TW202233828A - 去細胞化組織組成物 - Google Patents

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小原春樹
木村拓矢
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Abstract

本發明目的係提供一種顯示適切的強度及良好的組織再生之去細胞化組織。 前述課題可藉由一種去細胞化組織組成物來解決，該組成物係含有本發明之去細胞化組織，與(a)分子量：30,000～70,000及(b)等電點：pI6.00～9.00的蛋白質A。

Description

去細胞化組織組成物
本發明係有關於一種去細胞化組織組成物。
要移植取自他人或不同種動物之生物組織的移植片時，常有被移植者方組織對移植片產生排斥反應的問題。作為此種問題的解決方法，期望開發出人工組織。作為其材質，有人嘗試各種高分子，但因此等素材與生物組織的相容性較低，而有移植片與生物組織的接合部位處發生脫落或感染症的問題。 因此，為了提升與生物組織的相容性，有人開發出使用去細胞化組織作為移植片之技術，其中該去細胞化組織係由支持組織(細胞外基質，ECM)所構成，而該支持組織則是由生物組織移除細胞所殘留者。去細胞化係指對被移植者去除具抗原性之核酸等細胞成分，由此可避免免疫排斥。 去細胞化組織可透過使用例如含有界面活性劑之處理液，將生物組織去細胞化而製造(專利文獻1～3)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特表2005-514971號公報 [專利文獻2]日本特表2006-507851號公報 [專利文獻3]日本特表2005-531355號公報
[發明所欲解決之課題]
於再生醫療中使用去細胞化組織時，重要的是無排斥反應，而且可迅速進行組織的再生。從而企望開發出具有適切的強度，且顯示良好的組織再生之去細胞化組織。 從而，本發明目的在於提供一種顯示適切的強度及良好的組織再生之去細胞化組織。 [解決課題之手段]
本案發明人針對具有適切的強度及良好的組織再生之去細胞化組織致力研究的結果發現，意外的是，含特定蛋白質的去細胞化組織組成物具有優異的強度及細胞黏著性，可促進良好的組織再生。 本發明係基於此種見解者。 從而，本發明係有關於： [1] 一種去細胞化組織組成物，其係含有去細胞化組織，與(a)分子量：30,000～70,000及(b)等電點：pI6.00～9.00的蛋白質A； [2] 如[1]之去細胞化組織組成物，其進一步含有(a)分子量：3,000～15,000及(b)等電點：pI3.00～5.50的蛋白質B； [3] 如[1]或[2]之去細胞化組織組成物，其中前述蛋白質A的含量，相對於去細胞化組織組成物為0.01～5.0質量%； [4] 如[1]～[3]中任一項之去細胞化組織組成物，其中前述蛋白質B的含量，相對於去細胞化組織組成物為0.001～3.0質量%； [5] 如[1]～[4]中任一項之去細胞化組織組成物，其中蛋白質A及蛋白質B於組成物中的質量比為A：B=5：1～150：1； [6] 如[1]～[5]中任一項之去細胞化組織組成物，其中每單位乾燥質量的DNA含量，相對於去細胞化組織組成物為0.0300質量%以下； [7] 如[1]～[6]中任一項之去細胞化組織組成物，其中前述蛋白質A為膜聯蛋白；及 [8] 如[1]～[7]中任一項之去細胞化組織組成物，其中前述蛋白質B為源自於纖維調節蛋白之胜肽。 [發明之效果]
根據本發明之去細胞化組織組成物，由於顯示適度的強度及優良的細胞黏著性，而能夠於活體內顯示良好的組織再生力(例如細胞的誘因效果及分化誘導效果)。又，透過具有優良的強度，於施作時可顯示優良的處理性能。
[實施發明之形態]
本發明之去細胞化組織組成物係含有去細胞化組織，與(a)分子量：30,000～70,000及(b)等電點：pI6.00～9.00的蛋白質(以下有稱為蛋白質A)。本發明之去細胞化組織組成物亦可含有(a)分子量：3,000～15,000及(b)等電點：pI3.00～5.50的蛋白質(以下有稱為蛋白質B)。
《去細胞化組織》 去細胞化組織係由源自動物之組織去除細胞成分而得之組織，係以彈性蛋白、膠原蛋白(I型、IV型等)、層黏連蛋白等細胞外基質成分為主成分的組織。其活體埋植時的排斥反應較低，可達移植對象之細胞的固定及重建，而發揮細胞支架之機能。 獲得本發明之組成物所含去細胞化組織的方法可使用向來週知之方法。於本發明中，去細胞化之方法，只要可獲得本發明之效果則不特別限定，可舉出例如採高靜水壓處理之方法、採冷凍-解凍處理之方法、使用界面活性劑之方法、藉由超音波處理進行處理之方法、使用酵素之方法或以高張電解質溶液進行處理之方法、採物理攪拌之方法、高張溶液低張溶液法、採使用蛋白分解酵素或核酸分解酵素等的酵素處理之方法、採醇溶劑之處理等；可組合此等的2種以上，而為了有效獲得去細胞化組織組成物，且為了發揮本案發明之效果，較佳為採高靜水壓處理之方法。
使用於本發明之去細胞化組織組成物的去細胞化組織，只要是源自脊椎動物之生物組織，則不特別限定，而由排斥反應較少而言，較佳為源自哺乳類或鳥類之生物組織；而由容易取得而言，更佳為源自哺乳類家畜、鳥類家畜或人類之生物組織。哺乳類家畜可舉出牛、馬、駱駝、羊駝、驢、犛牛、綿羊、豬、山羊、鹿、羊駝、狗、貉、黃鼠狼、狐狸、貓、兔子、倉鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、松鼠、浣熊等。又，鳥類家畜可舉出鸚鵡科、鸚鵡、雞、鴨、火雞、鵝、珍珠雞、野雞、鴕鳥、鵪鶉、鴯鶓等。此等當中，由取得穩定性而言，較佳為牛、豬、兔子、人類的生物組織。
作為生物組織之部位，可使用在細胞外具基質構造之部位；此類部位可舉出例如肝臟、腎臟、輸尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃腺、食道、胃、小腸、大腸、肛門、胰臟、心臟、血管、脾臟、肺、腦、骨、脊髓、軟骨、精巢、子宮、輸卵管、卵巢、胎盤、角膜、骨骼肌、肌腱、神經、皮膚等。就生物組織之部位，由組織再生效果高而言，較佳為軟骨、骨、肝臟、腎臟、心臟、心膜、主動脈、皮膚、小腸黏膜下組織、肺、腦、內胸動脈或脊髓，更佳為心膜、內胸動脈、肝臟、軟骨、皮膚、小腸黏膜下組織或脊髓。
藉由前述採高靜水壓處理之方法而得到前述去細胞化組織時，係對活體來源組織於介質中施加50～1500MPa的靜水壓。基於充分進行去細胞化之觀點，施加之靜水壓較佳為50MPa以上；基於不需要可耐加壓之壓力容器、不需要大量能量，同時防止用於施加之介質為水性介質時生成冰，且生成的冰導致組織受損之觀點，較佳為1500MPa以下。施加之靜水壓更佳為80～1300MPa，再更佳為90～1200MPa，再更佳為95～1100MPa，再更佳為95～700MPa，基於發揮去細胞化效果、減菌效果及病毒去活化效果且容易施加之觀點，最佳為400～700MPa。
施加靜水壓所使用之介質可舉出水、生理食鹽水、注射用水、丙二醇或其水溶液、甘油或其水溶液、糖類水溶液等。緩衝液可舉出乙酸緩衝液、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、HEPES緩衝液、MES緩衝液等。此等介質亦可含有界面活性劑。
高靜水壓處理的溫度只要是不會生成冰，且不會因熱而損傷組織的溫度則不特別限定，由可順利進行去細胞處理且對組織的影響較少而言，較佳為0～45℃，更佳為4～37℃，最佳為15～35℃。高靜水壓處理的時間過短的話，無法充分進行細胞的破壞；較長時則會導致能量的浪費；由此，於高靜水壓處理中，維持目標施加壓力之時間較佳為1～120分鐘，更佳為5～60分鐘，再更佳為7～30分鐘。
經前述高靜水壓處理之組織較佳進行核酸分解酵素處理。核酸分解酵素係供去除來自經施加靜水壓之生物組織的核酸成分者，不特別限定，可舉出例如源自胰臟、源自脾臟或源自大腸菌的DNAse(例如DNaseI、DNaseII)。 核酸分解酵素可添加於前述高靜水壓處理所使用之介質(例如水、生理食鹽水、注射用液或緩衝液等)而使其作用。添加之酵素量係隨酵素的種類或單位數(U)之定義而異，只要是本業者則可適宜設定。若例如為DNaseI，只要以50～200U/mL使用即可。處理溫度亦隨所用核酸分解酵素而異，只要設定為例如1℃～40℃的溫度即可。處理時間亦不特別限定，可為例如1～120小時(較佳為1～96小時，更佳為1～48小時)，如為低溫時，可採長時間處理；如為高溫時則可為短時間之處理。
