WO2022102739A1 - 脱細胞化組織組成物 - Google Patents

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decellularized
protein
tissue composition
mass
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光将 本間
謙一郎 日渡
春樹 小原
拓矢 木村
敬太 木下
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株式会社Adeka
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Definitions

  • the present invention relates to a decellularized tissue composition.
  • Decellularization means removing cellular components such as nucleic acids that are antigenic to the transplantee, thereby avoiding immune rejection.
  • the decellularized tissue can be produced by decellularizing the living tissue using, for example, a treatment liquid containing a surfactant (Patent Documents 1 to 3).
  • an object of the present invention is to provide a decellularized tissue exhibiting appropriate strength and good tissue regeneration.
  • the decellularized tissue composition according to [1] which further contains protein B having (a) a molecular weight of 3,000 to 15,000 and (b) an isoelectric point: pI3.00 to 5.50.
  • the decellularized tissue composition of the present invention since it exhibits appropriate strength and excellent cell adhesion, it exhibits good tissue regeneration ability (for example, cell-inducing effect and differentiation-inducing effect) in vivo. Can be done. In addition, by having excellent strength, it exhibits excellent handling performance at the time of treatment.
  • the decellularized tissue composition of the present invention comprises a decellularized tissue and a protein having (a) a molecular weight of 30,000 to 70,000 and (b) an isoelectric point: pI6.00 to 9.00 (hereinafter, protein). (Sometimes referred to as A) and.
  • the decellularized tissue composition of the present invention is a protein having (a) a molecular weight of 3,000 to 15,000 and (b) an isoelectric point: pI3.00 to 5.50 (hereinafter, may be referred to as protein B). ) May be included.
  • the decellularized tissue is a tissue from which cell components have been removed from animal-derived tissue, and is a tissue whose main component is extracellular matrix components such as elastin, collagen (type I, type IV, etc.) and laminin. It has a low rejection reaction at the time of transplantation, can be expected to establish and reconstruct the cells at the transplant destination, and functions as a scaffold for the cells.
  • a method for obtaining the decellularized tissue contained in the composition of the present invention a conventionally known method can be used.
  • the method for decellularization is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, but for example, a method by high hydrostatic pressure treatment, a method by freeze-thaw treatment, and a surfactant are used.
  • Methods, treatment with an alcohol solvent, etc. may be mentioned, and two or more of these may be combined, and high hydrostatic pressure treatment is performed in order to efficiently obtain a decellularized tissue composition and to exert the effect of the present invention.
  • the method according to is preferable.
  • the decellularized tissue used in the decellularized tissue composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a vertebrate-derived biological tissue, but since there are few rejection reactions, a mammalian or bird-derived biological tissue is preferable.
  • Mammalian livestock, bird livestock or human-derived biological tissues are more preferred because they are readily available.
  • Mammal livestock include cows, horses, camels, raccoons, donkeys, yaks, sheep, pigs, goats, deer, alpaca, dogs, raccoon dogs, weasels, foxes, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, rats, mice, squirrels, Examples include raccoons.
  • livestock of birds examples include inco, parrot, chicken, duck, turkey, guinea fowl, guinea fowl, pheasant, ostrich, quail, and emu.
  • bovine, pig, rabbit, and human biological tissues are preferable because of the stability of availability.
  • a site having an extracellular matrix structure can be used, and such sites include, for example, liver, kidney, urinary tract, bladder, urethra, tongue, tongue, esophagus, stomach, and small intestine.
  • examples include the large intestine, anus, pancreas, heart, blood vessels, spleen, lungs, brain, bones, spinal cord, cartilage, testis, uterus, oviduct, ovary, placenta, cornea, skeletal muscle, tendon, nerve, and skin.
  • a site of living tissue it is preferably in cartilage, bone, liver, kidney, heart, heart membrane, aorta, skin, small intestinal submucosal tissue, lung, brain, internal thoracic artery, or spinal cord because of its high effect of tissue regeneration.
  • the heart membrane, internal thoracic artery, liver, cartilage, skin, small intestinal submucosal tissue, or spinal cord is preferably in cartilage, bone, liver, kidney, heart, heart membrane, aorta, skin, small intestinal submucosal tissue, lung, brain, internal thoracic artery, or spinal cord.
  • a hydrostatic pressure of 50 to 1500 MPa is applied to the tissue derived from a living body in a medium.
  • the hydrostatic pressure to be applied is preferably 50 MPa or more, a pressure vessel that can withstand the application is not required, a large amount of energy is not required, and the medium used for the application is an aqueous medium. Is preferably 1500 MPa or less from the viewpoint of producing ice and preventing the tissue from being damaged by the generated ice.
  • the hydrostatic pressure to be applied is more preferably 80 to 1300 MPa, further preferably 90 to 1200 MPa, further preferably 95 to 1100 MPa, further preferably 95 to 700 MPa, and 400 to 700 MPa are decellularization effect, sterilization effect and virus-free. It is most preferable from the viewpoint of activating effect and ease of application.
  • Examples of the medium used for applying the hydrostatic pressure include water, physiological saline, water for injection, propylene glycol or an aqueous solution thereof, glycerin or an aqueous solution thereof, and a saccharide aqueous solution.
  • Examples of the buffer solution include acetate buffer solution, phosphate buffer solution, citric acid buffer solution, borate buffer solution, tartrate buffer solution, Tris buffer solution, HEEPS buffer solution, MES buffer solution and the like. These media may contain a surfactant.
  • the temperature of the high hydrostatic pressure treatment is not particularly limited as long as it does not generate ice and does not damage the tissue due to heat, but it is 0 to 0 because the decellularization treatment is smoothly performed and the effect on the tissue is small. 45 ° C. is preferable, 4 to 37 ° C. is more preferable, and 15 to 35 ° C. is most preferable. If the time of high hydrostatic pressure treatment is too short, cells will not be sufficiently destroyed, and if it is long, it will lead to waste of energy. Therefore, in high hydrostatic pressure treatment, the time to maintain the target applied pressure is 1 to 1 to 1. 120 minutes is preferable, 5 to 60 minutes is more preferable, and 7 to 30 minutes is even more preferable.
  • the tissue treated with high hydrostatic pressure is preferably treated with a nucleolytic enzyme.
  • Nucleic acid-degrading enzymes remove nucleic acid components from living tissues to which hydrostatic pressure is applied, and are not particularly limited, but are, for example, pancreas-derived, spleen-derived, or Escherichia coli-derived DNase (for example, DNase I, DNase II) can be mentioned.
  • the nucleic acid-degrading enzyme can be added to the medium used for the high hydrostatic pressure treatment (for example, water, physiological saline, injection solution, buffer solution, etc.) and allowed to act.
  • the amount of enzyme to be added varies depending on the type of enzyme and the definition of the number of units (U), but can be appropriately set by those skilled in the art.
  • DNase I may be used at 50 to 200 U / mL.
  • the treatment temperature also varies depending on the nucleolytic enzyme used, but may be set to, for example, 1 ° C to 40 ° C.
  • the treatment time is also not particularly limited, but may be, for example, 1 to 120 hours (preferably 1 to 96 hours, more preferably 1 to 48 hours). Time processing is sufficient.
  • the tissue treated with high hydrostatic pressure is washed with a washing liquid.
  • the cleaning solution may be the same as or different from the medium for high hydrostatic pressure treatment.
  • the cleaning liquid preferably contains an organic solvent or a chelating agent.
  • the organic solvent can improve the efficiency of removing lipids, and the chelating agent inactivates calcium ions and magnesium ions in the decellularized tissue to make the particulate decellularized tissue of the present invention into a diseased part. It can prevent calcification when applied.
  • the organic solvent a water-soluble organic solvent is preferable, and ethanol, isopropanol, acetone, and dimethyl sulfoxide are preferable because the effect of removing lipids is high.
  • Chelating agents include ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), diethylenetriminpentaacetic acid (DTPA), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), triethylenetetraminehexacetic acid (TTHA), 1,3-propane.
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • DTPA diethylenetriminpentaacetic acid
  • HEDTA hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid
  • TTHA triethylenetetraminehexacetic acid
  • Diaminetetraacetic acid PDTA
  • 1,3-diamino-2-hydroxypropanetetraacetic acid DPTA-OH
  • HIDA hydroxyethyliminodiacetic acid
  • DHEG dihydroxyethylglycine
  • GEDTA glycol etherdiaminetetraacetic acid
  • Iminocarboxylic acid-based chelating agents such as dicarboxymethyl glutamic acid (CMGA), 3-hydroxy-2,2'-iminodysuccinic acid (HIDA), dicarboxymethyl aspartic acid (ASDA) or salts thereof; citric acid, tartrate acid, malic acid.
  • a hydroxycarboxylic acid-based chelating agent such as lactic acid or a salt thereof, and examples of the salt of these chelating agents include a sodium salt or a potassium salt.
  • the cleaning temperature is not particularly limited as long as it does not damage the tissue due to heat, but is preferably 0 to 45 ° C., more preferably 1 to 40 ° C., because the cleaning property is good and the effect on the tissue is small. Most preferably 2 to 35 ° C. In the case of washing, the washing liquid may be shaken or stirred as necessary.
  • the biological tissue is subjected to a temperature of -80 to -20 ° C (preferably -80 to -40 ° C) for 1 to 48 hours (preferably 10 to 10 to 40 ° C). After holding and freezing for 30 hours, the step of thawing at a temperature of 20 to 37 ° C. is repeated once or twice or more (preferably 2 to 5 times). After that, it is preferable to carry out the nucleolytic enzyme treatment, and the nucleolytic enzyme treatment may be carried out by the same method as the treatment in the high hydrostatic pressure treatment. In the freeze-thawed living tissue, the cells in the tissue are destroyed, and these cells are removed by the washing solution. The cleaning method may be the same as that used in the high hydrostatic pressure treatment.
  • the biological tissue is treated with a detergent solution (for example, 0.25 mass% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution) from 1 to 48. Shake at 2-10 ° C (preferably 4 ° C) for an hour (preferably 12-36 hours).
  • a detergent solution for example, 0.25 mass% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • different surfactant solutions eg, 0.5% mass% Triton X (polyoxyethylene octylphenyl ether) solution
  • 1 to 48 hours preferably 12 to 36 hours
  • 2 to 10 ° C. preferably
  • It may be shaken at 4 ° C.
  • Surfactants include, but are not limited to, sodium dodecyl sulphate, alkyl sulfonates, alkyl sulphates, polyoxyethylene alkyl sulfates, ⁇ -sulfofatty acid ester salts, polyoxyethylene alkyl ethers, etc.
  • Examples thereof include polyoxyethylene alkyl phenyl ether (for example, polyoxyethylene octyl phenyl ether) and alkyl (poly) glycosides.
  • the tissue derived from the living body is sonicated (for example, intensity: 10 W / cm 2 , frequency: 10 kHz, action time: in physiological saline, for example). 2 minutes). Then, preferably in a surfactant solution (eg, 1% mass% Triton X (polyoxyethylene octylphenyl ether) solution) for 1 to 120 hours (preferably 12 to 120 hours), 2 to 10 ° C. (preferably). Shake at 4 ° C). Further, it is preferable to carry out the nucleolytic enzyme treatment, and the nucleolytic enzyme treatment may be carried out by the same method as the treatment in the high hydrostatic pressure treatment. After that, it is preferable to wash by the same method as the washing in the high hydrostatic pressure treatment.
  • a surfactant solution eg, 1% mass% Triton X (polyoxyethylene octylphenyl ether) solution
  • the obtained decellularized tissue is not limited, but is preferably freeze-dried. Freeze-drying can be omitted depending on the site of the living tissue. Further, the obtained decellularized tissue may be sterilized by gamma ray irradiation, UV irradiation or the like, and it is preferable to sterilize by gamma ray irradiation.
  • the content of the decellularized tissue is preferably 90.0 to 100.0% by mass, preferably 95.0 to 100.0% by mass, based on the decellularized tissue composition, from the viewpoint of exerting the effect of the present invention. % Is more preferable, 96.0 to 100.0% by mass is further preferable, and 97.0 to 100.0% by mass is most preferable.
  • the DNA content of the decellularized tissue composition is low, but in the decellularized tissue composition of the present invention, the DNA content per dry mass is higher than that of the decellularized tissue composition. It is preferably 0.0300% by mass or less. This can prevent rejection from occurring when used in regenerative medicine.
  • the decellularized DNA ratio of the decellularized tissue composition of the present invention is more preferably 0.0250% by mass or less, further preferably 0.0200% by mass or less, and 0. It is more preferably 0.0150% by mass or less, and most preferably 0.0120% by mass or less.
  • the decellularized DNA ratio is 0.0150% by mass or less, it is preferable in that the cell adhesion to the decellularized tissue composition is particularly easy to be enhanced.
  • the lower limit of the decellularized DNA ratio is not particularly limited, but is preferably as low as possible, preferably 0.0001% by mass or more, and further preferably 0.0002% by mass or more from the viewpoint of ease of realization.
  • the DNA content can be measured by the picogreen method.
