KR20230107827A - 탈세포화 조직 조성물 - Google Patents

탈세포화 조직 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230107827A
KR20230107827A KR1020237018831A KR20237018831A KR20230107827A KR 20230107827 A KR20230107827 A KR 20230107827A KR 1020237018831 A KR1020237018831 A KR 1020237018831A KR 20237018831 A KR20237018831 A KR 20237018831A KR 20230107827 A KR20230107827 A KR 20230107827A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
decellularized tissue
decellularized
protein
tissue composition
mass
Prior art date
Application number
KR1020237018831A
Other languages
English (en)
Inventor
미쓰마사 홈마
켄이치로 히와타리
하루키 오바라
타쿠야 기무라
케이타 키노시타
Original Assignee
가부시키가이샤 아데카
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 아데카 filed Critical 가부시키가이샤 아데카
Publication of KR20230107827A publication Critical patent/KR20230107827A/ko

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633Extracellular matrix [ECM]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14Macromolecular materials
    • A61L27/22Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06Lysis of microorganisms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0652Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656Adult fibroblasts
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50Proteins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명의 목적은 적절한 강도 및 양호한 조직 재생을 보이는 탈세포화 조직을 제공하는 것이다. 상기 과제는, 본 발명의 탈세포화 조직과, (a) 분자량: 30,000∼70,000 및 (b) 등전점: pI 6.00∼9.00의 단백질 A를 함유하는 탈세포화 조직 조성물에 의해 해결할 수 있다.

Description

탈세포화 조직 조성물
본 발명은 탈세포화 조직 조성물에 관한 것이다.
타인이나 이종의 동물의 생체 조직 유래 이식편을 이식하는 경우, 피이식자 측 조직에 의한 이식편의 거절 반응이 문제가 된다. 이러한 문제의 해결 방법으로서, 인공 조직의 개발이 기대되고 있다. 소재로서 다양한 고분자가 시도되고 있으나, 이들 소재와 생체 조직 간의 적합성이 낮기 때문에, 이식편과 생체 조직 간의 접합 부위에서의 탈락이나 감염증이 발생하는 문제가 있다.
따라서, 생체 조직과의 적합성을 향상시키기 위하여, 생체 조직으로부터 세포를 제각(除却)하여 잔존하는 지지 조직(세포외 매트릭스, ECM)으로 이루어지는 탈세포화 조직(脫細胞化 組織)을 이식편으로 사용하는 기술이 개발되어 왔다. 탈세포화란 피이식자에 있어 항원성을 갖는 핵산 등의 세포 성분을 제거하는 것을 의미하며, 이에 따라 면역 거절을 회피할 수 있다.
탈세포화 조직은, 예를 들면 계면 활성제를 함유하는 처리액을 이용하여 생체 조직을 탈세포화함으로써 제조할 수 있다(특허 문헌 1∼3).
(특허 문헌 1) 일본 특허 공표 2005-514971호 공보 (특허 문헌 2) 일본 특허 공표 2006-507851호 공보 (특허 문헌 3) 일본 특허 공표 2005-531355호 공보
재생 의료에 있어서 탈세포화 조직을 사용하는 경우에는, 거절 반응이 없는 것에 더하여, 조직의 재생을 신속하게 수행할 수 있는 것이 중요하다. 적절한 강도를 가지며, 그리고 양호한 조직 재생을 보이는 탈세포화 조직이 요망되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 적절한 강도 및 양호한 조직 재생을 보이는 탈세포화 조직을 제공하는 것이다.
본 발명자는, 적절한 강도 및 양호한 조직 재생을 갖는 탈세포화 조직에 대하여 예의 연구한 결과, 놀랍게도 특정한 단백질을 포함하는 탈세포화 조직 조성물이 뛰어난 강도 및 세포 접착성을 가지며, 양호한 조직 재생을 돕는 것을 알아냈다.
본 발명은 이러한 깨달음에 의거한 것이다.
따라서, 본 발명은,
[1] 탈세포화 조직과, (a) 분자량: 30,000∼70,000 및 (b) 등전점(等電點): pI 6.00∼9.00의 단백질 A를 함유하는 탈세포화 조직 조성물,
[2] [1]에 있어서, (a) 분자량: 3,000∼15,000 및 (b) 등전점: pI 3.00∼5.50의 단백질 B를 추가로 함유하는 탈세포화 조직 조성물,
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 단백질 A의 함유량이 탈세포화 조직 조성물에 대하여 0.01∼5.0 질량%인 탈세포화 조직 조성물,
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 B의 함유량이 탈세포화 조직 조성물에 대하여 0.001∼3.0 질량%인 탈세포화 조직 조성물,
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 단백질 A 및 단백질 B의 조성물 중의 질량비가 A:B=5:1∼150:1인 탈세포화 조직 조성물,
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 건조 질량 당 DNA 함유량이 탈세포화 조직 조성물에 대하여 0.0300 질량% 이하인 탈세포화 조직 조성물,
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질이 아넥신(Annexin)인 탈세포화 조직 조성물,
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 B가 피브로모듈린(Fibromodulin) 유래 펩티드인 탈세포화 조직 조성물
에 관한 것이다.
