CN115634305B - 一种多功能静电纺复合纳米纤维材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医用高分子材料领域，公开了一种多功能静电纺复合纳米纤维材料及其制备方法和应用。具体采用高压静电纺丝技术制备PLLA与QCS复合纳米纤维，然后依次与带负电的原料层和带正电的原料层通过层层自组装（LBL）技术制备成多功能复合纳米纤维材料。本发明制备的多功能复合纳米纤维材料兼具NIR辅助按需供氧、止血、抗菌和抗炎，以及促进细胞增殖、迁移和血管生成等多功能特性，被认为可以改造恶劣的缺氧微环境，可作为新型医用多功能支架材料应用于糖尿病伤口处理，在医用材料领域以及临床上具有很好的应用前景。

Description

一种多功能静电纺复合纳米纤维材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种多功能静电纺复合纳米纤维材料及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病性皮肤损伤（DSI）是糖尿病最危险的并发症之一，常发生在人体的腿部和足部。糖尿病患者DSI的发生率高达25%，在某些病例中可能最终导致非创伤性肢体截肢。DSI的治疗方法保守，包括清创、引流、抗感染、生长因子和高压氧治疗，但其临床效果并不完全令人满意。近年来，组织工程创面敷料（TEWD）已成为下一代加速糖尿病创面愈合的方法。先进的TEWD包括纳米纤维、水凝胶和微针贴片等，已经被广泛开发。其中，电纺丝纳米纤维因其优良的生物相容性（细胞外基质ECM样结构）、加工性能（混合、同轴或自组装）和载药能力（包覆或粘合）而具有更大的临床转化前景。

DSI的愈合过程可分为四个重叠阶段，持续3周以上。它可被恶劣的缺氧微环境（HME）阻断，HME由一系列内源性和外源性因素组成，如局部出血、细菌感染和微血管病变-缺氧反馈回路。本课组已经开发了几种基于壳聚糖季铵盐（QCS）的电纺纳米纤维创面敷料（Advanced Healthcare Materials,2020, 9, 23,13）。由于带电聚合物与宿主细胞之间的静电相互作用，这些纳米纤维具有止血和广谱抗菌作用。但不能完全避免糖尿病微血管病变引起的缺氧。缺氧的作用和机制已得到很大揭示。如缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）异常转录，导致血管化损伤。

为了解决这一问题，最近开发了一种高效的HME靶向供氧策略。初步研究了一系列氧载体（分子式咪唑酸、过氧化物纳米颗粒、二硫化钼等）和复合TEWD。然而，它们中很少有能够在外界刺激（如近红外）下响应性释放氧气。同时，这些氧载体在生物相容性和生物降解性方面普遍较差。这些研究中的氧载体难以满足美国食品药品监督管理局（FDA）和中国国家药品监督管理局（NMPA）的高要求。在此基础上，我们根据通用原理对理想的载氧剂和复合TEWD进行优化（ACS Nano, 2022, 16, 2, 1708–1733）。

血红蛋白（Hb）从红细胞中分离出来，是一种天然的氧载体，具有良好的热响应能力。血红蛋白的血红素在生理条件下与氧可逆结合。当氧气分压急剧下降时，Hb可自动释放氧气。此外，Hb的释氧动力学可受环境温度的控制。光热疗法（PTT）是一种有效的无创温度调节技术。黑磷（BP）纳米片是一种具有良好的近红外热转化效率的光热剂。BP纳米片在高水平的研究工作中备受关注，其副作用报道较少。在这里，我们假设Hb和BP纳米片的结合将产生一种先进的光热响应氧载体。

层层自组装（LBL）是一种多功能的技术，通过带电聚合物之间的静电相互作用进行功能修饰。它可以对微观结构进行纳米尺度的控制，并允许聚合物、纳米材料和生物分子的整合而不阻碍其生物活性。目前，黑磷、血红蛋白、壳聚糖季铵盐、透明质酸、聚乳酸在生物医学材料学领域内的应用还未得到充分的发挥，且有关通过静电纺丝技术和层层自组装技术构建多功能静电纺复合纳米纤维的报道还未见到。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种多功能静电纺复合纳米纤维材料及其制备方法和应用。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种多功能复合纳米纤维材料，所述多功能复合纳米纤维材料包括纤维芯材，纤维芯材的表面通过层层自组装依次包裹有透明质酸层与壳聚糖季铵盐层，所述纤维芯材为壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维。

优选地，所述壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维是将壳聚糖季铵盐分散于聚乳酸基质中制备而成的复合纳米纤维材料。

进一步地，所述壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维的制备方法为：将壳聚糖季铵盐溶液与聚乳酸溶液共混孵育后得到壳聚糖季铵盐/聚乳酸共混液，然后将壳聚糖季铵盐/聚乳酸共混液进行纺丝处理，得到壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维；所述壳聚糖季铵盐溶液的质量分数为0.2%-2%；所述聚乳酸溶液的质量分数为8%-12%；所述壳聚糖季铵盐溶液与聚乳酸溶液的共混体积比为（0.1-1）∶（3-10）。更加优选地，所述共混孵育方式为搅拌；所述搅拌速率为500-1500rpm，搅拌时间为24-72h；所述纺丝处理的工艺参数为：接收器转速为500-3000rpm，接收距离10-20cm，喷射速率为0.5-1mL/h，电压为15-20kV。

优选地，所述透明质酸层由黑磷（BP）、血红蛋白（Hb）、透明质酸（HA）制备而成。更加优选地，所述黑磷为二维黑磷纳米片。

更加优选地，所述季铵盐壳聚糖层由季铵盐壳聚糖（QCS）制备而成。

优选地，所述聚乳酸为左旋聚乳酸（PLLA）。这是因为PLLA在生物体内经过酶分解，最终形成二氧化碳和水，具有良好的生物兼容性。

本发明第二方面提供了一种上述第一方面所述的多功能复合纳米纤维材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）将壳聚糖季铵盐溶液与聚乳酸溶液共混孵育后得到壳聚糖季铵盐/聚乳酸共混液，然后将壳聚糖季铵盐/聚乳酸共混液进行纺丝处理，得到壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维；

