CN113509590A - 外泌体联合透明质酸的伤口敷料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了外泌体联合透明质酸的伤口敷料及其制备方法和应用,所述伤口敷料由透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体构成,所述透明质酸水凝胶是透明质酸水溶液经过反复冷冻解冻再与碳二亚胺盐酸盐及已二酸二酰肼进行交联所获得。相应地,本发明还公开了上述外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,以及其在促进伤口愈合药物或材料中的应用。本发明中的伤口敷料结合了间充质干细胞的外泌体和透明质酸水凝胶的特性,与伤口创面接触后,可促进血管再生、胶原合成,从而修复损伤的组织,且安全可靠,生物相容性好,对创面的愈合具有明显促进作用,不容易造成感染,愈合后不留疤痕。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料制备技术领域,尤其涉及外泌体联合透明质酸的伤口敷料及其制备方法和应用。
背景技术
由于某些全身性疾病导致人体免疫细胞受损;年老体弱、营养不良等导致细胞再生能力不足;创面感染、炎症反应等因素往往导致伤口难以愈合。随着科技进步,医学临床上对于伤口的照护方式越发追求效率及疗效,过去传统式之绷带、纱布、棉球等一般敷料难以满足现代的临床治疗需求,人们需要更有效率的伤口复原医材及更符合多样化疾病伤口的敷料,以保护创面、促进皮肤再生、加速伤口愈合。理想的敷料应具有良好的生物相容性,具有加速组织再生、促进气体交换、保护伤口免受外来微生物侵害、可吸收多余渗出物、易于更换新敷料等优势,但单一敷料很难达到理想效果,这促使人们不断探索组合敷料。
自1970年Rovee等人的人体实验证实湿润伤口上皮细胞移行增生的速度较快,能加速伤口的愈合后,湿润伤口愈合(moist wound healing,MWH)的观念开始被广泛接受。目前的新型湿性敷料包括以透明薄膜式敷料为代表的覆盖型外层敷料;以藻酸盐敷料、伤口胶为代表的内层填塞型敷料;以银离子敷料为代表的抗菌性敷料等,但其功能均较为单一且在湿润环境下吸收渗液的特性及通透性差,易导致感染。新一代敷料要基于创造最佳的环境,使上皮细胞顺畅迁移,从而利于伤口愈合而设计,除了要舒适地覆盖伤口,更要着重于其功能性发展,如:帮助伤口愈合、减少瘢痕形成、针对伤口类型之特化敷料等等,以达到缩短伤口愈合进程及减轻愈合后遗症的最终目的。
近年来,随着干细胞与再生医学迅速发展,外泌体的治疗优势日渐凸显。外泌体含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸。外泌体能与细胞膜结合,直接进入细胞内部释放多种趋化因子、生长因子等,招募血管内皮细胞、促进其增殖和迁移来促进血管再生,以改善宿主血供,进而促进组织损伤修复。在小鼠的皮肤缺损模型中还表明,外泌体可以增加Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比例、TGF-β3与TGF-β1的比例以及MMP-3与TIMP-1的比例,激活ERK/MAPK通路,抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,促进创伤区胞外基质的改建,最终抑制瘢痕的形成,可见外泌体在伤口愈合应用中具有广阔的前景。
透明质酸(HA)是一种重要的糖胺聚糖(GAG),存在于许多人体组织的细胞外基质中,包括皮肤、结缔组织和神经组织,可参与伤口愈合过程的许多步骤,包括炎症和表皮再生。在伤口愈合的早期阶段,HA可提供一种基质协助成纤维细胞和内皮细胞的重组、增殖和迁移;在伤口愈合过程中能促进血管生成。且研究证明,HA在胎儿无疤痕愈合中起关键作用。足见,基于HA水凝胶的生物材料在伤口愈合、皮肤修复中起着关键性作用。纯的透明质酸存在易溶于水,吸收迅速,在组织中停留时间短,力学性能较差等缺陷,为了使透明质酸在生物材料领域的应用更广泛,就要对其进行化学改性,优化其性能,提高其材料硬度和机械性能,以扩大其应用范围。为提高透明质酸的力学性能和控制其降解率,常常对其进行化学修饰或交联,可通过交联、酯化、接枝、分子修饰和复合等方法进行改性。其中交联手段最为常见,常用的交联方法有酰肼交联、二硫化物交联、聚乙二醇交联、醛交联、碳二亚胺交联等。交联处理后的得到分子网状结构,使透明质酸分子链增长、平均分子质量增大、黏弹性增强、水溶性相对减弱、机械强度提高。但是在交联处理后的透明质酸会带有轻微的毒性,不利于后续作为载体应用在医药领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种外泌体联合透明质酸的伤口敷料,安全可靠,生物相容性好,对创面的愈合具有明显促进作用,且不容易造成感染,愈合后不留疤痕。
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,方法简单,实施性强,安全可靠。
为达到上述技术效果,本发明提供了一种外泌体联合透明质酸的伤口敷料,所述伤口敷料由透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体构成,所述透明质酸水凝胶是透明质酸水溶液经过反复冷冻解冻再与碳二亚胺盐酸盐及已二酸二酰肼进行交联所获得。
优选地,所述透明质酸水凝胶由下述方法制得:
称量透明质酸粉末,然后加入去离子水进行溶解,形成最终浓度为0.5-2%的透明质酸水溶液;
将所述透明质酸水溶液搅拌均匀,并反复冷冻解冻至少两次;
将酸性溶液缓慢的加入到所述透明质酸水溶液中,测量pH值,直至pH值为4.4-5停止;
然后加入己二酸二酰肼,混合均匀,再加入碳二亚胺盐酸盐搅拌,后缓慢加入碳酸氢钠溶液,调整pH值到6.5-7.5,得到透明质酸水凝胶。