  • a dry test piece of the decellularized tissue composition (hereinafter, may be referred to as a sample) is immersed in a proteolytic enzyme solution to dissolve it, and then treated with phenol / chloroform to remove the protein, and then subjected to an ethanol precipitation method. Collect DNA.
  • the recovered DNA is fluorescently stained with picogreen (Life Technologies) to quantify the DNA by measuring the fluorescence intensity, and the DNA content (mass) of the sample is calculated.
  • a calibration curve prepared using the standard DNA attached to Pico Green is used. From the dry mass and DNA content of the sample, the DNA ratio is calculated according to the following formula.
  • the decellularized tissue composition of the present invention comprises protein A having (a) a molecular weight of 30,000 to 70,000 and (b) an isoelectric point: pI 6.00 to 9.00.
  • the decellularized tissue composition of the present invention may further contain a protein having (a) a molecular weight of 3,000 to 15,000 and (b) an isoelectric point: pI3.00 to 5.50. Thereby, the effect of the present invention can be more exerted.
  • the molecular weight and isoelectric point (pI) of the protein can be determined, for example, by two-dimensional electrophoresis of the protein, and identification of the protein can be performed by mass spectrometry.
  • either isoelectric point separation or molecular weight separation may be performed first (as the first dimension), but from the viewpoint of improving the accuracy of measurement, the isoelectric point separation is performed in the first dimension. It is preferable to perform molecular weight separation in the second dimension.
  • Two-dimensional electrophoresis can be performed according to a conventional method, and commercially available kits and devices can be used. For example, isoelectric focusing is performed using a capillary gel or strip gel as a separation medium, and the gel after completion of the electrophoresis is used as a planar gel (for example, SDS-polyacrylamide gel) to develop the isoelectric focusing.
  • the molecular weight can be separated by performing electrophoresis in the direction perpendicular to the relative weight.
  • electrophoresis By staining the gel subjected to two-dimensional electrophoresis according to a conventional method, the presence or absence of protein, the molecular weight, and the isoelectric point can be confirmed.
  • the molecular weight of the protein A is preferably 30,000 to 70,000, more preferably 30,000 to 50,000, and even more preferably 30,000 to 40,000 from the viewpoint of exerting the effect of the present invention.
  • the isoelectric point (pI) of the protein A is preferably 6.00 to 9.00, more preferably 6.00 to 8.50, and even more preferably 6.50 to 8.50.
  • the protein A is preferably annexin.
  • Annexin is a protein with a curved core domain consisting of so-called annexin repeats (about 70 amino acid residues) having 4 or 8 ⁇ -helix structures.
  • the amino-terminal domain is a sequence unique to each annexin (residues 11 to 196), but the carboxy-terminal domain is well conserved among the annexins.
  • the calcium binding site and the phospholipid binding site are located on the domain on the carboxy-terminal side.
  • the molecular weight of annexin VI with 8 annexin repeats is about 66 k.
  • the origin of the annexin contained in the decellularized tissue composition is not particularly limited as long as it is derived from eukaryotes, but annexins derived from mammals or birds are preferable.
  • Mammals include cows, horses, camels, ryamas, donkeys, yaks, sheep, pigs, goats, deer, alpaca, dogs, raccoon dogs, weasels, foxes, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, rats, mice, squirrels, or raccoons. And so on.
  • birds include inco, parrot, chicken, duck, turkey, goose, guinea fowl, pheasant, ostrich, quail, and emu.
  • annexins A1 to A11 and A13 are present and have a binding site between Ca 2+ and phospholipids.
  • S100A10 having a C-terminal lysine binds to the N-terminal region of the concave surface of annexin A2, and becomes a binding site for tissue-type plasminogen activator (tPA) and plasminogen.
  • the annexin contains annexins having different modifications. That is, it comprises phosphorylated, glycosylated, ubiquitinated, nitrosylated, methylated, or acetylated, or unmodified annexins.
  • the annexin A2 described in the examples is three kinds of annexin A2 having different phosphorylation, and all of them can show the effect of the present invention.
  • the decellularized tissue composition of the present invention can include, but is not limited to, a variant of annexin as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • Annexin variants include, for example. (1) One or more (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7) as a whole at one or more of the amino acid sequences of annexin (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1). More preferably 1-5), eg, a polypeptide comprising an amino acid sequence in which 1-several amino acids have been deleted, substituted, inserted, and / or added as a whole and have annexin activity, or (2).
  • a polypeptide having an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence of annexin (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) and having annexin activity can be mentioned.
  • the activity of annexin include the ability to bind "Ca 2+ and phospholipids".
  • the decellularized tissue composition of the present invention may be used to improve cell adhesion as compared with a cell-free tissue composition.
  • the variant may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted, and / or added in the amino acid sequence of annexin (eg, SEQ ID NO: 1).
  • the modified polypeptide has a binding ability between Ca 2+ and a phospholipid. That is, a polypeptide that does not show the ability to bind Ca 2+ to a phospholipid is not included in the modified polypeptide.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted, and / or added means that the amino acid has been modified by substitution or the like.
  • the number of amino acid modifications can be, for example, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6, and even more preferably. Is 1 to 5, most preferably 1 to 2.
  • An example of a variant amino acid sequence that can be used in the present invention is preferably an amino acid sequence in which the amino acid has one or several (preferably 1, 2, 3 or 4) conservative substitutions. be able to.
  • the variant may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence having an amino acid sequence identity of 90% or more with respect to the amino acid sequence of annexin (eg, SEQ ID NO: 1).
  • the modified polypeptide has a binding ability between Ca 2+ and a phospholipid. That is, a polypeptide that does not show the ability to bind Ca 2+ to a phospholipid is not included in the modified polypeptide. More preferably, an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably an amino acid sequence having an identity of 96% or more, more preferably an amino acid sequence having an identity of 97% or more, and more preferably an amino acid sequence having an identity of 98% or more.
  • Is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having an amino acid sequence of 99% or more, and is a polypeptide showing a binding ability between Ca 2+ and a phospholipid.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added or "amino acid sequence having 90% or more identity” in the amino acid sequence of the annexin (for example, SEQ ID NO: 1).
  • substitution of the amino acid sequence of annexin eg, SEQ ID NO: 1
  • conservative substitution means a substitution in which the superior effect of annexin is not lost. That is, it is a substitution that can maintain the binding ability of Ca 2+ of annexin to a phospholipid even when it is inserted, substituted, deleted, or added.
  • amino acid residue means replacing the amino acid residue with another chemically similar amino acid residue.
  • hydrophobic residue is replaced with another hydrophobic residue
  • polar residue is replaced with another polar residue having the same charge
  • Functionally similar amino acids that can be made by making such substitutions are known in the art for each amino acid.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine and the like.
  • polar (neutral) amino acid include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • the content of the protein A is preferably 0.01 to 5.0% by mass, more preferably 0.03 to 4.5% by mass, and 0.05 to 4.0% by mass with respect to the decellularized tissue composition.
  • mass% is even more preferable, 0.1 to 3.5% by mass is even more preferable, 0.2 to 3.3% by mass is even more preferable, and 0.3 to 3.0% by mass is most preferable. Thereby, the effect of the present invention can be exhibited.
  • the molecular weight of the protein B is preferably 3,000 to 15,000, more preferably 5,000 to 14,000, and even more preferably 7,000 to 13,000, from the viewpoint of exerting the effect of the present invention.
  • the isoelectric point (pI) of the protein is preferably 3.00 to 5.50, more preferably 3.40 to 5.30, and even more preferably 3.80 to 5.20.
  • the content of the protein B is preferably 0.001 to 3.0% by mass, more preferably 0.003 to 2.0% by mass, and 0.005 to 1.5% by mass with respect to the decellularized tissue composition.
  • the mass% is further preferable, 0.008 to 1.0% by mass is further preferable, 0.009 to 0.5% by mass is further preferable, and 0.01 to 0.1% by mass is most preferable. Thereby, the effect of the present invention can be exhibited.
  • the protein B preferably includes a fragment of fibromodulin.
  • Fibromodulin is a protein that mainly binds to fibrous collagen, and is considered to have a role of binding collagen fibers to each other. It is known that when the expression of fibromodulin increases, the density of collagen fibers increases. Fibromodulin is a protein consisting of 375 amino acids (SEQ ID NO: 2), having a molecular weight of 43,000 and a pI of 5.6.
  • Protein B is a fragment of fibromodulin, and is not limited, but is a fragment consisting of 90 amino acids at the C-terminal (SEQ ID NO: 3) estimated from the molecular weight. The fibromodulin fragment has a molecular weight of 10,000 and a pI of 4.65.
  • the origin of the fibromodulin fragment that can be contained in the decellularized tissue composition is not particularly limited as long as it is derived from eukaryote like annexin, and the same as annexin can be mentioned.
  • the decellularized tissue composition of the present invention can include, but is not limited to, a variant of the fibromodulin fragment as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • the fibromodulin fragment variant include, for example. (1) One or more (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 1) as a whole at one or more of the amino acid sequences of the fibromodulin fragment (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3). 7, and more preferably 1-5), eg, 1-several amino acids as a whole contain deleted, substituted, inserted, and / or added amino acid sequences and have the activity of a fibromodulin fragment.
  • fibromodulin fragment for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the activity of the fibromodulin fragment includes, as the decellularized tissue composition of the present invention, improving the adhesion of cells as compared with the one containing no variant.
  • the variant of the fibromodulin fragment exhibits the same amino acid mutation, identity, conservative substitution, etc. as the annexin variant.
  • the fibromodulin fragment is produced from fibromodulin by irradiating the decellularized tissue composition with gamma rays.
  • the intensity of gamma-ray irradiation is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, but is 10 to 50 kGy, preferably 15 to 35 kGy, and more preferably 20 to 30 kGy. Within the above range, fibromodulin fragments can be produced.
  • the reason why the decellularized tissue composition of the present invention exhibits excellent strength and excellent cell adhesion is not completely understood, but can be inferred as follows.
  • the protein A eg, annexin
  • the protein A contained in the decellularized tissue composition of the present invention has 4 or 8 ⁇ -helix structures (anexin repeats) and binds to Ca 2+ and phospholipids. It is considered that the binding ability between Ca 2+ and phospholipids is related to the cell adhesion ability, but not limited to. In addition, it is considered that annexin effectively acts on the strength of decellularized tissue.
  • the protein B (for example, fibromodulin fragment) contained in the decellularized tissue composition of the present invention is produced by cleaving fibromodulin by gamma-ray irradiation.
  • Fibromodjurin has a role of stabilizing collagen fibers, and it is considered that the presence of sufficient fibromodjurin suppresses the renewal of collagen in cells.
  • the decellularized tissue composition of the present invention can be produced by a method for obtaining decellularized tissue.
  • a method for obtaining decellularized tissue in order to efficiently obtain the decellularized tissue composition and to significantly exert the effect of the present invention, it is preferable to use the method by high hydrostatic pressure treatment.
  • the protein can be added externally to the decellularized tissue obtained by any method to obtain the decellularized tissue composition of the present invention.
  • Example 1 a decellularized tissue composition was prepared by high hydrostatic pressure treatment using bovine pericardium.
  • the bovine pericardium was cut open into a sheet to remove fat entirely (hereinafter, this sheet-shaped bovine pericardium is referred to as a "pericardial sheet").
  • High-pressure processing equipment for research and development Karl Fischer Steel Co., Ltd .: Dr. CHEF was used for high hydrostatic pressure treatment at 600 MPa for 10 minutes.
  • the pericardial sheet treated with high hydrostatic pressure was treated with the nucleic acid degrading enzyme DNaseI (125 U / mL), shaken at 4 ° C for 18 hours and 5 minutes or more, and then treated in 80% ethanol at 4 ° C for 1 hour or more. Finally, it was washed with 4 L of water for injection at 4 ° C. The freeze-drying treatment was carried out to obtain the decellularized tissue composition of Example 1.
  • DNaseI 125 U / mL
  • Example 2 a decellularized material was prepared by treatment with a surfactant using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the pericardial sheet was sterilized by immersing it in a 0.1% (v / v) peracetic acid solution prepared to contain 4% ethanol at 4 ° C for 2 hours, and then sterilized with water for injection at 4 ° C. Washed for hours. Then, shake with 0.25 mass% sodium dodecyl sulfate (hereinafter, SDS) solution (10 mM Tris, pH 8.0) at 4 ° C. for 24 hours, and then 0.5 mass% Triton-X (polyoxy).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Ethylene octylphenyl ether TX solution (10 mM Tris, pH 8.0) was shaken at 4 ° C. for 24 hours. Then, after washing with 10 L of water for injection at 4 ° C., the mixture was shaken with a phosphate buffer (PBS, 0.01M, pH 7.4) at 4 ° C. for 1 hour. After freeze-drying treatment, annexin A2 was added so as to be 0.3% by mass based on the weight of the decellularized tissue composition, and the decellularized tissue composition of Example 2 was obtained.
  • PBS phosphate buffer
  • Example 3 a decellularized material was prepared by freeze-thaw treatment using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the pericardial sheet was frozen in dry ice, stored in a cool box containing dry ice (about ⁇ 78 ° C.) for 20 hours, and then thawed at 25 ° C.
