CN100475279C

CN100475279C - 成体干细胞覆膜血管内支架及制备方法

Info

Publication number: CN100475279C
Application number: CNB2006100953667A
Authority: CN
Inventors: 王贵学; 江涛
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2006-12-27
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2009-04-08
Anticipated expiration: 2026-12-27
Also published as: CN101002967A

Abstract

本发明针对目前生物膜支架覆膜材料来源有限且来源途径可能会对人体造成一定伤害的现状，提出一种成体干细胞覆膜血管内支架及制备方法，属于生物医疗器械技术领域。它由金属血管内支架、覆于血管内支架上的SIS以及种植在SIS上的成体干细胞构成，基本方法是首先制备具有生物活性的SIS，分离人脐血内皮祖细胞，然后运用组织工程原理，进行细胞种植，使其形成内皮祖细胞的衬里，再通过一定的工艺使其覆盖修饰血管内支架，使支架内表面形成一光滑、平整的薄膜层，增强血管内支架的生物相容性和血液相容性。本发明为覆膜支架提供了一种新的生物膜材料来源，为预防支架植入术后再狭窄提供一条新的途径。

Description

成体干细胞覆膜血管内支架及制备方法

技术领域

本发明涉及对血管内支架进行覆膜修饰并进行内皮化处理，为预防血管内支架植入术后引发的支架内再狭窄问题提供新的方法，属于生物医疗器械技术领域。

背景技术

血管内支架(intravascular stents)临床实践的导入是自经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)以后冠状动脉介入领域的又一重大突破，因为支架解决了早期血管弹性回缩和后期的负性重塑过程造成的60％的再狭窄问题。尽管如此，血管内支架的长期成功被支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)所限制。虽然支架可以消除血管弹性回缩和负性重塑过程，但支架又能诱导比单纯球囊成形术更明显的慢性血管应答。大约20-30％的病人出现ISR，需要重复的介入治疗。因此，如何预防ISR的发生，已成为世界性的研究热点。国内外进行了许多相关研究，研发出药物洗脱性支架((drug-elutingstents，DES)、惰性涂层支架、生物可降解支架，细胞或基因涂层支架等，其中DES已经取得良好的临床效果。

由于普通金属支架本身有限的生物相容性，不但损伤血管内膜，引起内皮化过程的延迟，而且不能阻止支架外组织向支架内腔生长，因此不少学者致力于覆膜支架的研究。覆膜支架(covered stent)就是在普通金属内支架上覆以特殊膜性材料而构成，它既保留了普通金属支架的特性，还具有所覆膜性材料的特有性能。覆膜支架的突出特点是：藉其支架表面的膜性结构机械性阻隔支架内外组织的相互作用。从ISR的发生机制来看，血液中的纤维蛋白原、血小板、包括淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞在内白细胞及其分泌的细胞因子与血管组织中VSMC、白细胞及其分泌的细胞因子之间的相互作用是造成内膜增生的主要原因，因此覆膜支架所具有的特性可用来预防ISR的发生。此外，如果ISR过程中，增殖的SMC确实来源于骨髓的造血干细胞，则覆膜支架的膜性结构则可阻止其进入血管壁而起到预防ISR的作用。

目前报道覆膜血管内支架的种类主要有聚合物膜支架、药膜支架和生物膜支架，不同程度取得了良好的实验和临床效果，但也仍然存在着一些问题。如聚合物膜支架显著地增加了与血液接触的表面积，若处理不当，会导致更严重的血栓形成和平滑肌细胞增生，并会出现膜材料的老化降解现象；药膜支架中，对于药物的种类、载药量、缓释特性等问题仍需进一步的探讨和改进；生物膜支架是最具发展潜力的一种覆膜支架类型，膜材料主要包括自体静脉、经变性处理的异体静脉、肝索化的纤维蛋白及I型胶原蛋白等。目前自体静脉覆膜支架取得了较为理想的效果，但其来源有限，并会对机体造成伤害。因此，选择理想的生物覆膜材料是改进覆膜支架重要的主要研究方向。

发明内容

本发明的目的是研发一种新的生物膜血管内支架，针对目前生物膜支架覆膜材料来源有限且来源途径可能会对人体造成一定伤害的现状，提出一种猪小肠粘膜下层血管内支架及制备方法，提供一种新的生物膜材料的来源途径，并以其为成体干细胞生长的载体对血管内支架进行内皮化修饰，促进血管内支架植入后血管损伤处再内皮化过程，预防ISR的发生。