优选地,所述透明质酸水溶液在磁力搅拌器上进行搅拌均匀,并反复冷冻解冻至少两次,其中,冷冻条件为:在-(15-25)℃环境下保存8-14h;解冻条件为:在35~38℃水浴锅中保存0.5-2.5h;
所述酸性溶液为浓度为0.5-2mol/L的盐酸溶液;
所述碳酸氢钠溶液的浓度为0.5-2mol/L;
以质量分数计,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸加入量的1~5%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸加入量的1~5%。
为达到上述技术效果,本发明还提供了上述外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,包括以下步骤:
S1:从脐带间充质干细胞培养液的上清液中分离纯化出间充质干细胞外泌体,采用PBS重新悬浮所述间充质干细胞外泌体,除菌,并冷冻保存;
S2:对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻,使其发生物理交联,然后再加入已二酸二酰肼和碳二亚胺盐酸盐进行化学交联,调节pH后得到透明质酸水凝胶;
S3:将所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,得到伤口敷料。
优选地,所述S2步骤包括:
称量透明质酸粉末,然后加入去离子水进行溶解,最终形成浓度为0.5-2%的透明质酸水溶液;
在磁力搅拌器上进行搅拌均匀,对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻至少两次,使其发生物理交联;
配置0.5-2mol/L的盐酸溶液,并缓慢的加入到所述透明质酸溶液中,测量pH值,直至pH值为4.4-5停止;
然后加入己二酸二酰肼,混合均匀,再加入碳二亚胺盐酸盐搅拌,使其发生化学交联,其中,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸粉末加入量的1-5%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸粉末加入量的1-5%;
最后缓慢加入0.5-2mol/L的碳酸氢钠溶液,调整pH值到6.5-7.5,得到透明质酸水凝胶。
优选地,在对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻过程中,冷冻条件为:在-(15-25)℃环境下保存8-14h;
解冻条件为:在35~38℃水浴锅中保存0.5-2.5h。
优选地,所述S1步骤包括:
将脐带组织清理后接种培养,待原代细胞生长至70-75%融合度进行传代培养;
选用生长状况良好的P2代脐带间充质干细胞,接种培养,加入促进外泌体分泌的细胞刺激因子,待细胞生长至85-95%融合度时吸出上清液,离心去除细胞碎片;
随后将上清液加入超滤管中浓缩至终体积为初始体积的20-30%,超速离心0.5-2h,离心速度为10000-15000转/分钟,去除细小细胞碎片;
取上清液再次超速离心,离心速度为90000-100000转/分钟,离心0.5-2h;
去除上清液,加入生理盐水清洗后再次超速离心0.5-2h,离心速度为90000-100000转/分钟;
去除上清液,得到所述间充质干细胞外泌体沉淀。
采用PBS重新悬浮所述间充质干细胞外泌体沉淀,除菌,冷冻保存,得到间充质干细胞外泌体。
优选地,所述S3步骤包括:
在2-5℃条件下,将所述间充质干细胞外泌体分步加入到所述透明质酸水凝胶中,使得所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,得到伤口敷料,其中,所述间充质干细胞外泌体的最终浓度为250-400μg/mL。
优选地,所述间充质干细胞外泌体分三次加入到所述透明质酸水凝胶中,三次所述间充质干细胞外泌体的加入重量之比为:第一次加入量:第二次加入量:第三次加入量=(4~6):(2~4):(1~3);
三次所述间充质干细胞外泌体的加入过程中的搅拌转速之比为:第一次搅拌转速:第二次搅拌转速:第三次搅拌转速=(2000-2300):(1500-1800):(1000-1300)。
本发明还提供了上述外泌体联合透明质酸的伤口敷料在促进伤口愈合药物或材料中的应用。
实施本发明,具有如下有益效果:
1、本发明提供的外泌体联合透明质酸的伤口敷料,其中,伤口敷料由透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体构成。其中,透明质酸水凝胶是透明质酸水溶液经过反复冷冻解冻使其发生物理交联,然后再通过碳二亚胺盐酸盐及已二酸二酰肼进行化学交联,其采用物理交联结合化学交联制得,可在不同pH和温度下具有较强的稳定性,并可有效地降低化学交联剂的用量,减轻化学交联剂因具有轻微的毒性而带来的缺陷。
2、本发明的伤口敷料结合了间充质干细胞的外泌体和透明质酸水凝胶,与现有的伤口敷料相比,本发明通过透明质酸包裹间充质干细胞的外泌体,与伤口创面接触后,稳定缓慢释放外泌体中的生长因子、趋化因子,促进血管内皮细胞和成纤维细胞增殖和迁移,从而促进血管再生、胶原合成,进而修复损伤的组织。因此,本发明安全可靠,生物相容性好,对创面的愈合具有明显促进作用,且不容易造成感染,愈合后不留疤痕。
3、本发明的外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,其包括了制备间充质干细胞外泌体、制备透明质酸水凝胶、透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体三大步骤,方法较为简单,实施性强,有利于工业化应用,安全可靠。而且,制得的成品对创面的愈合具有明显促进作用,且不容易造成感染,愈合后不留疤痕。