  • the pericardial sheet obtained by repeating this freeze-thaw four times was treated with DNaseI (125 U / mL) as a nucleolytic enzyme and shaken at 4 ° C. for 96 hours. Further, it was shaken in 80% ethanol at 4 ° C.
  • annexin A2 was added so as to be 0.3% by mass based on the weight of the decellularized tissue composition, and the decellularized tissue composition of Example 3 was obtained.
  • Example 4 a decellularized material was prepared by ultrasonic treatment using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the pericardial sheet was sonicated (intensity: 10 W / cm 2 , frequency: 10 kHz, action time: 2 minutes) in physiological saline.
  • the sonicated bovine pericardium was shaken in 1 mass% TX solution (10 mM Tris, pH 8.0) at 4 ° C. for 96 hours.
  • the TX-treated pericardial sheet was treated with DNaseI (125 U / mL) as a nucleolytic enzyme and shaken at 4 ° C. for 96 hours.
  • annexin A2 was added so as to be 0.3% by mass based on the weight of the decellularized tissue composition, and the decellularized tissue composition of Example 4 was obtained.
  • Example 5 a decellularized material was prepared by high hydrostatic pressure treatment using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the bovine pericardium was cut open into a sheet and the fat was completely removed to obtain a pericardial sheet.
  • High-pressure processing equipment for research and development Karl Fischer Steel Co., Ltd .: High hydrostatic pressure treatment for 10 minutes was performed at 600 MPa with Dr. CHEF).
  • the pericardial sheet treated with high hydrostatic pressure was treated with the nucleic acid degrading enzyme DNase 125 U / mL, shaken at 4 ° C for 18 hours and 5 minutes or more, then treated in 80% ethanol at 4 ° C for 1 hour or more, and finally 4 Washing was performed with 4 L of water for injection at ° C. Freeze-drying treatment was performed to obtain a decellularized bovine heart cyst. Annexin A2 was added so as to be 1.0% by mass (total content) per weight of the decellularized tissue composition to obtain the decellularized tissue composition of Example 5.
  • Example 6 a decellularized material was prepared by treatment with a surfactant using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the pericardial sheet was sterilized by immersing it in a 0.1% (v / v) peracetic acid solution prepared to contain 4% ethanol at 4 ° C for 2 hours, and then sterilized with water for injection at 4 ° C. Washed for hours. Then, shake with 0.25% by mass SDS solution (10 mM Tris, pH 8.0) at 4 ° C. for 24 hours, and then with 0.5% by mass TX solution (10 mM Tris, pH 8.0) 4 Shake at ° C for 24 hours.
  • Example 7 a decellularized material was prepared by freeze-thaw treatment using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the pericardial sheet was frozen in dry ice, stored in a cool box containing dry ice (about ⁇ 78 ° C.) for 20 hours, and then thawed at 25 ° C.
  • the pericardial sheet obtained by repeating this freeze-thaw four times was treated with DNaseI (125 U / mL) as a nucleolytic enzyme and shaken at 4 ° C. for 96 hours. Further, it was shaken in 80% ethanol at 4 ° C.
  • Example 8 a decellularized material was prepared by ultrasonic treatment using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the pericardial sheet was sonicated (intensity: 10 W / cm 2 , frequency: 10 kHz, action time: 2 minutes) in physiological saline.
  • the sonicated bovine pericardium was shaken in 1 mass% TX solution (10 mM Tris, pH 8.0) at 4 ° C. for 96 hours.
  • the TX-treated pericardial sheet was treated with DNaseI (125 U / mL) as a nucleolytic enzyme and shaken at 4 ° C. for 96 hours.
  • Comparative Example 1 a decellularized material was prepared by treating with a surfactant using bovine pericardium.
  • the pericardial sheet was sterilized by immersing it in a 0.1% (v / v) peracetic acid solution prepared to contain 4% ethanol at 4 ° C for 2 hours, and then sterilized with water for injection at 4 ° C. Washed for hours. Then, shake with 0.25 mass% SDS solution (10 mM Tris, pH 8.0) at 4 ° C. for 24 hours, and then with 0.5 mass% TX solution (10 mM Tris, pH 8.0) for 4 hours. Shake at ° C for 24 hours.
  • a decellularized material was prepared by freeze-thaw treatment using bovine pericardium.
  • the pericardial sheet was frozen in dry ice, stored in a cool box containing dry ice (about ⁇ 78 ° C.) for 20 hours, and then thawed at 25 ° C.
  • the pericardial sheet obtained by repeating this freeze-thaw four times was treated with DNaseI (125 U / mL) as a nucleolytic enzyme and shaken at 4 ° C. for 96 hours. Further, it was shaken in 80% ethanol at 4 ° C. for 96 hours, and then shaken in water for injection at 4 ° C. for 2 hours. Freeze-drying treatment was performed to obtain a decellularized bovine heart cyst (decellularized material) of Comparative Example 2.
  • a decellularized material was prepared by ultrasonic treatment using bovine pericardium.
  • the pericardial sheet was sonicated (intensity: 10 W / cm 2 , frequency: 10 kHz, action time: 2 minutes) in physiological saline.
  • the sonicated bovine pericardium was shaken in 1 mass% TX solution (10 mM Tris, pH 8.0) at 4 ° C. for 96 hours.
  • the TX-treated pericardial sheet was treated with DNaseI (125 U / mL) as a nucleolytic enzyme and shaken at 4 ° C. for 96 hours. Further, it was shaken in 80% ethanol at 4 ° C. for 72 hours, and then shaken in physiological saline at 4 ° C. for 2 hours. Freeze-drying treatment was performed to obtain a decellularized bovine heart cyst (decellularized material) of Comparative Example 3.
  • ⁇ Cell adhesion test The decellularized tissue composition or decellularized material obtained in Examples and Comparative Examples was cut into a disk shape having a diameter of 4 mm using autoclaved scissors and tweezers, and used as a cell insert for 96-well plate. I set it. 175 ⁇ L of DMEM medium was added to the lower side of the cell insert and 15 ⁇ L to the upper side, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours or more to acclimate the decellularized tissue composition or decellularized material. After removing DMEM medium, human skin fibroblasts (NHDF) were seeded (7.0 ⁇ 104 cells / cm 2 ) and cultured at 37 ° C. for 3 hours.
  • NHDF human skin fibroblasts
  • Example 9 a decellularized tissue composition was prepared by high hydrostatic pressure treatment using pig liver.
  • the pig liver was cut open into a sheet to remove fat entirely (hereinafter, this sheet-shaped pig liver is referred to as a "liver sheet").
  • High-pressure processing equipment for research and development (Kobe Steel Co., Ltd .: Dr. .CHEF) was subjected to high hydrostatic pressure treatment at 600 MPa for 10 minutes.
  • the liver sheet treated with high hydrostatic pressure was treated with the nucleic acid degrading enzyme DNaseI (125 U / mL), shaken at 4 ° C for 18 hours and 5 minutes or more, and then treated in 80% ethanol at 4 ° C for 1 hour or more, and finally.
  • the freeze-drying treatment was carried out to obtain the decellularized tissue composition of Example 9.
  • Example 10 a decellularized material was prepared by high hydrostatic pressure treatment using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the bovine pericardium was cut open into a sheet and the fat was completely removed to obtain a pericardial sheet.
  • High-pressure processing equipment for research and development Karl Fischer Steel Co., Ltd .: High hydrostatic pressure treatment for 10 minutes was performed at 600 MPa with Dr. CHEF).
  • the pericardial sheet treated with high hydrostatic pressure was treated with the nucleic acid degrading enzyme DNase 125 U / mL, shaken at 4 ° C for 18 hours and 5 minutes or more, then treated in 80% ethanol at 4 ° C for 1 hour or more, and finally 4 Washing was performed with 4 L of water for injection at ° C. Freeze-drying treatment was performed to obtain a decellularized bovine heart cyst. Annexin A2 was added so as to be 3.0% by mass (total content) per weight of the decellularized tissue composition to obtain the decellularized tissue composition of Example 10.
  • Example 11 a decellularized tissue composition was prepared by high hydrostatic pressure treatment using bovine pericardium.
  • the bovine pericardium was cut open into a sheet to remove fat entirely (hereinafter, this sheet-shaped bovine pericardium is referred to as a "pericardial sheet").
  • High-pressure processing equipment for research and development Karl Fischer Steel Co., Ltd .: Dr. CHEF was used for high hydrostatic pressure treatment at 600 MPa for 10 minutes.
  • the pericardial sheet treated with high hydrostatic pressure was treated with the nucleic acid degrading enzyme DNaseI (125 U / mL), shaken at 4 ° C for 18 hours and 5 minutes or more, and then treated in 80% ethanol at 4 ° C for 1 hour or more. Finally, it was washed with 4 L of water for injection at 4 ° C. After freeze-drying treatment, gamma-ray irradiation (25 kGy) was performed to obtain a decellularized tissue composition of Example 11.
  • DNaseI 125 U / mL
  • Example 12 a decellularized material was prepared by high hydrostatic pressure treatment using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the bovine pericardium was cut open into a sheet and the fat was completely removed to obtain a pericardial sheet.
  • High-pressure processing equipment for research and development Karl Fischer Steel Co., Ltd .: High hydrostatic pressure treatment for 10 minutes was performed at 600 MPa with Dr. CHEF).
  • the pericardial sheet treated with high hydrostatic pressure was treated with the nucleic acid degrading enzyme DNase 125 U / mL, shaken at 4 ° C for 18 hours and 5 minutes or more, then treated in 80% ethanol at 4 ° C for 1 hour or more, and finally 4 Washing was performed with 4 L of water for injection at ° C.
  • decellularized bovine heart cyst was obtained by gamma-ray irradiation (25 kGy).
  • Annexin A2 was added so as to be 1.0% by mass (total content) per weight of the decellularized bovine heart membrane to obtain the decellularized tissue composition of Example 12.
  • Example 13 a decellularized material was prepared by high hydrostatic pressure treatment using bovine pericardium, and annexin A2 was added to obtain a decellularized tissue composition.
  • the bovine pericardium was cut open into a sheet and the fat was completely removed to obtain a pericardial sheet.
  • High-pressure processing equipment for research and development Karl Fischer Steel Co., Ltd .: High hydrostatic pressure treatment for 10 minutes was performed at 600 MPa with Dr. CHEF).
  • the pericardial sheet treated with high hydrostatic pressure was treated with the nucleic acid degrading enzyme DNase 125 U / mL, shaken at 4 ° C for 18 hours and 5 minutes or more, then treated in 80% ethanol at 4 ° C for 1 hour or more, and finally 4 Washing was performed with 4 L of water for injection at ° C.
  • decellularized bovine heart cyst was obtained by gamma-ray irradiation (25 kG).
  • Annexin A2 was added so as to be 3.0% by mass (total content) per weight of the decellularized bovine heart membrane to obtain the decellularized tissue composition of Example 13.
  • Example 9 The above-mentioned cell adhesion test was performed on Examples 9 to 13. The results are shown in FIG. It was found that Examples 9 to 13 had a larger number of cell adhesions and had a better cell-inducing effect than Comparative Example 1. In particular, Example 11 had a good cell-inducing effect. In Example 9, it was found that good results were also obtained using pig liver.
  • test piece As the width (mm) of the test piece, the length (40 mm) of the punched blade type cutting surface tube of the parallel portion was used as it was.
  • the cross-sectional area A (mm 2 ) of the test piece was calculated from the thickness and width of the test piece by the following formula.
  • A t ⁇ w (A: test piece cross-sectional area (mm 2 ), t: test piece thickness (mm), w: test piece width mm)) (3)
  • Test procedure The tensile test was carried out as follows in accordance with ISO37. In order to evenly distribute the tensile force over the cross section, the test piece was attached to a mechanical tester (MCT2150, manufactured by AND) so that both ends of the test piece were held in contrast.
  • the distance between the marked lines Lb (mm) for operating the testing machine was measured.
  • the speed of the grip was set to 200 mm / min. Specimen data broken outside between the markings was rejected and repeated tests were performed with additional specimens. The test piece was taken until it was measured correctly 3 times. From the measured values, the breaking strength [MPa] and elastic modulus [MPa] (at 10% elongation and at maximum) were calculated by the following formulas. (4) Result calculation ⁇ Breaking strength> The breaking strength (MPa (N / mm 2 )) was calculated by the following formula.
  • Breaking strength (MPa) maximum load (N) / cross section of test piece (mm 2 ) ⁇ Elastic modulus> The elastic modulus (stress / elongation strain)) was calculated by the following formula.
  • Elastic modulus (MPa) load (MPa (N / mm 2 )) / elongation strain ((LL 0 ) / L 0 )
  • the tear strength test of the decellularized tissue composition or the decellularized material obtained in Examples and Comparative Examples was carried out as follows. (1) Collection and preparation of test pieces A freeze-dried decellularized tissue composition or decellularized material was immersed in physiological saline for 15 minutes or more. It was collected from the swollen decellularized tissue composition or decellularized material so as to be 20 mm ⁇ 15 mm. A hole with a diameter of 6 mm was drilled at a position 2 mm from the top of the long side. A thread was passed through the hole to prepare a test piece. (2) Test procedure One end of the test piece was attached to the grip of the mechanical tester (MCT2150, manufactured by AND), and the thread was attached to the hook type fixator. The speed of the grip was set to 200 mm / min. The test piece was taken until it was measured correctly 3 times. The measured value was calculated as the maximum load [N] at the time of breakage.