經前述高靜水壓處理之組織係經洗淨液洗淨。洗淨液可與高靜水壓處理之介質相同或相異。洗淨液較佳含有有機溶媒或螯合劑。有機溶媒可提升脂質的去除效率，螯合劑則可藉由使去細胞化組織中的鈣離子或鎂離子去活性，而防止本發明之粒子化去細胞化組織施用於患部時的石灰化。作為有機溶劑，由脂質之高去除效果而言，較佳為水溶性有機溶劑，宜為乙醇、異丙醇、丙酮、二甲基亞碸。螯合劑可舉出乙二胺四乙酸(EDTA)、氮基三乙酸(NTA)、二伸乙三胺五乙酸(DTPA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三伸乙四胺六乙酸(TTHA)、1,3-丙烷二胺四乙酸(PDTA)、1,3-二胺基-2-羥基丙烷四乙酸(DPTA-OH)、羥乙基亞胺基二乙酸(HIDA)、二羥乙基甘胺酸(DHEG)、二醇醚二胺四乙酸(GEDTA)、二羧甲基麩胺酸(CMGA)、3-羥基-2,2’-亞胺基二琥珀酸(HIDA)、二羧甲基天冬胺酸(ASDA)等亞胺基羧酸系螯合劑或其鹽；檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸等羥基羧酸系螯合劑或其鹽；此等螯合劑之鹽可舉出鈉鹽或鉀鹽。 洗淨溫度只要是不會因熱而對組織造成損傷的溫度則不特別限定，由洗淨性良好且對組織的影響較少而言，較佳為0～45℃，更佳為1～40℃，最佳為2～35℃。進行洗淨時，亦可視需求將洗淨液搖晃或攪拌。
藉由採冷凍-解凍處理之方法而得到前述去細胞化組織時，係重複進行以下步驟1次或2次以上(較佳為2～5次)：將活體來源組織保持於-80～-20℃(較佳為-80～-40℃)的溫度1～48小時(較佳為10～30小時)使其冷凍後，以20～37℃的溫度予以解凍。其後，宜進行核酸分解酵素處理，核酸分解酵素處理可為與前述高靜水壓處理中之處理同樣的方法。經冷凍-解凍處理之生物組織，其組織中的細胞被破壞，將此細胞用洗淨液去除。洗淨之方法可為與高靜水壓處理中之洗淨同樣的方法。
藉由使用界面活性劑之方法而得到前述去細胞化組織時，係將活體來源組織用界面活性劑的溶液(例如0.25質量%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液)，以2～10℃(較佳為4℃)搖晃1～48小時(較佳為12～36小時)。再者，亦可用不同界面活性劑溶液(例如0.5%質量%Triton X(聚氧乙烯辛基苯基醚)溶液)，以2～10℃(較佳為4℃)搖晃1～48小時(較佳為12～36小時)。其後，較佳採用與高靜水壓處理中之洗淨同樣的方法進行洗淨。 界面活性劑不特別限定，可舉出例如十二基硫酸鈉、烷基磺酸鹽、烷基硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷基硫酸酯鹽、α-磺基脂肪酸酯鹽、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚(例如聚氧乙烯辛基苯基醚)、烷基(聚)糖苷。
藉由採超音波處理進行處理之方法而得到前述去細胞化組織時，係將活體來源組織於例如生理食鹽水中進行超音波處理(例如強度：10W/cm 2、頻率：10kHz、作用時間：2分鐘)。其後，較佳用界面活性劑溶液(例如1%質量%Triton X(聚氧乙烯辛基苯基醚)溶液)，以2～10℃(較佳為4℃)搖晃1～120小時(較佳為12～120小時)。進而，宜進行核酸分解酵素處理，核酸分解酵素處理可為與前述高靜水壓處理中之處理同樣的方法。其後，較佳採用與高靜水壓處理中之洗淨同樣的方法進行洗淨。
所得去細胞化組織不特別限定，較佳進行冷凍乾燥處理。冷凍乾燥可根據生物組織的部位而省略。又，所得去細胞化組織可藉由照射伽瑪射線、照射UV等進行滅菌，較佳藉由伽瑪射線照射進行滅菌。
前述去細胞化組織的含量，基於發揮本發明效果之觀點，相對於去細胞化組織組成物較佳為90.0～100.0質量%，更佳為95.0～100.0質量%，再更佳為96.0～100.0質量%，最佳為97.0～100.0質量%。
(去細胞化DNA比(DNA含量)) 一般而言，去細胞化組織組成物的DNA含量係愈少愈佳，而本發明中的去細胞化組織組成物，其每單位乾燥質量的DNA含量，相對於去細胞化組織組成物較佳為0.0300質量%以下。藉此，使用於再生醫療時，可防止排斥反應的發生。由細胞的誘引效果或分化誘導效果而言，本發明之去細胞化組織組成物的去細胞化DNA比更佳為0.0250質量%以下，再更佳為0.0200質量%以下，再更佳為0.0150質量%以下，最佳為0.0120質量%以下。去細胞化DNA比若為0.0150質量%以下，由特別容易提高對去細胞化組織組成物的細胞黏著性而言係較佳。
去細胞化DNA比的下限不特別限定，係愈低愈佳，由容易達成而言，較佳為0.0001質量%以上，更佳為0.0002質量%以上。
DNA含量可藉由PicoGreen法來測定。將去細胞化組織組成物的乾燥試片(以下有稱為試樣)浸漬於蛋白質分解酵素溶液中予以溶解後，用酚/氯仿進行處理去除蛋白質，並藉由乙醇沉澱法回收DNA。將回收之DNA藉由PicoGreen(Life Technologies公司)進行螢光染色並測定螢光強度，將DNA定量，而算出試樣的DNA含量(質量)。定量係採用使用PicoGreen所附標準DNA所作成的檢量線。由試樣的乾燥質量與DNA含量，依下式計算DNA比： (每單位乾燥質量的DNA含量(以下有稱為去細胞化DNA比)=(去細胞化組織組成物的乾燥試片的DNA含量)/(去細胞化組織組成物的乾燥試片的質量)
《蛋白質》 本發明之去細胞化組織組成物係包含(a)分子量：30,000～70,000及(b)等電點：pI6.00～9.00的蛋白質A。本發明之去細胞化組織組成物可進一步包含(a)分子量：3,000～15,000及(b)等電點：pI3.00～5.50的蛋白質。藉此，可進一步發揮本發明之效果。 前述蛋白質的分子量及等電點(pI)可例如將蛋白質進行二維電泳來進行，蛋白質的鑑定則可藉由質譜分析來進行。 於二維電泳法中，可先進行等電點分離及分子量分離之任一項(作為第一維)，而基於提升測定的精確度之觀點，係以第一維進行等電點分離、第二維進行分子量分離為佳。二維電泳法可依循常用方法來進行，可使用市售套組及裝置。例如能以毛細凝膠或條帶凝膠等作為分離介質進行等電點電泳，並將經電泳之凝膠，使用平面狀凝膠(例如SDS-聚丙烯醯胺凝膠)朝與等電點電泳之展開方向垂直的方向進行電泳而進行分子量分離。藉由將經二維電泳之凝膠依循常用方法予以染色，可確認有無蛋白質、分子量、等電點。
前述蛋白質A的分子量，基於發揮本發明之效果之觀點，較佳為30,000～70,000，更佳為30,000～50,000，再更佳為30,000～40,000。前述蛋白質A的等電點(pI)，較佳為6.00～9.00，更佳為6.00～8.50，再更佳為6.50～8.50。
前述蛋白質A較佳可舉出膜聯蛋白。膜聯蛋白係具有由4個或8個α-螺旋結構之所謂的膜聯蛋白重複單元(約70胺基酸殘基)所構成之彎曲核心結構域的蛋白質。胺基末端側結構域係各膜聯蛋白固有之序列(11～196殘基)，而羧基末端側的結構域則可於膜聯蛋白間良好地保存。鈣結合部位或磷脂質結合部位係存在於羧基末端側的結構域上。具有8個膜聯蛋白重複單元之膜聯蛋白VI的分子量為約66k。
去細胞化組織組成物所含膜聯蛋白的來源，只要是源自於真核生物則不特別限定，較佳為源自於哺乳類或鳥類的膜聯蛋白。哺乳類可舉出牛、馬、駱駝、羊駝、驢、犛牛、綿羊、豬、山羊、鹿、羊駝、狗、貉、黃鼠狼、狐狸、貓、兔子、倉鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、松鼠或浣熊等。又，鳥類可舉出鸚鵡科、鸚鵡、雞、鴨、火雞、鵝、珍珠雞、野雞、鴕鳥、鵪鶉或鴯鶓等。
脊椎動物體內存在膜聯蛋白A1～A11、A13之12種膜聯蛋白，具有Ca 2+與磷脂質之結合部位。例如在膜聯蛋白A2之凹面的N末端區結合有具有C末端離胺酸的S100A10，形成組織型血漿纖維原活化劑(tPA)與血漿纖維原的結合部位。 前述膜聯蛋白係包含修飾之不同的膜聯蛋白。亦即，係包含經磷酸化、糖苷基化、泛素化、亞硝基化、甲基化或乙醯基化或未經此等修飾之膜聯蛋白。例如實施例所記載之膜聯蛋白A2為磷酸化之不同的3種膜聯蛋白A2，惟其皆可顯示本發明之效果。
再者，本發明之去細胞化組織組成物不特別限定，只要可獲得本發明之效果，則可包含膜聯蛋白之突變體。膜聯蛋白突變體可舉出例如： (1)於膜聯蛋白之胺基酸序列(例如以序列編號1表示之胺基酸序列)的一處或多處，整體包含1或多個(較佳為1～10個，更佳為1～7個，再更佳為1～5個)，例如整體包含1～數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列，且具有膜聯蛋白之活性的多肽或 (2)具有與膜聯蛋白之胺基酸序列(例如以序列編號1表示之胺基酸序列)的相同性為90%以上的胺基酸序列，且具有膜聯蛋白之活性的多肽。 膜聯蛋白之活性可舉出例如與「Ca 2+及磷脂質」的結合能力。或者，可舉出本發明之去細胞化組織組成物，與不含突變體者相比，使細胞黏著性提升者。