附图说明
图1为实施例1的伤口敷料制备过程中培养的间充质干细胞的显微镜图;
图2为实施例1中的间充质干细胞外泌体在扫描电子显微镜下的形态;
图3为实施例1所得的伤口敷料对人皮肤成纤维细胞的细胞毒性的试验结果;
图4为实施例1所得的伤口敷料对人皮肤成纤维细胞增殖影响的曲线图;
图5为实施例1所得的伤口敷料体外抑菌的实验结果;
图6为实施例1所得的伤口敷料促创面愈合的实验结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明公开了一种外泌体联合透明质酸的伤口敷料,所述伤口敷料由透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体构成,所述透明质酸水凝胶是透明质酸水溶液经过反复冷冻解冻再与碳二亚胺盐酸盐及已二酸二酰肼进行交联所获得。
透明质酸作为一种应用广泛的生物材料,在使用过程中常常需要对其化学修饰或交联,其中交联手段最为常见,常用的交联方法有酰肼交联、二硫化物交联、聚乙二醇交联、醛交联、碳二亚胺交联等。交联处理后的得到分子网状结构,使透明质酸分子链增长、平均分子质量增大、黏弹性增强、水溶性相对减弱、机械强度提高。但是经化学交联处理后的透明质酸会带有轻微的毒性,不利于后续作为载体应用在医药领域。除化学交联之外,交联手段还可以采用物理交联法。一般来说,物理交联法安全,但是稳定性能不及化学交联法,化学交联法稳定性能好,但是有轻微的毒性。本发明先采用反复冻融,利用透明质酸链上的COOH和-NHCOCH2诱导产生分子内氢键而形成水凝胶,再加入己二酸二酰肼与碳二亚胺盐酸盐,使透明质酸交联,最终制得透明质酸水凝胶,并将其作为蛋白药物载体。
当物理交联结合化学交联后,发明人意外发现其在保证稳定性能的同时,还可以降低化学交联剂的用量,减轻化学交联剂因具有轻微的毒性而带来的缺陷。以质量分数计,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸加入量的1~5%,所述碳二亚胺盐酸盐的透明质酸加入量的1~5%。具体地,所述透明质酸水凝胶由下述方法制得:
称量透明质酸粉末,然后加入去离子水进行溶解,形成最终浓度为0.5-2%的透明质酸水溶液;
将所述透明质酸水溶液搅拌均匀,并反复冷冻解冻至少两次;
将酸性溶液缓慢的加入到所述透明质酸水溶液中,测量pH值,直至pH值为4.4-5停止;
然后加入己二酸二酰肼,混合均匀,再加入碳二亚胺盐酸盐搅拌,后缓慢加入碳酸氢钠溶液,调整pH值到6.5-7.5,得到透明质酸水凝胶。
优选地,所述透明质酸水溶液在磁力搅拌器上进行搅拌均匀,并反复冷冻解冻至少两次,其中,冷冻条件为:在-(15-25)℃环境下保存8-14h;解冻条件为:在35~38℃水浴锅中保存0.5-2.5h;
所述酸性溶液为浓度为0.5-2mol/L的盐酸溶液;
所述碳酸氢钠溶液的浓度为0.5-2mol/L;
以质量分数计,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸加入量的1~5%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸加入量的1~5%。
需要说明的是,本发明透明质酸水凝胶是透明质酸水溶液经过反复冷冻解冻使其发生物理交联,安全可靠,为提高稳定性能奠定基础。在反复冷冻解冻过程中,所述透明质酸水溶液优选反复冷冻解冻至少两次,其中,冷冻条件为:在-(15-25)℃环境下保存8-14h;解冻条件为:在35~38℃水浴锅中保存0.5-2.5h。更优地,所述冷冻条件为:在-20℃环境下保存12h;所述解冻条件为:在36~38℃水浴锅中保存1.5h。另外,对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻至少两次,其反复解冻的次数根据其物理交联效果而定。更优地,对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻两次,配合后续化学交联,即可得到具有良好稳定性能和低化学物质残留的透明质酸水凝胶。
物理交联完成后,再加入碳二亚胺盐酸盐及已二酸二酰肼进行化学交联,其中,所述碳二亚胺盐酸盐及已二酸二酰肼的加入比例优选为(1-2):(1-2)。透明质酸水溶液经过反复冷冻解冻后,先加入交联剂己二酸二酰肼,再加入碳二亚胺盐酸盐进行催化。优选地,以质量分数计,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸加入量的1~5%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸加入量的1~5%。更佳的,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸加入量的1~4%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸加入量的1~4%。
需要说明的是,本发明的己二酸二酰肼、碳二亚胺盐酸盐加入量可低至透明质酸加入量的1%,可以大大减轻了伤口辅料的毒性。现有技术中,化学交联剂的用量一般为透明质酸的用量的若干倍,即以透明质酸的用量计,化学交联剂的用量为透明质酸的用量的200-1250%。但是,本发明结合物理交和化学交联方法对透明质酸进行交联处理,处理过程中的己二酸二酰肼、碳二亚胺盐酸盐加入量极低,以透明质酸的用量计,己二酸二酰肼、碳二亚胺盐酸盐的加入量仅仅为透明质酸的用量的1~5%,保证稳定性能的同时,还可以降低化学交联剂的用量,减轻化学交联剂因具有轻微的毒性而带来的缺陷。
相应地,本发明还提供了上述外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,包括以下步骤:
S1:从脐带间充质干细胞培养液的上清液中分离纯化出间充质干细胞外泌体,采用PBS重新悬浮所述间充质干细胞外泌体,除菌,并冷冻保存;
S2:对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻,使其发生物理交联,然后再加入已二酸二酰肼和碳二亚胺盐酸盐进行化学交联,调节pH后得到透明质酸水凝胶;
S3:将所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,得到伤口敷料。
本发明制备方法包括了制备间充质干细胞外泌体、制备透明质酸水凝胶、透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体三大步骤,方法较为简单,实施性强,有利于工业化应用,安全可靠。而且,制得的成品对创面的愈合具有明显促进作用,且不容易造成感染,愈合后不留疤痕。
下面对每一步骤进行详细阐述,其中,S1步骤包括:
1)将脐带组织清理后接种培养,待原代细胞生长至70-75%融合度进行传代培养;
2)选用生长状况良好的P2代脐带间充质干细胞,接种培养,加入促进外泌体分泌的细胞刺激因子,待细胞生长至85-95%融合度时吸出上清液,离心去除细胞碎片;
3)随后将上清液加入超滤管中浓缩至终体积为初始体积的20-30%,超速离心0.5-2h,离心速度为10000-15000转/分钟,去除细小细胞碎片;
4)取上清液再次超速离心,离心速度为90000-100000转/分钟,离心0.5-2h;
5)去除上清液,加入生理盐水清洗后再次超速离心0.5-2h,离心速度为90000-100000转/分钟;
6)去除上清液,得到所述间充质干细胞外泌体沉淀。
7)采用PBS重新悬浮所述间充质干细胞外泌体沉淀,除菌,冷冻保存,得到间充质干细胞外泌体。
S1步骤,即制备间充质干细胞外泌体。其中间充质干细胞源性外泌体是间充质干细胞通过旁分泌机制分泌的30-150nm的微囊泡,能够借助所携带的蛋白质,microRNAs等生物活性物质拥有介导间充质干细胞的治疗效力,在多种疾病的治疗中发挥作用。间充质干细胞源性外泌体的来源较多,本发明提供的制备方法中,间充质干细胞是从脐带组织中获得。需要说明的是,步骤1)中,所述间充质干细胞也可以从骨髓,骨骼肌,骨外膜和骨小梁中获得。
所述步骤2)中,需要在培养液中加入促进外泌体分泌的细胞刺激因子,待细胞生长至85-95%融合度时吸出上清液。优选地,所述促进外泌体分泌的细胞刺激因子包括维生素C,INF-γ,HGF,HGF。更佳地,其中维生素C的加入浓度按在细胞培养液中的终浓度计为50ng/ml,INF-γ的加入浓度按在细胞培养液中的终浓度计为25ng/ml,HGF的加入浓度按在细胞培养液中的终浓度计为10ng/ml,HGF的加入浓度按在细胞培养液中的终浓度计为5ng/ml。待细胞培养3-4天后,细胞生长至90%融合度时吸出上清液用于分离外泌体。
随后将步骤2)中所得的上清液利用超速离心法获得外泌体,具体地,上清液加入超滤管中浓缩至终体积为初始体积的20-30%,超速离心0.5-2h,离心速度为10000-15000转/分钟,去除细小细胞碎片;取上清液再次超速离心,离心速度为90000-100000转/分钟,离心0.5-2h;去除上清液,加入生理盐水清洗后再次超速离心0.5-2h,离心速度为90000-100000转/分钟。
优选地,收集上清液并浓缩终体积为初始体积的20%,10000转/分钟离心1小时去除细小细胞碎片,取上清液再次90000转/分钟离心1小时,去除上清液,沉淀为干细胞分泌的外泌体,加入10ml生理盐水清洗一次,90000转/分钟离心1小时,去除上清液,得到外泌体沉淀。
最后,将制备得到的间充质干细胞外泌体除菌后冷冻保存。优选地,间充质干细胞外泌体的短期储存温度为4℃,但需要注意的是,此时较高的温度和冻融循环可能会影响外泌体膜结构并改变其特性,引起外泌体浓度的降低。间充质干细胞外泌体的长期储存温度为-80℃,低温环境更有利于维持外泌体的完整性。
需要说明的是,本发明中间充质干细胞外泌体的制备方法是采用超速离心法,除此之外,还可以采用聚合沉淀法,免疫亲和捕获法,微流体芯片技术,尺寸排阻色谱法与超滤法完成间充质干细胞外泌体的制备。
S2步骤,即制备透明质酸水凝胶。天然透明质酸需要对其进行结构修饰后才能得到机械性能良好的透明质酸水凝胶,过程中需要加入交联剂实现结构修饰,目前已知的交联剂有以下几种:BDDE(丁二醇缩水甘油醚),DVS(二乙烯基砜),ADH(乙二酸二酰肼),EDC(碳二亚胺),GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)。这些交联剂都是有机溶剂,具有很强的毒性和致癌性。在特定的反应参数下,交联剂同透明质酸发生反应后毒性消失,但是那些未参加反应的交联剂进入人体后会造成伤害。本发明为了降低化学交联剂的用量,制备出生物相容性好且结构稳定的透明质酸水凝胶,采用了物理交联与化学交联结合的方法制备透明质酸水凝胶,具体包括以下步骤
1)称量透明质酸粉末,然后加入去离子水进行溶解,最终形成浓度为0.5-2%的透明质酸水溶液;
2)在磁力搅拌器上进行搅拌均匀,对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻至少两次,使其发生物理交联;
3)配置0.5-2mol/L的盐酸溶液,并缓慢的加入到所述透明质酸溶液中,测量pH值,直至pH值为4.4-5停止;
4)然后加入己二酸二酰肼,混合均匀,再加入碳二亚胺盐酸盐搅拌,使其发生化学交联,其中,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸粉末加入量的1-5%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸粉末加入量的1-5%;