  • Examples 1 and 11 required less force to stretch by 10% than Comparative Example 1, that is, they were soft and had good handleability. Further, Examples 1 and 11 have a larger maximum elastic modulus than Comparative Example 1 and are close to the elastic modulus of human pericardium 49.62 ⁇ 3.22 (MPa, see Interactive CardioVascularand Thoric Surgery 22 (2016) 72-84). It showed the value. As a result, when transplanted into a patient, it is easy to become familiar with the patient's tissue, and the structural stability can be maintained with respect to pulse, pulsation, and the like.
  • Example 1 showed a maximum elastic modulus of 53.9 Mpa. Further, it was found that Examples 1 and 11 had higher breaking strength, that is, higher strength and higher strength than Comparative Example 1. Further, it was found that Examples 1 and 11 had higher tear strength than Comparative Example 1, that is, they were resistant to threading and had high suture strength when used in surgery. As described above, it was found that Examples 1 and 11 had better handleability and were stronger than Comparative Example 1.
  • a protein dissolving solution (containing urea and a surfactant) was added to prepare a total volume of 0.34 mL (protein 200 ⁇ g), which was used as a sample solution.
  • the sample solution was placed in a swelling tray, and the first-dimensional electrophoresis precast gel was placed over the solution. Further, a dry strip cover solution was layered and allowed to stand overnight. The swollen precast gel was set in an electrophoresis device and electrophoresed (500 V for 1 minute, 3500 V for 7.5 hours, 20 ° C.). An acrylamide gel with a concentration gradient of 10-20% was used. After preparation, the mixture was allowed to stand for 24 hours to completely polymerize acrylamide.
  • the equilibrated one-dimensional electrophoresis precast gel was placed on an acrylamide gel and fixed with a 1% agarose solution containing 0.125% bromophenol blue. A molecular weight marker was applied to the left end of the gel to make it a standard for molecular weight. The bromophenol blue band was run at 80 V for 17 hours until it was visible at the bottom of the gel.
  • the gel after migration was stained with a fluorescent stain for detecting all proteins (SYPRO Ruby protein gel stain, S21900, Thermo Fisher Scientific Inc.), and the image was preserved using a fluorescent scanner.
  • the image was captured by the scanner with an excitation wavelength of 488 nm, a fluorescence filter of 640 nm Bandpass, and a resolution of 100 micrometer.
  • silver staining was performed using silver nitrate (195-09382, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the silver-stained image after development was captured using a flatbed scanner. The results of two-dimensional electrophoresis are shown in FIG.
  • Example 1 three spots (1 to 3) were detected at isoelectric points pI 6 to 9 and a molecular weight of 30,000 to 40,000. On the other hand, in Comparative Example 1, the three spots detected in Example 1 were not detected. Also in Comparative Examples 2 and 3, the three spots detected in Example 1 were not detected. Example 1 was found to contain a specific protein not found in Comparative Examples 1-3.
  • spot identification Spots visualized by silver staining were cut out, 100 ⁇ L of 15 mM potassium ferricyanide and 50 mM sodium thiosulfate were added to a gel piece cut into 1 mm square pieces, and the mixture was shaken for 10 minutes. The solution was discarded, Milli-Q water was added, the mixture was shaken, and the gel pieces were washed until the color was removed. Acetonitrile was added to the gel pieces to dehydrate them. The gel pieces were swollen by adding 10 ⁇ L of an enzyme solution of 100 mM ammonium hydrogen carbonate and 0.01 ⁇ g / ⁇ L trypsin, and the gel pieces were kept at 37 ° C. for 16 hours.
  • Table 1 shows the results of identifying the three spots of Example 1 using a mass spectrometer.
  • the spot numbers in Table 1 and Table 2 described later correspond to the three spot numbers in FIG.
  • the three spots were identified as Annexin A2.
  • the protein weight per spot was calculated from the ratio of the weight of the protein subjected to two-dimensional electrophoresis to 200 ⁇ g and each spot signal (spot signal concentration) to the total sum of the spot signals.
  • spot 1 to 0.7 ⁇ g, spot 2 to 2.0 ⁇ g, and spot 3 to 0.8 ⁇ g A total protein weight of 3.5 ⁇ g was calculated from the three spots.
  • Example 1 (Calculation of protein weight of 3 spots contained in decellularized tissue composition) From the relationship between the weight of the purified and recovered protein and the weight of the two-dimensionally electrophoresed protein, the protein weights of the three spots per 20 mg of the decellularized tissue composition were calculated. The results are shown in Table 2. In Example 1, protein weights were calculated from the three spots. Example 1 contained 0.43% by weight of protein A. On the other hand, in Comparative Example 1, the protein weight corresponding to these three spots was not calculated. Also in Comparative Examples 2 and 3, the protein weight corresponding to the three spots was not calculated.
  • the proteins of the decellularized tissue compositions of Examples 9 and 11 to 13 were analyzed in the same manner.
  • the results of the two-dimensional electrophoresis of Example 9 are shown in FIG. 7A. Similar to Example 1, three spots (4 to 6) were detected at isoelectric points pI 6 to 9 and a molecular weight of 30,000 to 40,000.
  • the results of the two-dimensional electrophoresis of Example 11 are shown in FIG. 7B. Three spots (7-9) are detected at an isoelectric point pI6-9 and a molecular weight of 30,000-40,000, and at an isoelectric point pI4-5 and a molecular weight of 8,000-12,000. Spot (10) was detected. Spot 10 was detected only in Examples 11-13.
  • Example 9 The spots of Examples 9 and 11 were identified. The results of Example 9 are shown in Table 3. The spot numbers in Table 3 and Table 5 described later correspond to the spot numbers in FIG. 7A. Spots 4 to 6 of Example 9 were identified as Annexin A2 as in Example 1 (see Spot Nos. 1 to 3 in Table 1).
  • Table 4 shows the results of Example 11.
  • the spot numbers in Table 4 and Table 6 described later correspond to the spot numbers in FIG. 7B.
  • Spots 7-9 of Example 11 were identified as Annexin A2 as in Example 1, and Spot 10 was identified as a fibromodulin-derived peptide.
  • Example 9 the spot signal concentration was calculated and the spot weight was calculated.
  • Example 9 0.14 ⁇ g from spot 4, 0.27 ⁇ g from spot 5, and 0.03 ⁇ g from spot 6 were obtained.
  • a total protein weight of 0.44 ⁇ g was calculated from the three spots.
  • Example 11 the protein weights of 0.7 ⁇ g from the spot 7, 1.6 ⁇ g from the spot 8, 0.4 ⁇ g from the spot 9, and 2.7 ⁇ g in total from the three spots were calculated, and the protein weight was calculated from the spot 10 to 0.
  • a protein weight of 24 ⁇ g was calculated.
  • Example 9 contained 0.05% by weight of protein A.
  • Example 11 contained 0.33% by mass of protein A and 0.03% by mass of protein B.
  • the decellularized tissue composition of the present invention can be used as a tissue for transplantation showing good tissue regeneration.

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Abstract

本発明の目的は、適切な強度、及び良好な組織再生を示す脱細胞化組織を提供することである。　前記課題は、本発明の脱細胞化組織と、（ａ）分子量：３０，０００～７０，０００及び（ｂ）等電点：ｐＩ６．００～９．００のタンパク質Ａとを含有する脱細胞化組織組成物によって解決することができる。

Description

脱細胞化組織組成物
　本発明は、脱細胞化組織組成物に関する。