본 발명의 탈세포화 조직 조성물에 따르면, 적당한 강도 및 뛰어난 세포 접착성을 보이기 때문에, 생체 내에 있어서 양호한 조직 재생능(예를 들면, 세포의 유인 효과 및 분화 유도 효과)을 보일 수 있다. 또한, 뛰어난 강도를 가짐으로써 시술 시에 있어서 뛰어난 핸들링(handling) 성능을 보인다.
도 1은 실시예 1 및 비교예 1의 탈세포화 조직의 이차원 전기 영동에 있어서의, 실시예 1 및 비교예 1에서 서로 다른 단백질의 스팟(spot)을 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1∼13 및 비교예 1 및 3의 탈세포화 조직 조성물의 세포 접착성 시험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1 및 11 및 비교예 1의 탈세포화 조직 조성물의 10% 신장 시 탄성률을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1 및 11 및 비교예 1의 탈세포화 조직 조성물의 최대 탄성률을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 1 및 11 및 비교예 1의 탈세포화 조직 조성물의 파단(破斷) 강도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 1 및 11 및 비교예 1의 탈세포화 조직 조성물의 인열(引裂) 강도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 9 및 11의 탈세포화 조직의 이차원 전기 영동에 있어서의, 비교예 1과 상이한 단백질의 스팟을 나타낸 도면이다.
본 발명의 탈세포화 조직 조성물은, 탈세포화 조직과, (a) 분자량: 30,000∼70,000 및 (b) 등전점: pI 6.00∼9.00의 단백질(이하, 단백질 A라고 칭할 수 있음)을 함유한다. 본 발명의 탈세포화 조직 조성물은, (a) 분자량:3,000∼15,000 및 (b) 등전점: pI 3.00∼5.50의 단백질(이하, 단백질 B라고 칭할 수 있음)을 포함할 수도 있다.
《탈세포화 조직》
탈세포화 조직은 동물 유래 조직에서 세포 성분을 제거한 조직으로, 엘라스틴, 콜라겐(I형, IV형 등), 라미닌 등의 세포외 매트릭스 성분을 주 성분으로 하는 조직이다. 생체 매식(埋植) 시의 거절 반응이 낮고, 이식할 곳의 세포의 정착 및 재구축을 기대할 수 있으며, 세포의 비계(발판)로서 기능한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 탈세포화 조직을 얻는 방법은, 종래 공지의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는 탈세포화의 방법은, 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 한도에 있어서 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 고정수압 처리에 의한 방법, 동결 융해(融解) 처리에 의한 방법, 계면 활성제를 사용하는 방법, 초음파 처리에 의해 처리하는 방법, 효소를 사용하는 방법 또는 고장(高張) 전해질 용액으로 처리하는 방법, 물리적 교반에 의한 방법, 고장액 저장액(低張液)법, 단백 분해 효소나 핵산 분해 효소 등에 의한 효소 처리에 의한 방법, 알코올 용제에 의한 처리 등을 들 수 있으며, 이들 2종 이상을 조합할 수도 있고, 탈세포화 조직 조성물을 효율적으로 얻기 위하여, 또한 본원 발명의 효과를 발휘하기 위하여, 고정수압 처리에 의한 방법이 바람직하다.
본 발명의 탈세포화 조직 조성물에 사용하는 탈세포화 조직은, 척추 동물 유래 생체 조직이면 특별히 한정되지 않으나, 거절 반응이 적은 이유로 포유류 또는 조류 유래 생체 조직이 바람직하고, 입수가 용이한 이유로 포유류의 가축, 조류의 가축 또는 인간 유래 생체 조직이 더 바람직하다. 포유류의 가축으로는, 소, 말, 낙타, 라마(llama), 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 기니피그, 래트, 마우스, 다람쥐, 아메리카 너구리(raccoon) 등을 예로 들 수 있다. 또한, 조류의 가축으로는 잉꼬, 앵무새, 닭, 오리, 칠면조, 거위, 뿔닭(guinea fowl), 꿩, 타조, 메추라기, 에뮤(emu) 등을 예로 들 수 있다. 이들 중에서도 입수의 안정성에서 소, 돼지, 토끼, 인간의 생체 조직이 바람직하다.