5)最后缓慢加入0.5-2mol/L的碳酸氢钠溶液,调整pH值到6.5-7.5,得到透明质酸水凝胶。
需要说明的是,步骤2)中,在对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻过程中,其冷冻条件为:在-(15-25)℃环境下保存8-14h;解冻条件为:在35~38℃水浴锅中保存0.5-2.5h。优选地,所述冷冻条件为:在-20℃环境下保存12h;所述解冻条件为:在36~38℃水浴锅中保存1.5h。
另外,对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻至少两次,其反复解冻次数根据其物理交联效果而定,优选地,对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻两次,配合后续化学交联,可得到具有良好稳定性能和低化学物质残留的透明质酸水凝胶。
在化学交联过程中,加入己二酸二酰肼,混合均匀,再加入碳二亚胺盐酸盐搅拌,使其发生化学交联,其中,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸粉末加入量的1~5%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸粉末加入量的1~5%,使其发生化学交联。优选地,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸加入量的1~4%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸加入量的1~4%。
需要说明的是,现有技术中,化学交联剂的用量一般为透明质酸的用量的若干倍,即以透明质酸的用量计,化学交联剂的用量为透明质酸的用量的200-1250%。但是,本发明结合物理交和化学交联方法对透明质酸进行交联处理,处理过程中的己二酸二酰肼、碳二亚胺盐酸盐加入量极低,以透明质酸的加入量计,己二酸二酰肼、碳二亚胺盐酸盐的加入量仅仅为透明质酸的加入量的1~5%,本发明结合物理交和化学交联方法对透明质酸进行交联处理,处理过程中的己二酸二酰肼、碳二亚胺盐酸盐加入量大大降低,在保证稳定性能的同时,降低了化学交联剂的用量,减轻化学交联剂因具有轻微的毒性而带来的缺陷,提高了生物相容性。
S3步骤,即透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体,制备伤口敷料。具体包括以下步骤:
在2-5℃条件下,将所述间充质干细胞外泌体分步加入到所述透明质酸水凝胶中,使得所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,得到伤口敷料,其中,所述间充质干细胞外泌体的最终浓度为250-400μg/mL。
优选地,所述间充质干细胞外泌体分三次加入到所述透明质酸水凝胶中,三次所述间充质干细胞外泌体的加入重量之比为:第一次加入量:第二次加入量:第三次加入量=(4~6):(2~4):(1~3)。更为优选地,三次所述间充质干细胞外泌体的加入重量之比为:第一次加入量:第二次加入量:第三次加入量=5:3:2。将所述间充质干细胞外泌体分步加入所述透明质酸水凝胶中,可以使透明质酸水凝胶更好地包裹所述间充质干细胞外泌体,使制得的伤口敷料可以稳定地释放间充质干细胞外泌体中的生长因子、趋化因子,促进血管内皮细胞和成纤维细胞增殖和迁移,从而促进血管再生、胶原合成,进而修复损伤的组织。
除此之外,三次所述间充质干细胞外泌体的加入过程中需要配合搅拌,优选地,其搅拌转速之比为:第一次搅拌转速:第二次搅拌转速:第三次搅拌转速=(2000-2300):(1500-1800):(1000-1300)。更为优选地,第一次加入过程中的搅拌转速为2000rpm,第二次加入过程中的搅拌转速1500rpm,第三次加入过程中的搅拌转速为1000rpm。
需要说明的是,本发明的伤口敷料是结合了间充质干细胞外泌体和透明质酸水凝胶,与现有的伤口敷料相比,本发明通过透明质酸包裹间充质干细胞的外泌体,得到伤口敷料。优选地,所述伤口敷料中,间充质干细胞外泌体的最终浓度为250-400μg/mL,更佳地,所述间充质干细胞外泌体的最终浓度为300μg/mL。本发明提供的伤口敷料与伤口创面接触后,稳定缓慢释放外泌体中的生长因子、趋化因子,促进血管内皮细胞和成纤维细胞增殖和迁移,从而促进血管再生、胶原合成,进而修复损伤的组织。需要说明的是,所述间充质干细胞外泌体的最终浓度可以根据实际需求而调整,其调整方法可根据现有技术来实现,其中可调整所述间充质干细胞外泌体的加入量来改变伤口敷料中所述间充质干细胞外泌体的浓度。
另外,需要说明的是,所述透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体的制备过程是在2-5℃条件下进行,优选地,透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体的制备过程在4℃条件下进行,这是因为据相关研究表明在24h内,外泌体的最佳储存温度为4℃。
本发明还提供了所述外泌体联合透明质酸的伤口敷料在促进伤口愈合药物或材料中的应用。为了更好的理解发明方案,本说明书提供以下实施例加以说明:
实施例1
外泌体联合透明质酸的伤口敷料制备,具体步骤如下:
S1:间充质干细胞外泌体的制备:
1)医院采集足月剖腹产胎儿脐带组织,采集前签署客户知情同意书,组织于4℃冷藏无菌环境下运抵实验室,运输过程中使用组织保护液保护脐带组织生物学活性,组织保护液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制,确保运输过程中无细菌和真菌污染;
