CN101366977A

CN101366977A - 具有生物活性的组织修补材料及其制备方法

Info

Publication number: CN101366977A
Application number: CNA2008101507906A
Authority: CN
Inventors: 王爱军
Original assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2008-09-03
Filing date: 2008-09-03
Publication date: 2009-02-18
Anticipated expiration: 2028-09-03
Also published as: CN101366977B

Abstract

一种具有生物活性的组织修补材料及其制备方法，本发明是在脱细胞小肠粘膜下层上复合有人体活细胞及其合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子所构成；所制备的具有生物活性的组织修补材料去除了天然抗原成分，其应用到创面后可在创面存活，直接参与创面的修复，持续合成分泌生长因子，引导创周细胞的长入、血管的生成、诱导干细胞向皮肤细胞的分化，因此可以明显促进创面的愈合；不仅具有人体组织的部分特征，和脱细胞小肠粘膜下层良好的机械性能，同时还对人体的生物相容性高、显著降低免疫排斥反应，可覆盖创面、充填软组织缺损、促进创周细胞的生长和增殖，修复软组织器官缺损并促进损伤愈合。

Description

具有生物活性的组织修补材料及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及一种具有生物活性的组织修补材料及其制备方法。

背景技术

器官和组织中的细胞，其行为不仅取决于细胞内在的基因序列，在很大程度上还受到外界环境因素的影响，包括细胞与细胞外基质的相互作用。细胞外基质不仅为细胞生长提供支持和保护，更重要的是细胞与细胞外基质的相互作用能调节细胞的形态发生过程，影响细胞生存、迁移、增殖和功能代谢。因此，在组织工程研究中制备利于种子细胞粘附、增殖和分化的细胞外基质材料是十分重要和迫切的。

小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa，SIS)来源于小肠，是一种天然的细胞外基质生物材料，主要由I、III型纤维胶原蛋白构成，含有少量的IV、V型胶原，还包含氨基葡聚糖和糖蛋白等，近年来被较多应用于血管、腹壁等多种组织缺损的修补，是理想的生物支架材料。

SIS在体内能引导、支持宿主细胞生长，逐渐完全降解，适用于组织工程的支架材料。SIS中含有多种生长因子，即使经过脱细胞处理后仍然含有这些生长因子，在创伤愈合的早期阶段可以为组织再生创造合适的微环境。这是其它天然材料和人工聚合物(如胶原、壳聚糖和聚乳酸、聚羟基乙酸)所不能比拟的。

然而，SIS的成分主要是由动物细胞分泌合成，包括有胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白等细胞外基质成分，与人体的成分存在有差异，因此植入体内后难以与人体相融合，可能激发机体的异物反应或免疫排斥反应，使其在使用中受到限制。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有生物活性的组织修补材料及其制备方法，使所制备的修补材料含有来自人体的活细胞及其分泌合成的细胞外基质和多种生长因子，能用于修复软组织器官缺损并促进损伤愈合，具有生物相容性高、无毒害、显著降低免疫排斥反应的优点。

本发明所提出的具有生物活性的组织修补材料，是在脱细胞小肠粘膜下层上复合有人体活细胞及其合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子所构成；所述的脱细胞小肠粘膜下层是将哺乳动物空肠经脱细胞处理后获得；所述的人体活细胞为成体细胞、或是成体干细胞，包括成纤维细胞、表皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞的任一种或是几种，其选择是根据所修复组织受区的需求来确定。

本发明具有生物活性的组织修补材料的制备方法，包括细胞获取、脱细胞SIS制备以及具有生物活性的组织修补材料的制备，具体步骤如下：

1)、细胞获取：细胞来自人体组织，根据所修复组织受区的需求选择细胞的类型，按常规的细胞培养方法进行体外培养，细胞的大规模扩增可采用细胞工厂、生物反应器的方法进行；

2)、脱细胞小肠粘膜下层的制备：取哺乳动物的空肠用水冲洗干净，切成所需长度，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时；用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗；机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗，获得粘膜下层；将其置入0.1～1M的NaOH溶液中浸泡8分钟以上，以达到溶解细胞、灭活病毒的目的，用PBS漂洗至pH中性；再将其置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，去除残留的DNA和α-gal天然抗原成分，降低免疫原性，用PBS漂洗；为使种植细胞更容易贴附，经脱水干燥后使用牛血清或胶原蛋白或多聚赖氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD多肽)的任一种溶液浸泡20分钟以上，再经干燥后形成脱细胞小肠粘膜下层，灭菌消毒；其中，所述的过氧乙酸和乙醇的体积终浓度分别为0.1～0.5％和2～10％；所述DNA酶的终浓度为30～50U/ml，α-半乳糖苷酶的终浓度为10～25U/ml；