猪的小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa，SIS)是一种不含细胞成分，无免疫原性，生物可降解的，以胶原成分为主的天然细胞外基质(参见文献：Lantz GC，Badylak SF，Hiles MC，et al.小肠粘膜下层作为血管移植物.J Invest Surg 1993；6：297-310)。用物理方法去除猪小肠的粘膜层和外部的肌层和浆膜层，再经脱细胞和消毒、灭菌处理可以得到SIS(参见文献：Abraham G A，Murray J，Billiar K，et al.猪肠胶原层作为作为生物材料的评价.J Biomed MaterRes，2000，51：442-452)。SIS包含多种细胞外基质分子，例如纤粘连蛋白(fibronectin，FN)透明质酸(hyaluronic acid，HA)肝素(heparin)，硫酸软骨素A和B(chondroitin sulfates Aand B)，硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)。此外，SIS还含有多种生长因子，如成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowth factor，FGF)，转化生长因子-β(Transforming growth factor，TGF-β)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)(参见文献：Elias Brountzos，Dusan Pavcnik，Hans A.et al.悬浮的小肠粘膜下层静脉瓣的重塑一个关于宿主细胞来源评价的实验性研究.J.Vasc.Interv.Radiol.，Mar 2003；14：349.)。研究表明，SIS有益于组织重建。在降解和重吸收过程中，它可由宿主组织重塑。近来美国FDA(the United States Food andDrug Administration)已经同意将SIS作为软组织修复和皮肤创伤敷料的生物材料。

鉴于SIS的特有性质，本发明主要内容为构建一种成体干细胞覆膜血管内支架，它由血管内支架、覆于血管内支架上的SIS以及种植在SIS上的内皮祖细胞(Endothelial ProgenitorCells，EPC)构成。血管内支架为不锈钢(316L)支架、镍钛合金支架、钴基合金支架或生物可降解镁合金支架；小肠粘膜下层SIS为猪空肠粘膜下层；内皮祖细胞EPC为人脐血内皮祖细胞或人外周血内皮祖细胞。

本发明的技术思路是首先制备具有生物活性的SIS，分离人脐血内皮祖细胞，然后运用组织工程原理，进行细胞种植，使其形成内皮祖细胞的衬里，再通过一定的工艺使其覆盖修饰血管内支架，使支架内表面形成一光滑、平整的薄膜层，增强血管内支架的生物相容性和血液相容性。

具体步骤如下：

1 SIS的制备：SIS制备方法参见文献：Abraham G A，Murray J，Billiar K，et al.猪肠胶原层作为作为生物材料的评价.J Biomed Mater Res，2000，51：442-452.张开刚，曾炳芳，张长青.骨髓基质干细胞复合小肠粘膜下层体外构建组织工程骨膜的实验研究.中华外科杂志，2005，43(24)：1594-1597.

2 人脐血内皮祖细胞的分离与培养：人脐血内皮祖细胞分离与培养方法参见文献：易成刚，郭树中，张琳西，等.人脐血中血管内皮祖细胞体外扩增和鉴定的实验研究.中国美容医学，2004，13(1)：22-24.

3 在SIS上进行内皮祖细胞种植，获得载有内皮祖细胞的SIS：种植方法参见文献：BadylakS，Liang A，Record R，Tullius R，Hodde J.内皮细胞粘附小肠粘膜下层：一种无细胞的生物工程支架.Biomaterials 1999；20：2257-2263.

4 SIS覆膜血管内支架制作方法：需用的材料有橡胶棒、血管内支架、载有EPC的猪SIS、硝酸纤维素膜等，制作过程如下：

1)内腔覆膜支架的制作方法

①选择与血管内支架内径相当的橡胶棒；精确裁剪载有EPC的猪SIS(厚度约为180-200μm)，使其宽度略长于橡胶棒周长0.5～1.0mm，长度与血管内支架的长度等同；

②将载有EPC的猪SIS包裹橡胶棒，使SIS的细胞面与橡胶棒接触，采用可降解的聚丙烯纺织纤维单丝，连续缝合的方法缝合成管状；

③将步骤②中包裹有SIS的橡胶棒，插入血管内支架内腔，再用连续缝合的方法，将载有EPC的猪SIS覆于支架内腔；

④将步骤③中的支架连同橡胶棒浸入PBS溶液中，将橡胶棒与SIS分离。

2)外表面覆膜支架的制作方法

①选择与血管内支架外径相当的橡胶棒，精确裁剪载有EPC的猪SIS(厚度约为180-200μm)，使其宽度略长于橡胶棒周长0.5～1.0mm，长度与血管内支架的长度等同；