생체 조직의 부위로는, 세포 외에 매트릭스 구조를 가진 부위를 사용할 수 있으며, 이러한 부위로는, 예를 들면, 간장, 신장, 요관, 방광, 요도, 혀, 편도, 식도, 위, 소장, 대장, 항문, 췌장, 심장, 혈관, 비장, 폐, 뇌, 뼈, 척수, 연골, 정소, 자궁, 난관, 난소, 태반, 각막, 골격근, 힘줄, 신경, 피부 등을 예로 들 수 있다. 생체 조직의 부위로서, 조직 재생의 효과가 높은 이유로 바람직하게는 연골, 뼈, 간장, 신장, 심장, 심막, 대동맥, 피부, 소장 점막하 조직, 폐, 뇌, 내뇌동맥 또는 척수이고, 보다 바람직하게는 심막, 내뇌동맥, 간장, 연골, 피부, 소장 점막하 조직 또는 척수이다.
상기 고정수압 처리에 의한 방법에 의해 상기 탈세포화 조직을 얻는 경우에는, 생체 유래 조직에 용매 중에서 50∼1500 MPa의 정수압을 인가한다. 탈세포화가 충분히 수행되는 관점에서 인가하는 정수압은 50 MPa 이상이 바람직하고, 인가에 견딜 수 있는 압력 용기가 불필요하고, 많은 에너지를 필요로 하지 않음과 아울러, 인가에 사용하는 매체가 수성 매체인 경우에는 얼음이 생성되고, 생성된 얼음으로 인해 조직이 손상(damage)을 받는 것을 방지하는 관점에서 1500 MPa 이하가 바람직하다. 인가하는 정수압은 80∼1300 MPa가 보다 바람직하고, 90∼1200 MPa가 더욱 바람직하며, 95∼1100 MPa가 보다 더욱 바람직하고, 95∼700 MPa가 훨씬 바람직하며, 400∼700 MPa가 탈세포화 효과, 멸균 효과 및 바이러스 불활화(不活化) 효과를 발휘하고, 또한 인가의 용이함의 관점에서 가장 바람직하다.
정수압의 인가에 사용하는 매체로는 물, 생리 식염수, 주사용수, 프로필렌 글리콜 또는 그 수용액, 글리세린 또는그 수용액, 당류 수용액 등을 예로 들 수 있다. 완충액으로는 아세트산 완충액, 인산 완충액, 시트르산 완충액, 붕산 완충액, 타타르산 완충액, 트리스(tris) 완충액, HEPES 완충액, MES 완충액 등을 예로 들 수 있다. 이들 매체는 계면 활성제를 포함할 수도 있다.
고정수압 처리의 온도는, 얼음이 생성되지 않고, 열로 인한 조직에 대한 손상이 없는 온도라면 특별히 한정되지 않으나, 탈세포 처리가 원활하게 수행되고 조직에 대한 영향도 적은 이유로 0∼45℃가 바람직하고, 4∼37℃가 더욱 바람직하고, 15∼35℃가 가장 바람직하다. 고정수압 처리의 시간은, 너무 짧으면 세포의 파괴가 충분히 이루어지지 않고, 긴 경우에는 에너지의 낭비로 이어지는 이유로, 고정수압 처리에 있어서 목적으로 하는 인가 압력을 유지하는 시간은 1∼120분이 바람직하고, 5∼60분이 보다 바람직하고, 7∼30분이 더욱 바람직하다.
상기 고정수압 처리된 조직은, 바람직하게는 핵산 분해 효소 처리를 수행한다. 핵산 분해 효소는 정수압이 인가된 생체 조직으로부터의 핵산 성분을 제거하는 것으로, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 췌장 유래, 비장 유래 또는 대장균 유래 DNase(예를 들면, DNase I, DNase II)를 예로 들 수 있다.
핵산 분해 효소는, 상기 고정수압 처리에 사용한 매체(예를 들면, 물, 생리 식염수, 주사용액 또는 완충액 등)에 첨가하여 작용시킬 수 있다. 첨가하는 효소량은, 효소의 종류나 유닛 수(U)의 정의에 따라 서로 다른데, 당업자라면 적당히 설정할 수 있다. 예를 들면, DNase I이라면 50∼200 U/mL로 사용하면 된다. 처리 온도도 사용하는 핵산 분해 효소에 따라 다른데, 예를 들면 1℃∼40℃의 온도로 설정하면 된다. 처리 시간도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 1∼120시간(바람직하게는 1∼96시간, 보다 바람직하게는 1∼48시간)이면 되며, 저온의 경우에는 길게 처리하고, 고온의 경우에는 단시간의 처리이면 된다.
