CN110144124A - 一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料及其制备与应用 - Google Patents

一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料及其制备与应用，属于功能高分子合成技术领域。所述复合材料含有季铵化甲壳素层及丝素蛋白层，所述季铵化甲壳素层与丝素蛋白层间依靠静电相互作用吸附，层层交替自组装黏附于生物基材表面得到复合材料，且常用生物基材作为基底均适用此方法；所述复合材料具有良好的广谱抗菌性和长效抗菌性，能显著抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌增殖，对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率都在95％以上。通过控制自组装的层数，可调控复合材料季铵化甲壳素的吸附量及其抗菌能力。本制备方法简单可靠、低环境污染、产品生物相容性好，可用于制备伤口敷料或创面修复材料。

Description

一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料及其制备与应用
技术领域
本发明属于功能高分子合成技术领域，具体涉及一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料及其制备与应用。
背景技术
皮肤组织是隔离外部环境的天然屏障，对维持机体内环境稳定具有重要的作用。皮肤受损可导致其生理功能丧失并进一步出现病原菌感染、蛋白质和电解质失衡等并发症。及时开展自体/异体皮肤移植、应用伤口敷料或抗生素治疗可有效缓解伤口感染，促进创面修复。新型抗菌伤口敷料，如吸附抗生素、银离子或其他金属纳米颗粒，已经得到临床推广应用(Advanced Drug Delivery Reviews 123(2018)33-64)。不足的是，上述敷料均存在药物暴释现象；抗菌作用强烈但不持久。另一方面，抗菌因子随体液扩散，对肝肾脑等脏器具有潜在的生物毒性。在此背景下，研发具有原位和长效抗菌功能的伤口敷料十分必要。
甲壳素是一种从虾蟹壳中提取得到的多糖类物质，其来源丰富，可降解再生，是一种理想的生物材料。甲壳素分子内与分子间存在强烈的氢键作用，难溶于水、稀酸、稀碱以及常规有机溶剂，极大的限制了其应用。专利CN107261209A公布了一种季铵化甲壳素的均相制备方法，采用羟丙基三甲基氯化铵修饰甲壳素分子，制备得到易溶于水的季铵化甲壳素。研究表明，季铵化甲壳素生物相容性良好，具有优良的广谱抗菌性，对创面修复具有一定的促进作用(Adv.Mater.2018,30,1801100)。
目前，针对季铵化甲壳素尚未见到基于层层自组装技术构建季铵化甲壳素抗菌复合材料的方法。
发明内容
本发明解决了现有抗菌复合材料存在制备方法繁琐、加工成本高和生物相容性不佳的问题。本发明中季铵化甲壳素层和丝素蛋白层交替排列，生物相容性较好的丝素蛋白和优良抗菌性能的季铵盐甲壳素共同组装，使得复合材料同时兼具良好的生物相容性和广谱抗菌性能。
根据本发明的第一方面，提供了一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料，所述复合材料含有季铵化甲壳素层和丝素蛋白层；所述季铵化甲壳素层和丝素蛋白层交替排列；所述季铵化甲壳素层和丝素蛋白层通过静电相互作用吸附；所述季铵化甲壳素层和丝素蛋白层数相同，且至少为1层。
优选地，所述复合材料还包括支撑层，最底层的丝素蛋白层粘附在所述支撑层表面。
优选地，所述季铵化甲壳素层和丝素蛋白层的层数均小于等于20层。
优选地，所述支撑层为聚己内酯、聚乙烯醇或纤维素形成的膜材料。
按照本发明的另一方面，提供了一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料的制备方法，将丝素蛋白膜浸泡在季铵化甲壳素溶液中，使带正电荷的季铵化甲壳素与带负电荷的丝素蛋白通过静电相互作用吸附，得到丝素蛋白层和季铵化甲壳素层的复合材料。
优选地，所述丝素蛋白膜固化在支撑层；所述丝素蛋白膜固化在支撑层上是先将支撑层浸泡在丝素蛋白溶液中，使支撑层表面形成丝素蛋白膜，然后再浸泡在固化剂中使丝素蛋白膜固化得到。
优选地，所述将丝素蛋白膜浸泡在季铵化甲壳素溶液中后，再依次浸泡在丝素蛋白溶液中和季铵化甲壳素溶液中，通过层层自组装的方式，得到具有多层季铵化甲壳素层和多层丝素蛋白层的复合材料；设定先后分别浸泡在丝素蛋白溶液中和季铵化甲壳素溶液中为1轮依次浸泡，所述依次浸泡的轮数至少为1轮；
