CN111588901A - 一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料、制备方法及应用 - Google Patents

一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医用材料与医疗器械领域，公开了一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料、制备方法及应用，所述自组装纳米纤维敷料含有季铵化甲壳素层和VEGF定向进化噬菌体层，所述季铵化甲壳素层与噬菌体层通过静电引力作用交替吸附于基材表面得到自组装纳米纤维敷料；所述自组装纳米纤维敷料兼具优异的抗菌性和促血管生成功能，研究证实可促进糖尿病大鼠皮肤溃疡血管化修复。本制备方法简单可靠、加工设备简易、对环境污染小，产品附加值高，可应用于制备糖尿病溃疡专用敷料或其他创面修复材料。

Description

一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料、制 备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医用材料与医疗器械领域，具体涉及一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料、制备方法及应用。
背景技术
Ⅱ型糖尿病源于胰岛素抵抗引发的代谢紊乱综合征，也是我国最主要的慢性非传染性疾病之一。流行病学研究显示，糖尿病现患病例数已超过4亿，其中约60％患者需接受不同类型治疗。重症患者由于皮层内血糖沉积破坏了胶原纤维的结构和生理功能，因而极易出现糖尿病溃疡等继发病变，严重时可导致患者截肢甚至死亡。糖尿病溃疡区域血供差、组织层次结构不清晰、创面长期不愈合，现有临床治疗方案均无有效报道。在此背景下，糖尿病溃疡专用敷料拥有极大的市场潜力，在医疗器械领域估值达300亿美元。值得一提的是，FDA批准的伤口敷料大多仅具有保湿或抗菌作用，而兼具促进皮肤血管化修复等多种生物学功能的新型敷料却鲜有报道。
血管内皮生长因子(VEGF)具有加速血管内皮细胞增殖、迁移，改善局部血供及促进组织再生等功能，受到临床医师及医疗器械研发者广泛且持续的关注；负载VEGF的复合敷料具有较好的皮肤修复效果和应用价值。VEGF产量低、成本高，调查发现美国赛默飞世尔公司1mg VEGF市场价高达67000元，与之伴随的高昂医疗费用使VEGF复合敷料不得不止步于实验室研发，影响市场化进程。
发明内容
针对现有技术以上缺陷或改进需求中的至少一种，本发明提供了一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料、制备方法及应用，解决了现有糖尿病溃疡敷料存在不能促进新生组织血管再生，长效抗菌性不佳，生物相容性不足和加工成本高等问题。本发明中VEGF定向进化噬菌体层和季铵化甲壳素层交替排列，抗菌性较好的季铵化甲壳素和成血管能力较好的VEGF定向进化噬菌体共同组装，获得的敷料兼具良好的成血管能力和抗菌能力。
本发明将VEGF生长因子展示于M13噬菌体衣壳蛋白(PVIII)区域，获得的VEGF定向进化噬菌体经由释放，可激活膜受体启动下游信号通路和生物过程。与天然VEGF相比，该定向进化噬菌体具有如下优势：1.效价高，每个噬菌体上理论上能够展示3000个拷贝；2.成本低，采用普通大肠杆菌培养噬菌体，经简单离心即可大量生产；3.缓释时间长，噬菌体为纳米纤维，自身带有负电荷，通过正负电荷层层自组装技术可与季铵化甲壳素高效复合；因此噬菌体可缓慢从复合层中持续释放。在季铵盐甲壳素与VEGF定向进化噬菌体持续性释放作用下，发挥协同作用，解决细菌侵入与成血管因子高效递送的问题；保障皮损组织不受过度炎性反应的影响，因此新型敷料可用于糖尿病溃疡血管化修复。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料；
所述自组装纳米纤维敷料含有季铵化甲壳素层和VEGF定向进化噬菌体层；所述季铵化甲壳素层和噬菌体层交替排列；所述季铵化甲壳素层和噬菌体层通过静电引力相互作用吸附；所述季铵化甲壳素层和噬菌体层数相同，且至少为1层。
优选地，所述自组装纳米纤维敷料还包括基材，且季铵化甲壳素层固定于所述基材表面为自组装的起始层，也称季铵化甲壳素膜。