3)、专用培养液的配制，其组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清5～15％，胰岛素1～50μg/ml、碱性成纤维细胞生长因子1～10ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.2～0.25mM、转铁蛋白1～10μg/ml，维生素C10～50μg/ml。

4)、具有生物活性的组织修补材料的制备：将体外扩增培养的细胞用细胞培养液悬浮，按10⁴～10⁶个/cm²的密度滴加在脱细胞小肠粘膜下层表面，在5％CO₂环境中37℃条件下静置贴附后，置入专用培养液中培养2～3天；弃去培养液，将脱细胞小肠粘膜下层未种植细胞的一面向上，再按照上述方法以10⁴～10⁶个/cm²的密度种植细胞(其两面种植的细胞可以不同)，静置后加入专用培养液培养2～3天；再将两面复合有细胞的脱细胞小肠粘膜下层置于培养器皿内的培养支架上，用专用培养液继续培养5～8天，每2天换液，培养完成；得到具有生物活性的组织修补材料，上述的培养条件均为37℃的5％CO₂环境。

本发明制备的具有生物活性的组织修补材料，是在去除细胞和天然抗原成分的动物来源小肠粘膜下层上复合了人体活细胞及其合成分泌的细胞外基质成分和多种细胞生长因子，其应用到创面后可在创面存活，不仅能直接参与创面的修复，而且可持续合成分泌生长因子，引导创周细胞的长入、血管的生成、诱导干细胞向皮肤细胞的分化，因此可以明显促进创面的愈合。使得脱细胞小肠粘膜下层在经过人体细胞改造后具有人体组织的部分特征，不仅具有脱细胞小肠粘膜下层良好的机械性能，同时还对人体的生物相容性高、显著降低免疫排斥反应，可覆盖创面、充填软组织缺损、促进创周细胞的生长和增殖，修复软组织器官缺损并促进损伤愈合。

本发明具有生物活性的组织修补材料的主要功能有：(1)充当组织加强物，修复机体组织缺损(疝、瘘等营养不良和感染创面)；(2)作为组织充填材料而使局部丰满，修复颜面部凹陷畸形。

具体实施方式

以下结合实例对本发明技术方案做进一步的详细说明。

实例一：

1)、成纤维细胞和表皮细胞的获取：无菌获取人皮肤组织，去除脂肪层，切成5mm×5mm大小，中性蛋白酶消化后，分离表皮和真皮组织；用300U/ml胶原酶消化真皮组织，消化完成后将真皮组织吹散收集细胞液，离心后弃上清获取成纤维细胞，接种入培养瓶补足成纤维细胞培养液，扩增培养至所需数量；将分离的表皮用0.25％胰酶消化液消化后，吹散收集细胞液，离心后弃上清获取表皮细胞，接种入培养瓶补足表皮细胞培养液，扩增培养至所需数量；

2)、脱细胞小肠粘膜下层的制备：将猪空肠用蒸馏水冲洗干净，切成10cm片段，置于含有0.4％(v/v)过氧乙酸和8％(v/v)乙醇的水溶液中浸泡消毒1.5小时；用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后沿纵向剖开，机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗后，获得粘膜下层；再置入0.3M的NaOH溶液中4±2℃条件下脱细胞处理30分钟，用PBS漂洗至pH中性；将其置入含有40U/ml的DNA酶和20U/ml的α-半乳糖苷酶的混合溶液中，37℃环境下处理1小时，去除残留的DNA和α-gal天然抗原成分，用PBS漂洗，经脱水干燥后，使用胎牛血清浸泡30分钟，再经冷冻干燥后，环氧乙烷灭菌消毒；

3)、专用培养液的配制，各组分按体积百分比为：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清10％，胰岛素10μg/ml、碱性成纤维细胞生长因子2ng/ml、氢化可的松15ng/ml、腺嘌呤0.2mM、转铁蛋白8μg/ml、维生素C 40μg/ml。

4)、具有生物活性的组织修补材料的制备：将体外培养的成纤维细胞和表皮细胞消化、离心后，分别用细胞培养液悬浮，按10⁵个/cm²的密度将成纤维细胞滴加在脱细胞小肠粘膜下层表面，于5％CO₂环境中37℃条件下静置30分钟，加入专用培养液培养3天，弃去培养液，将脱细胞小肠粘膜下层未种植细胞的一面向上，再按照上述方法以10⁵个/cm²的密度种植表皮细胞，静置后加入专用培养液培养2天，再将两面复合有细胞的脱细胞小肠粘膜下层置于培养器皿内的培养支架上，用专用培养液继续培养5天，每2天换液，即培养完成；上述的培养条件均为37℃的5％CO₂环境。

本实例制备的具有生物活性的组织修补材料包含有人皮肤活细胞及其合成分泌的多种人源性细胞生长因子和细胞外基质成分，包括bFGF、EGF、TGF-β1、IL-8、胶原蛋白等，可直接用于修复软组织器官缺损并促进损伤愈合，能直接参与后期创面重塑并抑制瘢痕的形成。

