CN114949358A

CN114949358A - 一种用于深部创面修复的复合材料及其制备方法

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Publication number: CN114949358A
Application number: CN202210562540.3A
Authority: CN
Inventors: 董坚; 徐晓明; 龙庭凤; 曾元; 顾加明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明公开了一种用于深部创面修复的复合材料及其制备方法，公开的复合材料包括：猪小肠黏膜下层和干细胞凝胶制剂，干细胞凝胶制剂包括间充质干细胞、高分子稳定剂和美洲大蠊提取物溶液；制备方法包括以下步骤：S1、用细胞培养基将间充质干细胞制成细胞悬液；S2、另取一细胞培养基，将经过无菌处理的高分子稳定剂加入该细胞培养基中制成凝胶溶液；高分子稳定剂的组分包括海藻酸钠，含量为10～50g/L，还包括1～3wt％透明质酸钠，5～10wt％二甲基亚砜，30～50wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液；S3、将凝胶溶液与美洲大蠊提取物溶液混合均匀，之后加入细胞悬液中制得干细胞凝胶制剂；S4、将干细胞凝胶制剂接种到猪小肠黏膜下层材料上获得用于深部创面修复的复合材料。

Description

一种用于深部创面修复的复合材料及其制备方法

技术领域

本申请涉及医学组织工程领域，具体涉及一种用于深部创面修复的复合材料及其制备方法。

背景技术

在全球范围，由严重创伤、烧伤和慢性疾病导致的深部组织创面修复成为了一个十分严重的问题，目前主要采用传统的药物治疗和手术治疗手段，新型的细胞治疗方法也应用于临床患者。药物治疗时间长，见效慢，严重影响受试者生活质量。对于严重的皮肤损伤，外科治疗包括手术切除病变组织，采用自体植皮、同种异体植皮以及其他相关修复材料进行修复治疗。然而，无论是自体或异体皮肤移植均受到供体来源和免疫排斥反应的限制。此外，修复手术可能不成功，或创面愈合几年后在原辐照部位再次破溃。

目前细胞治疗方法的临床研究结果显示，间充质干细胞凝胶具有表皮细胞分化潜能，可促进受创皮肤的愈合，将间充质干细胞凝胶局部涂抹到皮肤烧伤、糖尿病足溃疡、放射性皮肤损伤不愈合的创面，能够控制疾病的进展，促进创面修复，取得了较好的治疗效果。但是细胞疗法对于深达肌层组织的修复效果不甚理想，难以有效修复深层组织，恢复其正常生理功能。干细胞凝胶治疗深部组织损伤效果有限，现有的干细胞凝胶不能模拟细胞外基质的纤维结构，并且干细胞分泌的细胞因子和生物活性成份只能促进皮肤结构中表皮细胞和上皮细胞生长，不能修复深部肌层组织，缺少必须氨基酸和胶原蛋白等合成肌纤维的原料。

综上所述，目前亟待寻找从根本上解决深部组织创面难愈合新的治疗策略。

发明内容

为此，本申请提供一种用于深部创面修复的复合材料及其制备方法，以解决现有细胞治疗药物难以修复创伤部位深部组织的问题。

为了解决上述问题，本发明提供以下方案：

第一方面，本发明提供了一种用于深部创面修复的复合材料，其包括：

猪小肠黏膜下层和干细胞凝胶制剂，干细胞凝胶制剂包括间充质干细胞、高分子稳定剂和美洲大蠊提取物溶液。

可选地，间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和羊膜间充质干细胞，1mL干细胞凝胶制剂中含有0.5～3×10⁶个间充质干细胞。

可选地，高分子稳定剂的组分包括海藻酸钠，含量为10～50g/L，还包括1～3wt％透明质酸钠，5～10wt％二甲基亚砜，30～50wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液。

进一步可选地，高分子稳定剂的组分包括海藻酸钠，含量为30g/L，还包括1wt％透明质酸钠，5wt％二甲基亚砜，30wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液。

可选地，美洲大蠊提取物溶液的浓度为0.05mg/ml～1mg/ml。

第二方面，本发明提供了一种用于深部创面修复的复合材料的制备方法，其包括以下步骤：

S1、用细胞培养基将间充质干细胞制成细胞悬液；

S2、另取一细胞培养基，将经过无菌处理的高分子稳定剂加入该细胞培养基中制成凝胶溶液；高分子稳定剂的组分包括海藻酸钠，含量为10～50g/L，还包括1～3wt％透明质酸钠，5～10wt％二甲基亚砜，30～50wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液；