（2）在氧气氛围下，先将黑磷、血红蛋白加入透明质酸溶液中孵育后得到A液，将壳聚糖季铵盐溶液作为B液；然后将步骤（1）制备的壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维依次在A液、B液中进行浸泡处理，并记为1个自组装周期，完成N个自组装周期后，得到多功能复合纳米纤维。

优选地，步骤（1）中所述壳聚糖季铵盐溶液的质量分数为0.2%-2%。更加优选地，所述壳聚糖季铵盐溶液中的溶剂为六氟异丙醇。

优选地，步骤（1）中所述聚乳酸溶液的质量分数为8%-12%。更加优选地，所述聚乳酸溶液中的溶剂为六氟异丙醇。

优选地，步骤（1）中所述壳聚糖季铵盐溶液与聚乳酸溶液的共混体积比为（0.1-1）∶（3-10）。

更加优选地，步骤（1）中所述共混孵育方式为搅拌；所述搅拌速率为500-1500rpm，搅拌时间为24-72h。

更加优选地，步骤（1）中所述纺丝处理的工艺参数为：接收器转速为500-3000rpm，接收距离10-20cm，喷射速率为0.5-1mL/h，电压为15-20kV。

优选地，步骤（2）中所述孵育方式为搅拌；所述搅拌速率为100-1500rpm，搅拌时间为0.5-4h。

优选地，所述A液中透明质酸的质量分数为0.1%-3%，黑磷的浓度为0.01-0.1mg/mL，血红蛋白的浓度为0.2-3mg/mL。其中，步骤（2）中所述透明质酸溶液中的溶剂为去离子水。更加优选地，所述黑磷为二维黑磷纳米片。

优选地，所述B液中壳聚糖季铵盐的质量分数为0.1%-2%。其中，步骤（2）中所述壳聚糖季铵盐溶液中的溶剂为去离子水。

优选地，步骤（2）中所述浸泡处理步骤具体为：在A液或B液中浸泡，清洗后再浸入另一种液体；所述浸泡时间为5-30min，清洗试剂为去离子水，清洗次数为1-3次。

更加优选地，步骤（2）中在A液或B液中浸泡处理的同时还可加入搅拌处理，搅拌速率为0-200rpm。

本发明第三方面提供了上述第二方面制备方法制备的多功能复合纳米纤维材料。

本发明第四方面提供了上述第一方面或第三方面所述的多功能复合纳米纤维材料在医用材料中的应用。优选地，所述医用材料包括医用支架材料如伤口敷料材料。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

（1）本发明采用高压静电纺丝技术制备PLLA与QCS复合纳米纤维，然后依次与带负电的原料层（带Hb和BP纳米片的HA层）和带正电的原料层（QCS层）进行层层自组装（LBL）制备多功能复合纳米纤维材料，可应用于复合创面敷料。其中，Hb和BP纳米片通过LBL在QCS和HA的帮助下自组装到PLLA/QCS纳米纤维上，给以其制备的多功能复合纳米纤维材料赋予NIR辅助按需供氧、止血、抗菌和抗炎，以及促进细胞增殖、迁移和血管生成等多功能特性，被认为可以改造恶劣的缺氧微环境。因此，本发明制备的多功能复合纳米纤维的一体化生物活性特性与糖尿病性皮肤损伤的临床需要高度匹配，可作为新型医用多功能支架材料应用于糖尿病伤口处理，在医用材料领域以及临床上具有很好的应用前景。

（2）本发明将QCS和HA作为固定相自组装到PLLA/QCS纳米纤维上，其中，QCS具有抗菌和止血作用，HA是Hb和BP纳米片的载体。本发明结合血红蛋白与氧气可逆性结合的特性，以及黑磷优异的光热转化性能，构建了新型氧气递送载体；该氧气递送载体能够在近红外下响应性释放氧气，改善糖尿病伤口低氧的恶劣环境，而且巧妙地采用层层自组装技术同时保留了纳米纤维的细胞外基质ECM样结构与血红蛋白和黑磷固有的生物活性。

（3）本发明制备的复合纳米纤维材料中，采用的黑磷，血红蛋白，壳聚糖季铵盐，透明质酸和聚乳酸均为生物相容性和生物降解性能良好的原料，且这些原料来源广泛，绿色环保，制备工艺简单，成本低廉。此外，通过改变黑磷、血红蛋白、壳聚糖季铵盐和透明质酸的浓度，层层自组装的沉积层数、清洗时间等参数以调节各种原料的相对含量，可以构建得到不同结构和性能的多功能复合纳米纤维材料，以适用于多种应用场景。

附图说明

图1为本发明多功能复合纳米纤维材料的制备过程示意图；

图2为本发明实施例1-3和对比例1样品的表面结构扫描电镜图和表面粗糙度AFM图，其中，a为表面结构扫描电镜图，b为表面粗糙度AFM图；图中，PQBH-0为对比例1样品，PQBH-2为实施例1样品，PQBH-4为实施例2样品，PQBH-8为实施例3样品；

图3为本发明实施例3样品的EDS能谱分析图；

图4为本发明实施例1-3样品分别在1.5W/cm²和3.5W/cm²功率密度下的光热成像图和实时温度变化曲线图，其中，a为实施例1-3样品的体外光热成像图，b为实施例1-3样品的体内光热成像图，c为实施例1-3样品的体外光热转换过程中的实时温度变化曲线图，d为实施例3样品的体外温度开关实验的实时温度变化曲线图；图中，PQBH-2为实施例1样品，PQBH-4为实施例2样品，PQBH-8为实施例3样品；

图5为本发明实施例1-3样品的载氧量和释氧量随时间变化的数据图，其中，a为实施例1-3样品的载氧量随时间变化的数据统计图，b为实施例3样品分别在不经近红外照射（Control），经间断的近红外照射（Intermittent）和连续的近红外照射（Contimuous）条件下的释氧量随时间变化曲线图；图中，PQBH-2为实施例1样品，PQBH-4为实施例2样品，PQBH-8为实施例3样品；