상기 고정수압 처리된 조직은 세정액으로 세정한다. 세정액은, 고정수압 처리의 매체와 동일할 수도 있고 서로 다를 수도 있다. 세정액은 유기 용매 또는 킬레이트제를 함유하는 것이 바람직하다. 유기 용매는 지질의 제거 효율을 향상시킬 수 있고, 킬레이트제는 탈세포화 조직 중의 칼슘 이온이나 마그네슘 이온을 불활성화함으로써, 본 발명의 입자화 탈세포화 조직을 질환부에 적용한 경우의 석회화를 막을 수 있다. 유기 용제로는, 지질의 제거 효과가 높은 이유로 수용성의 유기 용제가 바람직하고, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 디메틸술폭시드가 바람직하다. 킬레이트제로는 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 니트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid, NTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylene tri amine pentaacetic acid, DTPA), 히드록시에틸에틸렌디아민 트리아세트산(hydroxyethyl ethylenediamine triacetic acid, HEDTA), 트리에틸렌테트라아민 헥사아세트산(triethylenetetraminehexaacetic acid, TTHA), 1,3-프로판디아민 테트라아세트산(1,3-propane diamine tetraacetic acid, PDTA), 1,3-디아미노-2-히드록시프로판 테트라아세트산(1,3-diamino-2-hydroxypropane tetraacetic acid, DPTA-OH), 히드록시에틸이미노 디아세트산(hydroxyethyliminodiacetic acid, HIDA), 디히드록시에틸글리신(dihydroxyethylglycine, DHEG), 글리콜에테르디아민테트라아세트산(glycol ether diaminetetraacetic acid, GEDTA), 디카복시메틸 글루탐산(dicarboxymethyl glutamic acid, CMGA), 3-히드록시-2,2'-이미노디숙신산(3-hydroxy-2,2'-iminodisuccinic acid, HIDA), 디카복시메틸아스파르트산(dicarboxymethyl aspartic acid, ASDA) 등의 이미노카복실산(iminocarboxylic acid)계 킬레이트제 또는 그 염; 시트르산, 타타르산, 말산, 락트산 등의 히드록시디카복실산계 킬레이트제 또는그 염을 들 수 있으며, 이들 킬레이트제의 염으로는 나트륨염 또는 칼륨염을 예로 들 수 있다.
세정 온도는 열로 인한 조직에 대한 손상이 없는 온도라면 특별히 한정되지 않으나, 세정성이 양호하고 조직에 대한 영향도 적은 이유로 0∼45℃가 바람직하고, 1∼40℃가 더욱 바람직하고, 2∼35℃가 가장 바람직하다. 세정하는 경우에는, 필요에 따라 세정액을 진탕(쉐이킹) 또는 교반할 수도 있다.
동결 융해 처리에 의한 방법에 의해 상기 탈세포화 조직을 얻는 경우에는, 생체 유래 조직을 -80∼-20℃, 바람직하게는 -80∼-40℃의 온도에서, 1∼48시간(바람직하게는 10∼30시간) 유지하여 동결시킨 다음, 20∼37℃의 온도에서 융해하는 공정을 1회 또는 2회 이상(바람직하게는 2∼5회) 반복 수행한다. 그 다음에, 핵산 분해 효소 처리를 수행하는 것이 바람직하고, 핵산 분해 효소 처리는, 상기 고정수압 처리에 있어서의 처리와 동일한 방법이면 된다. 동결 융해 처리된 생체 조직은 조직 중의 세포가 파괴되어 있으며, 이 세포는 세정액에 의해 제거된다. 세정의 방법은 고정수압 처리에 있어서의 세정과 동일한 방법이면 된다.
계면 활성제를 사용하는 방법에 의해 상기 탈세포화 조직을 얻는 경우에는, 생체 유래 조직을 계면 활성제의 용액(예를 들면, 0.25 질량%의 도데실황산 나트륨(SDS) 용액)으로 1∼48시간(바람직하게는 12∼36시간), 2∼10℃(바람직하게는 4℃)에서 진탕한다. 나아가, 서로 다른 계면 활성제 용액(예를 들면, 0.5% 질량% Triton X(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 용액)으로 1∼48시간(바람직하게는 12∼36시간), 2∼10℃(바람직하게는 4℃)에서 진탕할 수도 있다. 그런 다음, 고정수압 처리에 있어서의 세정과 동일한 방법으로 세정하는 것이 바람직하다.
계면 활성제로는, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 도데실 황산 나트륨, 알킬술폰산염, 알킬 황산 에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬 황산 에스테르염, α-술포지방산 에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르(예를 들면, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르), 알킬(폴리)글리코시드를 예로 들 수 있다.