　他人や異種の動物の生体組織由来の移植片を移植する場合、被移植者側組織による移植片の拒絶反応が問題となる。このような問題の解決方法として、人工組織の開発が期待されている。素材として種々の高分子が試されているが、これら素材と生体組織との適合性が低いため、移植片と生体組織との接合部位における脱落や感染症が発生する問題がある。
　そこで、生体組織との適合性を向上すべく、生体組織から細胞を除却して残存する支持組織（細胞外マトリックス、ＥＣＭ）からなる脱細胞化組織を移植片として使用する技術が開発されてきた。脱細胞化とは、被移植者にとって抗原性をもつ核酸などの細胞成分を除去することを意味し、これによって免疫拒絶を回避できる。
　脱細胞化組織は、例えば界面活性剤を含有する処理液を用いて、生体組織を脱細胞化することによって製造することができる（特許文献１～３）。
特表２００５－５１４９７１号公報 特表２００６－５０７８５１号公報 特表２００５－５３１３５５号公報
　再生医療において脱細胞化組織を使用する場合には、拒絶反応がないことに加えて、組織の再生が速やかに行えることが重要である。適切な強度を有し、そして良好な組織再生を示す脱細胞化組織が望まれている。
　従って、本発明の目的は、適切な強度、及び良好な組織再生を示す脱細胞化組織を提供することである。
　本発明者は、適切な強度、及び良好な組織再生を有する脱細胞化組織について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、特定のタンパク質を含む脱細胞化組織組成物が、優れた強度及び細胞接着性を有し、良好な組織再生を促すことを見出した。
　本発明は、こうした知見に基づくものである。
　従って、本発明は、
［１］脱細胞化組織と、（ａ）分子量：３０，０００～７０，０００及び（ｂ）等電点：ｐＩ６．００～９．００のタンパク質Ａとを含有する脱細胞化組織組成物、
［２］（ａ）分子量：３，０００～１５，０００及び（ｂ）等電点：ｐＩ３．００～５．５０のタンパク質Ｂを更に含有する［１］に記載の脱細胞化組織組成物、
［３］前記タンパク質Ａの含有量が、脱細胞化組織組成物に対して０．０１～５．０質量％である［１］又は［２］に記載の脱細胞化組織組成物、
［４］前記タンパク質Ｂの含有量が、脱細胞化組織組成物に対して０．００１～３．０質量％である［１］～［３］のいずれかに記載の脱細胞化組織組成物、
［５］タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂの組成物中の質量比が、Ａ：Ｂ＝５：１～１５０：１である［１］～［４］のいずれかに記載の脱細胞化組織組成物、
［６］乾燥質量あたりのＤＮＡ含有量が、脱細胞化組織組成物に対して０．０３００質量％以下である［１］～［５］のいずれかに記載の脱細胞化組織組成物、
［７］前記タンパク質が、アネキシンである［１］～［６］のいずれかに記載の脱細胞化組織組成物、及び
［８］前記タンパク質Ｂが、フィブロモジュリン由来ペプチドである［１］～［７］のいずれかに記載の脱細胞化組織組成物、
に関する。
　本発明の脱細胞化組織組成物によれば、適度な強度及び優れた細胞接着性を示すことから、生体内において良好な組織再生能（例えば、細胞の誘因効果及び分化誘導効果）を示すことができる。また、優れた強度を有することによって、施術時において、優れたハンドリング性能を示す。
実施例１及び比較例１の脱細胞化組織の二次元電気泳動における、実施例１及び比較例１で異なるタンパク質のスポットを示した図である。 実施例１～１３並びに比較例１及び３の脱細胞化組織組成物の細胞接着性試験の結果を示したグラフである。 実施例１及び１１並びに比較例１の脱細胞化組織組成物の１０％伸長時弾性率を示したグラフである。 実施例１及び１１並びに比較例１の脱細胞化組織組成物の最大弾性率を示したグラフである。 実施例１及び１１並びに比較例１の脱細胞化組織組成物の破断強度を示したグラフである。 実施例１及び１１並びに比較例１の脱細胞化組織組成物の引裂き強度を示したグラフである。 実施例９及び１１の脱細胞化組織の二次元電気泳動における、比較例１と異なるタンパク質のスポットを示した図である。
　本発明の脱細胞化組織組成物は、脱細胞化組織と、（ａ）分子量：３０，０００～７０，０００及び（ｂ）等電点：ｐＩ６．００～９．００のタンパク質（以下、タンパク質Ａと称することがある）とを含有する。本発明の脱細胞化組織組成物は、（ａ）分子量：３，０００～１５，０００及び（ｂ）等電点：ｐＩ３．００～５．５０のタンパク質（以下、タンパク質Ｂと称することがある）を含んでもよい。
《脱細胞化組織》
　脱細胞化組織は、動物由来の組織から細胞成分を除去した組織であり、エラスチン、コラーゲン（Ｉ型、ＩＶ型等）、ラミニン等の細胞外マトリックス成分を主成分とする組織である。生体埋植時の拒絶反応が低く、移植先の細胞の定着及び再構築が期待でき、細胞の足場として機能する。
　本発明の組成物に含まれる脱細胞化組織を得る方法は、従来公知の方法が使用できる。本発明においては脱細胞化の方法は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば高静水圧処理による方法、凍結融解処理による方法、界面活性剤を使用する方法、超音波処理により処理する方法、酵素を使用する方法、又は高張電解質溶液で処理する方法、物理的撹拌による方法、高張液低張液法、蛋白分解酵素や核酸分解酵素等による酵素処理による方法、アルコール溶剤による処理などが挙げられ、これらの２種以上を組み合わせてもよく、脱細胞化組織組成物を効率的に得るため、また、本願発明の効果を発揮するため、高静水圧処理による方法が好ましい。
　本発明の脱細胞化組織組成物に使用する脱細胞化組織は、脊椎動物由来の生体組織であれば、特に限定されないが、拒絶反応が少ないことから、哺乳類又は鳥類由来の生体組織が好ましく、入手が容易であることから、哺乳類の家畜、鳥類の家畜又はヒト由来の生体組織が更に好ましい。哺乳類の家畜としては、ウシ、ウマ、ラクダ、リャマ、ロバ、ヤク、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、アルパカ、イヌ、タヌキ、イタチ、キツネ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス、リス、アライグマ等が挙げられる。また、鳥類の家畜としては、インコ、オウム、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、キジ、ダチョウ、ウズラ、エミュー等が挙げられる。これらの中でも、入手の安定性から、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒトの生体組織が好ましい。
　生体組織の部位としては、細胞外にマトリクス構造を持った部位が使用でき、このような部位としては、例えば、肝臓、腎臓、尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃、食道、胃、小腸、大腸、肛門、膵臓、心臓、血管、脾臓、肺、脳、骨、脊髄、軟骨、精巣、子宮、卵管、卵巣、胎盤、角膜、骨格筋、腱、神経、皮膚等が挙げられる。生体組織の部位として、組織再生の効果が高いことから、好ましくは軟骨、骨、肝臓、腎臓、心臓、心膜、大動脈、皮膚、小腸粘膜下組織、肺、脳、内胸動脈、又は脊髄であり、より好ましくは心膜、内胸動脈、肝臓、軟骨、皮膚、小腸粘膜下組織、又は脊髄である。
　前記高静水圧処理による方法により、前記脱細胞化組織を得る場合は、生体由来組織に媒体中で５０～１５００ＭＰａの静水圧を印加する。脱細胞化が十分に行われる観点から、印加する静水圧は５０ＭＰａ以上が好ましく、印加に耐えられる圧力容器が不要であり、多大なエネルギーを要さないと共に、印加に用いる媒体が水性媒体の場合には氷が生成し、生成した氷により組織がダメージを受けることを防ぐ観点から、１５００ＭＰａ以下が好ましい。印加する静水圧は８０～１３００ＭＰａがより好ましく、９０～１２００ＭＰａが更に好ましく、９５～１１００ＭＰａが更により好ましく、９５～７００ＭＰａが一層好ましく、４００～７００ＭＰａが、脱細胞化効果、減菌効果及びウイルス不活化効果を発揮し、且つ印加の容易さの観点から最も好ましい。
　静水圧の印加に使用する媒体としては、水、生理食塩水、注射用水、プロピレングリコール又はその水溶液、グリセリン又はその水溶液、糖類水溶液等が挙げられる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。これらの媒体は、界面活性剤を含んでもよい。
　高静水圧処理の温度は、氷が生成せず、熱による組織へのダメージがない温度であれば、特に限定されないが、脱細胞処理が円滑に行われ組織への影響も少ないことから０～４５℃が好ましく、４～３７℃が更に好ましく、１５～３５℃が最も好ましい。高静水圧処理の時間は、短すぎると細胞の破壊が十分行われず、長い場合にはエネルギーの浪費につながることから、高静水圧処理において、目的とする印加圧力を維持する時間は、１～１２０分が好ましく、５～６０分がより好ましく、７～３０分が更に好ましい。
　前記高静水圧処理された組織は、好ましくは核酸分解酵素処理を行う。核酸分解酵素は、静水圧が印加された生体組織からの核酸成分を除去するものであり、特に限定されるものではないが、例えば膵臓由来、脾臓由来、又は大腸菌由来のＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ）が挙げられる。
　核酸分解酵素は、前記高静水圧処理に用いた媒体（例えば、水、生理食塩水、注射用液、又は緩衝液など）に添加して、作用させることができる。添加する酵素量は、酵素の種類やユニット数（Ｕ）の定義により異なるが、当業者であれば適宜設定することができる。例えば、ＤＮａｓｅＩであれば、５０～２００Ｕ／ｍＬで使用すればよい。処理温度も、用いる核酸分解酵素によって異なるが、例えば１℃～４０℃の温度に設定すればよい。処理時間も、特に限定されるものではないが、例えば１～１２０時間（好ましくは１～９６時間、より好ましくは１～４８時間）でよく、低温の場合は長く処理し、高温の場合は短時間の処理でよい。
　前記高静水圧処理された組織は、洗浄液で洗浄する。洗浄液は、高静水圧処理の媒体と同じでもよいし異なっていてもよい。洗浄液は、有機溶媒又はキレート剤を含有することが好ましい。有機溶媒は脂質の除去効率を向上させることができ、キレート剤は、脱細胞化組織中のカルシウムイオンやマグネシウムイオンを不活性化することにより、本発明の粒子化脱細胞化組織を疾患部に適用した場合の石灰化を防ぐことができる。有機溶剤としては、脂質の除去効果が高いことから、水溶性の有機溶剤が好ましく、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルホキシドが好ましい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，３－プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、１，３－ジアミノ－２－ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ－ＯＨ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）、３－ヒドロキシ－２，２’－イミノジコハク酸（ＨＩＤＡ）、ジカルボキシメチルアスパラギン酸（ＡＳＤＡ）等のイミノカルボン酸系キレート剤又はその塩；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸等のヒドロキシカルボン酸系キレート剤又はその塩が挙げられ、これらのキレート剤の塩としては、ナトリウム塩又はカリウム塩が挙げられる。
　洗浄温度は、熱による組織へのダメージがない温度であれば、特に限定されないが、洗浄性が良好で組織への影響も少ないことから０～４５℃が好ましく、１～４０℃が更に好ましく、２～３５℃が最も好ましい。洗浄する場合には、必要に応じて、洗浄液を振とう又は撹拌してもよい。
　凍結融解処理による方法により、前記脱細胞化組織を得る場合は、生体由来組織を－８０～－２０℃（好ましくは－８０～－４０℃）の温度で、１～４８時間（好ましくは１０～３０時間）保持して凍結させた後、２０～３７℃の温度で融解する工程を、１回又は２回以上（好ましくは２～５回）繰り返して行う。その後に、核酸分解酵素処理を行うのが好ましく、核酸分解酵素処理は、前記高静水圧処理における処理と同様の方法でよい。凍結融解処理された生体組織は、組織中の細胞が破壊されており、この細胞は洗浄液により除去される。洗浄の方法は、高静水圧処理における洗浄と同様の方法でよい。
　界面活性剤を使用する方法により、前記脱細胞化組織を得る場合は、生体由来組織を界面活性剤の溶液（例えば、０．２５質量％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液）で、１～４８時間（好ましくは１２～３６時間）、２～１０℃（好ましくは４℃）で振とうする。更に、異なる界面活性剤溶液（例えば、０．５％質量％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）溶液）で、１～４８時間（好ましくは１２～３６時間）、２～１０℃（好ましくは４℃）で振とうしてもよい。その後、高静水圧処理における洗浄と同様の方法で洗浄するのが好ましい。
　界面活性剤としては、限定されるものではないが、例えばドデシル硫酸ナトリウム、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、α－スルホ脂肪酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）、アルキル（ポリ）グリコシドが挙げられる。
　超音波処理により処理する方法により、前記脱細胞化組織を得る場合は、生体由来組織を、例えば生理食塩水中で、超音波処理（例えば、強度：１０Ｗ／ｃｍ２、周波数：１０ｋＨｚ、作用時間：２分間）する。その後、好ましくは、界面活性剤溶液（例えば、１％質量％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）溶液）で、１～１２０時間（好ましくは１２～１２０時間）、２～１０℃（好ましくは４℃）で振とうする。更に、核酸分解酵素処理を行うのが好ましく、核酸分解酵素処理は、前記高静水圧処理における処理と同様の方法でよい。その後、高静水圧処理における洗浄と同様の方法で洗浄するのが好ましい。
　得られた脱細胞化組織は、限定されるものではないが、凍結乾燥処理を行うことが好ましい。凍結乾燥は、生体組織の部位によって省略できる。また、得られた脱細胞化組織は、ガンマ線照射、ＵＶ照射等により、滅菌してもよく、ガンマ線照射により滅菌することが好ましい。
　前記脱細胞化組織の含有量としては、本発明の効果を発揮する観点から、脱細胞化組織組成物に対して９０．０～１００．０質量％が好ましく、９５．０～１００．０質量％がより好ましく、９６．０～１００．０質量％が更に好ましく、９７．０～１００．０質量％が最も好ましい。
（脱細胞化ＤＮＡ比（ＤＮＡ含有量））
　一般に脱細胞化組織組成物のＤＮＡ含有量は少ないことが好ましいとされているが、本発明における脱細胞化組織組成物では、乾燥質量あたりのＤＮＡ含有量は、脱細胞化組織組成物に対して、０．０３００質量％以下であることが好ましい。これにより、再生医療に使用した場合に拒絶反応が発生すること防止できる。細胞の誘引効果や分化誘導効果の点から、本発明の脱細胞化組織組成物の脱細胞化ＤＮＡ比は、０．０２５０質量％以下がより好ましく、０．０２００質量％以下が更に好ましく、０．０１５０質量％以下が一層好ましく、０．０１２０質量％以下が最も好ましい。脱細胞化ＤＮＡ比が０．０１５０質量％以下であると、脱細胞化組織組成物への細胞接着性を特に高めやすい点で好ましい。
　脱細胞化ＤＮＡ比の下限は、特に限定されないが、低いほど好ましく、実現のしやすさから好ましくは０．０００１質量％以上、更に好ましくは０．０００２質量％以上である。
　ＤＮＡ含有量は、ピコグリーン法によって測定することができる。脱細胞化組織組成物の乾燥試験片（以下、サンプルと称する場合がある。）をタンパク質分解酵素溶液に浸漬して溶解した後、フェノール／クロロホルムで処理してタンパク質を除去し、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収する。回収したＤＮＡをピコグリーン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により蛍光染色して蛍光強度を測定することによりＤＮＡを定量し、サンプルのＤＮＡ含有量（質量）を算出する。定量は、ピコグリーンに添付された標準ＤＮＡを用いて作成した検量線を用いる。サンプルの乾燥質量とＤＮＡ含有量から、下記の式に従ってＤＮＡ比を計算する。
（乾燥質量あたりのＤＮＡ含有量（以下、脱細胞化ＤＮＡ比と称する場合がある。）＝（脱細胞化組織組成物の乾燥試験片のＤＮＡ含有量）／（脱細胞化組織組成物の乾燥試験片の質量）
《タンパク質》
　本発明の脱細胞化組織組成物は、（ａ）分子量：３０，０００～７０，０００及び（ｂ）等電点：ｐＩ６．００～９．００のタンパク質Ａを含む。本発明の脱細胞化組織組成物は、（ａ）分子量：３，０００～１５，０００及び（ｂ）等電点：ｐＩ３．００～５．５０のタンパク質を更に含んでもよい。これにより、本発明の効果をより発揮できる。