图6为本发明实施例3和对比例1样品应用于动物止血模型中的出血情况图、出血量数据统计图和止血时间统计图，其中，a、b、c分别为大鼠断尾模型、大鼠肝损伤模型和兔肝损伤模型中的出血情况图，d为动物止血模型的出血量数据统计图，e为动物止血模型的止血时间统计图；图中，NC为阴性对照，PC为阳性对照，PQBH-0为对比例1样品，PQBH-8为实施例3样品；

图7为本发明实施例1-3和对比例1样品在808nm激光（1.5W·cm^-2）照射下与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）或大肠杆菌（E.coil）共孵育后的LB平板菌落图和活/死细菌的荧光染色图像，其中，a为LB平板菌落图，b为对MRSA的抑菌率，c为对E.coil的抑菌率，d为活/死细菌的荧光染色图像（红色代表死细菌，绿色代表活细菌）；图中，BC为空白对照组，PC为抗生素组，PQBH-0为对比例1样品，PQBH-2为实施例1样品，PQBH-4为实施例2样品，PQBH-8为实施例3样品；

图8为本发明实施例3和对比例1样品与L929或HUVECs细胞共孵育分组情况模式图，以及HIF-1α免疫荧光染色图及其数据统计图，划痕实验划痕愈合镜检图及其数据统计图，Transwell迁移实验细胞跨孔迁移染色图及其数据统计图，成管形成试验荧光染色图及其数据统计图，其中，a为实施例3和对比例1样品与L929或HUVECs细胞共孵育分组情况模式图，b为HIF-1α免疫荧光染色图，c和d分别为L929和HUVECs细胞的HIF-1α免疫荧光染色数据统计图，e为划痕实验划痕愈合镜检图，f和g分别为L929和HUVECs细胞的划痕实验细胞迁移面积数据统计图，h为Transwell迁移实验细胞跨孔迁移染色图，i和j分别为L929和HUVECs细胞的Transwell迁移实验数据统计图，k为成管形成试验荧光染色图，l为成管形成试验分枝点数据统计图，m为成管形成试验毛细血管长度数据统计图；图中，Normoxia为常氧组，Hypoxia+HG为低氧+HG组，PQBH-0为低氧高糖环境+样品PQBH-0，PQBH-8为低氧高糖环境+样品PQBH-8+NIR照射；

图9为本发明实施例3和对比例1样品与L929或HUVECs细胞共孵育的CCK8结果统计图；图中，Normoxia为常氧组，Hypoxia+HG为低氧+HG组，PQBH-0为低氧高糖环境+样品PQBH-0，PQBH-8为低氧高糖环境+样品PQBH-8+NIR照射；

图10为本发明实施例3和对比例1样品在糖尿病皮肤缺损小鼠模型中的创面愈合过程图及其数据统计图，其中，a为第0d、3d、7d、12d时用数码相机和超声仪拍摄的创面图像，b为创面愈合动态过程重构的等高线图，c为第3d、7d、12d时创面面积比结果统计图；图中，BC为空白组，PC为阳性组，PQBH-0为对比例1样品，PQBH-8为实施例3样品+NIR照射；

图11为本发明实施例3和对比例1样品在糖尿病皮肤缺损小鼠模型中第12天的再生皮肤组织的H&E染色图和Masson染色图；图中，BC为空白组，PC为阳性组，PQBH-0为对比例1样品，PQBH-8为实施例3样品+NIR照射；

图12为本发明实施例3和对比例1样品在糖尿病皮肤缺损小鼠模型中第12天的再生皮肤组织中HIF-1α、CD31和α-SMA免疫荧光图像及其数据统计图，Western Blot检测HIF-1α和VEGF蛋白表达量示意图及其数据统计图，其中，a为HIF-1α、CD31和α-SMA免疫荧光图像，b为HIF-1α、CD31和α-SMA荧光强度数据统计图，c为Western Blot检测HIF-1α和VEGF蛋白表达量图，d为Western Blot检测HIF-1α和VEGF蛋白表达量数据统计图；图中，BC为空白组，PC为阳性组，PQBH-0为对比例1样品，PQBH-8为实施例3样品+NIR照射；

图13为本发明实施例3和对比例1样品在糖尿病皮肤缺损小鼠模型中第12天的再生皮肤组织切片CD68、Ly6G、IL-6和TNF-α染色图像及其数据统计图，其中，a为CD68、Ly6G、IL-6和TNF-α染色图像，b为CD68、Ly6G、IL-6和TNF-α染色结果数据统计图；图中，BC为空白组，PC为阳性组，PQBH-0为对比例1样品，PQBH-8为实施例3样品+NIR照射；

图14为本发明实施例1-3和对比例1样品在糖尿病皮肤缺损小鼠模型中第12天的心、肝、脾、肺、肾、脑的HE染色图像；图中，B.C.为空白组，PQBH-0为对比例1样品，PQBH-2为实施例1样品，PQBH-4为实施例2样品，PQBH-8为实施例3样品。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例结合附图，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

实施例1

本实施例先提供一种黑磷（BP）纳米片，其制备方法为：在电化学体系中，采用BP晶体作为阳极，铂作为阴极，并将两个电极完全浸入含有六氟磷酸四丁基铵的碳酸丙烯（PC）溶液中；在体系中施加-5V电压完成分层后，将剥落的BP片迅速转移到离心管中；然后将无水丙酮加入BP片中分散均匀，以5000r/min离心10min收集BP纳米片，再用水和乙醇洗涤，去除电解质和杂质；收集上述BP纳米片备用。

本实施例提供一种多功能复合纳米纤维材料，制备流程如图1所示，其制备方法具体包括如下步骤：

（1）将聚乳酸颗粒溶于六氟异丙醇中，室温搅拌均匀后得到10wt%的聚乳酸溶液；将壳聚糖季铵盐（上海麦克林生化科技有限公司，CAS：NONE6321）溶于六氟异丙醇中，室温搅拌均匀后得到2wt%的壳聚糖季铵盐溶液；将聚乳酸溶液与壳聚糖季铵盐溶液按体积比8∶2共混，1500rpm搅拌48h后得到聚乳酸/壳聚糖季铵盐纺丝液。

