CN102188755A - 担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种药物技术领域的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，包括：将蛋白溶解于高分子多糖水溶液中作为内水相；将缓释高分子溶解于有机溶剂中，可加入助悬剂分散作为外油相；内水相逐滴加入外油相，磁力搅拌或者匀浆形成乳液，将乳液加入注射器中，加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；或者将内水相和外油相分别置于同轴共纺的毛细管中，对内外双层同时施加高压静电，用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；在室温下静置晾干，得到组织工程纤维；其中蛋白或多肽药物0.5-20％、高分子多糖2-20％、助悬剂0-15％、缓释高分子60-99％。本发明改善蛋白的释放曲线，提高在制剂、贮存、释放过程中的稳定性、增加纤维的载药量。

Description

担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种药物技术领域的组织工程纤维支架的制备方法，具体涉及的是一种担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法。

背景技术

目前有关乳液法静电纺丝组织工程纤维支架的制备方法中，通常忽略对蛋白药物活性和构象的保护问题，同时存在蛋白或多肽药物的初期突释现象。

经对现有技术的文献检索发现，LiXiaoqiang等在Colloids and Surfaces B：Biointerfaces 2010年第75期第418-424页，文章题名“Encapsulation of proteins in poly(l-lactide-co-caprolactone)fibers byemulsion electrospinning”(乳液法静电纺丝制备担载蛋白的聚乳酸-己内酯共聚物纤维)，提出采用牛血清白蛋白(BSA，7.69％，w/w)和聚乳酸-己内酯共聚物(PLACL，92.31％，w/w)制备缓释纤维。用氯仿(94％，w/w)溶解聚乳酸-己内酯共聚物(6％，w/w)，添加司班80做助悬剂，作为外油相，内水相为牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液的混合溶液(BSA为10％，w/w)，内水相和外油相的体积比为1/20，将内水相逐滴加入外油相，转速为250rpm搅拌20分钟后形成W/O乳液，之后立即进行静电纺丝。所得到的纤维体外释放曲线存在较为严重的突释现象，第一天释放出27％，没有达到理想的缓释效果，也没有提及对蛋白的构象保护结果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，使其可以在制剂、贮存、释放过程中有效稳定蛋白的空间构象，同时改善蛋白的释放曲线，提高蛋白担载量。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过普通静电纺丝方法或者同轴共纺方法制备获得担载蛋白的组织工程纤维支架；

所述的普通静电纺丝的方法包括以下步骤：

a)将蛋白溶解于高分子多糖水溶液中作为内水相；

b)将缓释高分子溶解于有机溶剂中，可以加入助悬剂分散或溶解在有机溶剂中作为外油相；

c)内水相逐滴加入外油相，采用磁力搅拌或者匀浆的方式，形成W/O乳液；

d)将上述W/O乳液加入注射器中，加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；

e)将纤维薄膜在室温下静置晾于，得到组织工程纤维。纤维可塑性强，可依据需要塑造成各种形状的纤维支架；

所述的同轴共纺的方法包括以下步骤：

a)将蛋白溶解于0.5％-50％(w/w)的高分子多糖水溶液中作为内水相；

b)将缓释高分子溶解于有机溶剂中，可以加入助悬剂分散或溶解在有机溶剂中作为外油相；

c)将上述内水相和外油相分别置于同轴共纺的毛细管中，对内外双层同时施加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；

d)将纤维薄膜在室温下静置晾干，得到组织工程纤维。纤维可塑性强，可依据需要塑造成各种形状的纤维支架。

所述的担载蛋白的组织工程纤维支架组分及重量百分比为：蛋白或多肽药物0.5-20％、高分子多糖2-20％、助悬剂0-15％、缓释高分子60-99％。

所述的蛋白与高分子多糖的重量比从10/1至1/10。

内水相与外油相的体积比从1/20至1/5。

所述的有机溶剂采用二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃或二甲基甲酰胺或其组合。

所述的蛋白包括促红细胞生成素(EPO)、重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素(INF)、生长激素(GH)、胰岛素(Insulin)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板生长因子(PDGF)、内皮生长因子(ECGF)、神经生长因子(NGF)、骨衍生性生长因子(BDGF)、骨形成蛋白(BMP)、组织多肽抗原(TPA)、抗体(antibody)、凝血因子VIII(Vm)等用于组织再生治疗的蛋白。

