JP4469981B2 - 脱細胞化組織 - Google Patents
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Description
本発明は、組織を脱細胞化するための方法およびシステム、ならびにそのような脱細胞化方法によって調製された組織、組織グラフトなどを利用した医薬および治療方法に関する。
臓器(例えば、心臓、血管など)の移植に外来性組織を使用する際の主な障害は免疫拒絶反応である。同種異系移植片(または同種移植片、allograft)と異種移植片(xenograft)で起こる変化が最初に記述されたのは90年以上前のことである(Carrel A.,1907,J Exp Med 9:226-8;Carrel A.,1912.,J Exp Med 9:389-92;Guthrie CC.,1908,J Am Med Assoc;Calne RY.,1970,Transplant Proc 2:550;およびAuchincloss 1988,Transplantation 46:1)。動脈移植片の拒絶反応は、病理学的には移植片の拡張(破裂に至る)または閉塞のいずれかを招く。前者の場合、細胞外マトリクスの分解により生じ、一方、後者は血管内細胞の増殖により起こる(Uretsky BF,Mulari S,Reddy S,et al.,1987,Circulation 76:827-34)。
本発明では、本発明者らは、まったく新しい脱細胞化技術を開示する。臨床適用における問題となる毒性の界面活性剤を使用しない細胞成分を除去するための新たな方法を提供する。本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、界面活性剤を使用しない脱細胞化のための方法を開発することに成功した。
1.脱細胞化組織であって、
A)上記組織の細胞残存率は、生体内において免疫反応を惹起するレベル未満であり、かつ
B)上記組織は、上記組織が未処理状態で有する機能を発揮するのに支障があるような損傷を受けていない、
脱細胞化組織。
2.上記組織の細胞残存率は、30%以下である、項目1に記載の脱細胞化組織。
3.上記組織の組織損傷率は、30%以下である、項目1に記載の脱細胞化組織。
4.上記組織は、臨床適用することができる組織強度を有する、項目1に記載の脱細胞化組織。
5.上記組織は、上記組織が未処理状態の組織強度の80%以上の組織強度を有する、項目1に記載の脱細胞化組織。
6.上記組織は、上記組織が未処理状態のβ値の80%以上の組織強度を有する、項目1に記載の脱細胞化組織。
7.20以上のβ値の組織強度を有する、項目1に記載の脱細胞化組織。
8.上記組織は、管状組織である、項目1に記載の脱細胞化組織。
9.上記組織は、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨から選択されるものの組織である、項目1に記載の脱細胞化組織。
10.上記組織が未処理状態で有する機能を発揮するのに支障があるような損傷を受けていない上記状態は、細胞外マトリクスが実質的に残存することを包含する、項目1に記載の脱細胞化組織。
11.上記細胞外マトリクスの残存率は、少なくとも約50%である、項目10に記載の脱細胞化組織。
12.上記組織は、哺乳動物由来である、項目1に記載の脱細胞化組織。
13.上記組織は、ヒト由来である、項目1に記載の脱細胞化組織。
14.上記組織は、ブタ由来である、項目1に記載の脱細胞化組織。
15.組織グラフトであって、
A)細胞残存率が、生体内において免疫反応を惹起するレベル未満であって、未処理状態で有する機能を発揮するのに支障があるような損傷を受けていない、脱細胞化された組織であって、所望の組織の構造が形成されている、脱細胞化組織、
を含む、組織グラフト。
16.上記組織グラフトは、細胞を有する、項目15に記載の組織グラフト。
17.上記細胞は、レシピエント由来の細胞である、項目16に記載の組織グラフト。
18.上記細胞は、上記組織と同じ種の生物由来である、項目16に記載の組織グラフト。
19.上記組織グラフトは、細胞を有しない、項目15に記載の組織グラフト。
20.上記脱細胞化組織は、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨からなる群より選択される器官の組織である、項目15に記載の組織グラフト。
21.上記組織は、哺乳動物由来である、項目15に記載の組織グラフト。
22.上記組織は、ヒト由来である、項目15に記載の組織グラフト。
23.上記細胞は、血管内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、血球ならびにこれらに分化する前駆細胞および体性幹細胞からなる群より選択される、項目15に記載の組織グラフト。
