必将与材料学、药物学、分子生物学、细胞学、基因学及多种技术结合。通过与本发明综合应用，且未来如果类似的药物缓释系统能够研制成功，并且能够做成生物支架的形式，对以后多功能组织工程支架的构建与应用将会提供更广阔的前景。
以下是针对本发明载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的复合膜理化性能、药物体外释放性能及细胞毒性等检测试验。
一、载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的制备、理化性能表征及药物体外释放行为检测
（1）主要试剂
PLGA（中国，济南岱罡生物），羊毛角蛋白（中国，广州禾大），bFGF（美国，Peprotech），牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）（美国，Sigma），右旋糖酐（dextran，DEX）（美国，Sigma）。
（2）仪器与设备
静电纺丝机（中国，永康乐业），透射电子显微镜（日本，JEOL），X射线衍射仪（日本，Rigaku），扫描电子显微镜（日本，JEOL），傅里叶变换红外光谱仪（德国，布鲁克）。
（3）实验方法
① 乳液静电纺丝法制备载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜
水相溶液的配置：将5～40μg bFGF冻干粉加入到含0.1%～0.5%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的PBS中将其溶解，bFGF的浓度为0.5～4g/L，静置混匀后，将bFGF/BSA溶液于-20℃至-80℃下分装冻存待用。
将右旋糖酐（DEX）溶解于PBS中，DEX的浓度为0.12～0.15g/mL，充分搅拌混匀后，加入配置好的bFGF/BSA 混合溶液，bFGF/BSA 溶液与DEX溶液体积比为1:15～1:13，将混匀后的DEX/bFGF/BSA溶液作为水相（W），最终水相溶液中bFGF的浓度为0.03～0.3g/L。
油相溶液的配置：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶解于三氯甲烷（CHCl3）与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶剂（比例8:2-5:5）中，配置成15～20% w/v的PLGA 溶液，然后加入羊毛角蛋白，羊毛角蛋白在溶液中浓度1.0%～1.5%（w/v），充分震荡混匀，得到PLGA/羊毛角蛋白混合溶液，将其作为油相（O）。
复合膜制备：以水油体积比为1：11～1：13，将bFGF的水相溶液（W）逐滴加入到油相溶液（O）中，在4℃下高速搅拌，配制成载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白乳液电纺液备用。
将载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白乳液电纺液装入静电纺丝仪的注射装置中，在电压为15～20kv，速度为0.2～0.3mm/min，接收距离为14～16cm时进行电纺，得到的纳米纤维样品分别接收于锡箔纸上，待电纺完成后，将样品放于恒温干燥箱中待有机溶剂挥发完全后保存待用。
② 表面形貌、理化性能表征
利用扫描电子显微镜观察载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的表面形貌。利用透射电子显微镜观察载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的纤维内部形貌。利用荧光显微镜观察PLGA/羊毛角蛋白复合膜是否成功负载了bFGF。用X-线衍射仪检测复合膜的X射线衍射图谱，采用Cu靶，加速电压为 40kV，管电流为40mA，角度为3～85°。
③ bFGF包裹效率
精确称量载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜，设置三个平行样，溶解于CHCl3，震荡摇匀，完全溶解后，以600μL的双蒸水反复萃取五次，并进行适当稀释，以ELISA试剂盒测定溶液中bFGF含量，并代入标准曲线，计算bFGF的包裹量和包裹效率。
包裹效率=（实际包裹量/理论包裹量）×100%
④ 药物释放
精确称量载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜，每组设置三个平行样，标号后放在不同离心管内，分别加入2mLPBS浸泡，将所有离心管放于37℃恒温水浴锅中轻微震荡，预定时间（1h、4h、8h、24h、3d、7d、14d、21d和28d）将溶液全部吸出，于-80℃冰箱保存，并补充2mL新鲜的PBS继续浸泡。待样本收齐后取出，用ELISA试剂盒测定bFGF的释放量，并绘制释放曲线。
⑤ 结果
扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）结果（如图1）显示，通过乳液静电纺丝法制备的载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜纤维粗细均匀、表面光滑、无串珠样结构，不含bFGF的电纺膜与含不同含量bFGF的电纺膜表面形貌无明显差异。
透射电镜结果(transmission electron microscopy，TEM)（如图2）显示，载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜具有稳定、连续的芯壳结构。
荧光显微镜结果（如图3）显示，载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜纤维出现绿色的荧光效应，证明乳液电纺技术将bFGF-FITC成功搭载于纤维中，并呈现连续性。
X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）结果显示，通过乳液电纺制备的载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的曲线与普通电纺法制备的在晶型上与PLGA/羊毛角蛋白复合膜一样，均为非晶态，这说明bFGF/BSA和DEX被包裹在纤维的芯层且因为添加量非常低，并没有明显影响到PLGA/羊毛角蛋白复合膜的晶型。
载5、10、20、30、40μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的包裹率分别为94.6%±18%、97.3%±11.3%、95.03%±9.3%、84%±5.78%、96.7%±3.72%。