所述的高分子多糖选用葡聚糖、可溶性纤维素衍生物、透明质酸、海藻酸盐中的一种或者任意混合。

所述的助悬剂为甘油、糖浆及山梨醇等小分子助悬剂，或阿拉伯胶、西黄蓍胶，海藻酸钠等天然高分子助悬剂，或纤维素类、聚乙烯醇等半合成或合成高分子助悬剂。

所述的缓释高分子指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽急的聚氨基酸，其中包括：聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸及其组合、聚乙交酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯等。

普通静电纺丝法和同轴共纺法的步骤b)中的有机溶剂可以选择N，N-二甲基甲酰胺、氯仿、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯、乙腈等等可以溶解缓释高分子的单一或者混合溶剂。

普通静电纺丝法的步骤c)，将内水相分散于外油相形成乳液时，磁力搅拌或者均匀浆的速率为200-2500rpm，时间为15-30分钟。

本发明以可降解高分子材料为基质；高分子多糖溶液作为“内亲水相”，在内水相中加入高分子多糖可以和缓释高分子共同调节蛋白的释放速率，根据治疗需要控制释放速率在内水相中加入高分子多糖通过增大粘度降低蛋白分子的可动性，减少聚集现象的发生；高分子多糖与蛋白有很好的生物相溶性，可以减少由于蛋白与缓释高分子的直接接触而引起的蛋白吸附，可以提高蛋白在组织工程纤维支架制备、贮存、体内治疗过程中的稳定性。

本发明制得的纤维可以有效稳定蛋白的构象，提高蛋白在支架制备、贮存、释放过程中的稳定性，改善一般组织工程纤维中蛋白的释放曲线，此外还可以增加纤维中蛋白的担载量。可维持蛋白持续释放半个月至三个月且第一天突释不大于蛋白担载量的15％，总释放量接近或不低于蛋白担载量的85％。

附图说明

图1本发明实施例纤维薄膜扫描电镜照片(放大倍数：2,740)；

图2本发明实施例纤维释放过程中纤维形态扫面电镜照片(放大倍数：3,000)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的担载蛋白的组织工程纤维支架及其制备和体外释放实验实施作详细说明：以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

普通静电纺丝制备担载蛋白的组织工程纤维支架及体外释放

a)将BSA(0.5％，w/w)溶解于高分子多糖(0.5％，w/w)水溶液0.5ml作为内水相；

b)将聚乳酸羟基乙酸共聚物(99％，w/w)溶解于N，N-二甲基甲酰胺和氯仿等体积混合有机溶剂2.5ml中作为外油相；

c)内水相逐滴加至外油相中，采用磁力搅拌200rpm，30分钟，形成W/O乳液。

d)将上述W/O乳液加入注射器中，加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；

e)将纤维薄膜在室温下静置晾干，得到乳液法静电纺丝组织工程纤维。纤维可塑性强，可依据需要塑造成各种形状的纤维支架。

精密称量10mg纤维，扫描电镜照片如图1所示，加入1mlPBS溶液，于37℃、60rpm气浴摇床培养，定时取出上清夜并补加缓冲介质，采用microbca的方法测试上清夜中BSA的含量，扣除空白纤维的读数，计算纤维释放度，释放过程中纤维形态扫面电镜如图2所示。