(1或數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列) 前述突變體亦可為由膜聯蛋白(例如序列編號1)之胺基酸序列中，1或數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列所構成的多肽。而且，前述突變體之多肽係具有Ca 2+與磷脂質的結合能力。亦即，未顯示Ca 2+與磷脂質的結合能力之多肽不包含於前述突變體之多肽。於本說明書中，「1或數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列」係指因胺基酸的取代等而發生突變之意。胺基酸的突變個數可為例如1～30個、1～20個、1～15個、1～10個，較佳為1～8個，更佳為1～6個，再更佳為1～5個，最佳為1～2個。可用於本發明之突變體之胺基酸序列的實例較佳可為其胺基酸具有1或數個(較佳為1、2、3或4個)保存性取代的胺基酸序列。
(與胺基酸序列之同一性為90%以上的胺基酸序列) 前述突變體亦可為由相對於膜聯蛋白(例如序列編號1)之胺基酸序列，與胺基酸序列之同一性為90%以上的胺基酸序列所構成的多肽。而且，前述突變體之多肽係具有Ca 2+與磷脂質的結合能力。亦即，未顯示Ca 2+與磷脂質的結合能力之多肽不包含於前述突變體之多肽。更佳為由該同一性為95%以上的胺基酸序列，更佳為96%以上的胺基酸序列，更佳為97%以上的胺基酸序列，更佳為98%以上的胺基酸序列，更佳為99%以上的胺基酸序列所構成的多肽，且顯示Ca 2+與磷脂質的結合能力之多肽。
前述膜聯蛋白(例如序列編號1)之胺基酸序列中「1或數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列」或「同一性為90%以上的胺基酸序列」係膜聯蛋白(例如序列編號1)之胺基酸序列經取代者；此胺基酸序列之取代係維持本發明所使用之膜聯蛋白之機能的保存性取代。換言之，「保存性取代」係指未喪失膜聯蛋白之優良效果的取代。亦即，縱為經前述插入、取代或缺失或者加成時，仍可維持膜聯蛋白之Ca 2+與磷脂質的結合能力的取代。具體而言，係指將胺基酸殘基以其他化學上類似的胺基酸殘基替代之意。可舉出例如將某一疏水性殘基由別的疏水性殘基取代時，將某一極性殘基由帶有相同電荷的別的極性殘基取代的情形等。藉由進行此種取代而形成之機能上類似的胺基酸係依每種胺基酸於該技術領域中週知者。非極性(疏水性)胺基酸可舉出例如丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸等。極性(中性)胺基酸可舉出例如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、半胱胺酸等。帶正電荷(鹼性)胺基酸可舉出精胺酸、組胺酸、離胺酸等。又，帶負電荷(酸性)胺基酸可舉出天冬胺酸、麩胺酸等。
前述蛋白質A的含量，相對於去細胞化組織組成物較佳為0.01～5.0質量%，更佳為0.03～4.5質量%，再更佳為0.05～4.0質量%，再更佳為0.1～3.5質量%，再更佳為0.2～3.3質量%，最佳為0.3～3.0質量%。藉此，可發揮本發明之效果。
前述蛋白質B的分子量，基於發揮本發明效果之觀點，較佳為3,000～15,000，更佳為5,000～14,000，再更佳為7,000～13,000。前述蛋白質的等電點(pI)，較佳為3.00～5.50，更佳為3.40～5.30，再更佳為3.80～5.20。
前述蛋白質B的含量，相對於去細胞化組織組成物較佳為0.001～3.0質量%，更佳為0.003～2.0質量%，再更佳為0.005～1.5質量%，再更佳為0.008～1.0質量%，再更佳為0.009～0.5質量%，最佳為0.01～0.1質量%。藉此，可發揮本發明之效果。
本發明之去細胞化組織組成物中，蛋白質A與蛋白質B較佳以此等的質量比為A：B=5：1～150：1的範圍含有，更佳以8：1～110：1的範圍含有，再更佳以10：1～50：1的範圍含有。藉此，可發揮本發明之效果。
前述蛋白質B較佳可舉出纖維調節蛋白之片段。纖維調節蛋白係主要結合於纖維性膠原蛋白之蛋白質，咸認具有使膠原蛋白纖維彼此結合之作用。已知纖維調節蛋白的表現提高，則膠原蛋白纖維的密度會增加。纖維調節蛋白係由375個胺基酸所構成的蛋白質(序列編號2)，分子量為43,000，pI為5.6。 蛋白質B係纖維調節蛋白之片段，不特別限定，若由分子量推定，則為由C末端之90個胺基酸所構成的片段(序列編號3)。纖維調節蛋白片段其分子量為10,000、pI為4.65。
可含於去細胞化組織組成物之纖維調節蛋白片段的來源，只要與膜聯蛋白同樣地源自於真核生物則不特別限定，可舉出與膜聯蛋白相同者。
本發明之去細胞化組織組成物不特別限定，只要可獲得本發明之效果，則可包含纖維調節蛋白片段之突變體。纖維調節蛋白片段突變體可舉出例如： (1)於纖維調節蛋白片段之胺基酸序列(例如以序列編號3表示之胺基酸序列)的一處或多處，整體包含1或多個(較佳為1～10個，更佳為1～7個，再更佳為1～5個)，例如整體包含1～數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列，且具有纖維調節蛋白片段之活性的多肽或 (2)具有與纖維調節蛋白片段之胺基酸序列(例如以序列編號3表示之胺基酸序列)的相同性為90%以上的胺基酸序列，且具有纖維調節蛋白片段之活性的多肽。 纖維調節蛋白片段之活性可舉出本發明之去細胞化組織組成物，與不含突變體者相比，使細胞黏著性提升者。 纖維調節蛋白片段之突變體係顯示與前述膜聯蛋白突變體同樣之胺基酸突變、同一性及保存性取代等者。
前述纖維調節蛋白片段，研判藉由對去細胞化組織組成物照射伽瑪射線，可由纖維調節蛋白所生成。伽瑪射線照射的強度，只要可獲得本發明之效果則不特別限定，為10～50kGy，較佳為15～35kGy，更佳為20～30kGy。透過處於前述範圍，可生成纖維調節蛋白片段。
《作用》 本發明之去細胞化組織組成物顯示優良的強度及優良的細胞黏著性的原因雖未完全闡明，但可如下推論。然而，本發明不受以下說明所限定。 本發明之去細胞化組織組成物所含之蛋白質A(例如膜聯蛋白)係具有4個或8個α-螺旋構造(膜聯蛋白重複單元)，與Ca 2+結合於磷脂質。雖不予限定，研判Ca 2+與磷脂質的結合能力與細胞黏著能力有關。又，研判膜聯蛋白會有效地對去細胞化組織的強度產生作用。 又，本發明之去細胞化組織組成物所含之蛋白質B(例如纖維調節蛋白片段)，研判纖維調節蛋白係因照射伽瑪射線被切斷而生成。纖維調節蛋白具有穩定膠原蛋白纖維之作用，如纖維調節蛋白充分存在，研判可抑制細胞之膠原蛋白的新生。另外，茲推斷若纖維調節蛋白遭破壞，則無法抑制接觸此片段之細胞之膠原蛋白的新生。因此，便發生細胞的膠原蛋白新生，使細胞的機能活化，而推斷黏著於去細胞化組織組成物的細胞會增加。
本發明之去細胞化組織組成物可藉由獲得去細胞化組織之方法而製造。此時，為了有效獲得去細胞化組織組成物，且為了顯著發揮本案發明之效果，較佳使用採高靜水壓處理之方法。 又，可對以任意方法所得之去細胞化組織自外部添加前述蛋白質，而得到本發明之去細胞化組織組成物。 [實施例]
以下藉由實施例具體說明本發明，惟此等非限定本發明之範圍。
《實施例1》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由高靜水壓處理製作去細胞化組織組成物。 將牛心膜切開成片狀，去除全部脂肪(以下將此片狀牛心膜稱為「心膜片」)。於聚乙烯製袋中，將心膜片，對注射用水添加磷酸緩衝液(PBS，0.01M，pH7.4)後以其為介質，使用研究開發用高壓處理裝置(神戶製鋼所(股)：Dr.CHEF)，以600MPa進行10分鐘的高靜水壓處理。將經高靜水壓處理之心膜片以核酸分解酵素的DNaseI (125U/mL)進行處理，於4℃搖晃18小時5分鐘以上，接著在80%乙醇中於4℃實施1小時以上之處理，最終於4℃以4L的注射用水進行洗淨。進行冷凍乾燥處理，而得到實施例1之去細胞化組織組成物。
《實施例2》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由界面活性劑處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將心膜片於4℃下浸漬於製成含有4%乙醇的0.1%(v/v)過乙酸溶液2小時而減菌後，以注射用水於4℃進行洗淨1小時。其後，在0.25質量%的十二基硫酸鈉(下稱SDS)溶液(10mM Tris、pH8.0)中於4℃下搖晃24小時，接著以0.5質量%Triton-X(聚氧乙烯辛基苯基醚：下稱TX)溶液(10mM Tris、pH8.0)於4℃下搖晃24小時。其後，於4℃下使用10L的注射用水洗淨後，以磷酸緩衝液(PBS、0.01M、pH7.4)於4℃下搖晃1小時。進行冷凍乾燥處理，以按每單位去細胞化組織組成物的重量成為0.3質量%的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例2之去細胞化組織組成物。