2)实验室中用组织保护液清洗脐带组织表面血液,去除表皮和血管组织,取出华通胶清洗后剪碎成1-1.5mm3体积碎块,采用组织贴壁法接种于T75培养瓶中培养,使用无血清的增殖培养基培养;
3)原代细胞经14天培养,隔天换液,待细胞生长至70%融合度时进行传代培养;
4)选用生长状况良好的P2代脐带间充质干细胞,按10000/cm2密度接种于康宁T175培养瓶中,加入30ml无血清增殖培养基正常培养,在细胞培养过程中加入促进外泌体分泌的细胞刺激因子,包括维生素C(50ng/ml,按在细胞培养液中的终浓度计)、INF-γ(25ng/ml)、HGF(10ng/ml)、bFGF(5ng/ml),促进细胞生产和外泌体分泌;
5)培养3-4天后,细胞生长至90%融合度时吸出上清液用于分离外泌体,间充质干细胞正常传代培养,根据细胞生长状态决定培养代次。利用倒置电子显微镜鉴定间充质干细胞形态,图1为其间充质干细胞图;
6)收集的细胞上清液4000转/分钟离心20分钟去除细胞碎片,收集上清液,向细胞上清液加入15ml超滤管中浓缩,超滤膜孔径3KD,3500转/分钟离心30分钟,去除多余水分;
7)收集超滤管中液体再次浓缩去除多余水分,浓缩终体积为初始体积的20%。
8)浓缩液体超速离心,10000转/分钟离心1小时去除细小细胞碎片,取上清液再次90000转/分钟离心1小时,去除上清液,沉淀为干细胞分泌的外泌体,加入10ml生理盐水清洗一次,90000转/分钟离心1小时,去除上清液,得到外泌体沉淀。
9)采用100μL的PBS重新悬浮外泌体,0.22μm的过滤器除菌,放置于-80℃条件下保存待用。利用扫描电镜对外泌体形态进行观察,图2为其间充质干细胞外泌体在扫描电子显微镜下的形态。
S2:透明质酸水凝胶的制备:
1)称量1g透明质酸粉末,然后加入100ml的去离子水进行溶解,最终形成浓度为1%的透明质酸水溶液,在磁力搅拌器上进行搅拌均匀,反复冷冻,使其交联。冷冻条件为:在-20℃环境下保存12h;解冻条件为:在36~38℃水浴锅中保存1.5h,冷冻解冻循环次数为2次。
2)配置1mol/L的盐酸溶液,并缓慢的加入到1%透明质酸溶液中,测量pH值,降到4.7左右就停止,然后加入0.04g已二酸二酰肼,混合均匀,再加入0.04g碳二亚胺盐酸盐搅拌,搅拌时间为30分钟。后缓慢加入1mol/L的碳酸氢钠溶液,调整pH值到7左右,溶液即可变成水凝胶。
S3:所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,制备伤口敷料。
在4℃条件下,将所述间充质干细胞外泌体三步加入到所述透明质酸水凝胶中,使得所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,制得伤口敷料,其中间充质干细胞外泌体的浓度为300μg/mL。
三次间充质干细胞外泌体的加入重量之比为:第一次加入量:第二次加入量:第三次加入量=5:3:2。
间充质干细胞外泌体加入到所述透明质酸水凝胶的过程中伴随着均匀搅拌,第一次加入过程中的搅拌转速为2000rpm,第二次加入过程中的搅拌转速1500rpm,第三次加入过程中的搅拌转速为1000rpm。
实施例2
S1:间充质干细胞外泌体的制备:
其中S1步骤中的1)~7)和9)步骤与实施例1相同,不再赘述,其不同之处在于步骤8)中:
浓缩液体超速离心,15000转/分钟离心45分钟去除细小细胞碎片,取上清液再次100000转/分钟离心45分钟,去除上清液,沉淀为干细胞分泌的外泌体,加入10ml生理盐水清洗一次,100000转/分钟离心45分钟,去除上清液,得到外泌体沉淀。
S2:制备透明质酸水凝胶:
1)称量1g透明质酸粉末,然后加入100ml的去离子水进行溶解,最终形成浓度为1%的透明质酸水溶液,在磁力搅拌器上进行搅拌均匀,反复冷冻,使其交联。冷冻条件为:在-25℃环境下保存14h;解冻条件为:在36~38℃水浴锅中保存2.5h,冷冻解冻循环次数为2次。
2)配置1mol/L的盐酸溶液,并缓慢的加入到1%透明质酸溶液中,测量pH值,降到4.7左右就停止,然后加入0.01g已二酸二酰肼,混合均匀,再加入0.01g碳二亚胺盐酸盐搅拌,搅拌时间为30分钟。后缓慢加入1mol/L的碳酸氢钠溶液,调整pH值到7左右,溶液即可变成水凝胶。
S3:所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,制备伤口敷料
在4℃条件下,将所述间充质干细胞外泌体分三次加入到所述透明质酸水凝胶中,使得所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,制得伤口敷料中,其中间充质干细胞外泌体的浓度为250μg/mL。
三次所述间充质干细胞外泌体的加入重量之比为:第一次加入量:第二次加入量:第三次加入量=6:2:2。
所述间充质干细胞外泌体加入到所述透明质酸水凝胶的过程中伴随着均匀搅拌,第一次加入过程中的搅拌转速为2300rpm,第二次加入过程中的搅拌转速1800rpm,第三次加入过程中的搅拌转速为1300rpm。
实施例3
S1:间充质干细胞外泌体的制备:
其中S1步骤与实施例1相同,不再赘述。
S2:制备透明质酸水凝胶:
1)称量1g透明质酸粉末,然后加入100ml的去离子水进行溶解,最终形成浓度为1%的透明质酸水溶液,在磁力搅拌器上进行搅拌均匀,反复冷冻,使其交联。冷冻条件为:在-15℃环境下保存14h;解冻条件为:在36~38℃水浴锅中保存1h,冷冻解冻循环次数为2次。
2)配置1mol/L的盐酸溶液,并缓慢的加入到1%透明质酸溶液中,测量pH值,降到4.7左右就停止,然后加入0.05g已二酸二酰肼,混合均匀,再加入0.05g碳二亚胺盐酸盐搅拌,搅拌时间为30分钟。后缓慢加入1mol/L的碳酸氢钠溶液,调整pH值到7左右,溶液即可变成水凝胶。