초음파 처리에 의해 처리하는 방법에 의해 상기 탈세포화 조직을 얻는 경우에는, 생체 유래 조직을, 예를 들면 생리 식염수 중에서 초음파 처리(예를 들면, 강도: 10 W/cm2, 주파수: 10 kHz, 작용 시간: 2분간)한다. 그런 다음, 바람직하게는, 계면 활성제 용액(예를 들면, 1% 질량% Triton X(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르) 용액)으로, 1∼120시간(바람직하게는 12∼120시간), 2∼10℃(바람직하게는 4℃)에서 진탕한다. 나아가, 핵산 분해 효소 처리를 수행하는 것이 바람직하고, 핵산 분해 효소 처리는 상기 고정수압 처리에 있어서의 처리와 동일한 방법이면 된다. 그런 다음, 고정수압 처리에 있어서의 세정과 동일한 방법으로 세정하는 것이 바람직하다.
얻어진 탈세포화 조직은, 한정되는 것은 아니지만, 동결 건조 처리를 수행하는 것이 바람직하다. 동결 건조는 생체 조직의 부위에 따라 생략할 수 있다. 또한, 얻어진 탈세포화 조직은 감마선 조사, UV 조사 등에 의해 멸균할 수도 있고, 감마선 조사에 의해 멸균하는 것이 바람직하다.
상기 탈세포화 조직의 함유량으로는, 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 탈세포화 조직 조성물에 대하여 90.0∼100.0 질량%가 바람직하고, 95.0∼100.0 질량%가 보다 바람직하고, 96.0∼100.0 질량%가 더욱 바람직하며, 97.0∼100.0 질량%가 가장 바람직하다.
(탈세포화 DNA비(DNA 함유량))
일반적으로 탈세포화 조직 조성물의 DNA 함유량은 적은 것이 바람직하다고 여겨지고 있는데, 본 발명에 있어서의 탈세포화 조직 조성물에서는, 건조 질량 당 DNA 함유량은 탈세포화 조직 조성물에 대하여, 0.0300 질량% 이하인 것이 바람직하다. 이에 따라, 재생 의료에 사용한 경우에 거절 반응이 발생하는 것을 방지할 수 있다. 세포의 유인 효과나 분화 유도 효과의 점에서, 본 발명의 탈세포화 조직 조성물의 탈세포화 DNA비는 0.0250 질량% 이하가 보다 바람직하고, 0.0200 질량% 이하가 더욱 바람직하고, 0.0150 질량% 이하가 훨씬 바람직하고, 0.0120 질량% 이하가 가장 바람직하다. 탈세포화 DNA비가 0.0150 질량% 이하이면, 탈세포화 조직 조성물에 대한 세포 접착성을 특히 높이기 쉬운 점에서 바람직하다.
탈세포화 DNA비의 하한은, 특별히 한정되지 않으나, 낮을수록 바람직하고, 구현의 용이함에서 바람직하게는 0.0001 질량% 이상, 더욱 바람직하게는 0.0002 질량% 이상이다.
DNA 함유량은 피코그린(PicoGreen)법에 의해 측정할 수 있다. 탈세포화 조직 조성물의 건조 시험편(이하, 샘플이라고 칭하는 경우가 있음.)을 단백질 분해 효소 용액에 침지하여 용해한 다음, 페놀/클로로포름으로 처리하여 단백질을 제거하고, 에탄올 침전법에 의해 DNA를 회수한다. 회수한 DNA를 피코그린(Life Technologies사)에 의해 형광 염색하여 형광 강도를 측정함으로써 DNA를 정량하고, 샘플의 DNA 함유량(질량)을 산출한다. 정량은 피코그린에 첨부된 표준 DNA를 사용하여 작성한 검량선을 사용한다. 샘플의 건조 질량과 DNA 함유량으로부터 하기의 식에 따라 DNA비를 계산한다.
(건조 질량 당 DNA 함유량(이하, 탈세포화 DNA비라고 칭하는 경우가 있음.)=(탈세포화 조직 조성물의 건조 시험편의 DNA 함유량)/(탈세포화 조직 조성물의 건조 시험편의 질량)
《단백질》
본 발명의 탈세포화 조직 조성물은, (a) 분자량: 30,000∼70,000 및 (b) 등전점: pI 6.00∼9.00의 단백질 A를 포함한다. 본 발명의 탈세포화 조직 조성물은, (a) 분자량: 3,000∼15,000 및 (b) 등전점: pI 3.00∼5.50의 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 효과를 보다 발휘할 수 있다.
상기 단백질의 분자량 및 등전점(pI)은, 예를 들면 단백질을 이차원 전기 영동하고, 단백질의 동정은 질량 분석에 의해 수행할 수 있다.