（2）将步骤（1）得到的聚乳酸/壳聚糖季铵盐纺丝液装至5mL注射器中，调整接收器转速为600rpm，溶液流速为0.5mL/h，收集距离为11cm，同时启动高压电源进行静电纺丝，设置电压为15kV，纺丝结束后得到复合纳米纤维膜基材。

（3）将透明质酸溶解在去离子水中得到透明质酸溶液，之后将BP纳米片、血红蛋白加入透明质酸溶液中200rpm搅拌2h后得到带负电荷的A液；所得A液中，BP纳米片的浓度为0.075mg/mL，血红蛋白的浓度为2mg/mL，透明质酸的质量分数为2%。将壳聚糖季铵盐溶于去离子水中作为带正电荷的B液；所得B液中，壳聚糖季铵盐的质量分数为1%。

（4）在室温富氧环境下，将步骤（2）得到的复合纳米纤维膜基材先在A液中浸泡15min，用去离子水漂洗后，再置于B液中浸泡15min，然后再次漂洗，记为1个自组装周期，沉积层数为2层，最后得到一种多功能复合纳米纤维材料，即复合纳米纤维膜，记为PQBH-2。

实施例2

一种多功能复合纳米纤维材料内容与实施例1的内容基本相同，其不同之处在于：步骤（4）中进行2个自组装周期，所述沉积层数为4层，得到的复合纳米纤维膜记为PQBH-4。

实施例3

一种多功能复合纳米纤维材料内容与实施例1的内容基本相同，其不同之处在于：步骤（4）中进行4个自组装周期，所述沉积层数为8层，得到的复合纳米纤维膜记为PQBH-8。

对比例1

一种多功能复合纳米纤维材料内容与实施例1的内容基本相同，其不同之处在于：不进行步骤（3）和步骤（4）的制备，直接将得到的复合纳米纤维膜基材记为PQBH-0。

将实施例1-3和对比例1制备的复合纳米纤维膜进行SEM和AFM电镜扫描，结果如图2所示。从图2a可以看出，PQBH-n（其中n为沉积层数，且n=0,2,4,8）均呈现出类似于细胞外基质的纤维网状结构，且随着n值的增大，复合纳米纤维膜的纤维平均直径逐渐增大，这主要是由QCS、HA、Hb和BP纳米片组成的聚电解质络合物引起的。此外，复合纳米纤维膜的粗糙度随着沉积层数n的增加而降低（如图2b所示）。该结果表明本发明通过静电纺丝和层层自组装技术成功地构建了不同层数的多功能复合纳米纤维。

为进一步验证Hb和BP是否加载到复合纳米纤维表面，本发明还对实施例3制备的复合纳米纤维膜PQBH-8进行了EDS能谱分析，结果如图3所示。由图3可知，PQBH-8复合纳米纤维上分布有碳元素、氧元素、氮元素、氯元素、硫元素（Hb的特征元素）、铁元素（Hb的特征元素）和磷元素（BP的特征元素）。这些结果证实了Hb和BP已成功地组装到复合纳米纤维基材上。

性能测试：

1、光热转换性能测试

（1）实验方法

将实施例1-3制备的复合纳米纤维膜样品PQBH-2、PQBH-4和PQBH-8剪成1×1cm大小的片状，备用。

体外光热转换性能：采用功率为1.5W/cm²或3.5W/cm²的808nm NIR激光照射各样品3min；再使用光热成像仪获取样品的光热成像图像，并记录各组温度变化，获取样品的温度曲线图像，以评估样品的体外光热转换性能。结果如图4中a、c所示。

体内光热转换性能：将样品PQBH-2、PQBH-4和PQBH-8应用于小鼠背侧皮肤，评价其在体内（808nm，1.5W/cm²）的光热转换性能。结果如图4b所示。

体外光热转换稳定性：为了检测样品PQBH-n的光热转换行为可以被近红外反复激发，本发明还进行了体外开/关循环测试，具体使用功率为1.5W/cm²的808nm NIR激光照射样品PQBH-8，直到温度达到最高；之后，去掉NIR照射，当样品温度降低到室温后；再次施加NIR照射，重复5个循环，评价其光热稳定性能。结果如图4d所示。

（2）实验结果

体外光热转换性能：从图4a可以看出，在1.5W/cm²或3.5W/cm²的辐照条件下，随着沉积层数的增加，样品的温度均在逐渐升高，由于材料中只有BP对NIR激光有光热转换效应，因此温度增加随着BP含量的增加而增加。从图4c可以看出，1.5W/cm²近红外照射条件下，180 s后样品PQBH-2、PQBH-4和PQBH-8的温度分别稳定在29.1±0.6℃、34.2±0.9℃和41.7±1.7℃；当近红外辐射增强到3.5W/cm²时，样品PQBH-2、PQBH-4和PQBH-8的温度分别上升到31.1±0.3℃、41.9±0.2℃和52.8±0.7℃。这些结果表明，复合纳米纤维PQBH-n（n=2,4,8）具有将808nm近红外光转化为热能进行光热治疗（PTT）的巨大潜力。基于以上结果，并考虑到高温会对周围皮肤组织造成损伤，选择1.5W/cm²作为合适的近红外功率用于体内动物实验。

体内光热转换性能：从图4b可以看出，样品PQBH-n的温度也随着沉积层数的增加而增加，其中，样品PQBH-8在小鼠背部的局部温度在2min内从33.6±1.6℃上升到40.2±0.4℃，与哺乳动物体温相近，非常适合应用于伤口修复。

光热转换稳定性：从图4d可以看出，样品PQBH-8在近红外照射下，在不到2 min的时间内可达到40℃左右；去除近红外辐照后，样品PQBH-8的温度逐渐下降到室温。经过第5次近红外辐照后，样品PQBH-8的温度仍可升至40℃，表明本发明制备的复合纳米纤维的光热转换行为可以被近红外反复控制。

综上，本发明制备的复合纳米纤维具有优异的光热转换能力和光热转换稳定性。

2、氧气装载与释放测试

（1）实验方法

将实施例1-3制备的复合纳米纤维膜样品PQBH-2、PQBH-4和PQBH-8剪成1×1cm大小的片状，备用。

载氧实验：为了检测PQBH-n（n=2,4,8）的载氧量，将制备的样品进行氮气处理以去除未装载到样品上的氧；然后将这些样本置于富氧生理盐水中；最后在特定的时间间隔内，使用溶解氧计（JPBJ-608，Rex，China）测量溶解氧浓度。结果如图5a所示。