S3:所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,制备伤口敷料
在4℃条件下,将所述间充质干细胞外泌体分三次加入到所述透明质酸水凝胶中,使得所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,制得伤口敷料中,其中间充质干细胞外泌体的浓度为400μg/mL。
三次所述间充质干细胞外泌体的加入重量之比为:第一次加入量:第二次加入量:第三次加入量=4:3:3。
间充质干细胞外泌体加入到所述透明质酸水凝胶的过程中伴随着均匀搅拌,第一次加入过程中的搅拌转速为2200rpm,第二次加入过程中的搅拌转速1700rpm,第三次加入过程中的搅拌转速为1200rpm。
试验例1
对实施例1所得的伤口敷料进行生物相容性测定,以评价其细胞毒性,具体测定方法如下:
冻存细胞传代生长后第1天,用0.25%胰酶将培养细胞从培养瓶中移出,细胞悬液在200g离心3min。用培养基重悬细胞悬液,调整密度为1×105个细胞/mL。将配制好的细胞悬液接种于96孔培养板,每孔接种100μL。置5%CO2培养箱37℃培养24h。第2天,弃去96孔培养板内原培养液。每孔加入100μL含适当浓度样品浸提液的处理培养基,置CO2培养箱继续培养24h。第3天,将培养板置显微镜下观察细胞形态。弃去孔内溶液,每孔加入50μL质量浓度为1g/L的MTT溶液,孵育4h后弃去MTT溶液,用DMSO溶解结晶并测定其在570nm的吸光度,按下式计算存活率(%)。
存活率(%)=100×OD570e/OD570b
式中OD570e为各浓度试样样品浸提液光密度平均值;OD570b为空白光密度平均值。测试样品分别为伤口敷料浓度为20%的浸提液、伤口敷料浓度为40%的浸提液、伤口敷料浓度为60%的浸提液、伤口敷料浓度为80%的浸提液、伤口敷料浓度为100%的浸提液和对照组,其中对照组为培养基。其MTT实验结果如图3所示,由结果可知,以上浓度的伤口敷料无细胞毒性。
试验例2
对实施例1所制得的伤口敷料进行对人皮肤成纤维细胞增殖的影响的研究,其测试研究过程如下:
将原代分离的人皮肤成纤维细胞培养至P2代时进行干预,分为两组,即对照组和实验组。
对照组采用无血清DMEM/F12培养基培养;
实验组在无血清DMEM/F12培养基中添加实施例1所制得的伤口敷料,含间充质干细胞外泌体浓度为300μg/mL。
两组人皮肤成纤维细胞接种于24孔板中,每个孔加入量为1×104个。在培养第1、3、5、7天,采用CCK-8试剂盒对细胞增殖情况进行检测。每组每个时间点设置5个孔。每个板孔中加入10μL的CCK-8试剂,并孵育1小时,用酶标仪检测每个孔在450nm处吸光度值并绘制细胞的增殖曲线。图4为实施例1所得的伤口敷料对人皮肤成纤维细胞增殖影响的曲线图,由图4所示,本发明的伤口敷料组的OD值,即吸光度,在培养时间的1~8天内均大于空白对照组,由此可知,本发明提供的伤口敷料可加快人体皮肤成纤维细胞的增殖,从而达到促进修复损伤组织的作用。
试验例3
对实施例1所得的伤口敷料进行体外抑菌评价,采用载体浸泡定量抑菌试验完成上述表征,其试验过程如下:
取金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)24小时新鲜斜面培养物用PBS洗下,用PBS稀释至约5.0×106CFU/mL~5.0×107CFU/mL制成菌悬液备用。用微量移液器滴染10μL菌悬液于灭菌载体上(载体为10mm×10mm脱脂白平纹布片,脱脂方法按照《消毒技术规范》(2002版)进行,使用前压力蒸汽灭菌备用。),在36℃±1℃的温度下烘干备用。
称取5g样品于无菌平皿内,置20℃±1℃水浴5分钟,用无菌镊子取一片染菌载体并使其完全浸没于样品中,立即开始计时。6小时后,取染菌载体加入5.0mL PBS试管中,混匀,震荡,将试验菌洗下,吸取1.0mL样液,按活菌培养计数方法测定存活菌数。取5g完全培养基进行平行试验,作为阳性对照。阳性对照回收菌量为1.0×104CFU/片~9.0×104CFU/片。取同批次PBS作阴性对照,试验样本组设伤口敷料组、间充质干细胞外泌体组、透明质酸水凝胶组。试验重复3次,计算抑菌率。
抑菌率=(对照样品的平均菌落数-试验样品平均菌落数)/对照样品的平均菌落数*100%)。
图5为本实施例1所得的伤口敷料体外抑菌的实验结果,由结果可知,实施例所得的伤口敷料和间充质干细胞外泌体均有较明显的体外抑菌效果,但是伤口敷料的抑菌效果优于间充质干细胞外泌体。
试验例4
对实施例1所得的伤口敷料进行促伤口愈合能力的评价,其评价过程如下:
将小鼠放入气体麻醉机中用异氟烷进行麻醉,然后用脱毛膏涂抹背部并用剃刀退毛。用酒精消毒后,用手术剪在背部造成直径约1cm的全皮层切除伤口。对伤口拍照以供后续处理。
随机分为以下5组:
空白对照组:只用医用透明固定胶带覆盖伤口;
组1:注射氨苄青霉素,并用医用透明胶带包裹伤口;
组2:将透明质酸水凝胶覆盖在伤口上,并用医用胶带固定;
组3:将间充质干细胞外泌体涂抹在伤口上,并用医用胶带包裹伤口;
组4:将外泌体联合透明质酸的伤口敷料覆盖在伤口上,并用医用胶带固定。
在1,3,7,14天用异氟烷将小鼠麻醉,对伤口拍照用以计算面积。计算创面的愈合率时,需要在各时间点对足背创面拍照,利用Image-Pro Plus 6.0软件计算其面积,并按照公式计算创面愈合率。
创面愈合率=(原始创面面积-当前测量面积)/原始创面面积*100%。
图6为实施例1所得的伤口敷料促创面愈合的实验结果,经伤口敷料处理后的实验组的创面愈合率最高,明显高于与空白对照组和其它对照组,由此可知,实施例1所得的伤口敷料可以有效地促进创面愈合。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种外泌体联合透明质酸的伤口敷料,其特征在于,所述伤口敷料由透明质酸水凝胶包裹间充质干细胞外泌体构成,所述透明质酸水凝胶是透明质酸水溶液经过反复冷冻解冻再与碳二亚胺盐酸盐及已二酸二酰肼进行交联所获得。