24.膜状組織グラフトであって、
A)細胞残存率が、生体内において免疫反応を惹起するレベル未満であって、未処理状態で有する機能を発揮するのに支障があるような損傷を受けていない、脱細胞化された組織であって、所望の組織の構造が形成されている、脱細胞化組織、
を含む、膜状組織グラフト。
25.上記組織の組織損傷率は、30%以下である、項目24に記載の膜状組織グラフト。
26.上記組織グラフトは、細胞を有する、項目24に記載の膜状組織グラフト。
27.上記細胞は、レシピエント由来の細胞である、項目26記載の膜状組織グラフト。
28.上記細胞は、上記組織と同じ種の生物由来である、項目26に記載の膜状組織グラフト。
29.上記組織グラフトは、細胞を有しない、項目26に記載の膜状組織グラフト。
30.脱細胞化組織を生産する方法であって、
1)組織を提供する工程;および
2)上記組織を、ミセル化していない状態の両親媒性分子を含む溶液に浸す工程、
を包含する、方法。
31.さらに、
3)上記組織を洗浄する工程、
を包含する、項目30に記載の方法。
32.上記洗浄は、PBSで行われる、項目31に記載の方法。
33.上記両親媒性分子は、1,2−エポキシドポリマーである、項目30に記載の方法。
34.上記両親媒性分子は、ポリエチレングリコール(PEG)である、項目30に記載の方法。
35.上記PEGの平均分子量は、200と6000との間である、項目34に記載の方法。
36.上記PEGの平均分子量は、1000と2000との間である、項目34に記載の方法。
37.上記PEGの平均分子量は、1500と2000との間である、項目34に記載の方法。
38.上記PEGの平均分子量は、1000以下である、項目34に記載の方法。
39.上記浸す工程は、30分間〜60分間行われる、項目30に記載の方法。
40.上記浸す工程は、物理的な処理を包含する、項目30に記載の方法。
41.上記洗浄する工程は、3日間〜5日間行われる、項目31に記載の方法。
42.上記両親媒性分子は、生体適合性である、項目30に記載の方法。
43.上記組織は、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨からなる群より選択されるものの組織である、項目30に記載の方法。
44.上記組織は、哺乳動物由来である、項目30に記載の方法。
45.上記組織は、ヒト由来である、項目30に記載の方法。
46.さらに、
4)化学的処理を行う工程、
を包含する、項目30に記載の方法。
47.上記化学的処理は、DNaseによる処理である、項目46に記載の方法。
48.上記化学的処理は、DNaseIによる処理である、項目46に記載の方法。
49.さらに細胞を播種する工程を包含する、項目30に記載の方法。
50.項目30に記載の方法によって得られる、脱細胞化組織。
51.組織の再生方法であって、
a)細胞残存率が、生体内において免疫反応を惹起するレベル未満であって、未処理状態で有する機能を発揮するのに支障があるような損傷を受けていない、脱細胞化組織を、生体内に提供する工程;および
b)上記生体内で組織再生が生じるに十分な時間インキュベートする工程、
を包含する、方法。
52.上記脱細胞化組織に細胞を提供する工程をさらに包含する、項目51に記載の方法。
53.上記細胞は、上記生体由来である、項目52に記載の方法。
54.上記細胞は、上記生体内に存在する、項目52に記載の方法。
55.上記細胞とは、上記生体と同種異系宿主由来である、項目52に記載の方法。
56.上記細胞とは、上記生体と異種宿主由来である、項目52に記載の方法。
57.上記細胞は、上記生体から予め単離したものである、項目52に記載の方法。
58.上記細胞は、血管細胞または血管様細胞である、項目52に記載の方法。
59.細胞分化を誘導する生理活性物質を上記生体に提供する工程をさらに包含する、項目51に記載の方法。
60.上記生理活性物質は、上記生体内由来かまたは生体外由来である、項目59に記載の方法。
61.上記生理活性物質は、核酸形態またはポリペプチド形態で提供される、項目59に記載の方法。
62.上記生理活性物質は、HGF、VEGF、FGF、IGF、PDGFおよびEGFからなる群より選択される、項目59に記載の方法。
63.上記組織は、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨からなる群より選択されるものの組織である、項目51に記載の方法。
64.組織グラフトを生産する方法であって、
1)細胞残存率が、生体内において免疫反応を惹起するレベル未満の組織であって、上記組織が未処理状態で有する機能を発揮するのに支障があるような損傷を受けていない、脱細胞化組織を生体内に提供する工程;
2)上記脱細胞化組織に上記生体の自己細胞を侵入させる工程;および