S3、将S2制得的凝胶溶液与美洲大蠊提取物溶液混合均匀，之后加入S1制得的细胞悬液中制得干细胞凝胶制剂；

S4、将S3制得的干细胞凝胶制剂接种到猪小肠黏膜下层材料上获得用于深部创面修复的复合材料。

可选地，S1制得的细胞悬液中，间充质干细胞的含量为1.2×10⁶～7.5×10⁷个/mL。

可选地，S3中的美洲大蠊提取物溶液的浓度为0.05mg/ml～1mg/ml。

可选地，S3中，凝胶溶液与细胞悬液的体积比为2:1。

可选地，S4中，将干细胞凝胶制剂接种到猪小肠黏膜下层材料上后，猪小肠黏膜下层材料上的间充质干细胞的数量为1000～100000个/mm²。

相比现有技术，本申请至少具有以下有益效果：

(1)本申请提供的一种用于深部创面修复的复合材料，采用的猪小肠黏膜下层相对于干细胞二维培养体系，为天然的脱细胞基质，属于生物衍生材料，保留了天然的纤维结构和孔隙及细胞因子、具备免疫源性较低、组织相容性良好、生长因子含量高、可降解且能促进细胞和组织再生等优点，同时来源广泛、获取方便、价格低廉，取材不存在伦理方面的问题；且猪小肠粘膜下层复水后的可塑性强，并且猪小肠黏膜下层支架材料的三维培养体系可负载各种生长因子，并为移植细胞提供附着基质，能够促进细胞增殖、分化并加速移植载体再血管化进程，促进干细胞能够更好地适应病损组织，发挥其更好的生物学特性，是很好的组织再生的支架；将干细胞凝胶制剂中的间充质干细胞接种于可降解的猪小肠黏膜下层支架材料上，之后整体移植于体内损伤部位，功能性的间充质干细胞增殖分化为形态、结构、功能与天然组织、器官相似的具有特殊功能的活性组织，对深层组织的修复作用明显；通过上述作用，本申请提供的复合材料能够有效解决细胞疗法对于深达肌层组织的修复效果不理想问题。

(2)本申请提供的一种用于深部创面修复的复合材料，加入了美洲大蠊提取物即康复新，其主要成份有丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等氨基酸和尿嘧啶等生物碱，成分复杂，其主要临床作用：通利血脉、养阴生肌；美洲大蠊提取物具有抗炎镇痛、抗菌、抗氧化、促进组织修复、增强免疫功能、改善微循环等作用；复合材料中加入的美洲大蠊提取物，在在创伤修复的不同阶段影响胶原纤维、生长因子的表达含量从而加快黏膜修复，主要包括降低炎症反应、提高免疫水平和抗氧化活性、调节生长因子表达、调控创面愈合相关信号通路等，随着猪小肠黏膜下层支架材料的逐步降解，美洲大蠊提取物消除炎症及水肿，促进创伤部位坏死组织脱落，迅速修复溃疡及创面，缓解疼痛，抑制细菌生长，减少渗出，提高巨噬细胞吞噬能力，活化非特异性细胞免疫功能，促进肉芽组织的生长，促进血管新生，改善微循环，同时运用美洲大蠊提取物和间充质干细胞的协同效果加快创面愈合速度，修复深层组织，更好地治疗组织损伤。

附图说明

为了更直观地说明现有技术以及本申请，下面给出几个示例性的附图。应当理解，附图中所示的具体形状、构造，通常不应视为实现本申请时的限定条件；例如，本领域技术人员基于本申请揭示的技术构思和示例性的附图，有能力对某些单元(部件)的增/减/归属划分、具体形状、位置关系、连接方式、尺寸比例关系等容易作出常规的调整或进一步的优化。

图1为本申请实施例提供的实验1中不同浓度的康复新溶液对HaCat细胞增殖效果的影响的曲线图；图1中，1为康复新浓度2mg/mL，2为康复新浓度1mg/mL，3为康复新浓度0.5mg/mL，4为康复新浓度0.1mg/mL，5为康复新浓度0.05mg/mL，6为康复新浓度0mg/mL；

图2为本申请实施例提供的实验2中0.5mg/mL的康复新溶液对人脐带间充质干细胞的细胞数量和细胞活率的影响情况曲线图；图2-A为康复新溶液对人脐带间充质干细胞的细胞数量影响情况，图2-B为康复新溶液对人脐带间充质干细胞的细胞活率影响情况；

图3为本申请实施例提供的实验3中不同实验组对全层皮肤缺损模型的修复效果对比。

具体实施方式

以下结合附图，通过具体实施例对本申请作进一步详述。

在本申请的描述中：除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。本申请中的术语“第一”、“第二”、“第三”等旨在区别指代的对象，而不具有技术内涵方面的特别意义(例如，不应理解为对重要程度或次序等的强调)。“包括”、“包含”、“具有”等表述方式，同时还意味着“不限于”(某些单元、部件、材料、步骤等)。