优选地，所述依次浸泡的轮数小于等于19轮。
优选地，所述支撑层为聚己内酯、聚乙烯醇或纤维素通过流延法或静电纺丝法制备得到；
所述固化为依次浸泡在甲醇和戊二醛溶液中进行；浸泡在甲醇溶液中的时间为10min-30min；浸泡在戊二醛溶液中的时间为6-12h，所述戊二醛溶液的质量浓度为0.5％-5％。
优选地，所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.5％-20％；所述季铵化甲壳素溶液的质量浓度为0.5％-5％；
所述浸泡在丝素蛋白溶液中的时间和浸泡在季铵化甲壳素溶液中的时间分别为10min-30min；
在丝素蛋白溶液中浸泡后以及在季铵化甲壳素溶液中浸泡后，还包括在生理盐水中洗涤的步骤。
按照本发明的另一方面，提供了任一所述的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料用于制备伤口敷料或创面修复材料的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)层层自组装(LBL)技术是指将基材交替地浸泡于带相反电荷的高分子溶液中，通过静电吸附作用形成聚电解质复合涂层，从而实现对基材表面理化及生物学性能的修饰和调控。本发明中季铵化甲壳素带有正电荷，丝素蛋白带有负电荷。通过LBL自组装技术可将季铵化甲壳素和丝素蛋白固定于基材表面，固定后季铵化甲壳素和丝素蛋白层性能稳定，难溶于水；赋予复合材料优良的生物相容性和广谱抗菌性。季铵化甲壳素的含量及其抗菌效果可通过组装层数实现简易调节。
(2)本发明中优选地采用高压静电纺丝法制备丝素蛋白纳米纤维膜，并将其作为基材；季铵化甲壳素作为正电层组分，丝素蛋白溶液作为负电层组分；通过层层自组装制备得到抗菌复合纳米纤维材料。丝素蛋白是天然蚕丝的主要成分，生物相容性和生物活性良好，是一种理想的敷料基材。此外，丝素蛋白易溶于有机溶剂六氟异丙醇，所得溶液电纺性能良好，纳米纤维比表面积高。采用季铵化甲壳素作为正电层组分，丝素蛋白作为负电层组分，两种组分通过静电作用交替吸附于基材表面，从而实现对抗菌因子的有效固定。
(3)本发明获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料具有良好的生物相容性，相对细胞增殖率均明显大于80％，符合生物材料生物毒性Ⅰ类标准。本发明获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料能显著抑制革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰阴性菌(大肠杆菌)增殖，具有广谱抗菌性，对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率都在95％以上；本发明获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料具有良好血液相容性，溶血率显著低于5％。
(4)本发明制备条件温和，对环境污染小，产品附加值高，有望应用于工业生产。本发明获得的抗菌复合材料可作为制备伤口敷料或创面修复材料使用，产品附加值高，有望应用于工业化生产。
附图说明
图1是实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料扫描电子显微镜观察的结果。
图2是实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料傅里叶变换红外光谱的结果。
图3是实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料溶血实验的结果。
图4是实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料体外细胞毒性实验的结果。
图5是阴性对照抗大肠杆菌的效果图；图6是阳性对照抗大肠杆菌的效果图；图7、图8、图9和图10分别是季铵化甲壳素为0层、1层、4层和7层的复合物抗大肠杆菌的效果图。
图11是阴性对照抗金黄色葡萄球菌的效果图；图12是阳性对照抗金黄色葡萄球菌的效果图；图13、图14、图15和图16分别是季铵化甲壳素为0层、1层、4层和7层的复合物抗金黄色葡萄球菌的效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