释氧实验：为了检测本发明制备的复合纳米纤维的氧释放情况，将样品PQBH-8在连续的（Contimuous组）和每半小时照射10min的间歇的（Intermittent组）近红外照射下在特定的时间点检测样品在除氧生理盐水中的溶解氧浓度，同时将未进行近红外照射的样品作为对照（Control组）。需要说明的是，为了确保Hb有足够的氧气，样品PQBH-8进行了一夜的氧气处理；所有的释氧实验均在氮气环境下进行。结果如图5b所示。

（2）实验结果

载氧实验：将氮处理后的PQBH-n（n=2,4,8）浸入富氧生理盐水中，测试其载氧能力，结果从如图5a中可以看出，各组生理盐水中的含氧量百分比均呈下降趋势，其中样品PQBH-8在12h内的下降值最为明显，也即样品PQBH-8的载氧量最高。

释氧实验：从图5b可以看出，样品PQBH-8在没有近红外照射的情况下释氧量非常小；在连续近红外照射下，PQBH-8所载氧快速释放，在12h左右达到平衡；而PQBH-8在间歇近红外照射下氧释放相对缓慢，在20h左右停止。这是因为，本申请制备的复合纳米纤维可通过近红外触发材料的光热转换特性促使材料升温，当温度升高时，氧解离曲线右移，使血红蛋白对氧的亲和力减弱，也即血红蛋白释氧能力增强，因此促进了血红蛋白的快速释氧，因此，出现了近红外照射可以控制释氧量的情况。

综上，载氧/释氧实验结果验证了本发明制备的复合纳米纤维能够在近红外照射条件下有效并响应地向受损皮肤输送氧气，以确保足够的氧气供应，这与血红蛋白与氧的可逆结合有关。

3、动物模型止血能力测试

（1）实验方法

采用大鼠断尾模型（RatTA）、大鼠肝损伤模型（RatLI）、兔肝损伤模型（RabLI）评价复合纳米纤维膜的止血潜力。对于RatTA，每只老鼠的尾巴被切掉1-2cm，然后用样品PQBH-0或PQBH-8覆盖流血的尾巴；对于RatLI和RabLI，在肝脏上制造10mm的出血伤口，并立即将制备好的样品PQBH-0或PQBH-8覆盖出血部位；对照组为阴性对照（NC组），医用纱布为阳性对照（PC组）。记录出血时间，直至出血停止，该过程中使用纱布吸取留出来的血液，并通过称重吸血前后的纱布计算总失血量。结果如图6所示。

（2）实验结果

对比图6中的a可以看出，大鼠断尾模型中，NC组出现明显的出血现象，样品PQBH-0与PC组的出血现象接近，而样品PQBH-8覆盖伤口后几乎没有明显的血斑。对于图6中b和c的肝损伤模型中，不管动物种类是大鼠还是兔子，其出血现象趋势与大鼠断尾模型的结果趋近一致，样品PQBH-8的出血量也明显低于其他组。

从图6d中出血量的定量分析结果显示，大鼠断尾模型中，与NC组（0.17±0.06g）、PC组（0.09±0.02g）、PQBH-0组（0.10±0.03g）相比，PQBH-8组出血量显著减少（0.05±0.01g）。从图6e中也可以看出，NC组止血时间为168±38s，PQBH-8组止血时间显著缩短至69±15s。因此，样品PQBH-8的出血量是最低的，且止血时间也是最短的，这在大鼠肝损伤模型和兔肝损伤模型中也是同样的结果。

因此，样品PQBH-8作为伤口闭合的止血屏障效果最好。据此我们推测，本发明制备的复合纳米纤维膜的止血机制主要是：带正电的QCS（季铵基）和带负电的红细胞粘附聚集，迅速形成血块止血；QCS刺激血小板活化，使血凝块更加牢固；QCS激活补体系统等血液成分，促进凝血，进一步起到固定血凝块的作用。

4、抑菌活性测试

（1）实验方法

细菌感染是糖尿病患者伤口愈合的另一个主要挑战。因此，我们以一种革兰氏阳性菌（MRSA）和一种革兰氏阴性菌（E.coli）作为两类细菌的代表，评估了本发明制备的复合纳米纤维膜样品PQBH-n（n=0,2,4,8）对细菌的抗菌活性。实验开始前，先将实施例1-3和对比例1制备的复合纳米纤维样品PQBH-n（n=0,2,4,8）剪成1×1cm大小的片状，备用。

菌落形成试验：采用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和大肠杆菌（E.coil）检测样品PQBH-n（n=0,2,4,8）的抗菌活性，此外，还有BC组（空白对照组）和PC组（抗生素组）。具体为：先将PQBH-n与MRSA或E.coil悬浮液（1×10⁸CFU/mL）共孵育5h，并使用NIR每小时照射10min；再将上述菌液接种在Luria-Bertani（LB）培养皿上，37℃孵育16-24h后，采集不同组LB培养皿的图像，计数培养皿上的菌落形成单位（CFU）。根据菌落数计算抑制率（IR），具体计算公式为：IR（%）=（NC−NS）/NC×100%，其中NC和NS分别代表空白对照和样品的平均菌落数。结果如图7中的a、b、c所示。

活/死细菌染色实验：将PQBH-n与MRSA或E.coil悬浮液（1×10⁸CFU/mL）共孵育5h，并使用NIR每小时照射10min；根据活/死活性试剂盒，在室温下用DMAO和EthD-III染色15min；再将染色后的菌液添加到载玻片上，用盖玻片覆盖，在荧光显微镜下观察各组样本的活菌和死菌情况。结果如图7d所示。