实例二：

1)、脂肪干细胞获取：无菌获取人脂肪组织，切成1mm³大小，用400U/ml胶原酶液消化后，将脂肪组织吹散收集细胞液，离心后弃上清获取脂肪干细胞；加入细胞培养液后吹悬细胞，接种入培养瓶，扩增培养至所需数量；

2)、脱细胞小肠粘膜下层的制备：将羊空肠用蒸馏水冲洗干净，切成10cm片段，置于含有0.2％过氧乙酸和3％乙醇的水溶液中浸泡消毒1小时；用磷酸盐缓冲液漂洗后，纵向剖开肠段，机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗后，获得粘膜下层；再置入0.8M的NaOH溶液中，5±2℃环境下处理10分钟，用PBS漂洗至pH中性；将其置入含有40U/m1DNA酶和20U/mlα-半乳糖苷酶的混合溶液中，37℃环境下处理1小时，去除残留的DNA和α-gal天然抗原成分，用PBS漂洗；经脱水干燥后在0.1％多聚赖氨酸溶液浸泡50分钟；再经冷冻干燥后，钴60灭菌消毒。

3)、专用培养液的配制，各组分按体积百分比为：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清10％，胰岛素40μg/ml、碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml、氢化可的松100ng/ml、腺嘌呤0.22mM、转铁蛋白6μg/ml、维生素C 30μg/ml。

4)、具有生物活性的组织修补材料的制备：将体外培养的脂肪干细胞消化、离心后，用细胞培养液重新悬浮，按10⁶个/cm²的密度滴加在脱细胞小肠粘膜下层表面后，于5％CO₂环境中37℃条件下静置30分钟，加入专用培养液培养2天，弃去培养液，将脱细胞小肠粘膜下层未种植细胞的一面向上，再按上述方法以10⁵个/cm²的密度种植脂肪干细胞，静置后加入专用培养液培养3天，再将其取出置于培养器皿内的培养支架上，用专用培养液继续培养7天，培养期间每2天换液，即培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％CO₂环境。

本实例制备的具有生物活性的组织修补材料便于临床使用；含有脂肪干细胞合成、分泌的生长因子可以对真皮成纤维细胞影响来加速创面愈合，用于治疗皮肤创面愈合。

Claims

1.一种具有生物活性的组织修补材料，其特征在于，是在脱细胞小肠粘膜下层上复合有人体活细胞及其合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子所构成；所述的脱细胞小肠粘膜下层是哺乳动物空肠经脱细胞处理后获得；所述的人体活细胞为成体细胞或是成体干细胞。

2.制备权利要求1所述具有生物活性的组织修补材料的方法，包括有细胞获取的步骤，其特征在于，具体步骤如下：

1)、细胞获取：根据需求确定细胞类型，进行体外细胞的培养和扩增；

2)、脱细胞小肠粘膜下层的制备：取哺乳动物的空肠用水冲洗干净，切成所需长度，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时；用磷酸盐缓冲液漂洗；机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用磷酸盐缓冲液漂洗，获得粘膜下层；将其置入0.1～1M的NaOH溶液中浸泡8分钟以上，用磷酸盐缓冲液漂洗至pH中性；再将其置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，用磷酸盐缓冲液漂洗；经脱水干燥后使用牛血清或胶原蛋白或多聚赖氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的任一种溶液浸泡20分钟以上，再经干燥后形成脱细胞小肠粘膜下层，灭菌消毒；

3)、专用培养液的配制，其组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清5～15％，胰岛素1～50μg/ml、碱性成纤维细胞生长因子1～10ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.2～0.25mM、转铁蛋白1～10μg/ml、维生素C 10～50μg/ml；

4)、具有生物活性的组织修补材料的制备：将体外扩增培养的细胞用细胞培养液悬浮，按10⁴～10⁶个/cm²的密度滴加在脱细胞小肠粘膜下层表面，在5％ CO₂环境中37℃条件下静置贴附，置入专用培养液中培养2～3天；弃去培养液，将脱细胞小肠粘膜下层未种植细胞的一面向上，再按照上述方法以10⁴～10⁶个/cm²的密度种植细胞，静置后加入专用培养液培养2～3天；再将两面复合有细胞的脱细胞小肠粘膜下层置于培养器皿内的培养支架上继续培养5～8天，每2天换液，培养完成；得到具有生物活性的组织修补材料，上述的培养条件均为37⁰C的5％ CO₂环境。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述过氧乙酸的终浓度体积比为0.1～0.5％，乙醇的终浓度体积比为2～10％；所述DNA酶的终浓度为30～50U/ml，α-半乳糖苷酶的终浓度为10～25U/ml。