이차원 전기 영동법에 있어서, 등전점 분리 및 분자량 분리의 어느 것을 먼저(일차원째로서) 수행할 수도 있으나, 측정의 정밀도를 올리는 관점에서 일차원째로 등전점 분리를 수행하고, 이차원째로 분자량 분리를 수행하는 것이 바람직하다. 이차원 전기 영동법은 상법(常法)에 따라 수행할 수 있으며, 시판되고 있는 키트 및 장치를 사용할 수 있다. 예를 들면, 캐필러리 겔 또는 스트립 겔 등을 분리 매체로 하여 등전점 전기 영동을 수행하고, 영동을 종료한 겔을 평면 형상의 겔(예를 들면, SDS-폴리아크릴아미드 겔)을 사용하여 등전점 전기 영동의 전개 방향에 대하여 직각인 방향으로 전기 영동을 수행하여 분자량 분리할 수 있다. 이차원 전기 영동을 수행한 겔을 상법에 따라 염색함으로써, 단백질의 유무, 분자량, 등전점을 확인할 수 있다.
상기 단백질 A의 분자량으로는, 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 30,000∼70,000이 바람직하고, 30,000∼50,000이 보다 바람직하고, 30,000∼40,000이 더욱 바람직하다. 상기 단백질 A의 등전점(pI)으로는 6.00∼9.00이 바람직하고, 6.00∼8.50이 보다 바람직하고, 6.50∼8.50이 더욱 바람직하다.
상기 단백질 A로서 바람직하게는 아넥신을 예로 들 수 있다. 아넥신은 4개 또는 8개의 α-헤릭스 구조의 소위 아넥신 리피트(repeat)(약 70 아미노산 잔기)로 이루어지는 만곡된 코어 도메인(core domain)을 갖는 단백질이다. 아미노 말단 측 도메인은 각각의 아넥신에 고유한 서열(11∼196잔기)인데, 카복시 말단 측의 도메인은 아넥신 사이에서 잘 보존되어 있다. 칼슘 결합 부위나 인지질 결합 부위는 카복시 말단 측의 도메인 위에 존재해 있다. 8개의 아넥신 리피트를 갖는 아넥신 VI의 분자량은 약 66k이다.
탈세포화 조직 조성물에 포함되는 아넥신의 유래는, 진핵 생물 유래이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 포유류 또는 조류 유래 아넥신이 바람직하다. 포유류로는 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 기니피그, 래트, 마우스, 다람쥐 또는아메리카 너구리 등을 예로 들 수 있다. 또한, 조류로는 잉꼬, 앵무새, 닭, 오리, 칠면조, 거위, 뿔닭, 꿩, 타조, 메추라기 또는 에뮤 등을 예로 들 수 있다.
척추동물에 있어서는, 아넥신 A1∼A11, A13의 12종류의 아넥신이 존재해 있으며, Ca2+와 인지질 간의 결합 부위를 가지고 있다. 예를 들면, 아넥신 A2의 오목면의 N 말단 영역에 C 말단 리신을 갖는 S100A10이 결합하고, 조직형 플라스미노겐 액티베이터(tPA)와 플라스미노겐의 결합 부위가 된다.
상기 아넥신은 수식(修飾)이 서로 다른 아넥신을 포함한다. 즉, 인산화, 글리코실화, 유비키틴화, 니트로실화, 메틸화 또는 아세틸화된 또는 이들 수식이 되어 있지 않은 아넥신을 포함한다. 예를 들면, 실시예에 기재된 아넥신 A2는 인산화의 서로 다른 3종의 아넥신 A2인데, 모두 본 발명의 효과를 보일 수 있다.
나아가, 본 발명의 탈세포화 조직 조성물은, 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 한도에 있어서 아넥신의 개변체를 포함할 수 있다. 아넥신 개변체로는, 예를 들면,
(1) 아넥신의 아미노산 서열(예를 들면, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열)의 하나 또는 복수의 개소에 있어서, 전체적으로 하나 또는 복수 개(바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼7개, 더욱 바람직하게는 1∼5개), 예를 들면, 전체적으로 1∼수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 게다가 아넥신의 활성을 갖는 폴리펩티드 또는
(2) 아넥신의 아미노산 서열(예를 들면, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열)과의 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지며, 게다가 아넥신의 활성을 갖는 폴리펩티드를 예로 들 수 있다.
아넥신의 활성으로는, 예를 들면 "Ca2+와 인지질" 간의 결합능을 예로 들 수 있다. 혹은, 본 발명의 탈세포화 조직 조성물로서, 개변체를 포함하지 않는 것과 비교하여 세포의 접착성을 향상시키는 것을 예로 들 수 있다.