　前記タンパク質の分子量、及び等電点（ｐＩ）は、例えばタンパク質を二次元電気泳動し、タンパク質の同定は質量分析によって行うことができる。
　二次元電気泳動法において、等電点分離及び分子量分離のいずれを先に（一次元目として）行ってもよいが、測定の精度を上げる観点から、一次元目で等電点分離を行い、二次元目で分子量分離を行うことが好ましい。二次元電気泳動法は常法に従って行うことができ、市販されているキット及び装置を用いることができる。例えば、キャピラリーゲル又はストリップゲルなどを分離媒体として等電点電気泳動を行い、泳動を終了したゲルを平面状のゲル（例えば、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル）を用いて等電点電気泳動の展開方向に対して直角の方向に電気泳動を行って分子量分離することができる。二次元電気泳動を行ったゲルを常法に従って染色することにより、タンパク質の有無、分子量、等電点を確認できる。
　前記タンパク質Ａの分子量としては、本発明の効果を発揮する観点から、３０，０００～７０，０００が好ましく、３０，０００～５０，０００がより好ましく、３０，０００～４０，０００が更に好ましい。前記タンパク質Ａの等電点（ｐＩ）としては、６．００～９．００が好ましく、６．００～８．５０がより好ましく、６．５０～８．５０が更に好ましい。
　前記タンパク質Ａとして、好ましくはアネキシンが挙げられる。アネキシンは４個又は８個のα－へリックス構造のいわゆるアネキシンリピート（約７０アミノ酸残基）からなる彎曲したコアドメインを有するタンパク質である。アミノ末端側ドメインはそれぞれのアネキシンに固有の配列（１１～１９６残基）であるが、カルボキシ末端側のドメインはアネキシン間でよく保存されている。カルシウム結合部位やリン脂質結合部位はカルボキシ末端側のドメイン上に存在している。８個のアネキシンリピートを有するアネキシンＶＩの分子量は、約６６ｋである。
　脱細胞化組織組成物に含まれるアネキシンの由来は、真核生物由来であれば、特に限定されるものではないが、哺乳類又は鳥類由来のアネキシンが好ましい。哺乳類としては、ウシ、ウマ、ラクダ、リャマ、ロバ、ヤク、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、アルパカ、イヌ、タヌキ、イタチ、キツネ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス、リス、又はアライグマ等が挙げられる。また、鳥類としては、インコ、オウム、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、キジ、ダチョウ、ウズラ、又はエミュー等が挙げられる。
　脊椎動物においては、アネキシンＡ１～Ａ１１、Ａ１３の１２種類のアネキシンが存在しており、Ｃａ２＋とリン脂質との結合部位を有している。例えば、アネキシンＡ２の凹面のＮ末端領域にＣ末端リジンを有するＳ１００Ａ１０が結合し、組織型プラスミノゲンアクチベータ（ｔＰＡ）とプラスミノゲンの結合部位となる。
　前記アネキシンは、修飾の異なるアネキシンを含む。すなわち、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、又はアセチル化された、又はこれらの修飾をされていないアネキシンを含む。例えば、実施例に記載のアネキシンＡ２は、リン酸化の異なる３種のアネキシンＡ２であるが、いずれも本発明の効果を示すことができる。
　更に、本発明の脱細胞化組織組成物は、限定されるものではないが、本発明の効果が得られる限りにおいて、アネキシンの改変体を含むことができる。アネキシン改変体としては、例えば、
（１）アネキシンのアミノ酸配列（例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列）の１又は複数の箇所において、全体として１又は複数個（好ましくは１～１０個、より好ましくは１～７個、更に好ましくは１～５個）、例えば、全体として１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかもアネキシンの活性を有するポリペプチド、又は
（２）アネキシンのアミノ酸配列（例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列）との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかもアネキシンの活性を有するポリペプチド、が挙げられる。
　アネキシンの活性としては、例えば「Ｃａ２＋とリン脂質」との結合能が挙げられる。あるいは、本発明の脱細胞化組織組成物として、改変体を含まないものと比較して、細胞の接着性を向上させることが挙げられる。
（１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列）
　前記改変体は、アネキシン（例えば、配列番号１）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記改変体のポリペプチドは、Ｃａ２＋とリン脂質との結合能を有する。すなわち、Ｃａ２＋とリン脂質との結合能を示さないポリペプチドは、前記改変体のポリペプチドに含まれない。本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、例えば１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個であることができ、好ましくは１～８個、より好ましくは１～６個、更に好ましくは１～５個、最も好ましくは１～２個である。本発明に用いることのできる改変体のアミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
（アミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列）
　前記改変体は、アネキシン（例えば、配列番号１）のアミノ酸配列に対してアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記改変体のポリペプチドは、Ｃａ２＋とリン脂質との結合能を有する。すなわち、Ｃａ２＋とリン脂質との結合能を示さないポリペプチドは、前記改変体のポリペプチドに含まれない。より好ましくは該同一性が９５％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは９６％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは９７％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、且つＣａ２＋とリン脂質との結合能を示すポリペプチドである。
　前記アネキシン（例えば、配列番号１）のアミノ酸配列において「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」又は「同一性が９０％以上であるアミノ酸配列」は、アネキシン（例えば、配列番号１）のアミノ酸配列が置換されたものであるが、このアミノ酸配列の置換は、本発明に用いられるアネキシンの機能を維持する保存的置換である。換言すると「保存的置換」とは、アネキシンの優れた効果が失われない置換を意味する。すなわち、前記挿入、置換、又は欠失、若しくは付加された場合であっても、アネキシンのＣａ２＋とリン脂質との結合能が維持できる置換である。具体的には、アミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　前記タンパク質Ａの含有量としては、脱細胞化組織組成物に対して０．０１～５．０質量％が好ましく、０．０３～４．５質量％がより好ましく、０．０５～４．０質量％が更に好ましく、０．１～３．５質量％が更により好ましく、０．２～３．３質量％が一層好ましく、０．３～３．０質量％が最も好ましい。これにより、本発明の効果を発揮できる。
　前記タンパク質Ｂの分子量としては、本発明の効果を発揮する観点から、３，０００～１５，０００が好ましく、５，０００～１４，０００がより好ましく、７，０００～１３，０００が更に好ましい。前記タンパク質の等電点（ｐＩ）としては、３．００～５．５０が好ましく、３．４０～５．３０がより好ましく、３．８０～５．２０が更に好ましい。
　前記タンパク質Ｂの含有量としては、脱細胞化組織組成物に対して０．００１～３．０質量％が好ましく、０．００３～２．０質量％がより好ましく、０．００５～１．５質量％が更に好ましく、０．００８～１．０質量％が更により好ましく、０．００９～０．５質量％が一層好ましく、０．０１～０．１質量％が最も好ましい。これにより、本発明の効果を発揮できる。
　本発明の脱細胞化組織組成物は、タンパク質Ａと、タンパク質Ｂを、これらの質量比が、Ａ：Ｂ＝５：１～１５０：１の範囲で含有することが好ましく、８：１～１１０：１の範囲で含有することがより好ましく、１０：１～５０：１の範囲で含有することが更に好ましい。これにより、本発明の効果を効率的に発揮できる。
　前記タンパク質Ｂとして、好ましくはフィブロモジュリンの断片が挙げられる。フィブロモジュリンは、主に繊維性コラーゲンに結合するタンパク質であり、コラーゲン繊維同士を結合させる役割を有していると考えられる。フィブロモジュリンの発現が上昇すると、コラーゲン繊維の密度が増加することが知られている。フィブロモジュリンは３７５のアミノ酸からなるタンパク質（配列番号２）であり、分子量は４３，０００であり、ｐＩは５．６である。
　タンパク質Ｂは、フィブロモジュリンの断片であり、限定されるものではないが分子量から推定すると、Ｃ末端の９０アミノ酸からなる断片（配列番号３）である。フィブロモジュリン断片は、分子量１０，０００、ｐＩ４．６５である。
　脱細胞化組織組成物に含まれることのできるフィブロモジュリン断片の由来は、アネキシンと同じように真核生物由来であれば、特に限定されるものではなく、アネキシンと同じものが挙げられる。
　本発明の脱細胞化組織組成物は、限定されるものではないが、本発明の効果が得られる限りにおいて、フィブロモジュリン断片の改変体を含むことができる。フィブロモジュリン断片改変体としては、例えば、
（１）フィブロモジュリン断片のアミノ酸配列（例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列）の１又は複数の箇所において、全体として１又は複数個（好ましくは１～１０個、より好ましくは１～７個、更に好ましくは１～５個）、例えば、全体として１～数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかもフィブロモジュリン断片の活性を有するポリペプチド、又は
（２）フィブロモジュリン断片のアミノ酸配列（例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列）との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかもフィブロモジュリン断片の活性を有するポリペプチド、が挙げられる。
　フィブロモジュリン断片の活性としては、本発明の脱細胞化組織組成物として、改変体を含まないものと比較して、細胞の接着性を向上させることが挙げられる。
　フィブロモジュリン断片の改変体は、前記アネキシン改変体と同様のアミノ酸変異、同一性、及び保存的置換等を示すものである。
　前記フィブロモジュリン断片は、脱細胞化組織組成物をガンマ線照射することによって、フィブロモジュリンから生成されると考えられる。ガンマ線照射の強度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、１０～５０ｋＧｙであり、好ましくは１５～３５ｋＧｙであり、より好ましくは２０～３０ｋＧｙである。前記範囲であることによって、フィブロモジュリン断片を生成することができる。
《作用》
　本発明の脱細胞化組織組成物が、優れた強度及び優れた細胞接着性を示す理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
　本発明の脱細胞化組織組成物に含まれるタンパク質Ａ（例えば、アネキシン）は、４個又は８個のα－へリックス構造（アネキシンリピート）を有し、Ｃａ２＋とリン脂質に結合する。限定されるものではないが、Ｃａ２＋とリン脂質との結合能が、細胞接着能に関連しているものと考えられる。また、アネキシンが脱細胞化組織の強度に効果的に作用しているものと考えられる。
　また、本発明の脱細胞化組織組成物に含まれるタンパク質Ｂ（例えば、フィブロモジュリン断片）は、フィブロモジュリンがガンマ線照射により、切断され、生成されると考えられる。フィブロモジュジュリンには、コラーゲン線維を安定化する役割があり、フィブロモジュジュリンが十分存在すると細胞のコラーゲンの新生を抑制すると考えらえる。一方、フィブロモジュジュリンが壊れると、この断片に接触した細胞のコラーゲンの新生の抑制がなくなると推定される。そのため、細胞のコラーゲン新生が起こり、細胞の機能が活性化し、脱細胞化組織組成物に接着する細胞が増加すると推定される。
　本発明の脱細胞化組織組成物は、脱細胞化組織を得る方法により製造することができる。この場合、脱細胞化組織組成物を効率的に得るため、また、本願発明の効果を顕著に発揮するため、高静水圧処理による方法を用いることが好ましい。
　また、任意の方法で得られた脱細胞化組織に、外部から前記タンパク質を添加して、本発明の脱細胞化組織組成物を得ることができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、高静水圧処理により脱細胞化組織組成物を作製した。
　ウシ心膜を切り開いてシート状にし、脂肪を全体的に除去した（以下、このシート状のウシ心膜を「心膜シート」という）。ポリエチレン製袋に、心膜シートを、注射用水にリン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）を添加したものを媒体として、研究開発用高圧処理装置（（株）神戸製鋼所：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）で、６００ＭＰａにて１０分の高静水圧処理を行った。高静水圧処理した心膜シートを核酸分解酵素のＤＮａｓｅＩ（１２５Ｕ／ｍＬ）で処理、４℃で１８時間５分以上振とうし、続いて８０％エタノール中で４℃にて１時間以上処理、最後に４℃で４Ｌの注射用水で洗浄を行った。凍結乾燥処理を行い、実施例１の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例２》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、界面活性剤処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　心膜シートを、４％エタノールが含有するように作製した０．１％（ｖ／ｖ）過酢酸溶液に４℃で２時間浸漬することで減菌した後、注射用水にて４℃で１時間洗浄した。その後、０．２５質量％のドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）にて４℃で２４時間振とうし、続けて、０．５質量％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル：以下、ＴＸ）溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）にて４℃で２４時間振とうした。その後、４℃で１０Ｌの注射用水を用いて洗浄後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）にて４℃で１時間振とうした。凍結乾燥処理を行い、脱細胞化組織組成物の重量当たり０．３質量％となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例２の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例３》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、凍結融解処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　心膜シートを、ドライアイスで凍結させ、ドライアイスを入れた保冷箱中（約－７８℃）で２０時間保存した後、２５℃で溶解させた。この凍結融解を４回繰り返した心膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅＩ（１２５Ｕ／ｍＬ）で処理、４℃で９６時間振とうした。更に、８０％エタノール中、４℃で９６時間振とうした後、注射用水中、４℃で２時間振とうした。凍結乾燥処理を行い、脱細胞化組織組成物の重量当たり０．