③将步骤②中包裹有SIS的橡胶棒浸入PBS溶液中，将橡胶棒与SIS分离；

④将血管内支架插入步骤③中得到的SIS管，采用可降解的聚丙烯纺织纤维单丝，用连续缝合的方法，使载有EPC的猪SIS覆于血管内支架外表面。

本发明的主要优点在于：①提出了一种新的覆膜支架的膜性材料来源，SIS不但无免疫原性，而且有益于损伤组织的重建，克服了现有生物膜材料的缺点；②SIS可进行内皮祖细胞或骨髓间充质干细胞的种植，使其在羊膜基质上分化为血管内皮细胞，以达到促进血管内支架损伤部位再内皮化的目的。

附图说明

下面结合附图对本发明进行进一步的说明：

图1：载有内皮祖细胞的SIS结构示意图。

图2：内腔覆载有内皮祖细胞的SIS血管内支架的工艺流程示意图。

图3：外表面覆载有内皮祖细胞的SIS血管内支架的工艺流程示意图。

图4：内腔覆SIS血管内支架的示意图。

图5：外表面覆SIS血管内支架的示意图。

具体实施方式

第一步：SIS的制备

1.物理处理方法：取屠宰4h内的新鲜猪小肠，将小肠的浆膜层和肌层用裹有纱布的刀柄去除，用40℃水持续冲洗干净。

2.把用物理方法处理的小肠在室温下经过一系列的化学方法处理。材料与溶液的体积比例保持在1∶100。

1)将机械方法制得的SIS浸泡在含有100mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)和10mmol/LNaOH溶液中(pH11～12)16h；

2)用去离子水将基质冲洗干净，在含有1mmol/L HCl和1mmol/L NaCl溶液中(pH 0～1)浸泡6～8h；

3)用去离子水冲洗基质后，在1mmol/L NaCl的磷酸缓冲液(PBS)中浸泡16h；

4)用去离子水冲洗基质后，在PBS溶液中(pH 7～7.4)浸泡2h；

5)再用去离子水冲洗基质2h(pH5.8～7.0)；

6)杀菌：将SIS在含0.1％的过氧乙酸的20％乙醇溶液中浸泡8h，用含0.05％叠氮化钠的PBS溶液清洗2h，然后-70℃冻干后用γ射线照射(25～35kGy)消毒。

第二步：人脐血内皮祖细胞的分离培养：

1.EPC的分离：人脐血均取自足月健康的产妇，每份采血约40-60ml，复方枸橼酸钠注射液(ACD-A)按1∶10加入抗凝。然后1∶1加入PBS稀释，EPC分离采用密度梯度离心法：将稀释的脐血加入Histopaque-1077细胞分离液，以400g/min在室温离心30min，吸出单核细胞层。然后用PBS清洗3次细胞吹成悬液后计数。

2.EPC的培养：脐血中分离的单核细胞以1-3×10⁵的密度接种于铺有纤维连接蛋白(FN)塑料培养皿中，培养液用M-199，含有20％的胎牛血清，牛脑垂体提取物(BPE)，100μg/ml的肝素，放入37℃，5％CO2、湿度100％的细胞培养箱，分别于培养的第4、7、10天换液。

3.EPC的鉴定：脐血中6分离的单核细胞以1-3×10⁵的密度接种于放有包被有FN的盖玻片的培养板，分别于培养的第4、7、10天取出细胞爬片，免疫组化法检测CD31、CD34及KDR的表达，免疫荧光法检测CD133的表达。

第三步：SIS的内皮祖细胞化修饰：将第二步中培养的内皮祖细胞在5％CO2培养箱中37℃孵育培养并传代。将制备好的SIS经PBS溶液水化后，滴加10％小牛血清预湿10min，吸出弃掉。将传代培养的内皮祖细胞用0.25％胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，以2.0～3.0×10⁴个/m1的细胞密度滴加2ml于制备好的SIS上。然后培养液，置入37℃，5％CO₂培养箱中培养。图1即为获得的载有内皮祖细胞的SIS结构示意图，上层为内皮祖细胞EPC 2，下层为小肠粘膜下层SIS 3。

第四步：成体干细胞覆膜血管内支架的构建：

需用的材料有橡胶棒、血管内支架、载有EPC的猪SIS、硝酸纤维素膜等，严格按照无菌原则，所有步骤均在超净工作台中进行操作，制作过程如下：

1.内腔覆膜支架的制作方法，参见图2：

①选择与金属血管内支架1内径相当的橡胶棒5；精确裁剪载有EPC的猪SIS 4(厚度约为180-200μm)，使其宽度略长于橡胶棒5周长0.5～1.0mm，长度与金属血管内支架1的长度等同；