《實施例3》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由冷凍-解凍處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將心膜片以乾冰冷凍，保存於裝有乾冰的保冷箱中(約-78℃)20小時後，以25℃使其解凍。將重複此冷凍-解凍4次的心膜片以作為核酸分解酵素之DNaseI(125U/mL)進行處理，於4℃下搖晃96小時。進而，於80%乙醇中、4℃下搖晃96小時後，於注射用水中、4℃下搖晃2小時。進行冷凍乾燥處理，以按每單位去細胞化組織組成物的重量成為0.3質量%的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例3之去細胞化組織組成物。
《實施例4》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由超音波處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將心膜片，於生理食鹽水中進行超音波處理(強度：10W/cm 2、頻率：10kHz、作用時間：2分鐘)。對經超音波處理之牛心膜，在1質量%的TX溶液(10mM Tris、pH8.0)中於4℃下搖晃96小時。將經TX處理之心膜片以作為核酸分解酵素之DNaseI(125U/mL)進行處理，於4℃下搖晃96小時。進而，於80%乙醇中、4℃下搖晃72小時後，於生理食鹽水中、4℃下搖晃2小時。進行冷凍乾燥處理，以按每單位去細胞化組織組成物的重量成為0.3質量%的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例4之去細胞化組織組成物。
《實施例5》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由高靜水壓處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將牛心膜切開成片狀，去除全部脂肪，而得到心膜片。於聚乙烯製袋中，將心膜片，對注射用水添加磷酸緩衝液(PBS，0.01M，pH7.4)後以其為介質，使用研究開發用高壓處理裝置(神戶製鋼所(股)：Dr.CHEF)，以600MPa進行10分鐘的高靜水壓處理。將經高靜水壓處理之心膜片以核酸分解酵素的DNaseI(125U/mL)進行處理，於4℃搖晃18小時5分鐘以上，接著在80%乙醇中於4℃實施1小時以上之處理，最終於4℃以4L的注射用水進行洗淨。進行冷凍乾燥處理，而得到去細胞化牛心囊膜。以按每單位去細胞化組織組成物的重量成為1.0質量%(總含量)的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例5之去細胞化組織組成物。
《實施例6》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由界面活性劑處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將心膜片於4℃下浸漬於製成含有4%乙醇的0.1%(v/v)過乙酸溶液2小時而減菌後，以注射用水於4℃進行洗淨1小時。其後，在0.25質量%的SDS溶液(10mM Tris、pH8.0)中於4℃下搖晃24小時，接著以0.5質量%TX溶液(10mM Tris、pH8.0)於4℃下搖晃24小時。其後，於4℃下使用10L的注射用水洗淨後，以磷酸緩衝液(PBS、0.01M、pH7.4)於4℃下搖晃1小時。進行冷凍乾燥處理，以按每單位去細胞化組織組成物的重量成為1.0質量%的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例6之去細胞化組織組成物。
《實施例7》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由冷凍-解凍處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將心膜片以乾冰冷凍，保存於裝有乾冰的保冷箱中(約-78℃)20小時後，以25℃使其解凍。將重複此冷凍-解凍4次的心膜片以作為核酸分解酵素之DNaseI(125U/mL)進行處理，於4℃下搖晃96小時。進而，於80%乙醇中、4℃下搖晃96小時後，於注射用水中、4℃下搖晃2小時。進行冷凍乾燥處理，以按每單位去細胞化組織組成物的重量成為1.0質量%的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例7之去細胞化組織組成物。
《實施例8》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由超音波處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將心膜片，於生理食鹽水中進行超音波處理(強度：10W/cm 2、頻率：10kHz、作用時間：2分鐘)。對經超音波處理之牛心膜，在1質量%的TX溶液(10mM Tris、pH8.0)中於4℃下搖晃96小時。將經TX處理之心膜片以作為核酸分解酵素之DNaseI(125U/mL)進行處理，於4℃下搖晃96小時。進而，於80%乙醇中、4℃下搖晃72小時後，於生理食鹽水中、4℃下搖晃2小時。進行冷凍乾燥處理，以按每單位去細胞化組織組成物的重量成為1.0質量%的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例8之去細胞化組織組成物。
《比較例1》 於本比較例中，係使用牛的心膜，藉由界面活性劑處理製作去細胞化材料。 將心膜片於4℃下浸漬於製成含有4%乙醇的0.1%(v/v)過乙酸溶液2小時而減菌後，以注射用水於4℃進行洗淨1小時。其後，在0.25質量%的SDS溶液(10mM Tris、pH8.0)中於4℃下搖晃24小時，接著以0.5質量% TX溶液(10mM Tris、pH8.0)於4℃下搖晃24小時。其後，於4℃下使用10L的注射用水洗淨後，以磷酸緩衝液(PBS、0.01M、pH7.4)於4℃下搖晃1小時。進行冷凍乾燥處理，而得到比較例1之去細胞化牛心囊膜(去細胞化材料)。
《比較例2》 於本比較例中，係使用牛的心膜，藉由冷凍-解凍處理製作去細胞化材料。 將心膜片以乾冰冷凍，保存於裝有乾冰的保冷箱中(約-78℃)20小時後，以25℃使其解凍。將重複此冷凍-解凍4次的心膜片以作為核酸分解酵素之DNaseI(125U/mL)進行處理，於4℃下搖晃96小時。進而，於80%乙醇中、4℃下搖晃96小時後，於注射用水中、4℃下搖晃2小時。進行冷凍乾燥處理，而得到比較例2之去細胞化牛心囊膜(去細胞化材料)。
《比較例3》 於本比較例中，係使用牛的心膜，藉由超音波處理製作去細胞化材料。 將心膜片，於生理食鹽水中進行超音波處理(強度：10W/cm 2、頻率：10kHz、作用時間：2分鐘)。對經超音波處理之牛心膜，在1質量%的TX溶液(10mM Tris、pH8.0)中於4℃下搖晃96小時。將經TX處理之心膜片以作為核酸分解酵素之DNaseI(125U/mL)進行處理，於4℃下搖晃96小時。進而，於80%乙醇中、4℃下搖晃72小時後，於生理食鹽水中、4℃下搖晃2小時。進行冷凍乾燥處理，而得到比較例3之去細胞化牛心囊膜(去細胞化材料)。
《細胞黏著性試驗》 將實施例及比較例中所得之去細胞化組織組成物或去細胞化材料，使用經高壓蒸煮之剪刀與鑷子剪切成直徑4mm的圓盤狀而作成試片，將其裝設於96well plate用培養小杯中。將DMEM培養基以175μl添加於培養小杯的下側、以15μL添加於上側，於37°C靜置24小時以上，而進行去細胞化組織組成物或去細胞化材料的馴化。去除DMEM培養基後，播種人類皮膚纖維母細胞(NHDF)(7.0×10 4細胞/cm 2)，於37℃培養3小時。由試片上使用DPBS(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline)洗淨及去除未附著之細胞後，將試片以Wst-8(同人化學研究所製)染色，測定450nm下的吸光度。另外由經Wst-8染色之NHDF與吸光度作成檢量線，並由試片的吸光度與檢量線，算出附著於試片的NHDF數。 將細胞黏著性試驗的結果示於圖2。比較例2係與比較例1同等程度之結果。可知實施例1～8，與比較例1相比，細胞黏著數較多，細胞的誘因效果良好。尤以實施例1、5其細胞的誘因效果良好。
《實施例9》 於本實施例中，係使用豬肝，藉由高靜水壓處理製作去細胞化組織組成物。 將豬肝切開成片狀，去除全部脂肪(以下將此片狀豬肝稱為「肝臟片」)。於聚乙烯製袋中，將肝臟片，對注射用水添加磷酸緩衝液(PBS，0.01M，pH7.4)後以其為介質，使用研究開發用高壓處理裝置(神戶製鋼所(股)：Dr.CHEF)，以600MPa進行10分鐘的高靜水壓處理。將經高靜水壓處理之肝臟片以核酸分解酵素的DNaseI (125U/mL)進行處理，於4℃搖晃18小時5分鐘以上，接著在80%乙醇中於4℃實施1小時以上之處理，最終於4℃以4L的注射用水進行洗淨。進行冷凍乾燥處理，而得到實施例9之去細胞化組織組成物。