３質量％となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例３の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例４》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、超音波処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　心膜シートを、生理食塩水中で、超音波処理（強度：１０Ｗ／ｃｍ２、周波数：１０ｋＨｚ、作用時間：２分間）した。超音波処理したウシ心膜について、１質量％のＴＸ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）にて４℃で９６時間振とうした。ＴＸ処理した心膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅＩ（１２５Ｕ／ｍＬ）で処理、４℃で９６時間振とうした。更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振とうした後、生理食塩水中、４℃で２時間振とうした。凍結乾燥処理を行い、脱細胞化組織組成物の重量当たり０．３質量％となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例４の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例５》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、高静水圧処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　ウシ心膜を切り開いてシート状にし、脂肪を全体的に除去し、心膜シートを得た。ポリエチレン製袋に、心膜シートを、注射用水にリン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）を添加したものを媒体として、研究開発用高圧処理装置（（株）神戸製鋼所：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）で６００ＭＰａにて１０分の高静水圧処理を行った。高静水圧処理した心膜シートを核酸分解酵素のＤＮａｓｅ１２５Ｕ／ｍＬで処理、４℃で１８時間５分以上振とうし、続いて８０％エタノール中で４℃にて１時間以上処理、最後に４℃で４Ｌの注射用水で洗浄を行った。凍結乾燥処理を行い、脱細胞化ウシ心のう膜を得た。脱細胞化組織組成物の重量当たり１．０質量％（全含有量）となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例５の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例６》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、界面活性剤処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　心膜シートを、４％エタノールが含有するように作製した０．１％（ｖ／ｖ）過酢酸溶液に４℃で２時間浸漬することで減菌した後、注射用水にて４℃で１時間洗浄した。その後、０．２５質量％のＳＤＳ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）にて４℃で２４時間振とうし、続けて、０．５質量％ＴＸ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）にて４℃で２４時間振とうした。その後、４℃で１０Ｌの注射用水を用いて洗浄後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）にて４℃で１時間振とうした。凍結乾燥処理を行い、脱細胞化組織組成物の重量当たり１．０質量％となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例６の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例７》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、凍結融解処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　心膜シートを、ドライアイスで凍結させ、ドライアイスを入れた保冷箱中（約－７８℃）で２０時間保存した後、２５℃で溶解させた。この凍結融解を４回繰り返した心膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅＩ（１２５Ｕ／ｍＬ）で処理、４℃で９６時間振とうした。更に、８０％エタノール中、４℃で９６時間振とうした後、注射用水中、４℃で２時間振とうした。凍結乾燥処理を行い、脱細胞化組織組成物の重量当たり１．０質量％となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例７の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例８》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、超音波処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　心膜シートを、生理食塩水中で、超音波処理（強度：１０Ｗ／ｃｍ２、周波数：１０ｋＨｚ、作用時間：２分間）した。超音波処理したウシ心膜について、１質量％のＴＸ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）にて４℃で９６時間振とうした。ＴＸ処理した心膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅＩ（１２５Ｕ／ｍＬ）で処理、４℃で９６時間振とうした。更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振とうした後、生理食塩水中、４℃で２時間振とうした。凍結乾燥処理を行い、脱細胞化組織組成物の重量当たり１．０質量％となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例８の脱細胞化組織組成物を得た。
《比較例１》
　本比較例では、ウシの心膜を用いて、界面活性剤処理により脱細胞化材料を作製した。
　心膜シートを、４％エタノールが含有するように作製した０．１％（ｖ／ｖ）過酢酸溶液に４℃で２時間浸漬することで減菌した後、注射用水にて４℃で１時間洗浄した。その後、０．２５質量％のＳＤＳ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）にて４℃で２４時間振とうし、続けて、０．５質量％　ＴＸ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）にて４℃で２４時間振とうした。その後、４℃で１０Ｌの注射用水を用いて洗浄後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）にて４℃で１時間振とうした。凍結乾燥処理を行い、比較例１の脱細胞化ウシ心のう膜（脱細胞化材料）を得た。
《比較例２》
　本比較例では、ウシの心膜を用いて、凍結融解処理により脱細胞化材料を作製した。
　心膜シートを、ドライアイスで凍結させ、ドライアイスを入れた保冷箱中（約－７８℃）で２０時間保存した後、２５℃で溶解させた。この凍結融解を４回繰り返した心膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅＩ（１２５Ｕ／ｍＬ）で処理、４℃で９６時間振とうした。更に、８０％エタノール中、４℃で９６時間振とうした後、注射用水中、４℃で２時間振とうした。凍結乾燥処理を行い、比較例２の脱細胞化ウシ心のう膜（脱細胞化材料）を得た。
《比較例３》
　本比較例では、ウシの心膜を用いて、超音波処理により脱細胞化材料を作製した。
　心膜シートを、生理食塩水中で、超音波処理（強度：１０Ｗ／ｃｍ２、周波数：１０ｋＨｚ、作用時間：２分間）した。超音波処理したウシ心膜について、１質量％のＴＸ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）にて４℃で９６時間振とうした。ＴＸ処理した心膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅＩ（１２５Ｕ／ｍＬ）で処理、４℃で９６時間振とうした。更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振とうした後、生理食塩水中、４℃で２時間振とうした。凍結乾燥処理を行い、比較例３の脱細胞化ウシ心のう膜（脱細胞化材料）を得た。
《細胞接着性試験》
　実施例及び比較例で得られた脱細胞化組織組成物又は脱細胞化材料を、オートクレーブしたハサミとピンセットを用いて直径４ｍｍの円盤状に切り抜き試験片とし、これを９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ用のセルインサートにセットした。ＤＭＥＭ培地をセルインサートの下側に１７５μＬ、上側に１５μＬ添加し、３７°Ｃで２４時間以上静置して、脱細胞化組織組成物又は脱細胞化材料の馴化をした。ＤＭＥＭ培地を除去した後、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を播種（７．０×１０４細胞／ｃｍ２）し、３７℃で３時間培養した。試験片から、付着していない細胞をＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）を用いて洗浄及び除去した後、試験片をＷｓｔ－８（同人化学研究所製）で染色し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。別途、Ｗｓｔ－８により染色したＮＨＤＦと、吸光度から検量線を作成しておき、試験片の吸光度と検量線から、試験片に付着したＮＨＤＦ数を算出した。
　細胞接着性試験の結果を図２に示す。比較例２は、比較例１と同程度の結果であった。実施例１～８は、比較例１に比べて、細胞接着数が多く、細胞の誘因効果が良好であることがわかった。特に、実施例１、５は、細胞の誘因効果が良好であった。
《実施例９》
　本実施例では、ブタの肝臓を用いて、高静水圧処理により脱細胞化組織組成物を作製した。
　ブタ肝臓を切り開いてシート状にし、脂肪を全体的に除去した（以下、このシート状のブタ肝臓を「肝臓シート」という）。ポリエチレン製袋に、肝臓シートを、注射用水にリン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）を添加したものを媒体として、研究開発用高圧処理装置（（株）神戸製鋼所：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）で、６００ＭＰａにて１０分の高静水圧処理を行った。高静水圧処理した肝臓シートを核酸分解酵素のＤＮａｓｅＩ（１２５Ｕ／ｍＬ）で処理、４℃で１８時間５分以上振とうし、続いて８０％エタノール中で４℃にて１時間以上処理、最後に４℃で４Ｌの注射用水で洗浄を行った。凍結乾燥処理を行い、実施例９の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例１０》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、高静水圧処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　ウシ心膜を切り開いてシート状にし、脂肪を全体的に除去し、心膜シートを得た。ポリエチレン製袋に、心膜シートを、注射用水にリン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）を添加したものを媒体として、研究開発用高圧処理装置（（株）神戸製鋼所：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）で６００ＭＰａにて１０分の高静水圧処理を行った。高静水圧処理した心膜シートを核酸分解酵素のＤＮａｓｅ１２５Ｕ／ｍＬで処理、４℃で１８時間５分以上振とうし、続いて８０％エタノール中で４℃にて１時間以上処理、最後に４℃で４Ｌの注射用水で洗浄を行った。凍結乾燥処理を行い、脱細胞化ウシ心のう膜を得た。脱細胞化組織組成物の重量当たり３．０質量％（全含有量）となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例１０の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例１１》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、高静水圧処理により脱細胞化組織組成物を作製した。
　ウシ心膜を切り開いてシート状にし、脂肪を全体的に除去した（以下、このシート状のウシ心膜を「心膜シート」という）。ポリエチレン製袋に、心膜シートを、注射用水にリン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）を添加したものを媒体として、研究開発用高圧処理装置（（株）神戸製鋼所：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）で、６００ＭＰａにて１０分の高静水圧処理を行った。高静水圧処理した心膜シートを核酸分解酵素のＤＮａｓｅＩ（１２５Ｕ／ｍＬ）で処理、４℃で１８時間５分以上振とうし、続いて８０％エタノール中で４℃にて１時間以上処理、最後に４℃で４Ｌの注射用水で洗浄を行った。凍結乾燥処理を行った後、ガンマ線照射（２５ｋＧｙ）をすることで、実施例１１の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例１２》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、高静水圧処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　ウシ心膜を切り開いてシート状にし、脂肪を全体的に除去し、心膜シートを得た。ポリエチレン製袋に、心膜シートを、注射用水にリン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）を添加したものを媒体として、研究開発用高圧処理装置（（株）神戸製鋼所：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）で６００ＭＰａにて１０分の高静水圧処理を行った。高静水圧処理した心膜シートを核酸分解酵素のＤＮａｓｅ１２５Ｕ／ｍＬで処理、４℃で１８時間５分以上振とうし、続いて８０％エタノール中で４℃にて１時間以上処理、最後に４℃で４Ｌの注射用水で洗浄を行った。凍結乾燥処理を行った後、ガンマ線照射（２５ｋＧｙ）をすることで、脱細胞化ウシ心のう膜を得た。脱細胞化ウシ心のう膜の重量当たり、１．０質量％（全含有量）となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例１２の脱細胞化組織組成物を得た。
《実施例１３》
　本実施例では、ウシの心膜を用いて、高静水圧処理により脱細胞化材料を作製し、アネキシンＡ２を添加し、脱細胞化組織組成物を得た。
　ウシ心膜を切り開いてシート状にし、脂肪を全体的に除去し、心膜シートを得た。ポリエチレン製袋に、心膜シートを、注射用水にリン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）を添加したものを媒体として、研究開発用高圧処理装置（（株）神戸製鋼所：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）で６００ＭＰａにて１０分の高静水圧処理を行った。高静水圧処理した心膜シートを核酸分解酵素のＤＮａｓｅ１２５Ｕ／ｍＬで処理、４℃で１８時間５分以上振とうし、続いて８０％エタノール中で４℃にて１時間以上処理、最後に４℃で４Ｌの注射用水で洗浄を行った。凍結乾燥処理を行った後、ガンマ線照射（２５ｋＧ）をすることで、脱細胞化ウシ心のう膜を得た。脱細胞化ウシ心のう膜の重量当たり、３．０質量％（全含有量）となるようにアネキシンＡ２を添加し、実施例１３の脱細胞化組織組成物を得た。
　実施例９～１３について、上述の細胞接着性試験を行った。結果を図２に示す。実施例９～１３は、比較例１に比べて、細胞接着数が多く、細胞の誘因効果が良好であることがわかった。特に、実施例１１は、細胞の誘因効果が良好であった。実施例９において、ブタ肝臓を用いても、良い結果が得られることがわかった。
《強度試験》
（引張試験）
　実施例１及び１１並びに比較例１で得られた脱細胞化組織組成物又は脱細胞化材料の引張試験を以下のように行った。
（１）試験片の採取・作製
　凍結乾燥状態の脱細胞化組織組成物又は脱細胞化材料を生理食塩水に１５分以上浸漬した。膨潤した脱細胞化組織組成物又は脱細胞化材料からＩＳＯ３７に記載されているダンベル形状８号形状試験片を採取した。