药物释放结果（如图4）表明，载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜在28天内均能够持续稳定的释放bFGF，且在第28天时仍能够检测到bFGF在持续释放。通过释放曲线可以发现，bFGF的释放可分为三个阶段，第一个阶段为体外释放实验的24h内，复合膜显示出轻微的突释反应；体外释放的24小时至第7天，bFGF进入零级释放阶段，即第二阶段，以恒定的速率释放bFGF；随着时间的延长，在体外释放的7至28天，bFGF的释放速率逐渐减慢，进入缓慢释放期即第三阶段，通过复合膜的逐步降解实现对bFGF持续的控制释放。
二、载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白引导组织再生膜的细胞相容性检测
（1）主要试剂
DMEM/F-12培养基、PBS、胎牛血清（美国Hyclone），3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]细胞增殖-细胞毒性检测试剂盒。
（南京，凯基）。
（2）仪器与设备 s-3400N扫描电子显微镜（日本，HITACHI），CO2 培养箱(德国，Heraeus)。
（3）实验方法
① 细胞相容性检测
将剪好并灭菌的载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜分别放置于24孔板底部，每孔加入200μL细胞培养液优先润湿复合膜表面，随后将第4代牙周膜成纤维细胞以1×105个/mL接种于复合膜上，每组设置三个平行样。分别于2、4、7天取出培养板，吸去孔中的培养液并用PBS轻轻冲洗干净后，加入固定液，于4℃固定2小时后，用缓冲液轻轻将复合膜冲洗3次，每次15min。随后用锇酸4℃固定1h后，再次用缓冲液冲洗2次，每次15min。冲洗完成后用酒精梯度脱水，脱水完成后加入叔丁醇并进行真空干燥。待样本完全干燥后喷金，在扫描电镜下观察细胞形态。
将剪好并灭菌的载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜分别放置于24孔板底部，每孔加入200μL细胞培养液润湿复合膜表面，随后将第4代牙周膜成纤维细胞以1×105个/mL接种于复合膜上，每组设置三个平行样。并于1、3、5、7天进行MTT检测。
将剪好并灭菌的载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜分别放置于24孔板底部，每孔加入200μL细胞培养液润湿复合膜表面，随后将第4代牙周膜成纤维细胞以1×105个/mL接种于复合膜上，每组设置三个平行样。观察细胞生长情况，待细胞融合至60-70%时，将培养基更换为成骨诱导培养基，进行成骨诱导，并于诱导的1、3、7、10、14天取出培养板进行碱性磷酸酶活性的测定。
② 结果
SEM结果（如图5）显示，在细胞接种的初期，细胞培养第2天，六组复合膜上细胞量均较小，细胞量差异不明显，即使是不含bFGF的复合膜也有利于细胞的黏附；但含30、40μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜由于累积释放的bFGF含量较高，过量的bFGF抑制细胞的增殖和活性，所以这两种复合膜中的细胞形态较差，不够饱满；而含5、10μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜中的细胞形态更饱满，充分铺展，伪足也更长。培养第4天时，细胞形态与第2天相比，更加饱满、伸展更充分、伪足更多，且细胞在纤维膜上能够顺着一个方向排列生长。六组复合膜中，以含5、10、20μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜上的细胞形态更好、更饱满，并且在含10μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜上的细胞最多。第7天时，纤维膜上的细胞增殖融合，黏连成片，尤其是含10μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜，其上的细胞最多，基本完全覆盖了复合膜表面。其次为含5μg和20μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜，不含bFGF的复合膜以及含30、40μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜上的细胞形态不如前几组且数量偏少。
MTT结果（如图6）显示，随着时间的延长，六组复合膜上的细胞均成对数增长。将同组复合膜上细胞在不同时间点MTT检测的OD值进行单因素方差分析，结果显示，同组复合膜在不同时间点细胞数量差异具有显著性（P＜0.001，P＜0.05），说明随着时间的延长，六组复合膜上的细胞数量具有统计学差异，均能够不同程度促进hPLDFs的黏附和增殖。将六组复合膜在各时间点MTT检测的OD值进行单因素方差分析，并用LSD法分别进行两两比较，结果显示：与其余五组复合膜相比，含10μg bFGF的复合膜在第1、3、5、7天的OD值均最高，且组间差异均具有显著性，说明在MTT检测的7天内，含10μg bFGF的复合膜上细胞量最多，与其他五组复合膜上细胞量差异具有统计学意义。因此，含10μg bFGF的复合膜对细胞增殖的的促进作用最显著。
碱性磷酸酶（ALP）测定详细结果显示，六组复合膜在第1、3、7、10、14天各时间点的ALP结果均具有统计学意义（F=59.089/126.229/56.687/113.665/61.762/76.624，P＜0.001/＜0.001/＜0.001/＜0.001/＜0.001/＜0.001，P＜0.05），说明随着时间的延长，六组复合膜上的细胞ALP活力具有统计学差异，且六组复合膜对hPLDFs的ALP活性具有不同程度的促进作用。第7天，载5、10、20、30、40μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜上细胞的ALP活性显著升高，以含10μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的ALP值最高，但五组复合膜的ALP值均无统计学差异，而含0μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜与五组载bFGF的复合膜的ALP值差异均具有统计学意义（P＜0.001/＜0.001/＜0.001/＜0.001/＜0.001，P＜0.05），提示与不含bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜相比，载bFGF的五组复合膜上的细胞成骨向分化行为更活跃。
附图说明