本实施例提供了一种用于深部创面修复的复合材料，其包括：

猪小肠黏膜下层和干细胞凝胶制剂，干细胞凝胶制剂包括间充质干细胞、美洲大蠊提取物溶液(即康复新溶液，下文中均记为康复新溶液)和高分子稳定剂，康复新溶液的浓度为0.05mg/ml～1mg/ml；间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和羊膜间充质干细胞，本实施例所用的间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，1mL干细胞凝胶制剂中含有0.5～3×10⁶个所述间充质干细胞；高分子稳定剂的组分包括海藻酸钠，含量为10～50g/L，还包括1～3wt％透明质酸钠，5～10wt％二甲基亚砜，30～50wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液；根据实验结果，优选30g/L海藻酸钠，1wt％透明质酸钠，5wt％二甲基亚砜，30wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液。

本实施例还提供了一种用于深部创面修复的复合材料的制备方法，其包括以下步骤：

S1、用细胞培养基将间充质干细胞制成细胞悬液；细胞悬液中，间充质干细胞的含量为1.2×10⁶～7.5×10⁷个/mL；

S2、另取一细胞培养基，将经过无菌处理的高分子稳定剂加入该细胞培养基中制成凝胶溶液；高分子稳定剂的组分包括海藻酸钠，含量为10～50g/L，还包括1～3wt％透明质酸钠，5～10wt％二甲基亚砜，30～50wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液；根据实验结果，优选30g/L海藻酸钠，1wt％透明质酸钠，5wt％二甲基亚砜，30wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液；

S3、将S2制得的凝胶溶液加入S1制得的细胞悬液中制得干细胞凝胶制剂；凝胶溶液与细胞悬液的体积比为2:1；还加入了康复新溶液，康复新溶液浓度为0.05mg/ml～1mg/ml；

S4、将S3制得的干细胞凝胶制剂接种到猪小肠黏膜下层材料上获得所述用于深部创面修复的复合材料；将干细胞凝胶制剂接种到猪小肠黏膜下层材料上后，猪小肠黏膜下层材料上的所述间充质干细胞的数量为1000～100000个/mm²。

接下来提供一系列实验及结果，以说明本发明的效果。

实验1

选择浓度分别为0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml的康复新溶液与HaCat细胞共同培养，CCK-8检测不同浓度康复新溶液对HaCat细胞增殖情况影响，筛选出最适合HaCat细胞生长的康复新(美洲大蠊提取物)浓度(最佳浓度)。实验结果如图1所示；图1中，1为康复新浓度2mg/mL，2为康复新浓度1mg/mL，3为康复新浓度0.5mg/mL，4为康复新浓度0.1mg/mL，5为康复新浓度0.05mg/mL，6为康复新浓度0mg/mL。

从实验结果可以看出康复新(美洲大蠊提取物)促进HaCat细胞生长，0.05mg/ml促进作用最明显，0.5mg/ml次之。综合考虑不同浓度康复新溶液对创面的愈合作用强，优选康复新浓度为0.5mg/ml。

实验2

将实验1得出的最佳浓度的康复新溶液与人脐带间充质干细胞共培养，使用台盼蓝染色检测康复新对人脐带间充质干细胞活性影响情况。

本次优选细胞悬液间充质干细胞的含量为1.2×10⁷个/mL。实验结果如图2所示；其中，图2-A为康复新溶液对人脐带间充质干细胞的细胞数量影响情况，图2-B为康复新溶液对人脐带间充质干细胞的细胞活率影响情况。

从结果中可以看出，0.5mg/ml的康复新对人脐带间充质干细胞的细胞数量和细胞活率在9小时内变化不明显，超过9小时后细胞数量和活率明显下降。可按照最佳康复新浓度(0.5mg/ml)制备复合材料。

实验3

本实验为动物实验，选用SD大鼠，实验分为5组，分别为空白对照组，SIS组，SIS+康复新组，不含康复新复合材料组，含康复新复合材料组。

实验方法：

所有动物使用电推刀局部去毛，采用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。各组臀部皮肤用刀片切割约1×1cm²全层皮肤缺损模型。模型完成3天后开始用药。

各组区别：

空白对照组：不进行任何治疗；

SIS组：选用0.3×0.3cm²SIS材料(即猪小肠黏膜下层材料)，敷贴到创面上；

SIS+康复新组：使用大小为0.3×0.3cm²，含0.5mg/ml康复新溶液1ml的SIS材料敷贴创面；

不含康复新复合材料组：使用本申请实施例提供的不含康复新(即美洲大蠊提取物)的复合材料敷贴创面，使用大小为0.3×0.3cm²，复合材料中含1×10⁵个间充质干细胞；每天1次，连用6天；