（2）实验结果

从图7a可以看出，与BC组相比，本发明制备的复合纳米纤维样品PQBH-n（n=2,4,8）与细菌在近红外照射下孵育后，MRSA和E.coli菌落数量明显减少，其中PQBH-8组菌落数量最少。图7中b和c的抑菌率定量分析结果显示，与其他组相比，PQBH-8组对MRSA和E.coli的抑制率分别为99.9%和90.4%，显著抑制MRSA和E.coli的生长。从图7d可以看出，PQBH-8组红色荧光信号明显增强，活菌数量显著减少。

综上，结果表明样品PQBH-8的抑菌活性最好，由此可以看出，本发明制备的复合纳米纤维膜的沉积层数越多，抑菌效果越好。我们推测本发明制备的复合纳米纤维膜的抗菌作用是一个复杂的过程，是QCS的抗菌活性和PTT效应等多种因素协同作用的结果：首先，PQBH-n的主要成分是壳聚糖季铵盐（QCS），QCS作为阳离子表面活性剂，有效抗菌的部分是有机根与氮原子结合形成的阳离子基团。将带正电的壳聚糖季铵盐与带负电的细菌膜通过静电相互作用，产生室阻效应，从而抑制细菌生长而死亡；同时，其疏水烷基还可与细菌亲水性基团相互作用，改变膜的通透性，导致细胞结构破坏和细菌死亡。其次，在近红外照射下，BP的稳健光热效应引起的局部热疗增加了细菌的敏感性，对抑制细菌生长有积极作用。上述结果提示，本发明制备的复合纳米纤维膜兼具多种功能，可作为促进糖尿病创面愈合的创面敷料。

5、促细胞增殖和血管生成活性测试

（1）实验方法

伤口愈合需要多种细胞的参与，本发明以小鼠成纤维细胞（L929）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为模式细胞，具体采用HIF-1α免疫荧光染色法检测复合纳米纤维膜样品PQBH-n（n=0,8）的携氧能力，采用划痕法和transwell迁移法研究复合纳米纤维膜样品PQBH-n（n=0,8）促进细胞迁移的能力（细胞迁移在创面愈合过程中起着至关重要的作用），采用成管形成试验检测复合纳米纤维膜样品PQBH-n（n=0,8）对血管生成的影响（在慢性创伤中，血管生成对恢复持续供氧至关重要），采用细胞增殖实验检测复合纳米纤维膜样品PQBH-n（n=0,8）对L929和HUVECs细胞活力的影响。

实验分为4组（如图8a所示），具体为：常氧组（Normoxia）、低氧+HG组（Hypoxia+HG，代表低氧高糖环境）、PQBH-0组（代表低氧高糖环境+样品PQBH-0）、PQBH-8联合NIR照射组（代表低氧高糖环境+样品PQBH-8+NIR照射）。进一步地，常氧组细胞在基础培养基和正常培养条件下培养；除常氧组外的其余各组细胞均在高浓度葡萄糖（33mM）培养基和缺氧（1%O₂）条件下培养，以模拟低氧高糖环境。具体实验步骤如下：

HIF-1α免疫荧光染色：以1×10⁴cells/mL的密度将HUVECs或L929接种到24孔transwell的下室中，并在上室中加入各组样品；按组分别培养24h后，细胞用4%多聚甲醛固定15min；用HIF-1α免疫荧光染色评价缺氧情况，在荧光显微镜下对细胞进行拍照，监测HIF-1α分别在常氧组、缺氧+HG组、PQBH-0组和PQBH-8联合NIR照射组中的表达，并量化HIF-1α的相对荧光强度。结果如图8中b、c和d所示。

划痕试验：在细胞划痕试验中，HUVECs或L929以1×10⁵cells/mL的密度接种到下室；然后用无菌的P200移液管尖刮取细胞，用PBS冲洗去除游离细胞；再把每组样品都放在上室；在24h时，分别在光学显微镜下拍摄HUVECs和L929的照片；通过计算闭塞面积与初始伤口面积的比值来评估迁移率。结果如图8中e、f和g所示。

Transwell迁移试验：采用HUVECs或L929以1×10⁴cells/mL的密度接种于上室，下室加入各组样品；24h后，用棉签去除保留在上表面滤膜上的迁移细胞；下室迁移细胞用0.5%结晶紫溶液染色，用光学显微镜拍照，统计各组迁移细胞数量。结果如图8中h、i和j所示。

成管形成试验：为了进行成管试验，在预冷的24孔板的下室中加入每孔250μL的Matrigel（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA），在37℃下聚合30min；然后，将密度为1×10⁵cells/mL的HUVECs悬液接种在基质上，各组样品放置在上室中；孵育6h后，细胞用染料AM染色，并在荧光显微镜下拍照，结果如图8k所示；并计算细胞形成的毛细血管样结构的分枝点和毛细血管长度，评价小管形成能力，结果如图8中l和m所示。

细胞增殖实验：以1×10³cells/mL的密度将HUVECs或L929接种到96孔中；在正常培养基和正常培养条件下将细胞培养24h后，按组分别加入处理因素；在加入处理因素后的第1d、2d、3d时，每孔加入10µL的CCK8溶液，再培养2h；用酶标仪检测450nm处的吸光度值。结果如图9所示。

（2）实验结果

HIF-1α免疫荧光染色：对比图8中b、c和d中的常氧组和缺氧+HG组可以看出，常氧组细胞HIF-1α表达最低，缺氧+HG组处理细胞HIF-1α表达最高，因此，在33 mM葡萄糖和1%O₂的条件下，可以成功模拟缺氧环境，并导致HIF-1α的高表达。基于此，PQBH-0组处理细胞HIF-1α表达与缺氧+HG组接近，PQBH-8联合NIR照射组处理细胞HIF-1α表达处于常氧组和缺氧+HG组之间。结果表明，本发明制备的复合纳米纤维膜在近红外辐射处理后能够输送氧气，并明显逆转了细胞的缺氧情况。

划痕试验：结合图8中e、f和g可以看出，24h时，缺氧+HG组培养的L929细胞中无细胞间隙最大，迁移面积仅为42.38±2.27%，证实了L929在缺氧和高糖作用下迁移功能明显受损。相比之下，PQBH-8联合NIR照射组处理的L929在划痕处迁移并填充，迁移面积高达83.41±1.07%，比常氧组的迁移面积56.48±1.76%还高出26.93%。在HUVECs细胞中也出现了同样的趋势。这些结果说明PQBH-8联合NIR后释放的氧能有效促进创面愈合。