图 1为载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的SEM。图中A.不含bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；B.含5μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；C.含10μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜 ；D.含20μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；E.含30μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；F.含40μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜。
图 2为载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的TEM图。图中a.不含bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；b.含 5μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；c.含10μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；d.含20μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；e.含30μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；f.含40μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜。
图3为载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜的荧光显微镜图。
图4为载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜bFGF的累计释放率曲线。图中A.含5μgbFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；B.含10μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜
C.含20μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；D.含30μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；E.含40μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜。
图5为载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜与细胞共培养7天的扫描电镜图。图中A.不含bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；B.含5μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜
C.含10μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；D.含20μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；E.含30μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；F.含40μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜。
图 6为载bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜与细胞共培养的MTT图。图中A.不含bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；B.含5μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；C.含10μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；D.含20μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；E.含30μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜；F.含40μg bFGF的PLGA/羊毛角蛋白复合膜。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述，但实施例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
1）水相溶液的配置：将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）冻干粉溶解于含牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，形成碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液，其中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）含量为0.5g/L，牛血清白蛋白含量为0.5%（w/v）；
将右旋糖酐(DEX)溶解于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，充分搅拌均匀形成浓度为0.13g/mL的右旋糖酐溶液；
将碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液同右旋糖酐溶液按照1:15比例混合，得到右旋糖酐/碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白混合溶液，作为水相溶液备用，最终水相溶液中bFGF的浓度为0.03g/L；
2）油相溶液的配置：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶解于三氯甲烷（CHCl3）与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶剂（比例8:2）中，然后加入羊毛角蛋白，充分震荡混匀，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羊毛角蛋白混合溶液，作为油相溶液备用，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）浓度为15%，羊毛角蛋白浓度为1.3%；
3）复合膜制备：将上述水相溶液按照1:11的比例逐滴加入到油相溶液中，在4℃下高速搅拌，形成电纺液，然后将纺丝液采用静电纺丝技术复合成纤维复合膜。
实施例2