3)上記細胞の分化が生じるに十分な時間インキュベートする工程、
を包含する、方法。
65.上記細胞は、血管細胞または血管様細胞である、項目67に記載の方法。
66.上記組織は、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨からなる群より選択されるものの組織である、項目64に記載の方法。
67.上記脱細胞組織は、細胞をさらに含む、項目64に記載の方法。
68.上記脱細胞組織は、自己由来である、項目64に記載の方法。
69.上記脱細胞組織は、同種異系宿主由来である、項目64に記載の方法。
70.上記脱細胞組織は、異種宿主由来である、項目64に記載の方法。
71.上記細胞は、自己由来である、項目67に記載の方法。
72.上記細胞は、同種異系宿主由来である、項目67に記載の方法。
73.上記細胞は、異種宿主由来である、項目67に記載の方法。
74.さらに、
4)上記細胞の分化を誘導する生理活性物質を提供する工程、
を包含する、項目64に記載の方法。
75.上記生理活性物質は、造血活性を有するサイトカインである、項目74に記載の方法。
76.項目64に記載の方法によって生産された、組織グラフト。
77.組織または臓器移植を必要とするかまたは上記危険にある被験体の処置または予防の方法であって、
1)細胞残存率が、生体内において免疫反応を惹起するレベル未満であって、未処理状態で有する機能を発揮するのに支障があるような損傷を受けていない、脱細胞化組織、または上記脱細胞化組織を含む組織グラフトを提供する工程;および
2)上記脱細胞化組織または組織グラフトを被験体に移植する工程、
を包含する、方法。
78.上記組織は、細胞をさらに含む、項目77に記載の方法。
79.上記細胞は、レシピエント由来の細胞である、項目78に記載の方法。
80.上記細胞は、上記組織と同じ種の生物由来である、項目78に記載の方法。
81.上記組織は、細胞を有しない、項目78に記載の方法。
82.上記組織は、上記被験体由来である、項目77に記載の方法。
83.上記組織は、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨から選択されるものの組織である、項目77に記載の方法。
84.上記被験体は、哺乳動物である、項目77に記載の方法。
85.上記被験体は、ヒトである、項目77に記載の方法。
86.臓器移植のための医薬であって、
A)細胞残存率が、生体内において免疫反応を惹起するレベル未満であって、未処理状態で有する機能を発揮するのに支障があるような損傷を受けていない、脱細胞化組織、または上記脱細胞化組織を含む組織グラフト、
を含む、医薬。
87.上記組織は、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨から選択されるものの組織である、項目86に記載の医薬。
88.上記細胞は、哺乳動物由来である、項目86に記載の医薬。
89.上記組織は、ヒト由来である、項目86に記載の医薬。
90.上記組織は、上記移植を必要とする被験体由来である、項目86に記載の医薬。
91.上記組織は、ブタ由来である、項目86に記載の医薬。
92.細胞残存率が、生体内において免疫反応を惹起するレベル未満であって、未処理状態で有する機能を発揮するのに支障があるような損傷を受けていない、脱細胞化組織、または上記脱細胞化組織を含む組織グラフトの、臓器移植のための医薬を製造するための使用。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞(例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など、独語の場合の「ein」、「der」、「das」、「die」などおよびその格変化形、仏語の場合の「un」、「une」、「le」、「la」など、スペイン語における「un」、「una」、「el」、「la」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など)は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書(定義を含めて)が優先する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において使用される「再生」(regeneration)とは,個体の組織の一部が失われた際に残った組織が増殖して復元される現象をいう。動物種間または同一個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動する。ヒト組織の多くはその再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望めない。