Transwell迁移试验：从图8中h、i和j中可以看出，与常氧组、缺氧+HG组和PQBH-0组相比，PQBH-8联合NIR照射组处理显著促进了L929和HUVECs细胞的迁移，说明PQBH-8联合NIR照射组释放的溶解氧、温度刺激、壳聚糖季铵盐和透明质酸组分等一体化生物活性性能增强了L929和HUVECs细胞的迁移。因此，综合划痕试验和Transwell迁移试验结果可以看出，本发明制备的复合纳米纤维膜联合近红外处理能有效提高L929和HUVECs的迁移能力，有利于创面愈合。

成管形成试验：从图8中k可以看出，与常氧组相比，缺氧+HG组和PQBH-0组细胞管状结构的成熟和完整程度较低，提示在缺氧和高糖条件下细胞的成血管潜能受到了损害。值得注意的是，与其他组相比，PQBH-8联合NIR照射组的分支点和毛细血管长度显著增加（如图8中l和m所示），表明血管形成增加可能是由于PQBH-8释放的氧气、温度刺激、壳聚糖季铵盐和透明质酸组分等一体化生物活性性能。

细胞增殖实验：从图9可以看出，PQBH-8联合NIR照射组处理后的L929和HUVECs的细胞活力明显高于其他三组。这一现象表明，恶劣的低氧微环境可能被PQBH-8联合NIR重构以促进细胞增殖。

6、建立糖尿病全层皮肤缺损模型

（1）实验方法

建立糖尿病全层皮肤缺损模型：将实施例3和对比例1制备的纳米纤维样品PQBH-n（n=0,8）剪成直径为1cm大小的圆片状，并在紫外光下进行灭菌处理，备用。然后使用Balb/c小鼠建立STZ诱导糖尿病全层皮肤缺损模型，具体为：在雄性Balb/C小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ，100mg·kg⁻¹），连续3d，同时用血糖计监测所有小鼠的血糖；两周后，血糖≥16.7mM的小鼠为糖尿病小鼠模型。接着让小鼠吸入3%异氟醚麻醉，剃毛后，用穿孔活检在每只小鼠背侧形成约8mm的全层伤口，按伤口敷料不同将STZ诱导的糖尿病小鼠随机分为4组，每组10只，分别为：空白组（未处理，BC组）、阳性组（商品敷料处理，PC组）、PQBH-0组、PQBH-8组（连续3天用波长为808 nm，功率为1.5 W/cm²的NIR照射2min/天）。

创面愈合过程观察：利用光学和超声图像对不同时间点的伤口部位进行观察，其中光学测定过程具体为：分别在第0天、第3天、第7天、第12天对创面进行拍照监测创面面积，并计算创面面积比（%）（具体公式为：创面面积比（%）= An/A0×100%，其中A0和An分别表示第0天和第m天（m=3,7,12）的平均面积）。同时采用等高线图对伤口愈合的动态过程进行重构。超声测定过程具体为：采用超声仪（Aplio500,TOSHIBA,Japan）观察第12天创面愈合情况。结果如图10所示。

再生皮肤组织检测：第12天时，获取各组小鼠创面再生皮肤组织，同时进行4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片；然后分别进行组织染色观察，缺氧情况评价和血管活性评价，以及炎症反应测定。

1）再生创面的组织染色观察：对再生创面组织进行H&E染色和Masson染色，观察创面长度、表皮厚度和胶原蛋白沉积情况；具体采用苏木精-伊红（H&E）染色评价再生表皮厚度，采用三色马松（Masson）染色评价胶原沉积情况，结果如图11所示。

2）再生创面的缺氧情况和血管活性：采用HIF-1α荧光染色评价再生创面的缺氧情况，结果如图12a和b中所示。采用αSMA/CD31双免疫荧光染色评价血管再生情况，结果如图12a和b中所示。同时检测再生创面的HIF-1α和VEGF的蛋白表达，具体步骤为：将皮肤组织均质，使用BCA蛋白检测试剂盒(P0012, Beyotime, China)检测蛋白质含量；然后将蛋白质样品经12% SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上。用TSBT冲洗3次后，用5%脱脂牛奶堵塞膜；膜与HIF1-α和VEGF一抗孵育过夜，洗净后，用二抗孵育，荧光成像分析系统(ChemiDoc, BIO-RAD, USA)检测蛋白条带，结果如图12c和d所示。

3）炎症反应测定：高血糖也可通过产生促炎细胞因子加剧炎症应激，为了评估本发明制备的复合纳米纤维材料在体内的抗炎能力，分别对再生组织中CD68、Ly6G、IL-6和TNF-α的表达水平进行免疫荧光染色观察，结果如图13所示。

（2）实验结果

从图10中的a、b、c均可以看出，随着术后时间的增加，各组的创面面积均在逐渐减小，而且进行NIR照射的PQBH-8组各时间点创面愈合效果均显著高于其他各组。且在第3天，BC组创面面积最大，这种情况一直持续到第7天，这与临床上糖尿病创面难以愈合且经常继续扩大的事实相一致；第7天，PQBH-8组创面面积比明显下降，而BC组、PC组和PQBH-0组创面面积比仍分别高达35.0%±3.5%、17.4%±1.9%和20.3%±2.0%（图10c）；第12天，BC组创面仍有较大未愈合部分，而PQBH-8组创面几乎完全愈合，且愈合效果远优于商品敷料PC组。

从图11中可以看出，H&E染色全扫描结果显示，PQBH-8组的上皮间隙最短，再上皮化最好，其次为PC组、PQBH-0组和BC组。PQBH-8组皮肤组织已经出现真皮组织和血管、毛囊等皮肤附属物，其余三组仅再生上皮和真皮的基本结构。Masson染色结果显示PQBH-8组胶原沉积最明显。