实验结果表明：乳液法静电纺丝组织工程纤维平稳缓释，第一天突释不大于药物载量的10％，总释放量接近或不低于药物载量的85％，无突释及不完全释放现象。

实施例2

普通静电纺丝制备担载蛋白的组织工程纤维支架及体外释放实验

a)将BSA(0.5％，w/w)溶解于高分子多糖(0.5％，w/w)水溶液0.5ml作为内水相；

b)将聚乳酸羟基乙酸共聚物(99％，w/w)溶解于N，N-二甲基甲酰胺和氯仿等体积混合有机溶剂10ml中作为外油相；

c)内水相逐滴加至外油相中，采用磁力搅拌2500rpm，15分钟，形成W/O乳液。

d)将上述W/O乳液加入注射器中，加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；

e)将纤维薄膜在室温下静置晾干，得到乳液法静电纺丝组织工程纤维。纤维可塑性强，可依据需要塑造成各种形状的纤维支架。

实施例3

普通静电纺丝制备担载蛋白的组织工程纤维支架及体外释放实验

a)将BSA(5％，w/w)溶解于高分子多糖(0.5％，w/w)水溶液0.5ml作为内水相；

b)将聚乳酸羟基乙酸共聚物(99％，w/w)溶解于N，N-二甲基甲酰胺和氯仿等体积混合有机溶剂2.5ml中作为外油相；

c)内水相逐滴加至外油相中，采用磁力搅拌2500rpm，15分钟，形成W/O乳液。

d)将上述W/O乳液加入注射器中，加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；

e)将纤维薄膜在室温下静置晾干，得到乳液法静电纺丝组织工程纤维。纤维可塑性强，可依据需要塑造成各种形状的纤维支架。

精密称量10mg纤维，加入1mlPBS溶液，于37℃、60rpm气浴摇床培养，定时取出上清夜并补加缓冲介质，采用microbca的方法测试上清夜中BSA的含量，扣除空白纤维的读数，计算纤维释放度。

实验结果表明：乳液法静电纺丝组织工程纤维平稳缓释，第一天突释不大于药物载量的10％，总释放量接近或不低于药物载量的85％，无突释及不完全释放现象。

实施例4

普通静电纺丝制备担载蛋白的组织工程纤维支架及体外释放实验

a)将BSA(5％，w/w)溶解于高分子多糖(0.5％，w/w)水溶液0.5ml作为内水相；

b)将聚乳酸羟基乙酸共聚物(99％，w/w)溶解于N，N-二甲基甲酰胺和氯仿等体积混合有机溶剂2.5ml中作为外油相；

c)内水相逐滴加至外油相中，采用磁力搅拌2500rpm，15分钟，形成W/O乳液。

d)将上述W/O乳液加入注射器中，加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；

e)将纤维薄膜在室温下静置晾干，得到乳液法静电纺丝组织工程纤维。纤维可塑性强，可依据需要塑造成各种形状的纤维支架。

精密称量10mg纤维，加入1mlPBS溶液，于37℃、60rpm气浴摇床培养，定时取出上清夜并补加缓冲介质，采用microbca的方法测试上清夜中BSA的含量，扣除空白纤维的读数，计算纤维释放度。

实验结果表明：乳液法静电纺丝组织工程纤维平稳缓释，第一天突释不大于药物载量的10％，总释放量接近或不低于药物载量的85％，无突释及不完全释放现象。

实施例5

同轴共纺法制备担载蛋白的组织工程纤维支架及体外释放实验

a)将BSA(5％，w/w)溶解于高分子多糖(0.5％，w/w)水溶液0.5ml作为内水相；

b)将聚乳酸羟基乙酸共聚物(99％，w/w)溶解于N，N-二甲基甲酰胺和氯仿等体积混合有机溶剂2.5ml中作为外油相；

c)内水相和外油相分别置于同轴共纺的毛细管中，对两层液体同时施加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；

d)将纤维薄膜在室温下静置晾干，得到乳液法静电纺丝组织工程纤维。纤维可塑性强，可依据需要塑造成各种形状的纤维支架。

精密称量10mg纤维，加入1mlPBS溶液，于37℃、60rpm气浴摇床培养，定时取出上清夜并补加缓冲介质，采用microbca的方法测试上清夜中BSA的含量，扣除空白纤维的读数，计算纤维释放度。