大きな傷害では、失われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し,不完全に組織が再生され機能が回復できない状態で終わる不完全再生が起こり得る。この場合には,生体内吸収性材料からなる構造物を用いて、組織欠損部への増殖力の強い組織の侵入を阻止することで本来の組織が増殖できる空間を確保し,さらに細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を高める再生医療が行われている。この例として、軟骨、骨および末梢神経の再生医療がある。神経細胞および心筋は再生能力がないかまたは著しく低いとこれまでは考えられてきた。近年、これらの組織へ分化し得る能力および自己増殖能を併せ持った組織幹細胞(体性幹細胞)の存在が報告され、組織幹細胞を用いる再生医療への期待が高まっている。胚性幹細胞(ES細胞)はすべての組織に分化する能力をもった細胞であり、それを用いた腎臓、肝臓などの複雑な臓器の再生が試みられているが実現には至っていない。
Ln(P/Ps)=β(D/Ds−1) (1)
で算出することができる。PsおよびDsは、100mmHgでの標準値を示す。PおよびDは、各々圧力および直径の値を示す。
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
(材料および方法)
(PEGによる脱細胞化)
ブタ頚動脈をHybrid(混合種)(Labo Products Co.Ltd.,Osaka,Japan)から、およびラット大動脈をSDラット(雄性、5週齢、日本動物,Tokyo,Japan)から、滅菌条件下で調製した。動物使用の倫理に関しては,大阪大学の動物実験の倫理に関する規定に従って行った。
1)(洗浄)組織を、生理食塩水で、1時間4℃にて洗浄した。
1)(洗浄)組織を、プロテアーゼ阻害剤(PROTEASE INHIBITOR COCKTAIL;SIGMA P2714)および20mM EDTAを含む生理食塩水に入れ、24時間37℃にて洗浄した。
1)(洗浄)組織を、生理食塩水で、1時間4℃にて洗浄した。
3)(洗浄)その後、4℃にてシェーカーにて24時間ごとに3回PBSを交換することによって洗浄した。
血管移植片のパラフィン切片(厚さ3μm)を調製し、そしてヘマトキシリン−エオシン染色を行って、細胞外マトリクスの同定を行った。基底膜の成分であるI/IV型コラーゲンを同定するために、免疫組織化学的染色法を用いた。SDラット(雄性、5週齢、Nippon Animal Co.Ltd.東京、日本)の大動脈を4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結保護した。凍結切片(5μm厚)を調製し、PBS(−)で3時間透過性にし、そしてPBS(−)中の1%BSAで1時間室温でブロッキングした。ついで、この切片を一次抗体(抗ラットコラーゲン抗体、コスモバイオ、東京、日本)とともにインキュベートし、そしてFITCと結合体化した二次抗体(抗ヒツジIg抗体;コスモバイオ、東京、日本)とインキュベートした。画像は、Zeiss LSM510共焦点顕微鏡を用いて得た。
ラット内皮細胞(EC)の調製は、以前に記載されるように行った(Fenselan A.,Mello RJ、Cancer Res.1976、36,3269−3273)。簡潔に説明すると、5週齢のSDラット(180−200g)を二酸化炭素吸入により殺傷し、大動脈を取り出した。大動脈を、PBS(−)中の3mg/mlコラゲナーゼに、37℃で30分間に浸した。生じた懸濁液を900×gで4分間遠心分離し、次いで細胞を10mlのDMEM+10%ウシ胎仔血清中に再懸濁した。細胞を、4×105細胞/mlに入れ、37℃で5%CO2中でインキュベートした。
ラット内皮細胞(EC)を、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Gibco BRL,Life Technologies Inc.Rockville,MD,USA)、1%非必須アミノ酸(Gibco BRL,Life Technologies Inc.Rockville,MD,USA)および抗生物質(100ユニット ペニシリン、0.1mgストレプトマイシン、0.25μg/ml アムホテリシンB;Gibco BRL,Life Technologies Inc.Rockville,MD,USA)を含むDMEM(Earle塩(+)L−グルタミンを補充した最小必須培地、Gibco BRL,Life Technologies Inc.Rockville,MD,USA))で37℃にて5%CO2雰囲気でFalcon組織培養ディッシュ(Falcon 3003,Beckton−Deckinson Co.Ltd.,New Jersey,USA)中で維持した。標識するために、細胞を3回リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、そして12mlの培地を加えた。ECを5μg/mlの細胞追跡用蛍光色素であるDiI(Molecular Probes,Inc,Eugene OR USA)で37℃で30分間標識し、3回PBS(−)で洗浄した。このように標識したECをすぐに以下のアッセイに用いた。