(1)采用高压静电纺丝法制备丝素蛋白纳米纤维材料。将1.2g丝素蛋白溶于10mL六氟异丙醇中得到丝素蛋白电纺液。将其置入高压静电纺丝机的推注泵中电纺，参数设置为：电压12kV，纺丝距离10cm，纺丝流率0.05mL/min，电纺时间2h。电纺结束后取下丝素蛋白纳米纤维材料，将其浸泡在甲醇中5min，然后浸泡于2.5％戊二醛水溶液中反应12h。
(2)采用LBL技术制备季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料。将上述的丝素蛋白纳米纤维材料直接作为基底层，浸泡于质量浓度为1％的季铵化甲壳素溶液中15min，使用生理盐水洗净。再将其浸泡于质量浓度为1％的丝素蛋白溶液中15min，使用生理盐水洗净。将复合材料在上述季铵化甲壳素溶液和丝素蛋白溶液中交替吸附带相反电荷的分子，制备得到多层季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料，并命名为QCF-n(n为季铵化甲壳素涂层的层数)。
实施例2
将实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料QCF-7置于60℃烘箱内干燥6h，然后采用扫描电子显微镜观察支架材料的微观形貌。
图1是实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料扫描电子显微镜的结果。如图所见，QCF-7表面呈现相互交织的丝状结构，并未因层层自组装处理而出现黏连现象。
实施例3
将实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料研成粉末，采用红外光谱仪检测复合材料的傅里叶变换红外光谱。
图2是实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料傅里叶变换红外光谱的结果。如图所见，复合材料酰胺1和酰胺2的峰强度均随组装层数增多而逐渐增强，说明季铵化甲壳素成功的固定于基材表面。
实施例4
将实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料高压灭菌后浸泡于RPMI-1640完全培养基中制备材料浸提液。采用体外细胞毒性实验(MTT)评价支架材料的细胞相容性。将小鼠成纤维细胞系(L929)以1×103个/孔的密度接种于96孔组织培养板中，常规培养24h后弃去培养基，加入200μL材料浸提液，继续培养3d。未加浸提液组作为空白对照。每隔24h取出1块组织培养板，向每孔中加入20μL MTT试剂，继续培养4h。弃去所有培养基，向每孔中加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，充分溶解后采用多功能酶标仪检测其在490nm处的吸光度值，经统计分析得到L929细胞的相对增殖率。
图4是实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料体外细胞毒性实验的结果。如图所见，各组相对细胞增殖率均明显大于80％，符合生物材料生物毒性Ⅰ类标准，细胞相容性良好。
实施例5
将实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料洗净后剪成1cm2大小的样品并置于15mL离心管中。向每支离心管中加入10mL生理盐水，37℃水浴30min，接着加入0.2mL全血与生理盐水质量比为1:1.25的稀释全血，混匀后于37℃恒温水浴60min。用10mL灭菌超纯水稀释0.2mL稀释全血作为阳性对照(即DS组)，10mL生理盐水稀释0.2mL稀释全血作为阴性对照(即NS组)。经1500rpm离心10min后，采用多功能酶标仪检测上清液在545nm处的吸光度值。经统计学分析得到溶血率。
图3是实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料溶血实验的结果。如图所示，各组溶血率均显著低于5％，无明显溶血现象发生。
实施例6
将实施例1获得的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料剪成1cm2大小的样品并置于试管内。向每支试管内加入2mL灭菌LB细菌培养基，于200rpm条件下37℃恒温振荡4h。将带菌的LB培养基逐级稀释后涂布于LB固体培养板中，在37℃条件下倒置培养过夜。采用数码相机拍摄菌落照片。