②将载有EPC的猪SIS 4包裹橡胶棒5，使SIS的细胞面与橡胶棒接触，采用可降解的聚丙烯纺织纤维单丝，连续缝合的方法缝合成管状；

③将步骤②中包裹有SIS的橡胶棒5，插入金属血管内支架1内腔，再用连续缝合的方法，将载有EPC的猪SIS覆于支架内腔；

④将步骤③中的支架连同橡胶棒浸入PBS溶液中，将橡胶棒与SIS分离，得到如图4所示的内腔覆膜支架6。

2.外表面覆膜支架的制作方法，参见图3：

①选择与金属血管内支架1外径相当的橡胶棒5，精确裁剪载有EPC的猪SIS 4(厚度约为180-200μm)，使其宽度略长于橡胶棒5周长0.5～1.0mm，长度与金属血管内支架1的长度等同；

②将载有EPC的猪SIS4包裹橡胶棒5，使SIS的细胞面与橡胶棒接触，采用可降解的聚丙烯纺织纤维单丝，连续缝合的方法缝合成管状；

③将步骤②中包裹有SIS的橡胶棒5浸入PBS溶液中，将橡胶棒与SIS分离；

④将血管内支架1插入步骤③中得到的SIS管，采用可降解的聚丙烯纺织纤维单丝，用连续缝合的方法，使载有EPC的猪SIS覆于金属血管内支架外表面，得到如图5所示的外表面覆膜支架7。

当然，在本例中，也可采用人外周血内皮祖细胞为种植细胞，血管支架还可采用镍钛合金支架、钴基合金支架或生物可降解镁合金支架等，按照上述方法制备，同样可以获得需要的覆膜支架。

Claims

1、一种成体干细胞覆膜血管内支架，其特征在于：它由血管内支架(1)、覆盖在血管内支架上的小肠粘膜下层SIS(2)以及种植在小肠粘膜下层SIS上的成体干细胞内皮祖细胞EPC(3)构成；血管内支架(1)为不锈钢支架、镍钛合金支架、钴基合金支架或生物可降解镁合金支架；小肠粘膜下层SIS(2)为猪空肠粘膜下层；内皮祖细胞EPC(3)为人脐血内皮祖细胞或人外周血内皮祖细胞。

2、制备权利要求1所述的小肠粘膜下层覆膜血管内支架的方法，其步骤如下：

①制备猪的小肠粘膜下层SIS；

②在小肠粘膜下层SIS上种植内皮祖细胞EPC，获得载有内皮祖细胞EPC的猪小肠粘膜下层SIS；

③用载有内皮祖细胞EPC的猪小肠粘膜下层SIS覆盖修饰血管内支架，制成内腔覆膜支架或外表面覆膜支架。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：由步骤③获得内腔覆膜支架的步骤如下：

①选择与血管内支架内径相当的橡胶棒；精确裁剪载有内皮祖细胞EPC的猪小肠粘膜下层SIS使其宽度略长于橡胶棒周长0.5～1.0mm，长度与血管内支架的长度等同；

②将载有内皮祖细胞EPC的猪小肠粘膜下层SIS包裹橡胶棒，使猪小肠粘膜下层SIS的细胞面与橡胶棒接触，采用可降解的聚丙烯纺织纤维单丝，连续缝合的方法缝合成管状；

③将步骤②中包裹有猪小肠粘膜下层SIS的橡胶棒，插入血管内支架内腔，再用连续缝合的方法，将载有内皮祖细胞EPC的猪小肠粘膜下层SIS覆于支架内腔；

④将步骤③中的支架连同橡胶棒浸入PBS溶液中，将橡胶棒与猪小肠粘膜下层SIS分离，得到内腔覆膜支架。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：由步骤③获得外表面覆膜支架的步骤如下：

①选择与血管内支架外径相当的橡胶棒，精确裁剪载有内皮祖细胞EPC的猪小肠粘膜下层SIS，使其宽度略长于橡胶棒周长0.5～1.0mm，长度与血管内支架的长度等同；

③将步骤②中包裹有猪小肠粘膜下层SIS的橡胶棒浸入PBS溶液中，将橡胶棒与猪小肠粘膜下层SIS分离；

④将血管内支架插入步骤③中得到的猪小肠粘膜下层SIS管中，采用可降解的聚丙烯纺织纤维单丝，用连续缝合的方法，使载有内皮祖细胞EPC的猪小肠粘膜下层SIS覆于血管内支架外表面。