脱細胞化血管移植片を、ナイロン糸の両側に結合させた。細胞懸濁物を、26ゲージの針を装着した10mlの使い捨てシリンジを用いて血管に流し込んでECを導入した。脱細胞化移植片を、室温で1時間回転させながら1.0×107細胞/mlの密度で播種した。この組織培養物を、37℃で95%空気および5%CO2の加湿雰囲気で維持した。これらの組織を、上述の10%FBSおよび抗生物質を補充したDMEMで培養した。
圧力−直径(P−D)関係の測定を、Hiromichi SonodaおよびKeiichi Takamizawa(Hiromichi Sonoda et al.,J Biomed Mater Res 2001;55:266−276))の方法に従って実施した。動脈切片の一端を固定されたステンレス鋼コネクタにカニューレ接続し、他端をスライディングコネクタにカニューレ接続した。血管切片を加圧腔内Krebs−Ringer溶液で徐々に膨潤させた。血管の中部で血管の外径をテレビシステム(C1000−16;Hamamatsu Photonics)および幅分析器(HTV−C1170;Hamamatsu Photonics)を用いてモニターした。腔内圧力を、圧力トランス(6M92;NECSanei,Tokyo,Japan)を用いて同時に記録した。
図1(c)および(d)に示されるように、天然の組織の細胞質成分は、1g/ml PEG(平均分子量1000)の水溶液により取り除かれていた。細胞膜の流動性は、高密度のPEG水溶液により顕著に改善された。図1(c)および(d)において示されるように、細胞膜およびDNA成分以外の細胞質成分の除去が観察された。DNA成分の沈降が確認されたからである。これらの成分が凝集することは、PEG水溶液がDNAにアクセス可能であることによって説明される。このことは、細胞膜および細胞質ゾルの抽出が容易となる要因である。組織移植片において生じる恒常的なDNA成分の分解物および溶解物は、DNaseIによって容易に除去され得る。このことは、HE染色画像によって、図1(e)および(g)において示されるように明らかに観察される。細胞成分が除去されたことに起因して、空洞形成が、弾力性プレートの間に観察された。この空洞形成が細胞外マトリクスの分解を抑えるようである。特に、この処理は、コラーゲン成分に対する効果が見かけ上低い。
細胞残存率を、100μm×100μmの面積中にある核数を顕微鏡を使用して計数することによって算出した。具体的には、処理前に同じサンプル中の上記面積中にある核数を顕微鏡を使用して計数し、処理後にも同様に計数し、処理後のサンプル中の核数を処理前の核数で除し100倍することにより、細胞残存率(%)を算出した。結果を以下の表1に示す。
組織損傷率は、一視野を100μm×100μmごとのユニットに区切り、ユニットを単位としてエラスチン断裂部位がある場合にカウントして算出した。一視野あたり24ユニットが存在した。エラスチン断裂は、x/24で表した。xは、ユニット中に断列がある場合に計数氏、例えば、全く断列が確認できない場合(未処理のコントロールなど)、0/24として算出して0%とした。結果を以下の表1にまとめる。
組織強度は、β値として表した。上述のP−D関係の曲線を作成した後、以下の方程式によってβ値を算出した。
ここで、Pは測定された圧力であり、Psは標準圧力(ここでは、100mmHgである)であり、Dは測定された直径であり、Dsは100mgHgの圧力で測定された直径を示す。β値は、増加すればするほど、剛性が高いことを示す。このようにして得たβ値の結果を以下の表2に示す。SDS処理した脱細胞化組織もTriton(登録商標)と同様のβ値を有していた(データ示さず)。
次に、破断加重を調べた。破断加重は、脱細胞化処理ブタ大動脈弁の大動脈壁部分を幅5mm,長さ30mmの短冊状にし,引張試験機(TENSILON RTC1150A:エーアンドディー社)で試験速度5mm/minで引張り,最大破断点加重を測定した(Shinoka T,Mayer JE.Tissue engineering heart valve leaflets.Circulation.1997;96(suppl II):II−102−II−107;Shum−Tim D,Mayer JE.Tissue engineering of autologus aorta using a new biodegradable polymer.Ann Thorac Surg.1999;68:2298−2304)。その結果、生体組織では1.6±0.9kgfであるのに対して、PEG処理では、1.7±0.6kgfであった。また、界面活性剤処理のものは、これらの値より著しく減少していた。従って、破断加重というパラメータからみても、本発明によるPEG処理では物理的特性が損傷されていないことが実証された。