《實施例10》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由高靜水壓處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將牛心膜切開成片狀，去除全部脂肪，而得到心膜片。於聚乙烯製袋中，將心膜片，對注射用水添加磷酸緩衝液(PBS，0.01M，pH7.4)後以其為介質，使用研究開發用高壓處理裝置(神戶製鋼所(股)：Dr.CHEF)，以600MPa進行10分鐘的高靜水壓處理。將經高靜水壓處理之心膜片以核酸分解酵素的DNAse125U/mL進行處理，於4℃搖晃18小時5分鐘以上，接著在80%乙醇中於4℃實施1小時以上之處理，最終於4℃以4L的注射用水進行洗淨。進行冷凍乾燥處理，而得到去細胞化牛心囊膜。以按每單位去細胞化組織組成物的重量成為3.0質量%(總含量)的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例10之去細胞化組織組成物。
《實施例11》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由高靜水壓處理製作去細胞化組織組成物。 將牛心膜切開成片狀，去除全部脂肪(以下將此片狀牛心膜稱為「心膜片」)。於聚乙烯製袋中，將心膜片，對注射用水添加磷酸緩衝液(PBS，0.01M，pH7.4)後以其為介質，使用研究開發用高壓處理裝置(神戶製鋼所(股)：Dr.CHEF)，以600MPa進行10分鐘的高靜水壓處理。將經高靜水壓處理之心膜片以核酸分解酵素的DNaseI (125U/mL)進行處理，於4℃搖晃18小時5分鐘以上，接著在80%乙醇中於4℃實施1小時以上之處理，最終於4℃以4L的注射用水進行洗淨。進行冷凍乾燥處理後，照射伽瑪射線(25kGy)，而得到實施例11之去細胞化組織組成物。
《實施例12》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由高靜水壓處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將牛心膜切開成片狀，去除全部脂肪，而得到心膜片。於聚乙烯製袋中，將心膜片，對注射用水添加磷酸緩衝液(PBS，0.01M，pH7.4)後以其為介質，使用研究開發用高壓處理裝置(神戶製鋼所(股)：Dr.CHEF)，以600MPa進行10分鐘的高靜水壓處理。將經高靜水壓處理之心膜片以核酸分解酵素的DNAse125U/mL進行處理，於4℃搖晃18小時5分鐘以上，接著在80%乙醇中於4℃實施1小時以上之處理，最終於4℃以4L的注射用水進行洗淨。進行冷凍乾燥處理後，照射伽瑪射線(25kGy)，而得到去細胞化牛心囊膜。以按每單位去細胞化牛心囊膜的重量成為1.0質量%(總含量)的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例12之去細胞化組織組成物。
《實施例13》 於本實施例中，係使用牛的心膜，藉由高靜水壓處理製作去細胞化材料，並添加膜聯蛋白A2，而得到去細胞化組織組成物。 將牛心膜切開成片狀，去除全部脂肪，而得到心膜片。於聚乙烯製袋中，將心膜片，對注射用水添加磷酸緩衝液(PBS，0.01M，pH7.4)後以其為介質，使用研究開發用高壓處理裝置(神戶製鋼所(股)：Dr.CHEF)，以600MPa進行10分鐘的高靜水壓處理。將經高靜水壓處理之心膜片以核酸分解酵素的DNAse125U/mL進行處理，於4℃搖晃18小時5分鐘以上，接著在80%乙醇中於4℃實施1小時以上之處理，最終於4℃以4L的注射用水進行洗淨。進行冷凍乾燥處理後，照射伽瑪射線(25kGy)，而得到去細胞化牛心囊膜。以按每單位去細胞化牛心囊膜的重量成為3.0質量%(總含量)的方式添加膜聯蛋白A2，而得到實施例13之去細胞化組織組成物。
針對實施例9～13，進行上述細胞黏著性試驗。將結果示於圖2。可知實施例9～13，與比較例1相比，細胞黏著數較多且細胞的誘因效果良好。尤以實施例11其細胞的誘因效果良好。就實施例9，已知即使使用豬肝，亦可獲得良好的結果。
《強度試驗》 (拉伸試驗) 如下進行實施例1及11以及比較例1中所得之去細胞化組織組成物或去細胞化材料的拉伸試驗。 (1)試片的採取及製作 將冷凍乾燥狀態之去細胞化組織組成物或去細胞化材料浸漬於生理食鹽水中15分鐘以上。由膨潤之去細胞化組織組成物或去細胞化材料採取ISO37所記載之啞鈴形8號形狀試片。 (2)試片的測定 啞鈴試片之平行部分的厚度係使用3D單發形狀測定裝置(VR-3200，KEYENCE)來測定。試片的寬度(mm)係直接採用平行部分之衝切刀型切斷面管的長度(40mm)。由試片的厚度與寬度，以下式算出試片的剖面積A(mm 2)。 A=t×w (A：試片剖面積(mm 2)、t：試片厚度(mm)、w：試片寬度(mm)) (3)試驗程序 依循ISO37，如下實施拉伸試驗。為使拉伸力均勻地分布於剖面上，而以試片兩端相對地保持的方式將試片安裝於力學試驗機(MCT2150,AND公司製)。測定使試驗機作動之標線間距離Lb(mm)。夾具的速度係採200mm/min。捨棄在標線間的外側斷裂之試片數據，以追加之試片進行重複試驗。試片係正確地進行至測定3次。由測定值，以下述計算式算出斷裂強度[MPa]、彈性模數[MPa](伸長10%時及最大時)。 (4)結果的計算 ＜斷裂強度＞ 斷裂強度(MPa(N/mm 2))係以下式算出。 斷裂強度(MPa)=最大荷重(N)/試片剖面(mm 2) ＜彈性模數＞ 彈性模數(應力/伸長變形))係以下式算出。 彈性模數(MPa)=荷重(MPa(N/mm 2))/伸長變形((L-L 0)/ L 0)
(撕裂強度試驗) 如下進行實施例及比較例中所得之去細胞化組織組成物或去細胞化材料的撕裂強度試驗。 (1)試片的採取及製作 將冷凍乾燥狀態之去細胞化組織組成物或去細胞化材料浸漬於生理食鹽水中15分鐘以上。由膨潤之去細胞化組織組成物或去細胞化材料，以20mm×15mm的方式採取。由長邊上於2mm的位置穿設直徑6mm的孔。使絲線通過孔中，調製成試片。 (2)試驗程序 將試片的一端安裝於力學試驗機(MCT2150,AND公司製)的夾具上，將絲線設置於掛鉤式固定具上。夾具的速度係採200mm/min。試片係正確地進行至測定3次。測定值係以斷裂時的最大荷重[N]算出。
將伸長10%時彈性模數、最大彈性模數、斷裂強度及撕裂強度的試驗結果分別示於圖3～6。可知實施例1及11，與比較例1相比，拉伸10%所需的力較少，亦即較柔軟，且處理性較佳。又，實施例1及11，與比較例1相比，最大彈性模數較大，並顯示接近人類心膜之彈性模數49.62±3.22 (MPa，參照Interactive Cardio Vascularand Thoracic Surgery22 (2016)72-84)的值。藉此，移植至患者時，易與患者組織相容，對於脈搏、心跳等可維持構造的穩定性。尤以實施例1顯示53.9Mpa之最大彈性模數。又，可知實施例1及11，與比較例1相比，斷裂強度較高，亦即強度較高且較為堅牢。又，可知實施例1及11，與比較例1相比，撕裂強度較高，亦即在手術中使用時絲線較耐拉扯，且縫合強度高。如此，實施例1及11，與比較例1相比，處理性較良好且較為堅牢。
《蛋白質的解析》 以二維電泳解析前述實施例1之去細胞化組織組成物及比較例1之去細胞化材料之組成的差異。 分別於2根微管中秤量實施例1之去細胞化組織組成物或比較例1之去細胞化材料20mg(1根10mg)。對其中一者添加蛋白質萃取緩衝液1(含尿素)、對另一者添加蛋白質萃取緩衝液2(含尿素及界面活性劑)，於室溫下搖晃後，進行離心並回收上清液。藉由超過濾單元(Amicon Ultra-4, Ultracel 3k, Millipore)進行緩衝液取代後，添加含尿素緩衝液，以離心濃縮而將蛋白質純化。分別針對以蛋白質萃取緩衝液1及2萃取出之溶液進行蛋白質的定量(Pierce 660nm Protein Assay, Thermo Scientific)。將以蛋白質萃取緩衝液1及2萃取出之蛋白質混合。由實施例之去細胞化組織組成物或比較例之去細胞化材料20mg，分別回收4.91mg及6.06mg的蛋白質。由實施例或比較例之試樣溶液分取200μg的蛋白質，作為二維電泳用試樣。
對試樣添加緩衝液後，添加蛋白質溶解溶液(含尿素及界面活性劑)而將總量調製成0.34mL(蛋白質200μg)而製成試料溶液。將試料溶液倒入膨潤用托盤中，使第一維電泳預製凝膠覆於溶液上。進而疊加乾揭膜液並靜置一夜。將膨潤之預製凝膠裝設於電泳裝置進行電泳(500V下1分鐘、3500V下7.5小時、20℃)。 使用具有10～20%之濃度梯度的丙烯醯胺凝膠。製作後靜置24小時，使丙烯醯胺完全聚合。將達平衡之第一維電泳預製凝膠放置於丙烯醯胺凝膠上，以含0.125%溴酚藍之1%瓊脂糖溶液固定。對凝膠左端施打分子量標記，作為分子量的標準。以80V進行電泳17小時至凝膠下端可見溴酚藍之譜帶。