实验结果表明：乳液法静电纺丝组织工程纤维平稳缓释，第一天突释不大于药物载量的10％，总释放量接近或不低于药物载量的85％，无突释及不完全释放现象。

实施例6

同轴共纺法制备担载蛋白的组织工程纤维支架及体外释放实验

a)将BSA(0.5％，w/w)溶解于高分子多糖(0.5％，w/w)水溶液0.5ml作为内水相；

b)将聚乳酸羟基乙酸共聚物(99％，w/w)溶解于N，N-二甲基甲酰胺和氯仿等体积混合有机溶剂2.5ml中作为外油相；

c)内水相和外油相分别置于同轴共纺的毛细管中，对两层液体同时施加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜；

d)将纤维薄膜在室温下静置晾干，得到乳液法静电纺丝组织工程纤维。纤维可塑性强，可依据需要塑造成各种形状的纤维支架。

精密称量10mg纤维，加入1mlPBS溶液，于37℃、60rpm气浴摇床培养，定时取出上清夜并补加缓冲介质，采用microbca的方法测试上清夜中BSA的含量，扣除空白纤维的读数，计算纤维释放度。

实验结果表明：乳液法静电纺丝组织工程纤维平稳缓释，第一天突释不大于药物载量的10％，总释放量接近或不低于药物载量的85％，无突释及不完全释放现象。

Claims (10)

1.一种担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征在于，通过普通静电纺丝方法或者同轴共纺方法制备获得担载蛋白的组织工程纤维支架；

所述的普通静电纺丝的方法包括以下步骤：

a)将蛋白溶解于0.5％-50％(w/w)的高分子多糖水溶液中作为内水相，

b)将缓释高分子溶解于有机溶剂中，加入助悬剂分散或溶解在有机溶剂中作为外油相；

c)内水相逐滴加入外油相，采用磁力搅拌或者匀浆的方式，形成W/O乳液，

d)将上述W/O乳液加入注射器中，加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜，

e)将纤维薄膜在室温下静置晾干，得到组织工程纤维，获得各种形状的纤维支架；

所述的同轴共纺的方法包括以下步骤：

a)将蛋白溶解于高分子多糖水溶液中作为内水相，

b)将缓释高分子溶解于有机溶剂中，加入助悬剂分散或溶解在有机溶剂中作为外油相，

c)将上述内水相和外油相分别置于同轴共纺的毛细管中，对内外双层同时施加高压静电，使用微量注射泵和接收器，在室温静电纺织成纤维薄膜，

d)将纤维薄膜在室温下静置晾干，得到组织工程纤维获得各种形状的纤维支架；

所述的担载蛋白的组织工程纤维支架组分及重量百分比为：蛋白或多肽药物0.5-20％、高分子多糖2-20％、助悬剂0-15％、缓释高分子60-99％。

2.根据权利要求1所述的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征是，所述的蛋白与高分子多糖的重量比从10/1至1/10。

3.根据权利要求1所述的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征是，所述的有机溶剂采用二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃或二甲基甲酰胺或其组合。

4.根据权利要求1所述的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征是，所述的内水相与外油相的体积比从1/20至1/5。

5.根据权利要求1所述的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征是，所述的蛋白包括促红细胞生成素、重组人粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素、生长激素、胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板生长因子、内皮生长因子、神经生长因子、骨衍生性生长因子、骨形成蛋白、组织多肽抗原、抗体、凝血因子VIII。

6.根据权利要求1所述的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征是，所述的高分子多糖为葡聚糖、可溶性纤维素衍生物、透明质酸、海藻酸盐中的一种或者任意混合。

7.根据权利要求1所述的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征是，所述的助悬剂为甘油、糖浆及山梨醇的小分子助悬剂，或阿拉伯胶、西黄蓍胶，海藻酸钠的天然高分子助悬剂，或纤维素类、聚乙烯醇的半合成或合成高分子助悬剂。

8.根据权利要求1所述的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征是，所述的缓释高分子指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽键的聚氨基酸，其中包括：聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸及其组合、聚乙交酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯。

9.根据权利要求1所述的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征是，所述的普通静电纺丝法和所述的同轴共纺法的步骤b)中的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、氯仿、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯、乙腈的单一或者混合溶剂。

10.根据权利要求1所述的担载蛋白的组织工程纤维支架的制备方法，其特征是，所述的普通静电纺丝法的步骤c)，将内水相分散于外油相形成乳液时，磁力搅拌或者均匀浆的速率为200-2500rpm，时间为15-30分钟。

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