（２）試験片の測定
　ダンベル試験片の平行部分の厚さは、３Ｄワンショット形状測定装置（ＶＲ－３２００、キーエンス）を用いて測定した。試験片の幅（ｍｍ）は、平行部分の打ち抜き刃型の切断面管の長さ（４０ｍｍ）をそのまま用いた。試験片の厚さと幅から試験片の断面積Ａ（ｍｍ２）を次の式で算出した。
　Ａ＝ｔ×ｗ
　（Ａ：試験片断面積（ｍｍ２）、ｔ：試験片厚さ（ｍｍ）、ｗ：試験片幅ｍｍ））
（３）試験手順
　ＩＳＯ３７に準拠し、以下の通り引張試験を実施した。断面に均一に引張力を分布させるために、試験片の両端が対照的に保持されるように、試験片を力学試験機（ＭＣＴ２１５０，ＡＮＤ社製）に取り付けた。試験機を作動させる標線間距離Ｌｂ（ｍｍ）を測定した。つかみ具の速度は２００ｍｍ／ｍｉｎとした。標線間の外側で破断した試験片データは棄却し、追加の試験片で繰り返し試験を行った。試験片は、正しく３回測定されるまで行った。測定値から下記計算式で破断強度［ＭＰａ］、弾性率［ＭＰａ］（１０％伸長時及び最大時）を計算した。
（４）結果の計算
＜破断強度＞
　破断強度（ＭＰａ（Ｎ／ｍｍ２））は次の式で算出した。
破断強度（ＭＰａ）＝最大荷重（Ｎ）／試験片断面（ｍｍ２）
＜弾性率＞
　弾性率（応力／伸長ひずみ））は次の式で算出した。
弾性率（ＭＰａ）＝荷重（ＭＰａ（Ｎ／ｍｍ２））／伸長ひずみ（（Ｌ－Ｌ０）／Ｌ０）
（引裂き強度試験）
　実施例及び比較例で得られた脱細胞化組織組成物又は脱細胞化材料の引裂き強度試験を以下のように行った。
（１）試験片の採取・作製
　凍結乾燥状態の脱細胞化組織組成物又は脱細胞化材料を生理食塩水に１５分以上浸漬した。膨潤した脱細胞化組織組成物又は脱細胞化材料から２０ｍｍ×１５ｍｍとなるように採取した。長辺の上から２ｍｍの位置に６ｍｍ径の穴を空けた。糸を穴に通し、試験片を調製した。
（２）試験手順
　試験片の一端を力学試験機（ＭＣＴ２１５０，ＡＮＤ社製）のつかみ具に取り付け、糸をフック式の固定具に設置した。つかみ具の速度は２００ｍｍ／ｍｉｎとした。試験片は、正しく３回測定されるまで行った。測定値は破断時の最大荷重［Ｎ］として算出した。
　１０％伸長時弾性率、最大弾性率、破断強度、及び引裂き強度の試験結果を、それぞれ図３～６に示す。実施例１及び１１は、比較例１に比べて、１０％伸ばすのに必要な力が少ない、すなわち柔らかく、ハンドリング性が良いことがわかった。また、実施例１及び１１は、比較例１に比べて、最大弾性率が大きく、ヒト心膜の弾性率４９．６２±３．２２（ＭＰａ、ＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅＣａｒｄｉｏＶａｓｃｕｌａｒａｎｄ　ＴｈｏｒａｃｉｃＳｕｒｇｅｒｙ２２（２０１６）７２－８４参照）に近い値を示していた。これにより、患者に移植された際に、患者組織と馴染みやすく、脈拍・拍動等に対して構造の安定性を維持できる。特に、実施例１は、５３．９Ｍｐａの最大弾性率を示した。また、実施例１及び１１は、比較例１に比べて、破断強度が高い、すなわち強度が高く、丈夫であることがわかった。また、実施例１及び１１は、比較例１に比べて、引裂き強度が高い、すなわち手術で用いる際に、糸かけに強い、縫合強度高いことがわかった。このように、実施例１及び１１は、比較例１に比べて、ハンドリング性が良好であると共に、丈夫であることがわかった。
《タンパク質の解析》
　前記実施例１の脱細胞化組織組成物及び比較例１の脱細胞化材料の組成の違いを、二次元電気泳動で解析した。
　実施例１の脱細胞化組織組成物又は比較例１の脱細胞化材料２０ｍｇを、それぞれ２本のマイクロチューブに秤量した（１本１０ｍｇ）。一方に、タンパク質抽出バッファー１（尿素含有）、他方にタンパク質抽出バッファー２（尿素及び界面活性剤含有）を添加し、室温下で振とうした後、遠心し、上清を回収した。限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４，Ｕｌｔｒａｃｅｌ　３ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によりバッファー置換後、尿素含有バッファーを加え、遠心で濃縮し、タンパク質を精製した。タンパク質抽出バッファー１及び２で抽出した溶液について、それぞれタンパク質の定量を行った（Ｐｉｅｒｃｅ　６６０ｎｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。タンパク質抽出バッファー１及び２で抽出したタンパク質を混合した。実施例の脱細胞化組織組成物又は比較例の脱細胞化材料２０ｍｇから、それぞれ４．９１ｍｇ及び６．０６ｍｇのタンパク質を回収した。実施例又は比較例のサンプル溶液から２００μｇのタンパク質を分取して、二次元電泳動用のサンプルとした。
　サンプルに緩衝液を加えた後、タンパク質溶解溶液（尿素及び界面活性剤含有）を加えて総量を０．３４ｍＬ（タンパク質２００μｇ）に調製し試料溶液とした。膨潤用トレイに試料溶液を入れ、一次元目電気泳動プレキャストゲルを溶液の上に被せた。更にドライストリップカバー液を重層して一晩静置した。膨潤したプレキャストゲルを電気泳動装置にセットし、泳動した（５００Ｖで１分、３５００Ｖで７．５時間、２０℃）。
　１０～２０％の濃度勾配を有するアクリルアミドゲルを使用した。作製後２４時間静置し、アクリルアミドを完全に重合させた。平衡化した一次元目電気泳動プレキャストゲルをアクリルアミドゲルに載せ、０．１２５％ブロモフェノールブルー入り１％アガロース溶液で固定した。ゲル左端に分子量マーカーをアプライし、分子量のスタンダードとした。８０Ｖで１７時間、ブロモフェノールブルーのバンドがゲル下端に見えるまで泳動した。
　泳動後のゲルは、全タンパク質検出用蛍光染色剤（SYPRO Ruby protein gel stain, S21900, Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて染色し、蛍光スキャナを用いてイメージを保存した。スキャナによる画像の取り込みは、励起波長：４８８ｎｍ、蛍光フィルタ：６４０ｎｍ　Ｂａｎｄｐａｓｓ、解像度：１００ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒで行った。蛍光染色像の取り込みの後、硝酸銀（１９５－０９３８２，富士フイルム和光純薬株式会社）を用いて銀染色を行った。現像後の銀染色像は、フラットベッド型スキャナを用いて取り込みを行った。
　二次元電気泳動の結果を図１に示す。実施例１は、等電点ｐＩ６～９、分子量３０，０００～４０，０００あたりに、３つのスポット（１～３）が検出された。これに対し、比較例１は、実施例１で検出された３つのスポットは検出されなかった。比較例２、３においても、実施例１で検出された３つのスポットは検出されなかった。実施例１は、比較例１～３にはない特定のタンパク質を含有していることがわかった。
（スポットの同定）
　銀染色により可視化したスポットを切り取り、１ｍｍ角の大きさに切断したゲル片に１５ｍＭフェリシアン化カリウム、５０ｍＭチオ硫酸ナトリウムを１００μＬ加えて１０分振とうした。溶液を捨てて、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を加えて振とうし、ゲル片から色が抜けるまで洗浄した。ゲル片にアセトニトリルを加えて脱水した。１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム、０．０１μｇ／μＬトリプシンの酵素溶液を１０μＬ加えてゲル片を膨潤させて、３７℃に１６時間おいた。５０μＬの０．１％ＴＦＡ，５０％アセトニトリルを加えて２０分振とうし、ペプチドを抽出した。抽出は２回行った。ペプチド抽出液が約１０μＬになるまで真空遠心機で濃縮した。サンプルをＺｉｐＴｉｐ　Ｃ１８（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＺＴＣ１８Ｓ９６０）に吸着させ、６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ溶液２．５μＬでペプチドを溶出させた。サンプル溶液１μＬとＣＨＣＡマトリクス溶液１μＬを混合し、ターゲットプレートに滴下し乾燥させた後に、質量分析計（ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ）で測定した。得られた質量値をもとにデータベース（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ）に登録されているタンパク質の同定を行った。
 
分析装置　ultrafleXtreme（Bruker Daltonics）
ターゲットプレート　MTP Anchorchip 600/384（209513, Bruker Daltonics）
極性　positive mode
検出モード　reflector mode（300-6,000 m/z）
ＣＨＣＡマトリクス溶液　０．３ｇ／Ｌ　ＣＨＣＡ、３３％アセトン、６６％エタノール
 
ＭＳ／ＭＳ　Ion Search　検索条件
同定ソフト　Mascot(Matrix Science）
データベース　NCBI RefSeq
検索生物種　Bos taurus
酵素　トリプシン
固定修飾　カルバミドメチル化
　実施例１の３つのスポットを、質量分析計を用いて同定した結果を、表１に示す。表１及び後述する表２のスポット番号は、図１の３つのスポット番号と対応している。３つのスポットは、アネキシンＡ２であることが同定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（スポットシグナル濃度の算出：泳動数値解析）
　得られた蛍光染色像のｔｉｆｆイメージファイルをＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ　Ｐｌａｔｉｎｕｍ（ＧＥ）にインポートし、数値化解析を行った。数値化解析においては、まず各ゲルの共通スポットにマニュアルでランドマークを付けた。ゲルあたり３００スポットまでランドマーク付与作業を行った後、ゲルのマッチングを行った。当該作業により、両検体のゲル上で展開されたスポットに共通のスポットＩＤが与えられた。その後、ゲルのスポット検出を行い、スポットシグナル濃度（％Ｖｏｌｕｍｅ）を算出した。
　スポットシグナル濃度は、ゲル内の全スポットのシグナルの総和に対して、スポットのシグナルが占める割合から算出した。％Ｖｏｌｕｍｅ値は百分率表示とし、最小表示は０．００１％とした。
（スポット重量の算出）
　二次元電気泳動したタンパク質の重量２００μｇと、スポットシグナルの総和に対する各スポットシグナル（スポットシグナル濃度）との比率から、各スポット当たりのタンパク質重量を算出した。２００μｇのタンパク質を二次元電気泳動にアプライした際の各スポット当たりのタンパク質重量を算出した結果、実施例１では、スポット１から０．７μｇ、スポット２から２．０μｇ、スポット３から０．８μｇ、３つのスポットから合計３．５μｇのタンパク質重量が算出された。
（脱細胞化組織組成物に含まれる３つのスポットのタンパク質重量の算出）
　精製され回収されたタンパク質の重量と、二次元電気泳動したタンパク質の重量との関係から、脱細胞化組織組成物２０ｍｇ当たりの３つのスポットのタンパク質重量を算出した。結果を、表２に示す。実施例１では、３つのスポットからタンパク質重量が算出された。実施例１は、タンパク質Ａを０．４３質量％含んでいた。これに対し、比較例１では、この３つのスポットに該当するタンパク質重量は算出されなかった。比較例２、３においても、３つのスポットに該当するタンパク質重量は算出されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例９及び１１～１３の脱細胞化組織組成物について、同様にタンパク質の解析を行った。実施例９の二次元電気泳動の結果を図７Ａに示す。実施例１と同様に、等電点ｐＩ６～９、分子量３０，０００～４０，０００あたりに、３つのスポット（４～６）が検出された。実施例１１の二次元電気泳動の結果を図７Ｂに示す。等電点ｐＩ６～９、分子量３０，０００～４０，０００あたりに、３つのスポット（７～９）が検出され、かつ、等電点ｐＩ４～５、分子量８，０００～１２，０００あたりに、スポット（１０）が検出された。スポット１０は、実施例１１～１３のみで検出された。
　実施例９及び１１のスポットについて、前記スポットの同定を行った。実施例９の結果を表３に示す。表３及び後述する表５のスポット番号は、図７Ａのスポット番号と対応している。実施例９のスポット４～６は、実施例１と同様に（表１スポット番号１～３参照）、アネキシンＡ２であることが同定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１１の結果を表４に示す。表４及び後述する表６のスポット番号は、図７Ｂのスポット番号と対応している。実施例１１のスポット７～９は、実施例１と同様にアネキシンＡ２であることが同定され、スポット１０は、フィブロモジュリン由来のペプチドであることが同定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例９及び１１について、前記スポットシグナル濃度の算出、スポット重量の算出を行った。
　２００μｇのタンパク質を二次元電気泳動にアプライした際の各スポット当たりのタンパク質重量を算出した結果、実施例９では、スポット４から０．１４μｇ、スポット５から０．２７μｇ、スポット６から０．０３μｇ、３つのスポットから合計０．４４μｇのタンパク質重量が算出された。また、実施例１１では、スポット７から０．７μｇ、スポット８から１．６μｇ、スポット９から０．４μｇ、３つのスポットから合計２．７μｇのタンパク質重量が算出され、かつ、スポット１０から０．２４μｇのタンパク質重量が算出された。
　実施例９、１１について、上述の脱細胞化組織組成物２０ｍｇ当たりのスポットのタンパク質重量の算出を行った。結果を、表５、６に示す。実施例９は、タンパク質Ａを０．０５質量％含んでいた。実施例１１は、タンパク質Ａを０．３３質量％、タンパク質Ｂを０．０３質量％含んでいた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
《脱細胞化ＤＮＡ比の算出》
　実施例１、９、及び１１の脱細胞化組織組成物及び比較例１～３の脱細胞化材料の質量を測定し、これをサンプルとし、タンパク質分解酵素溶液に浸漬して溶解した後、フェノール／クロロホルムで処理してタンパク質を除去し、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをピコグリーン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により蛍光染色して蛍光強度を測定することによりＤＮＡを定量し、サンプルの質量とＤＮＡの量から、サンプルのＤＮＡ含有量を算出した。なお、ＤＮＡの定量には、ピコグリーンに添付された標準ＤＮＡを用いて作成した検量線を用いた。別のサンプルを用いて、サンプルの質量（水分量７０％）と乾燥したサンプル（６０℃の恒温槽に１２時間保存したもの）の質量とから、乾燥減量比を求め、サンプルのＤＮＡ含量と乾燥減量比から、サンプルの乾燥質量あたりのＤＮＡ含量を算出した。結果を表７に示す。
（脱細胞化ＤＮＡ比）＝（サンプルの乾燥試験片のＤＮＡ含有量）／（サンプルの質量）×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　高静水圧処理の実施例１、９、及び１１は、比較例よりも、脱細胞化が良好に行われていることがわかった。
　本発明の脱細胞化組織組成物は、良好な組織再生を示す移植用組織として用いることができる。

Claims (8)

  1. 　脱細胞化組織と、（ａ）分子量：３０，０００～７０，０００及び（ｂ）等電点：ｐＩ６．００～９．００のタンパク質Ａとを含有する脱細胞化組織組成物。
  2. 　（ａ）分子量：３，０００～１５，０００及び（ｂ）等電点：ｐＩ３．００～５．５０のタンパク質Ｂを更に含有する請求項１に記載の脱細胞化組織組成物。
  3. 　前記タンパク質Ａの含有量が、脱細胞化組織組成物に対して０．０１～５．０質量％である請求項１又は２に記載の脱細胞化組織組成物。
  4. 　前記タンパク質Ｂの含有量が、脱細胞化組織組成物に対して０．００１～３．０質量％である請求項１～３のいずれか一項に記載の脱細胞化組織組成物。
  5. 　タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂの組成物中の質量比が、Ａ：Ｂ＝５：１～１５０：１である請求項１～４のいずれか一項に記載の脱細胞化組織組成物。
  6. 　乾燥質量あたりのＤＮＡ含有量が、脱細胞化組織組成物に対して０．０３００質量％以下である請求項１～５のいずれか一項に記載の脱細胞化組織組成物。
  7. 　前記タンパク質Ａが、アネキシンである請求項１～６のいずれか一項に記載の脱細胞化組織組成物。
  8. 　前記タンパク質Ｂが、フィブロモジュリン由来ペプチドである請求項１～７のいずれか一項に記載の脱細胞化組織組成物。
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