含康复新复合材料组：使用本申请实施例提供的含0.5mg/ml康复新溶液1ml的复合材料敷贴创面，使用大小为0.3×0.3cm²，复合材料中含1×10⁵个间充质干细胞；每天1次，连用6天。

实验结果如图3所示。

从实验结果可以看出：含康复新复合材料组创面愈合速度最快，12天时已经完全愈合，长出新生上皮组织，不含康复新复合材料组愈合速度稍慢，但也几乎完全愈合，该两组相比SIS组和SIS+康复新组效果均更好，且愈合质量优于SIS+康复新组和SIS组；SIS组创面好于SIS+康复新组；以上4组创面的愈合质量和速度均优于空白对照组。

从以上实验结果可以看出，本申请实施例提供的复合材料可以明显促进深部皮肤损伤组织的修复，加快创面愈合，其中，采用优选方案(即加入康复新溶液)的复合材料效果更好。

将体外培养扩增的有功能的含康复新的间充质干细胞种植于可降解的猪小肠黏膜下层支架材料上，将其移植到体内损伤部位，随着猪小肠黏膜下层支架材料的逐步降解，康复新消除炎症及水肿，促进创伤部位坏死组织脱落，迅速修复溃疡及创面，缓解疼痛，抑制细菌生长，减少渗出，提高巨噬细胞吞噬能力，活化非特异性细胞免疫功能，促进肉芽组织的生长，促进血管新生，改善微循环；功能性的间充质干细胞增殖分化为形态、结构、功能与天然组织、器官相似的具有特殊功能的活性组织，同时运用康复新和间充质干细胞的协同效果加快创面愈合速度，修复深层组织，更好地治疗组织损伤。本发明提供的复合材料可以解决细胞疗法对于深达肌层组织的修复效果不理想问题，实现对深层组织的快速修复，修复效果理想，为临床治疗深层皮肤损伤提供更多的治疗方案。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合(只要这些技术特征的组合不存在矛盾)，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述；这些未明确写出的实施例，也都应当认为是本说明书记载的范围。

上文中通过一般性说明及具体实施例对本申请作了较为具体和详细的描述。应当理解，基于本申请的技术构思，还可以对这些具体实施例作出若干常规的调整或进一步的创新；但只要未脱离本申请的技术构思，这些常规的调整或进一步的创新得到的技术方案也同样落入本申请的权利要求保护范围。

Claims

1.一种用于深部创面修复的复合材料，其特征在于，包括：

猪小肠黏膜下层和干细胞凝胶制剂，所述干细胞凝胶制剂包括间充质干细胞、高分子稳定剂和美洲大蠊提取物溶液。

2.根据权利要求1所述的一种用于深部创面修复的复合材料，其特征在于，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和羊膜间充质干细胞，1mL所述干细胞凝胶制剂中含有0.5～3×10⁶个所述间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种用于深部创面修复的复合材料，其特征在于，所述高分子稳定剂的组分包括海藻酸钠，含量为10～50g/L，还包括1～3wt％透明质酸钠，5～10wt％二甲基亚砜，30～50wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求3所述的一种用于深部创面修复的复合材料，其特征在于，所述高分子稳定剂的组分包括海藻酸钠，含量为30g/L，还包括1wt％透明质酸钠，5wt％二甲基亚砜，30wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1所述的一种用于深部创面修复的复合材料，其特征在于，所述美洲大蠊提取物溶液的浓度为0.05mg/ml～1mg/ml。

6.一种用于深部创面修复的复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、用细胞培养基将间充质干细胞制成细胞悬液；

S2、另取一细胞培养基，将经过无菌处理的高分子稳定剂加入该所述细胞培养基中制成凝胶溶液；所述高分子稳定剂的组分包括海藻酸钠，含量为10～50g/L，还包括1～3wt％透明质酸钠，5～10wt％二甲基亚砜，30～50wt％甘油，余量为磷酸盐缓冲液；

S3、将S2制得的所述凝胶溶液与美洲大蠊提取物溶液混合均匀，之后加入S1制得的所述细胞悬液中制得干细胞凝胶制剂；

S4、将S3制得的所述干细胞凝胶制剂接种到猪小肠黏膜下层材料上获得所述用于深部创面修复的复合材料。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，S1制得的所述细胞悬液中，所述间充质干细胞的含量为1.2×10⁶～7.5×10⁷个/mL。

8.根据根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，S3中的所述美洲大蠊提取物溶液的浓度为0.05mg/ml～1mg/ml。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，S3中，所述凝胶溶液与所述细胞悬液的体积比为2:1。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，S4中，将所述干细胞凝胶制剂接种到所述猪小肠黏膜下层材料上后，所述猪小肠黏膜下层材料上的所述间充质干细胞的数量为1000～100000个/mm²。