電泳後的凝膠係使用全蛋白質檢測用螢光染色劑(SYPRO Ruby protein gel stain, S21900, Thermo Fisher Scientific Inc.)染色，並使用螢光掃描器保存影像。使用掃描器之影像的讀取係以激發波長：488nm、螢光濾光片：640nm Bandpass、解析度：100micrometer進行。讀取螢光染色影像後，使用硝酸銀(195-09382,FUJIFILM Wako Pure Chemical股份有限公司)進行銀染色。顯像後之銀染色影像係使用平台式掃描器進行讀取。 將二維電泳的結果示於圖1。就實施例1，於等電點pI6～9、分子量30,000～40,000處驗出3個色點(1～3)。相對於此，比較例1則未驗出實施例1中所驗出的3個色點。就比較例2、3，均未驗出實施例1中所驗出的3個色點。可知實施例1含有比較例1～3未有的特定蛋白質。
(色點的鑑定) 切取藉由銀染色而可辨識的色點，對切成1mm見方大小的凝膠片添加15mM鐵氰化鉀、50mM硫代硫酸鈉100μL並搖晃10分鐘。移除溶液，添加Milli-Q水並搖晃，由凝膠片洗淨至褪色。對凝膠片添加乙腈並脫水。添加100mM碳酸氫銨、0.01μg/μL胰蛋白酶的酵素溶液10μL使凝膠片膨潤，放置於37℃16小時。添加50μL的0.1%TFA,50%乙腈並搖晃20分鐘，萃取出胜肽。萃取係進行2次。以真空離心機濃縮至胜肽萃取液成為約10μL。使試樣吸附於ZipTip C18(millipore、ZTC18S960)，以60%乙腈、0.1%TFA溶液2.5μL使胜肽溶出。將試樣溶液1μL與CHCA基質溶液1μL混合，滴加至目標盤並使其乾燥後，以質譜儀(ultrafleXtreme)進行測定。基於所得質量值進行登載於資料庫(NCBI RefSeq)之蛋白質的鑑定。 分析裝置　ultrafleXtreme(Bruker Daltonics) 目標盤　MTP Anchorchip 600/384(209513, Bruker Daltonics) 極性　positive mode 檢測模式　reflector mode(300-6,000 m/z) CHCA基質溶液　0.3g/L　CHCA、33%丙酮、66%乙醇 MS/MS　Ion Search　搜尋條件 鑑定軟體　Mascot(Matrix Science) 資料庫　NCBI RefSeq 搜尋生物物種　Bos taurus 酵素　胰蛋白酶 固定修飾　脲甲基化
將使用質譜儀鑑定實施例1之3個色點的結果示於表1。表1及後述表2之色點編號係與圖1之3個色點編號對應。3個色點經鑑定為膜聯蛋白A2。
Figure 02_image001
(色點訊號濃度的算出：電泳數值解析) 將所得螢光染色像的tiff影像檔匯入ImageMaster Platinum(GE)，進行數值化解析。於數值化解析，係首先對各凝膠的共同色點按手冊附加標記。按每個凝膠進行標記附加作業至300個色點後，進行凝膠的匹配。根據該作業，對在兩檢體之凝膠上展開的色點賦予共同的色點ID。其後，進行凝膠的色點檢測，算出色點訊號濃度(%Volume)。 色點訊號濃度係由色點訊號相對於凝膠內全部色點訊號的總和所占的比例來算出。%Volume值係採百分率標示，最小標示係定為0.001%。
(色點重量的算出) 由經二維電泳之蛋白質的重量200μg與各色點訊號(色點訊號濃度)相對於色點訊號的總和之比率，算出每個色點的蛋白質重量。算出將200μg的蛋白質施打至二維電泳時之每個色點的蛋白質重量的結果，就實施例1，由色點1算出0.7μg，由色點2算出2.0μg，由色點3算出0.8μg，由3個色點共算出3.5μg的蛋白質重量。
(去細胞化組織組成物所含之3個色點的蛋白質重量的算出) 由經純化且回收之蛋白質的重量與經二維電泳之蛋白質的重量的關係，算出每20mg去細胞化組織組成物之3個色點的蛋白質重量。將結果示於表2。就實施例1，由3個色點算出蛋白質重量。實施例1係含有0.43質量%的蛋白質A。相對於此，就比較例1，則未算出對應此3個色點的蛋白質重量。就比較例2、3，亦未算出對應3個色點的蛋白質重量。
Figure 02_image003
針對實施例9及11～13之去細胞化組織組成物，同樣地進行蛋白質的解析。將實施例9之二維電泳的結果示於圖7A。與實施例1相同，於等電點pI6～9、分子量30,000～40,000處驗出3個色點(4～6)。將實施例11之二維電泳的結果示於圖7B。於等電點pI6～9、分子量30,000～40,000處驗出3個色點(7～9)，且於等電點pI4～5、分子量8,000～12,000處驗出色點(10)。色點10係僅於實施例11～13中驗出。
針對實施例9及11之色點，進行前述色點的鑑定。將實施例9的結果示於表3。表3及後述表5之色點編號係與圖7A之色點編號對應。實施例9之色點4～6係與實施例1同樣地(參照表1色點編號1～3)鑑定為膜聯蛋白A2。
Figure 02_image005
將實施例11的結果示於表4。表4及後述表6之色點編號係與圖7B之色點編號對應。實施例11之色點7～9係與實施例1同樣地鑑定為膜聯蛋白A2；色點10則鑑定為源自纖維調節蛋白之胜肽。
Figure 02_image007
針對實施例9及11，進行前述色點訊號濃度的算出、色點重量的算出。 算出將200μg的蛋白質施打至二維電泳時之每個色點的蛋白質重量的結果，就實施例9，由色點4算出0.14μg，由色點5算出0.27μg，由色點6算出0.03μg，由3個色點共算出0.44μg的蛋白質重量。又，就實施例11，由色點7算出0.7μg，由色點8算出1.6μg，由色點9算出0.4μg，由3個色點共算出2.7μg的蛋白質重量，且由色點10算出0.24μg的蛋白質重量。
針對實施例9、11，進行每20mg上述去細胞化組織組成物之色點的蛋白質重量的算出。將結果示於表5、6。實施例9係含有0.05質量%的蛋白質A。實施例11則含有0.33質量%的蛋白質A、0.03質量%的蛋白質B。
Figure 02_image009
Figure 02_image011
《去細胞化DNA比的算出》 測定實施例1、9及11之去細胞化組織組成物及比較例1～3之去細胞化材料的質量，以其為試樣，浸漬於蛋白質分解酵素溶液予以溶解後，用酚/氯仿進行處理去除蛋白質，並藉由乙醇沉澱法回收DNA。將回收之DNA藉由PicoGreen(Life Technologies公司)進行螢光染色並測定螢光強度，將DNA定量，而由試樣的質量與DNA的量算出試樣的DNA含量。此外，DNA的定量係採用使用PicoGreen所附標準DNA所作成的檢量線。使用別的試樣，由試樣的質量(含水量70%)與乾燥之試樣(保存於60℃的恆溫槽12小時者)的質量，求出乾燥減量比，並由試樣的DNA含量與乾燥減量比算出試樣之每單位乾燥質量的DNA含量。將結果示於表7。 (去細胞化DNA比)=(試樣之乾燥試片的DNA含量)/(試樣的質量)×100
Figure 02_image013
可知高靜水壓處理之實施例1、9及11，相較於比較例，得以良好地進行去細胞化。 [產業上可利用性]
本發明之去細胞化組織組成物可作為顯示良好的組織再生之移植用組織使用。
[圖1]為表示實施例1及比較例1之去細胞化組織於二維電泳中，實施例1及比較例1中不同之蛋白質色點的圖。 [圖2]為表示實施例1～13以及比較例1及3之去細胞化組織組成物的細胞黏著性試驗之結果的圖表。 [圖3]為表示實施例1及11以及比較例1之去細胞化組織組成物伸長10%時之彈性模數的圖表。 [圖4]為表示實施例1及11以及比較例1之去細胞化組織組成物的最大彈性模數的圖表。 [圖5]為表示實施例1及11以及比較例1之去細胞化組織組成物的斷裂強度的圖表。 [圖6]為表示實施例1及11以及比較例1之去細胞化組織組成物的撕裂強度的圖表。 [圖7]為表示實施例9及11之去細胞化組織於二維電泳中與比較例1不同之蛋白質色點的圖。 
<![CDATA[<110>  日商ADEKA股份有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  去細胞化組織組成物]]>
          <![CDATA[<130>  ADK-068]]>
          <![CDATA[<150>  JP 2020-188489]]>
          <![CDATA[<151>  2020-11-12]]>
          <![CDATA[<160>  3     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  339]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Bos taurus]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Ala Tyr Thr Asn 