优选地，所述基材为丝素蛋白、聚己内酯、聚乙二醇中的任一或任意组合物形成的纳米纤维膜。
优选的，所述基材的聚己内酯可以单独纺丝；也可以分别与丝素蛋白、聚乙二醇进行混合电纺，组成质量比为聚己内酯：丝素蛋白＝4：1，或聚己内酯：聚乙二醇＝4：1。
优选地，所述季铵化甲壳素层和噬菌体层的层数均不多于40层。
为实现上述目的，按照本发明的另一个方面，还提供了一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料的制备方法；
将季铵化甲壳素膜浸泡在噬菌体悬液中，使带正电荷的季铵化甲壳素与带负电荷的M13噬菌体通过静电相互作用吸附，得到季铵化甲壳素层和噬菌体层自组装纳米纤维敷料。
优选地，所述季铵化甲壳素膜固定在基材上；所述季铵化甲壳素膜固定在基材上是先将基材浸泡在质量浓度为0.5-5％的季铵化甲壳素溶液中30min以上，取出晾干后浸泡在2.5(w/v)％戊二醛乙醇水溶液中交联6-24h，磷酸盐缓冲液洗净后得到。所述乙醇水溶液中乙醇的质量分数应大于50％。
优选地，所述基材是丝素蛋白、聚己内酯、聚乙二醇中的任一或任意其组合物通过高压静电纺丝法制备得到。
优选地，所述自组装纳米纤维敷料是将季铵化甲壳素膜依次浸泡于VEGF定向进化噬菌体悬液和季铵化甲壳素溶液中，通过层层自组装的方式，得到具有季铵化甲壳素层和VEGF定向进化噬菌体层的自组装叠层敷料；设定先后分别浸泡在季铵化甲壳素溶液中为1轮依次浸泡，所述依次浸泡的轮数至少为1轮。
优选地，所述依次浸泡的轮数不多于40轮。
优选地，将季铵化甲壳素膜依次浸泡于VEGF定向进化噬菌体悬液和季铵化甲壳素溶液中时，季铵化甲壳素溶液的质量浓度为0.5-5％，VEGF定向进化噬菌体悬液的浓度为1×1011-1014PFU，浸泡在季铵化甲壳素溶液和噬菌体悬液中的时间均为10-60min。
为实现上述目的，按照本发明的另一个方面，还提供了一种如前所述的自组装纳米纤维敷料、或如前所述的制备方法制得的自组装纳米纤维敷料在促进糖尿病溃疡血管化修复中的应用。
上述优选技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明中季铵化甲壳素带有正电荷，VEGF定向进化噬菌体带有负电荷。通过LBL自组装技术可将季铵化甲壳素和VEGF定向进化噬菌体交替吸附于基材表面，固定后的季铵化甲壳素层和VEGF定向进化噬菌体层稳定性得到显著性增强；获得的纳米纤维敷料具有优异的抗菌性和促血管生成的功能。上述纳米纤维敷料的生物学功能可通过自组装层数实现简易调节。
(2)本发明中优选采用高压静电纺丝法制备纳米纤维膜，并将其作为基材。电纺纳米纤维膜能够仿生细胞外基质相似的三维网络结构，具有比表面积高，生物相容性优良的特点，是一种理想的自组装基材。另一方面，纳米纤维可引导上皮细胞由正常组织向病损区域迁移，进而促进溃疡创面再上皮化。
(3)本发明获得的自组装纳米纤维敷料具有优异的生物相容性和促组织细胞再生功能。动物实验表明，本发明可促进糖尿病大鼠皮肤溃疡修复，其促进作用与新生血管密度增加有关。
(4)本发明制备方法简单可靠、加工设备简易、对环境污染小，产品附加值高，有望得到工业化生产。本发明获得的自组装纳米纤维敷料可作为糖尿病溃疡专用敷料或其他创面修复材料使用，有望得到临床推广。
附图说明
图1是实施例1获得的聚己内酯纳米纤维膜(空白组)扫描电子显微镜的结果；
图2是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型))扫描电子显微镜的结果；
图3是实施例1获得的聚己内酯纳米纤维膜(空白组)和自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型)和WT(野生型))体外细胞毒性实验的结果；
图4是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料VEGF(工程型)应用于糖尿病大鼠皮损修复的实物图；
图5是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型))和(WT(野生型))应用于糖尿病大鼠皮损修复的愈合率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下面结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。