图5是阴性对照抗大肠杆菌的效果图；图6是阳性对照抗大肠杆菌的效果图；图7、图8、图9和图10分别是季铵化甲壳素为0层、1层、4层和7层的复合物抗大肠杆菌的效果图。图11是阴性对照抗金黄色葡萄球菌的效果图；图12是阳性对照抗金黄色葡萄球菌的效果图；图13、图14、图15和图16分别是季铵化甲壳素为0层、1层、4层和7层的复合物抗金黄色葡萄球菌的效果图。可以得知，当季铵化甲壳素涂层数由0层增加至7层，LB固体培养基表面生成的菌落数逐渐减少，说明本发明季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料具有良好的抗菌性，且抗菌性能随着自组装层数增加而逐渐增强。
实施例7
将3g纤维素溶解在-12℃的7％NaOH/12％尿素水溶液中，再于4℃下离心10min，消除气泡及弃去未溶解的杂质，得到澄清透明溶液。经过流延法，将溶液铺展在玻璃片表面；随后缓慢浸入5％的硫酸溶液中再生塑型。将得到的薄膜在纯水溶液中反复冲洗浸泡，随后干燥；得到纤维素薄膜材料。将此纤维素材料先浸泡于20％的丝素蛋白溶液中过夜，随后依次浸泡于甲醇溶液中30min，2.5％戊二醛水溶液反应12h；随后用生理盐水洗净。将含有丝素蛋白层的纤维素材料作为基底，将该基底依次浸泡于5％的季铵化甲壳素溶液中30min以及20％的丝素蛋白溶液中30min；按照此顺序交替浸泡；期间用生理盐水洗净。得到具有多层结构的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料，其特征在于，所述复合材料含有季铵化甲壳素层和丝素蛋白层；所述季铵化甲壳素层和丝素蛋白层交替排列；所述季铵化甲壳素层和丝素蛋白层通过静电相互作用吸附；所述季铵化甲壳素层和丝素蛋白层数相同，且至少为1层。
2.如权利要求1所述的一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料，其特征在于，所述复合材料还包括支撑层，最底层的丝素蛋白层粘附在所述支撑层表面。
3.如权利要求1所述的一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料，其特征在于，所述季铵化甲壳素层和丝素蛋白层的层数均小于等于20层。
4.如权利要求2所述的一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料，其特征在于，所述支撑层为聚己内酯、聚乙烯醇或纤维素形成的膜材料。
5.一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料的制备方法，其特征在于，将丝素蛋白膜浸泡在季铵化甲壳素溶液中，使带正电荷的季铵化甲壳素与带负电荷的丝素蛋白通过静电相互作用吸附，得到丝素蛋白层和季铵化甲壳素层的复合材料。
6.如权利要求5所述的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白膜固化在支撑层；所述丝素蛋白膜固化在支撑层上是先将支撑层浸泡在丝素蛋白溶液中，使支撑层表面形成丝素蛋白膜，然后再浸泡在固化剂中使丝素蛋白膜固化得到。
7.如权利要求5或6所述的一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料的制备方法，其特征在于，所述将丝素蛋白膜浸泡在季铵化甲壳素溶液中后，再依次浸泡在丝素蛋白溶液中和季铵化甲壳素溶液中，通过层层自组装的方式，得到具有多层季铵化甲壳素层和多层丝素蛋白层的复合材料；设定先后分别浸泡在丝素蛋白溶液中和季铵化甲壳素溶液中为1轮依次浸泡，所述依次浸泡的轮数至少为1轮；
优选地，所述依次浸泡的轮数小于等于19轮。
8.如权利要求6所述的一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料的制备方法，其特征在于，所述支撑层为聚己内酯、聚乙烯醇或纤维素通过流延法或静电纺丝法制备得到；
所述固化为依次浸泡在甲醇和戊二醛溶液中进行；浸泡在甲醇溶液中的时间为10min-30min；浸泡在戊二醛溶液中的时间为6-12h，所述戊二醛溶液的质量浓度为0.5％-5％。
9.如权利要求7所述的一种季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.5％-20％；所述季铵化甲壳素溶液的质量浓度为0.5％-5％；
所述浸泡在丝素蛋白溶液中的时间和浸泡在季铵化甲壳素溶液中的时间分别为10min-30min；
在丝素蛋白溶液中浸泡后以及在季铵化甲壳素溶液中浸泡后，还包括在生理盐水中洗涤的步骤。
10.如权利要求1-4任一所述的季铵化甲壳素与丝素蛋白的复合材料用于制备伤口敷料或创面修复材料的应用。
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