(하나 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열)
상기 개변체는, 아넥신(예를 들면, 서열 번호 1)의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수도 있다. 그리고, 상기 개변체의 폴리펩티드는 Ca2+와 인지질 간의 결합능을 갖는다. 즉, Ca2+와 인지질 간의 결합능을 보이지 않는 폴리펩티드는 상기 개변체의 폴리펩티드에 포함되지 않는다. 본 명세서에 있어서, "하나 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열"이란 아미노산의 치환 등에 의해 개변이 이루어진 것을 의미한다. 아미노산의 개변의 개수는, 예를 들면 1∼30개, 1∼20개, 1∼15개, 1∼10개일 수 있고, 바람직하게는 1∼8개, 보다 바람직하게는 1∼6개, 더욱 바람직하게는 1∼5개, 가장 바람직하게는 1∼2개이다. 본 발명에 사용할 수 있는 개변체의 아미노산 서열의 예는, 바람직하게는 그 아미노산이 하나 또는 수 개(바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개)의 보존적 치환을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
(아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열)
상기 개변체는, 아넥신(예를 들면, 서열 번호 1)의 아미노산 서열에 대하여 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수도 있다. 그리고, 상기 개변체의 폴리펩티드는 Ca2+와 인지질 간의 결합능을 갖는다. 즉, Ca2+와 인지질 간의 결합능을 보이지 않는 폴리펩티드는 상기 개변체의 폴리펩티드에 포함되지 않는다. 보다 바람직하게는 해당 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 96% 이상인 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 97% 이상인 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 98% 이상인 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드이며, 또한 Ca2+와 인지질 간의 결합능을 보이는 폴리펩티드이다.
상기 아넥신(예를 들면, 서열 번호 1)의 아미노산 서열에 있어서 "하나 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열" 또는 "동일성이 90% 이상인 아미노산 서열"은, 아넥신(예를 들면, 서열 번호 1)의 아미노산 서열이 치환된 것인데, 이 아미노산 서열의 치환은 본 발명에 사용되는 아넥신의 기능을 유지하는 보존적 치환이다. 바꾸어 말하면 "보존적 치환"이란, 아넥신의 뛰어난 효과가 상실되지 않는 치환을 의미한다. 즉, 상기 삽입, 치환 또는 결실, 혹은 부가된 경우라도 아넥신의 Ca2+와 인지질 간의 결합능을 유지할 수 있는 치환이다. 구체적으로는, 아미노산 잔기를 다른 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 예를 들면, 어느 한 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기에 의해 치환하는 경우, 어느 한 극성 잔기를 동일한 전하를 갖는 다른 극성 잔기에 의해 치환하는 경우 등을 예로 들 수 있다. 이러한 치환을 수행할 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산은 아미노산별로 해당 기술 분야에 있어서 널리 알려져 있다. 비극성(소수성) 아미노산으로는, 예를 들면, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 트립토판, 페닐아랄닌, 티오닌 등을 들 수 있다. 극성(중성) 아미노산으로는, 예를 들면, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 들 수 있다. 양전하를 갖는 (염기성) 아미노산으로는, 아르기닌, 히스티딘, 리신 등을 들 수 있다. 또한, 음전하를 갖는 (산성) 아미노산으로는, 아스파라트산, 글루탐산 등을 들 수 있다.
상기 단백질 A의 함유량으로는, 탈세포화 조직 조성물에 대하여 0.01∼5.0 질량%가 바람직하고, 0.03∼4.5 질량%가 보다 바람직하고, 0.05∼4.0 질량%가 더욱 바람직하고, 0.1∼3.5 질량%가 보다 더욱 바람직하고, 0.2∼3.3 질량%가 훨씬 바람직하고, 0.3∼3.0 질량%가 가장 바람직하다. 이에 따라, 본 발명의 효과를 발휘할 수 있다.
상기 단백질 B의 분자량으로는, 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 3,000∼15,000이 바람직하고, 5,000∼14,000이 보다 바람직하고, 7,000∼13,000이 더욱 바람직하다. 상기 단백질의 등전점(pI)으로는 3.00∼5.50이 바람직하고, 3.40∼5.30이 보다 바람직하고, 3.80∼5.20이 더욱 바람직하다.
상기 단백질 B의 함유량으로는, 탈세포화 조직 조성물에 대하여 0.001∼3.0 질량%가 바람직하고, 0.003∼2.0 질량%가 보다 바람직하고, 0.005∼1.5 질량%가 더욱 바람직하고, 0.008∼1.0 질량%가 보다 더욱 바람직하고, 0.009∼0.5 질량%가 훨씬 바람직하고, 0.01∼0.1 질량%가 가장 바람직하다. 이에 따라, 본 발명의 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 탈세포화 조직 조성물은, 단백질 A와 단백질 B를 이들 질량비가 A:B=5:1∼150:1인 범위에서 함유하는 것이 바람직하고, 8:1∼110:1인 범위에서 함유하는 것이 보다 바람직하고, 10:1∼50:1인 범위에서 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 이에 따라, 본 발명의 효과를 효율적으로 발휘할 수 있다.