实施例1
(1)采用高压静电纺丝法制备聚己内酯纳米纤维膜。将15g聚己内酯溶解于100mL六氟异丙醇中，然后加入到高压静电纺丝机的推注泵中进行电纺。参数设置为：电压15kV，接收距离12cm，流率2.4mL/h，时间3h。电纺完成后将聚己内酯纳米纤维膜取下烘干备用。
(2)采用层层自组装技术制备纳米纤维敷料。将步骤(1)得到的聚己内酯纳米纤维膜作为基材，浸泡于质量浓度为3％的季铵化甲壳素溶液中30min，取出晾干，在2.5％戊二醛乙醇水溶液溶液中浸泡6h使交联反应充分完成。经磷酸盐缓冲液冲洗30min后得到季铵化甲壳素膜。以上乙醇水溶液中乙醇的质量分数为70％。将获得的季铵化甲壳素膜浸泡于浓度为1×1013PFU的VEGF定向进化噬菌体悬液中30min，用PBS洗净。再将其浸泡于质量浓度为1％的季铵化甲壳素溶液中30min,用PBS洗净。将季铵化甲壳素膜在VEGF定向进化噬菌体悬液和季铵化甲壳素溶液中交替浸泡7轮，制备得到自组装纳米纤维敷料，并命名为VEGF(工程型)。作为对照，采用上述层层自组装技术制备野生型噬菌体和季铵化甲壳素自组装纳米纤维敷料，组装层数为7层，并命名为WT(野生型)。作为对照，采用步骤1得到的聚己内酯纳米纤维膜作为敷料使用，并命名为空白组。
将实施例1获得的聚己内酯纳米纤维膜(空白组)和自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型))烘干后采用扫描电子显微镜观察支架材料的微观形貌。
图1是实施例1获得的聚己内酯纳米纤维膜(空白组)扫描电子显微镜的结果，如图所见，聚己内酯纳米纤维膜(空白组)呈现出相互交织的网状纳米纤维结构。图2是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型))扫描电子显微镜的结果，如图所见，经层层自组装后纳米纤维敷料表面吸附VEGF定向进化噬菌体和季铵化甲壳素，使纳米纤维的直径得到一定增加。
实施例1中仅以示例方式将聚己内酯纳米纤维膜作为基材，但并不作为对本发明的限制，基材可以是丝素蛋白、聚己内酯、聚乙二醇中的任一或任意组合物形成的纳米纤维膜。优选的，所述基材的聚己内酯可以单独纺丝；也可以分别与丝素蛋白、聚乙二醇进行混合电纺，组成质量比为聚己内酯：丝素蛋白＝4：1，或聚己内酯：聚乙二醇＝4：1。
实施例2
将实施例1获得的聚己内酯纳米纤维膜(空白组)和自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型)和WT(野生型))高压蒸汽灭菌后浸泡于RPMI-1640完全培养基中制备浸提液。将成纤维细胞L929按1.5×103个/孔密度接种96孔板。培养24h后去培养基，每孔加入200μL浸提液，继续培养72h。每隔24h取出1块组织培养板，向每孔中加入20μL噻唑蓝(0.5mg/mL)试剂,继续培养4h,每孔加入150μL二甲基亚砜，采用多功能酶标仪检测490nm处吸光度。
图3是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型)和WT(野生型))体外细胞毒性实验的结果。如图所见，与对照(空白和WT)相比，VEGF可显著促进成纤维细胞增殖，超过生物医用材料生物毒性Ⅰ类标准。
实施例3
将实施例1获得的自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型))剪成直径为14mm的圆片，并采用糖尿病大鼠全层皮肤损伤模型验证VEGF的应用效果。糖尿病大鼠购买自湖北省疾病预防控制中心，用异氟烷麻醉后切除直径为14mm的背部全层皮肤。实验组将VEGF敷贴在创面上，对照组将WT(野生型)和空白组敷贴在创面上，术后常规饲养。每隔一段时间拍摄创面照片，经面积统计分析得到糖尿病大鼠皮损愈合率。
图4是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型))应用于糖尿病大鼠皮损修复的实物图。如图所见，糖尿病大鼠皮肤缺损在20天内基本愈合，愈合过程中未出现感染、坏死等不良反应。VEGF组较空白组和WT组愈合效果更好。