从图12中的a和b均可以看出，PQBH-8组HIF-1α的表达在四组中最低，说明PQBH-8成功地改善了糖尿病患者所具有的恶劣缺氧微环境。α-SMA是平滑肌和成熟血管的重要指标，CD31是一种跨膜蛋白，在早期血管生成中起着重要作用。与BC组、PC组和PQBH-0组相比，PQBH-8组中α-SMA/CD31荧光强度最强。因此在本研究中，PQBH-8组上调了α-SMA和CD31的表达，且与其他各组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。由于新生毛细血管可改善微循环，为糖尿病患者的组织修复提供氧气和营养物质，因此血管生成对糖尿病患者的恶劣缺氧环境的改善有重要意义。总的来说，HIF-1α虽然可以上调VEGF的表达，但在糖尿病模型中不起作用，这是由于在糖尿病中，由于长期严重缺氧和高糖环境，HIF-1α的稳定性和功能受到抑制，导致HIF-1活性水平不足。如图12c和d所示，western blotting检测HIF-1α和VEGF的蛋白表达情况和表达量。由于PQBH-8具有运输氧气的能力，PQBH-8的HIF-1α表达水平虽然低于其他各组，但VEGF的表达水平高于其他各组，这与既往报道的持续缺氧抑制VEGF的产生相一致。综上所述，利用一体化生物活性分子(QCS、HA和BP)以及PQBH-8在近红外照射下原位释放的氧气，能够缓解局部缺氧，促进血管生成。

从图13中的a和b均可以看出，BC组愈合的皮肤组织中CD68表达量最高，提示炎症反应严重；相比之下，进行NIR照射的PQBH-8组中CD68表达最低，说明样品PQBH-8联合NIR组能有效对抗体内炎症反应；Ly6G的免疫组化染色显示，PQBH-8组的Ly6G强度低于其他三组，说明PQBH-8具有良好的抗炎活性；PQBH-8组的IL-6+细胞密度明显低于其他组；各组TNF-α表达趋势与IL-6一致。这些结果表明本发明制备的复合纳米纤维材料尤其是PQBH-8联合NIR具有减少糖尿病创面炎症的潜力。

综上所述，上述结果证实，PQBH-8联合NIR治疗可显著加速糖尿病全层皮肤愈合过程，促进了再生皮肤的再上皮化、血管生成和胶原沉积，改善创面缺氧微环境，降低炎症反应，提高再生组织质量。这些令人鼓舞的结果可能归因于NIR触发的氧气以及每种原材料的性质包括QCS、HA、Hb和BP纳米片的协同效应。

7、生物安全性评价

（1）实验方法

生物安全对于生物材料的应用非常重要。按上述实验方法建立糖尿病全层皮肤缺损模型，并按伤口敷料不同将STZ诱导的糖尿病小鼠随机分为5组，每组10只，分别为：空白组（未处理，B.C.组）、PQBH-0组、PQBH-2组、PQBH-4组、PQBH-8组；然后在第12天取各组小鼠脏器标本进行HE染色。具体为：第12天，获取各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器；采用HE染色法评价其体内组织相容性。结果如图14所示。

（2）实验结果

从图14可以看出，与B.C.组比较，实验组未见明显病理现象。结果表明，本发明制备的多功能复合纳米纤维材料应用于糖尿病小鼠皮肤伤口处理模型时不会引起明显的毒副作用，具有生物安全性，可在未来临床转化中表现出不错的潜力。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种多功能复合纳米纤维材料，其特征在于，所述多功能复合纳米纤维材料包括纤维芯材，纤维芯材的表面通过层层自组装依次包裹有透明质酸层与壳聚糖季铵盐层，所述纤维芯材为壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维；

所述壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维的制备方法为：将壳聚糖季铵盐溶液与聚乳酸溶液共混孵育后得到壳聚糖季铵盐/聚乳酸共混液，然后将壳聚糖季铵盐/聚乳酸共混液进行纺丝处理；所述壳聚糖季铵盐溶液的质量分数为0.2%-2%，所述聚乳酸溶液的质量分数为8%-12%；所述壳聚糖季铵盐溶液与聚乳酸溶液的共混体积比为（0.1-1）∶（3-10）；

所述透明质酸层由黑磷、血红蛋白、透明质酸制备而成。

2.根据权利要求1所述的多功能复合纳米纤维材料，其特征在于，所述壳聚糖季铵盐层由壳聚糖季铵盐制备而成。

3.一种权利要求2所述的多功能复合纳米纤维材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将壳聚糖季铵盐溶液与聚乳酸溶液共混孵育后得到壳聚糖季铵盐/聚乳酸共混液，然后将壳聚糖季铵盐/聚乳酸共混液进行纺丝处理，得到壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维；

（2）在氧气氛围下，先将黑磷、血红蛋白加入透明质酸溶液中孵育后得到A液，将壳聚糖季铵盐溶液作为B液；然后将步骤（1）制备的壳聚糖季铵盐/聚乳酸复合纳米纤维依次在A液、B液中进行浸泡处理，并记为1个自组装周期，完成N个自组装周期后，得到多功能复合纳米纤维。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述A液中黑磷的浓度为0.01-0.1mg/mL，血红蛋白的浓度为0.2-3mg/mL。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述A液中透明质酸的质量分数为0.1%-3%；所述B液中壳聚糖季铵盐的质量分数为0.1%-2%。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述孵育方式为搅拌；所述搅拌速率为100-1500rpm，搅拌时间为0.5-4h；所述浸泡处理步骤具体为：在A液或B液中浸泡，清洗后再浸入另一种液体；所述浸泡时间为5-30min。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述壳聚糖季铵盐溶液的质量分数为0.2%-2%，所述聚乳酸溶液的质量分数为8%-12%；步骤（1）中所述壳聚糖季铵盐溶液与聚乳酸溶液的共混体积比为（0.1-1）∶（3-10）。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述壳聚糖季铵盐溶液中的溶剂为六氟异丙醇；步骤（1）中所述聚乳酸溶液中的溶剂为六氟异丙醇；步骤（2）中所述透明质酸溶液中的溶剂为去离子水；步骤（2）中所述壳聚糖季铵盐溶液中的溶剂为去离子水。

9.权利要求3-8任一所述制备方法制备的功能复合纳米纤维材料。

10.权利要求1或2或9所述的多功能复合纳米纤维材料在医用材料中的应用。