2.如权利要求1所述的外泌体联合透明质酸的伤口敷料,其特征在于,所述透明质酸水凝胶由下述方法制得:
称量透明质酸粉末,然后加入去离子水进行溶解,形成最终浓度为0.5-2%的透明质酸水溶液;
将所述透明质酸水溶液搅拌均匀,并反复冷冻解冻至少两次;
将酸性溶液缓慢的加入到所述透明质酸水溶液中,测量pH值,直至pH值为4.4-5停止;
然后加入己二酸二酰肼,混合均匀,再加入碳二亚胺盐酸盐搅拌,后缓慢加入碳酸氢钠溶液,调整pH值到6.5-7.5,得到透明质酸水凝胶。
3.如权利要求2所述的外泌体联合透明质酸的伤口敷料,其特征在于,所述透明质酸水溶液在磁力搅拌器上进行搅拌均匀,并反复冷冻解冻至少两次,其中,冷冻条件为:在-(15-25)℃环境下保存8-14h;解冻条件为:在35~38℃水浴锅中保存0.5-2.5h;
所述酸性溶液为浓度为0.5-2mol/L的盐酸溶液;
所述碳酸氢钠溶液的浓度为0.5-2mol/L;
以质量分数计,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸加入量的1~5%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸加入量的1~5%。
4.一种外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:从脐带间充质干细胞培养液的上清液中分离纯化出间充质干细胞外泌体,采用PBS重新悬浮所述间充质干细胞外泌体,除菌,并冷冻保存;
S2:对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻,使其发生物理交联,然后再加入已二酸二酰肼和碳二亚胺盐酸盐进行化学交联,调节pH后得到透明质酸水凝胶;
S3:将所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,得到伤口敷料。
5.如权利要求4所述的外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,其特征在于,S2步骤包括:
称量透明质酸粉末,然后加入去离子水进行溶解,最终形成浓度为0.5-2%的透明质酸水溶液;
在磁力搅拌器上进行搅拌均匀,对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻至少两次,使其发生物理交联;
配置0.5-2mol/L的盐酸溶液,并缓慢的加入到所述透明质酸溶液中,测量pH值,直至pH值为4.4-5停止;
然后加入己二酸二酰肼,混合均匀,再加入碳二亚胺盐酸盐搅拌,使其发生化学交联,其中,所述己二酸二酰肼的加入量为透明质酸粉末加入量的1-5%,所述碳二亚胺盐酸盐的加入量为透明质酸粉末加入量的1-5%;
最后缓慢加入0.5-2mol/L的碳酸氢钠溶液,调整pH值到6.5-7.5,得到透明质酸水凝胶。
6.如权利要求4或5所述的外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,其特征在于,在对透明质酸水溶液进行反复冷冻解冻过程中,冷冻条件为:在-(15-25)℃环境下保存8-14h;
解冻条件为:在35~38℃水浴锅中保存0.5-2.5h。
7.如权利要求1所述的外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,其特征在于,S1步骤包括:
将脐带组织清理后接种培养,待原代细胞生长至70-75%融合度进行传代培养;
选用生长状况良好的P2代脐带间充质干细胞,接种培养,加入促进外泌体分泌的细胞刺激因子,待细胞生长至85-95%融合度时吸出上清液,离心去除细胞碎片;
随后将上清液加入超滤管中浓缩至终体积为初始体积的20-30%,超速离心0.5-2h,离心速度为10000-15000转/分钟,去除细小细胞碎片;
取上清液再次超速离心,离心速度为90000-100000转/分钟,离心0.5-2h;
去除上清液,加入生理盐水清洗后再次超速离心0.5-2h,离心速度为90000-100000转/分钟;
去除上清液,得到所述间充质干细胞外泌体沉淀;
采用PBS重新悬浮所述间充质干细胞外泌体沉淀,除菌,冷冻保存,得到间充质干细胞外泌体。
8.如权利要求1所述的外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,其特征在于,S3步骤包括:
在2-5℃条件下,将所述间充质干细胞外泌体分步加入到所述透明质酸水凝胶中,使得所述透明质酸水凝胶包裹所述间充质干细胞外泌体,得到伤口敷料,其中,所述间充质干细胞外泌体的最终浓度为250-400μg/mL。
9.如权利要求8所述的外泌体联合透明质酸的伤口敷料的制备方法,其特征在于,所述间充质干细胞外泌体分三次加入到所述透明质酸水凝胶中,三次所述间充质干细胞外泌体的加入重量之比为:第一次加入量:第二次加入量:第三次加入量=(4~6):(2~4):(1~3);
三次所述间充质干细胞外泌体的加入过程中的搅拌转速之比为:第一次搅拌转速:第二次搅拌转速:第三次搅拌转速=(2000-2300):(1500-1800):(1000-1300)。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的外泌体联合透明质酸的伤口敷料,或者如权利要求4-9任一项所述的制备方法制得的外泌体联合透明质酸的伤口敷料,其在促进伤口愈合药物或材料中的应用。
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