                      20                  25                  30          
          Phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala Leu Asn Ile Glu Thr Ala Ile Lys Thr 
                  35                  40                  45              
          Lys Gly Val Asp Glu Val Thr Ile Val Asn Ile Leu Thr Asn Arg Ser 
              50                  55                  60                  
          Asn Glu Gln Arg Gln Asp Ile Ala Phe Ala Tyr Gln Arg Arg Thr Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Glu Leu Ala Ser Ala Leu Lys Ser Ala Leu Ser Gly His Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Ile Leu Gly Leu Leu Lys Thr Pro Ala Gln Tyr Asp Ala Ser 
                      100                 105                 110         
          Glu Leu Lys Ala Ser Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp Ser Leu 
                  115                 120                 125             
          Ile Glu Ile Ile Cys Ser Arg Thr Asn Gln Glu Leu Gln Glu Ile Asn 
              130                 135                 140                 
          Arg Val Tyr Lys Glu Met Tyr Lys Thr Asp Leu Glu Lys Asp Ile Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe Arg Lys Leu Met Val Ala Leu Ala Lys 
                          165                 170                 175     
          Gly Arg Arg Ala Glu Asp Gly Ser Val Ile Asp Tyr Glu Leu Ile Asp 
                      180                 185                 190         
          Gln Asp Ala Arg Asp Leu Tyr Asp Ala Gly Val Lys Arg Lys Gly Thr 
                  195                 200                 205             
          Asp Val Pro Lys Trp Ile Ser Ile Met Thr Glu Arg Ser Val Cys His 
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Lys Val Phe Glu Arg Tyr Lys Ser Tyr Ser Pro Tyr Asp Met 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Glu Ser Ile Lys Lys Glu Val Lys Gly Asp Leu Glu Asn Ala Phe 
                          245                 250                 255     
          Leu Asn Leu Val Gln Cys Ile Gln Asn Lys Pro Leu Tyr Phe Ala Asp 
                      260                 265                 270         
          Arg Leu Tyr Asp Ser Met Lys Gly Lys Gly Thr Arg Asp Lys Val Leu 
                  275                 280                 285             
          Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser Glu Val Asp Met Leu Lys Ile Arg 
              290                 295                 300                 
          Ser Glu Phe Lys Lys Lys Tyr Gly Lys Ser Leu Tyr Tyr Tyr Ile Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Asp Thr Lys Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Leu Leu Tyr Leu Cys Gly 
                          325                 330                 335     
          Gly Asp Asp
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  375]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Gln Trp Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys Ser Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Trp Ala Gln Tyr Glu Glu Asp Ser His Trp Trp Phe Gln Phe Leu Arg 
                      20                  25                  30          
          Asn Gln Gln Ser Thr Tyr Asp Asp Pro Tyr Asp Pro Tyr Pro Tyr Glu 
                  35                  40                  45              
          Pro Tyr Glu Pro Tyr Pro Thr Gly Glu Glu Gly Pro Ala Tyr Ala Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Pro Pro Gln Pro Glu Pro Arg Asp Cys Pro Gln Glu Cys Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Pro Pro Asn Phe Pro Thr Ala Met Tyr Cys Asp Asn Arg Asn Leu 
                          85                  90                  95      
          Lys Tyr Leu Pro Phe Val Pro Ser Arg Met Lys Tyr Val Tyr Phe Gln 
                      100                 105                 110         