1）水相溶液的配置：将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）冻干粉溶解于含牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，形成碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液，其中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）含量为2.0g/L，牛血清白蛋白含量为0.5%（w/v）；
将右旋糖酐(DEX)溶解于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，充分搅拌均匀形成浓度为0.12g/mL的右旋糖酐溶液；
将碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液同右旋糖酐溶液按照1:13比例混合，得到右旋糖酐/碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白混合溶液，作为水相溶液备用，最终水相溶液中bFGF的浓度为0.15g/L；
2）油相溶液的配置：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶解于三氯甲烷（CHCl3）与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶剂（比例7:3）中，然后加入羊毛角蛋白，充分震荡混匀，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羊毛角蛋白混合溶液，作为油相溶液备用，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）浓度为18%，羊毛角蛋白浓度为1.2%；
3）复合膜制备：将上述水相溶液按照1:12的比例逐滴加入到油相溶液中，在4℃下高速搅拌，形成电纺液，然后将纺丝液采用静电纺丝技术复合成纤维复合膜。
实施例3
1）水相溶液的配置：将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）冻干粉溶解于含牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，形成碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液，其中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）含量为4.0g/L，牛血清白蛋白含量为0.1%（w/v）；
将右旋糖酐(DEX)溶解于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，充分搅拌均匀形成浓度为0.12g/mL的右旋糖酐溶液；
将碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液同右旋糖酐溶液按照1:14比例混合，得到右旋糖酐/碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白混合溶液，作为水相溶液备用，最终水相溶液中bFGF的浓度为0.27g/L；
2）油相溶液的配置：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶解于三氯甲烷（CHCl3）与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶剂（比例6:4）中，然后加入羊毛角蛋白，充分震荡混匀，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羊毛角蛋白混合溶液，作为油相溶液备用，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）浓度为20%，羊毛角蛋白浓度为1.5%；
3）复合膜制备：将上述水相溶液按照1:1～1:12的比例逐滴加入到油相溶液中，在4℃下高速搅拌，形成电纺液，然后将纺丝液采用静电纺丝技术复合成纤维复合膜。

Claims (4)

1.一种具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜，其特征在于该引导组织再生膜中是由碱性成纤维细胞生长因子与合成高分子化合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物、天然成分羊毛角蛋白构建而成。
2.一种如权利要求1所述的具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜的制备方法，其特征在于其工艺步骤为：
1）水相溶液的配置：将碱性成纤维细胞生长因子冻干粉溶解于含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，形成碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液，其中碱性成纤维细胞生长因子含量为0.5～4g/L，牛血清白蛋白含量为0.1%～0.5% ；
将右旋糖酐溶解于磷酸缓冲盐溶液中，充分搅拌均匀形成浓度为0.12～0.15g/mL 的右旋糖酐溶液；
将碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白溶液同右旋糖酐溶液按照体积比1:13～1:15比例混合，得到右旋糖酐/碱性成纤维细胞生长因子/牛血清白蛋白混合溶液，作为水相溶液备用，最终水相溶液中bFGF的浓度为0.03～0.3g/L；
2）油相溶液的配置：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，然后加入羊毛角蛋白，充分震荡混匀，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羊毛角蛋白混合溶液，作为油相溶液备用，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物浓度为15～20%，羊毛角蛋白浓度为1.0%～1.5%；
3）复合膜制备：将上述水相溶液按照体积比1:11～1:13的比例逐滴加入到油相溶液中，在0～4℃下高速搅拌，形成电纺液，然后将纺丝液采用静电纺丝技术复合成纤维复合膜。
3.按照权利要求1所述的具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜的制备方法，其特征在于过程2）中，所述三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂的体积比为8:2～5:5。