图5是实施例1获得的自组装纳米纤维敷料(VEGF(工程型))、WT(野生型)、空白组的愈合率；在皮肤愈合的各个阶段，VEGF(工程型)的愈合率都要明显好于WT(野生型)和空白组。
实施例4
将实施例1中的第(1)步骤替换为如下，其余相同。
将12g聚己内酯溶解于100mL六氟异丙醇中，然后加入3g聚乙二醇继续溶解，随后将混合液转移到高压静电纺丝机的推注泵中进行电纺。参数设置为：电压15kV，接收距离12cm，流率2.4mL/h，时间3h。电纺完成后将聚己内酯/聚乙二醇纳米纤维膜取下烘干备用。
实施例5
将实施例1中的第(1)步骤替换为如下，其余相同。
将12g聚己内酯和3g丝素蛋白溶解于100mL六氟异丙醇中，随后将混合液转移到高压静电纺丝机的推注泵中进行电纺。参数设置为：电压15kV，接收距离12cm，流率2.4mL/h，时间3h。电纺完成后将聚己内酯/丝素蛋白纳米纤维膜取下烘干备用。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料，其特征在于：
所述自组装纳米纤维敷料含有季铵化甲壳素层和VEGF定向进化噬菌体层；所述季铵化甲壳素层和噬菌体层交替排列；所述季铵化甲壳素层和噬菌体层通过静电引力相互作用吸附；所述季铵化甲壳素层和噬菌体层数相同，且至少为1层。
2.如权利要求1所述的促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料，其特征在于：
所述自组装纳米纤维敷料还包括基材，且最底层的季铵化甲壳素层固定于所述基材表面。
3.如权利要求2所述的促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料，其特征在于：
所述基材为丝素蛋白、聚己内酯、聚乙二醇中的任一或任意组合物形成的纳米纤维膜。
4.如权利要求1所述的促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料，其特征在于：
所述季铵化甲壳素层和噬菌体层的层数均不多于40层。
5.一种促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于：
将季铵化甲壳素膜浸泡在噬菌体悬液中，使带正电荷的季铵化甲壳素与带负电荷的M13噬菌体通过静电相互作用吸附，得到季铵化甲壳素层和噬菌体层自组装纳米纤维敷料。
6.如权利要求5所述的促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于：
所述季铵化甲壳素膜固定在基材上；所述季铵化甲壳素膜固定在基材上是先将基材浸泡在质量浓度为0.5-5％的季铵化甲壳素溶液中30min以上，取出晾干后浸泡在2.5(w/v)％戊二醛乙醇水溶液中交联6-24h，磷酸盐缓冲液洗净后得到。
7.如权利要求6所述的促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于：
所述基材是丝素蛋白、聚己内酯、聚乙二醇中的任一或任意其组合物通过高压静电纺丝法制备得到。
8.如权利要求5-7任一项所述的促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于：
所述自组装纳米纤维敷料是将季铵化甲壳素膜依次浸泡于VEGF定向进化噬菌体悬液和季铵化甲壳素溶液中，通过层层自组装的方式，得到具有季铵化甲壳素层和VEGF定向进化噬菌体层的自组装叠层敷料；设定先后分别浸泡在季铵化甲壳素溶液中为1轮依次浸泡，所述依次浸泡的轮数至少为1轮。
9.如权利要求8所述的促进糖尿病溃疡血管化修复的自组装纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于：
将季铵化甲壳素膜依次浸泡于VEGF定向进化噬菌体悬液和季铵化甲壳素溶液中时，季铵化甲壳素溶液的质量浓度为0.5-5％，VEGF定向进化噬菌体悬液的浓度为1×1011-1014PFU，浸泡在季铵化甲壳素溶液和噬菌体悬液中的时间均为10-60min。
10.一种如权利要求1-4任一项所述的自组装纳米纤维敷料、或如权利要求5-9任一项所述的制备方法制得的自组装纳米纤维敷料在促进糖尿病溃疡血管化修复中的应用。
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