          Asn Asn Gln Ile Ser Ser Ile Gln Glu Gly Val Phe Asp Asn Ala Thr 
                  115                 120                 125             
          Gly Leu Leu Trp Ile Ala Leu His Gly Asn Gln Ile Thr Ser Asp Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gly Lys Lys Val Phe Ser Lys Leu Arg His Leu Glu Arg Leu Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asp His Asn Asn Leu Thr Arg Ile Pro Ser Pro Leu Pro Arg Ser 
                          165                 170                 175     
          Leu Arg Glu Leu His Leu Asp His Asn Gln Ile Ser Arg Val Pro Asn 
                      180                 185                 190         
          Asn Ala Leu Glu Gly Leu Glu Asn Leu Thr Ala Leu Tyr Leu His His 
                  195                 200                 205             
          Asn Glu Ile Gln Glu Val Gly Ser Ser Met Lys Gly Leu Arg Ser Leu 
              210                 215                 220                 
          Ile Leu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn His Leu Arg Lys Val Pro Asp Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Pro Ser Ala Leu Glu Gln Leu Tyr Leu Glu His Asn Asn Val Phe 
                          245                 250                 255     
          Ser Val Pro Asp Ser Tyr Phe Arg Gly Ser Pro Lys Leu Leu Tyr Val 
                      260                 265                 270         
          Arg Leu Ser His Asn Ser Leu Thr Asn Asn Gly Leu Ala Ser Asn Thr 
                  275                 280                 285             
          Phe Asn Ser Ser Ser Leu Leu Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln Leu 
              290                 295                 300                 
          Gln Lys Ile Pro Pro Val Ser Thr Asn Leu Glu Asn Leu Tyr Leu Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Asn Arg Ile Asn Glu Phe Ser Ile Ser Ser Phe Cys Thr Val Val 
                          325                 330                 335     
          Asp Val Met Asn Phe Ser Lys Leu Gln Val Gln Arg Leu Asp Gly Asn 
                      340                 345                 350         
          Glu Ile Lys Arg Ser Ala Met Pro Ala Asp Ala Pro Leu Cys Leu Arg 
                  355                 360                 365             
          Leu Ala Ser Leu Ile Glu Ile 
              370                 375 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  90]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Bos taurus]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Ser Asn Thr Phe Asn Ser Ser Ser Leu Leu Glu Leu Asp Leu Ser Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gln Leu Gln Lys Ile Pro Pro Val Ser Thr Asn Leu Glu Asn Leu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Gln Gly Asn Arg Ile Asn Glu Phe Ser Ile Ser Ser Phe Cys 
                  35                  40                  45              
          Thr Val Val Asp Val Met Asn Phe Ser Lys Leu Gln Val Gln Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Asp Gly Asn Glu Ile Lys Arg Ser Ala Met Pro Ala Asp Ala Pro Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Leu Arg Leu Ala Ser Leu Ile Glu Ile 
                          85                  90
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005

Claims (8)

  1. 一種去細胞化組織組成物，其係含有去細胞化組織，與(a)分子量：30,000～70,000及(b)等電點：pI6.00～9.00的蛋白質A。
  2. 如請求項1之去細胞化組織組成物，其進一步含有(a)分子量：3,000～15,000及(b)等電點：pI3.00～5.50的蛋白質B。
  3. 如請求項1或2之去細胞化組織組成物，其中前述蛋白質A的含量，相對於去細胞化組織組成物為0.01～5.0質量%。
  4. 如請求項1或2之去細胞化組織組成物，其中前述蛋白質B的含量，相對於去細胞化組織組成物為0.001～3.0質量%。
  5. 如請求項1或2之去細胞化組織組成物，其中蛋白質A及蛋白質B於組成物中的質量比為A：B=5：1～150：1。
  6. 如請求項1或2之去細胞化組織組成物，其中每單位乾燥質量的DNA含量，相對於去細胞化組織組成物為0.0300質量%以下。
  7. 如請求項1或2之去細胞化組織組成物，其中前述蛋白質A為膜聯蛋白。
  8. 如請求項1或2之去細胞化組織組成物，其中前述蛋白質B為源自於纖維調節蛋白之胜肽。
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