ポリエチレングリコールは、典型的な両親媒性および高い生体適合性を有するポリマーである。ポリエチレングリコールは、その特徴的な分子特性によって種々の有用性があることが知られている。例えば、ポリエチレングリコール溶液は、生物学的実験においてDNAの精製に使用される。別の例では、ポリエチレングリコールは、臨床等級のペプチド結合体に使用される(Veronese FM,Biomaterials,2001,22:405−417;Monfardini C.,Veronese FM,Bioconjugate Chem.1998、9:418−450などを参照のこと)。ポリエチレングリコールは、ハイブリドーマ製造において細胞融合のために使用されているが、高密度のPEG水溶液によって組織の細胞質成分を含む細胞膜が顕著に流動化され、除去されるという本発明者らの結果は予想外であった。脱細胞化異種移植片および同種異系移植片の組織を、界面活性剤(例えば、Tris(登録商標)、SDSなど)を用いる方法によって生産することが可能である。これら界面活性剤は、医療用途への適用が限定または禁止されていることから、用いないことが好ましい。しかし、これらの移植片の臨床適用において、異種移植片および同種異系移植片の組織の生産は、毒性の界面活性剤を使わず、かつ、グルタルアルデヒドによる固定も使わずに行われることが望ましいと考えられる。本発明の方法の利点のひとつは、毒性の界面活性剤を用いることなく、より効率のよい脱細胞化が行われることである。
(方法)
(免疫学的応答)
Lewisラットの背部皮下に脱細胞化処理ブタ大動脈弁(PEG/DNasel処理弁および上述の第一世代(SDS,NP−40)処理弁の大動脈壁部分(1x1cm)を移植し,1週間後屠殺して、炎症細胞浸潤の程度をスコア化し評価した。本実施例においてコントロールとしてブタ生弁およびFreeStyle弁(グルタルアルデヒト固定/AOA処理、従来使用されている生体弁)で比較検討した。
ラット皮下に移植した検体を2ヵ月後に採収し、von Kossa染色で石灰沈着を評価した。また、原子吸光分光計(Atomic absorption spectrometry)で組織内Ca濃度を測定した。Ca濃度は、濃塩酸(または濃酸)に組織を入れて、加熱および溶解させる。その後、原子吸光測定を行う。その溶液を希釈し、高温プラズマ中に噴霧し、燃焼時に発生するスペクトルの元素特異的吸収波長(Caは393.366nm)より定量測定を行った。
第一世代脱細胞化プロセスで得られた大動脈壁組織の一部をイヌ下行大動脈に移植した。
脱細胞化組織およびコントロール組織を生後3週間のラットに移植して60日間観察した。摘出時に組織学的評価のために標本を取った。ヘマトキシン−エオジン(H&E)法で染色して全体構造を評価し、von Kossa染色により石灰化の評価を行った。結果を図7に示す。
各弁の生体組織での反応の比較
イヌ大腿大動脈に脱細胞化処理ブタの前腕の動脈(PEG/DNaseI処理血管およびSDS/NP−40処理血管)を移植し,10日後そのブタを屠殺して,炎症細胞浸潤の程度を比較検討した。
PEG/DNaseI処理血管とSDS/NP−40処理血管のいずれにも軽い炎症反応のみであり、全体的な組織構造は損なわれていないことが分かった。図11にその結果をしめす。しかしながら、PEG/DNaseI処理血管では移植後10日目にもかかわらず血管内皮を認め、血管壁に筋細胞様の核を認めた。これは脱細胞化された血管が自己細胞に置換されたことを示す。
次に、ブタから心膜を取り出し、実施例1に記載のように界面活性剤およびポリエチレングリコール溶液で処理した。処理した心膜について細胞残存率および組織損傷率を測定したところ、組織損傷率が30%未満でかつ細胞残存率が10%未満の脱細胞化心膜が得られた。
雄性Lewis系統ラットを本実施例において用いた。National Society for Medical Researchが作成した「Principles of Laboratory Animal Care」、およびInstitute of Laboratory Animal Resourceが作成しNational Institute of Healthが公表した「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」(NIH Publication No.86-23,1985改訂)に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って2群に分けた。C群(無治療群、n=5)とS群(脱細胞心膜移植群、n=5)。脱細胞心膜は左前下降枝結紮2週後に梗塞部位に直接移植した。