4.按照权利要求1所述的具有芯壳结构的载bFGF的引导组织再生膜的制备方法，其特征在于过程3）中，所述静电纺丝技术参数为：电压15～20 kV，接收距离14～16cm，流量0.2～0.3mm/min。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113274538A (zh) * 2021-05-28 2021-08-20 中国科学院过程工程研究所 一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用
CN115105642A (zh) * 2022-06-24 2022-09-27 宁夏医科大学 一种双层载双组份药物的功能性引导组织再生膜及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102188755A (zh) * 2011-04-29 2011-09-21 上海交通大学 担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法
CN103394131A (zh) * 2013-07-26 2013-11-20 宁夏医科大学 一种新型双层复合引导组织再生膜及其制备方法
CN103599568A (zh) * 2013-11-15 2014-02-26 无锡中科光远生物材料有限公司 一种双负载多层小直径血管支架材料的制备方法
WO2014141289A1 (en) * 2013-03-12 2014-09-18 Amrita Vishwa Vidyapeetham University Photo - chemo composition on the basis of microcapsules with a core -shell structure
CN104784758A (zh) * 2015-05-09 2015-07-22 南京师范大学 一种聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法
KR101685295B1 (ko) * 2015-07-02 2016-12-12 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 다중 약물 탑재 스캐폴드 및 이의 용도
CN107551318A (zh) * 2017-07-06 2018-01-09 天津大学 包载葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)‑VAPG/核酸复合物的聚丙交酯纤维膜及制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102188755A (zh) * 2011-04-29 2011-09-21 上海交通大学 担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法
WO2014141289A1 (en) * 2013-03-12 2014-09-18 Amrita Vishwa Vidyapeetham University Photo - chemo composition on the basis of microcapsules with a core -shell structure
CN103394131A (zh) * 2013-07-26 2013-11-20 宁夏医科大学 一种新型双层复合引导组织再生膜及其制备方法
CN103599568A (zh) * 2013-11-15 2014-02-26 无锡中科光远生物材料有限公司 一种双负载多层小直径血管支架材料的制备方法
CN104784758A (zh) * 2015-05-09 2015-07-22 南京师范大学 一种聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法
KR101685295B1 (ko) * 2015-07-02 2016-12-12 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 다중 약물 탑재 스캐폴드 및 이의 용도
CN107551318A (zh) * 2017-07-06 2018-01-09 天津大学 包载葡聚糖‑g‑聚(L‑赖氨酸)‑VAPG/核酸复合物的聚丙交酯纤维膜及制备方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUA LI等: "Controlled Release of PDGF-bb by Coaxial Electrospun Dextran/Poly(L-lactide-co-ε-caprolactone) Fibers with an Ultrafine Core/Shell Structure", 《JOURNAL OF BIOMATERIALS SCIENCE-POLYMER EDITION》 *
SONG ZHAO等: "Biological augmentation of rotator cuff repair using bFgF-loaded electrospun poly(lactide-co-glycolide) fibrous membranes", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》 *
ZHANG, HUALIN等: "Electrospun poly(lactic-co glycolic acid)/wool keratin fibrous composite scaffolds potential for bone tissue engineering applications", 《JOURNAL OF BIOACTIVE AND COMPATIBLE POLYMERS》 *
李欣: "《当代中西医结合临床诊疗 上》", 30 June 2017, 吉林科学技术出版社 *
王淑红: "《先进聚合物基复合材料及应用》", 30 June 2009, 哈尔滨地图出版社 *
高燕: "乳液静电纺丝微纳纤维膜的可控制备及双载药性能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113274538A (zh) * 2021-05-28 2021-08-20 中国科学院过程工程研究所 一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用
CN115105642A (zh) * 2022-06-24 2022-09-27 宁夏医科大学 一种双层载双组份药物的功能性引导组织再生膜及其制备方法
CN115105642B (zh) * 2022-06-24 2023-12-05 宁夏医科大学 一种双层载双组份药物的功能性引导组织再生膜及其制备方法

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