梗塞モデル作成2週後、移植後4週、8週後に、心臓超音波(SONOS 5500, Agilent Technologies社製)にて心機能を測定した。12-MHzのtransducerを用い、左側方より、左室が最大径を示す位置で、短軸像を描出した。B-modeにて、左室収縮末期面積(end systolic area)、M-modeにて、左室拡張末期径(LVDd)、左室収縮末期径(LVDs)、左室前壁厚(LVAWTh)を測定し、LVEF、LVFSを算出した。
心筋細胞移植後、8週間後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、10%ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行った。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン染色、マッソン-トリクローム染色を行った。また同時期の凍結切片を作成し、FactorVIII免疫染色を行った(図22)。
移植の4週間後、心エコー検査を行ったところ、S群における駆出率(示さず)および左室短縮率(示さず)は、他の3つの群と比較して有意な改善を示した。これらの機能改善は、移植後8週間まで維持された。
S群は、C群と比較して、LV壁の厚みにおける有意な増加およびLV断面積の減少を示した。顕微鏡検査では、新たに形成された心臓組織が、LV壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことを見出した。
次に、ブタから硬膜を取り出し、実施例1に記載のように界面活性剤およびポリエチレングリコール溶液で処理した。処理した硬膜について細胞残存率および組織損傷率を測定したところ、組織損傷率が30%未満でかつ細胞残存率が10%未満の脱細胞化硬膜が得られた。
最近、再生医療の高まりにより、小口径人工血管の開発が注目されている(Kaushal S, Amiel GE, Guleserian KJ, Shapira OM, Perry T, Sutherland FW, Rabkin E, Moran AM, Schoen FJ, Atala A, Soker S, Bischoff J, Mayer JE Jr.Nat Med 7 (2001) 1035-40)。現在、小口径人工血管の作製方法は、1)生体内で退縮可能なポリマーを枠組みとしてレシピエントの自己細胞を接着させる手法と、2)ブタ動脈などの生体血管を脱細胞化し、それを枠組みとしてレシピエントの自己細胞を接着させる手法に大別される。後者においては安定した枠組みの供給が可能という利点を有するが、脱細胞化、細胞の接着法ともに確立されたものはなく種々の方法(Bader A, Schilling T, Teebken OE, Brandes G, Herden T, Steinhoff G, Haverich A.,Eur J Cardiothorac Surg, 14 (1998) 279-84.;O'Brien MF, Goldstein S, Walsh S, Black KS, Elkins R, Clarke D.,Semin Thorac Cardiovasc Surg, 11 (1999) 194-200;Steinhoff G, Stock U, Karim N, Mertsching H, Timke A, Meliss RR, Pethig K, Haverich A, Bader A.,Circulation, 102 (2000) 50-5.)が提唱されている。生体弁開発の領域では石灰化の主たる規定因子であるグルタルアルデヒド固定を用いない生体弁の開発が求められる中、近年の組織細胞工学の著しい進歩に伴い、その手法を応用し従来の生体弁に比べさらに優れた耐久性を有する生体弁の開発が試みられている。しかし、小口径人工血管の領域ではその脱細胞処理によるドナー血管の特性の変化に関しては未だ明らかになっていない点も多い。
Hybrid(混合種)(Labo Products Co.Ltd.,Osaka,Japan)から滅菌条件下で調製した。動物使用の倫理に関しては,大阪大学の動物実験の倫理に関する規定に従って行った。
PEG/DNaseI処理血管は術後5日目からグラフト内に核の存在がHematoxylin-Eosin染色において確認され、術後10日目には正常血管と同等の細胞数を有するようになった(図12A、図13B)。エラスチンの確認のためvictria blue染色を施行したところ、脱細胞した血管においてもエラスチンの存在が確認され(図12C、図16、図17)、コラーゲンの染色方法であるsirius redを用いた免疫染色では経時的にエラスチン間にコラーゲンが充満されていることが確認された(図12C、図16)。血管内皮細胞は第VIII因子染色により、術後2日目より確認され、一層の内皮細胞が術後20日目まで確認できた(図18)。また、術後10日目では確認できなかったα-アクチン陽性細胞が術後20日目には一部に確認された(図19)。
長期耐久性を有する脱細胞化人工血管の開発は現存の人工血管の欠点を克服する新たな人工血管として、心臓外科においては重要な意義を有している。今回、我々が行ったPEG/DNaseI処理による脱細胞化人工血管は基本的な血管の枠組み、足場(Scaffold)に自己組織、特に内皮細胞を生着させることにより作成され、炎症反応や免疫反応を減少させ、優れた抗血栓性、抗石灰化特性を呈し、長期耐久性を有した脱細胞化人工血管の開発を可能にし得る方法である。脱細胞化人工血管としては安定した枠組みの供給が可能という利点を有することや生体弁材料としての使用歴から脱細胞化したブタ動脈が好んで用いられているが、脱細胞化の技術は開発途上であり、また脱細胞化によるドナー動脈の特性の変化に関しては未だ明らかになっていない点も多い。また種々の研究(Cohn LH, Collins JJ Jr, DiSesa VJ, Couper GS, Peigh PS, Kowalker W, Allred E.,Ann Surg, 210 (1989) 435-42.;Khan SS, Chaux A, Blanche C, Kass RM, Cheng W, Fontana GP, Trento A.,Ann Thorac Surg, 66 (1998) S35-9;Walley VM, Keon CA, Khalili M, Moher D, Campagna M, Keon WJ.Ionescu-Shiley , Ann Thorac Surg, 54 (1992) 111-6;Walley VM, Keon CA, Khalili M, Moher D, Campagna M, Keon WJ.Ionescu-Shiley ,Ann Thorac Surg, 54 (1992) 117-22.)により生体弁においては石灰化がその耐久性を大きく左右する因子であることが判明してきたが未だその詳細は明らかではない。小口径血管領域では、細胞親和性が良好であることに期待し、動物の血管、尿管を脱細胞化し、内皮細胞を播種する試みがなされているが、播種細胞の親和性を重視し脱細胞化しだけでは植え込み後の炎症反応、弾性繊維のひ薄化を回避できない結果になっている(Courtman DR, J Biomed Mater Res.55 (2001):576-86)。
Claims (14)
- A)組織を、ポリエチレングリコール(PEG)を含む溶液に浸す工程;及び
B)組織に対してDNaseIによる処理を行う工程
を包含する方法によって得られる、脱細胞化組織。 - 前記方法は
C)前記組織を洗浄する工程、
をさらに包含する、請求項1に記載の脱細胞化組織。 - 前記洗浄は、PBSで行われる、請求項2に記載の脱細胞化組織。
- 前記PEGの平均分子量は、200と6000との間である、請求項1〜3のいずれかに記載の脱細胞化組織。
- 前記PEGの平均分子量は、1000と2000との間である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記PEGの平均分子量は、1500と2000との間である、請求項1〜3のいずれかに記載の脱細胞化組織。
- 前記PEGの平均分子量は、1000以下である、請求項1〜3のいずれかに記載の脱細胞化組織。
- 前記浸す工程は、30分間〜60分間行われる、請求項1〜7のいずれかに記載の脱細胞化組織。
- 前記浸す工程は、物理的な処理を包含する、請求項1〜8のいずれかに記載の脱細胞化組織。
- 前記洗浄する工程は、3日間〜5日間行われる、請求項2〜9のいずれかに記載の脱細胞化組織。
- 前記組織は、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨からなる群より選択されるものの組織である、請求項1〜10のいずれかに記載の脱細胞化組織。
- 前記組織は、哺乳動物由来である、請求項1〜11のいずれかに記載の脱細胞化組織。
- 前記組織は、ヒト由来である、請求項1〜11のいずれかに記載の脱細胞化組織。
- 前記方法がさらに細胞を播種する工程を包含する、請求項1〜13のいずれかに記載の脱細胞化組織。
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