상기 단백질 B로서, 바람직하게는 피브로모듈린의 단편을 예로 들 수 있다. 피브로모듈린은 주로 섬유성 콜라겐에 결합하는 단백질로, 콜라겐 섬유끼리를 결합시키는 역할을 가지고 있다고 생각된다. 피브로모듈린의 발현이 상승되면, 콜라겐 섬유의 밀도가 증가하는 것이 알려져 있다. 피브로모듈린은 375의 아미노산으로 이루어지는 단백질(서열 번호 2)이며, 분자량은 43,000이고, pI는 5.6이다.
단백질 B는 피브로모듈린의 단편이며, 한정되는 것은 아니지만 분자량으로 추정하면, C 말단의 90 아미노산으로 이루어지는 단편(서열 번호 3)이다. 피브로모듈린 단편은 분자량 10,000, pI 4.65이다.
탈세포화 조직 조성물에 포함될 수 있는 피브로모듈린 단편의 유래는, 아넥신과 동일하게 진핵 생물 유래이면 특별히 한정되는 것은 아니며, 아넥신과 동일한 것을 예로 들 수 있다.
본 발명의 탈세포화 조직 조성물은, 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 한도에 있어서 피브로모듈린 단편의 개변체를 포함할 수 있다. 피브로모듈린 단편 개변체로는, 예를 들면,
(1) 피브로모듈린 단편의 아미노산 서열(예를 들면, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열)의 하나 또는 복수의 개소에 있어서, 전체적으로 하나 또는 복수 개(바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼7개, 더욱 바람직하게는 1∼5개), 예를 들면, 전체적으로 하나∼수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 게다가 피브로모듈린 단편의 활성을 갖는 폴리펩티드 또는
(2) 피브로모듈린 단편의 아미노산 서열(예를 들면, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열)과의 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지며, 게다가 피브로모듈린 단편의 활성을 갖는 폴리펩티드를 예로 들 수 있다.
피브로모듈린 단편의 활성으로는, 본 발명의 탈세포화 조직 조성물로서, 개변체를 포함하지 않는 것과 비교하여, 세포의 접착성을 향상시키는 것을 예로 들 수 있다.
피브로모듈린 단편의 개변체는, 상기 아넥신 개변체와 동일한 아미노산 변이, 동일성 및 보존적 치환 등을 보이는 것이다.
상기 피브로모듈린 단편은, 탈세포화 조직 조성물을 감마선 조사함으로써, 피브로모듈린으로부터 생성된다고 생각된다. 감마선 조사의 강도는, 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 한도에 있어서, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 10∼50 kGy이고, 바람직하게는 15∼35 kGy이며, 보다 바람직하게는 20∼30 kGy이다. 상기 범위임으로써 피브로모듈린 단편을 생성할 수 있다.
《작용》
본 발명의 탈세포화 조직 조성물이 뛰어난 강도 및 뛰어난 세포 접착성을 보이는 이유는, 완전에 해명된 것은 아니지만, 이하와 같이 추론할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이하의 설명에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 탈세포화 조직 조성물에 포함되는 단백질 A(예를 들면, 아넥신)는 4개 또는 8개의 α-헤릭스 구조(아넥신 리피트)를 가지며, Ca2+와 인지질에 결합한다. 한정되는 것은 아니지만, Ca2+와 인지질 간의 결합능이 세포 접착능과 관련되어 있다고 생각된다. 또한, 아넥신이 탈세포화 조직의 강도에 효과적으로 작용하고 있다고 생각된다.
또한, 본 발명의 탈세포화 조직 조성물에 포함되는 단백질 B(예를 들면, 피브로모듈린(フィブロモジュリン) 단편)는, 피브로모듈린이 감마선 조사에 의해 절단되고 생성된다고 생각된다. 피브로모듈린에는, 콜라겐 선유(線維)를 안정화하는 역할이 있으며, 피브로모듈린이 충분히 존재하면 세포의 콜라겐의 신생을 억제한다고 생각된다. 한편, 피브로모듈린이 부서지면, 이 단편에 접촉한 세포의 콜라겐의 신생의 억제가 없어진다고 추정된다. 그 때문에, 세포의 콜라겐 신생이 일어나고, 세포의 기능이 활성화되고, 탈세포화 조직 조성물에 접착하는 세포가 증가한다고 추정된다.
본 발명의 탈세포화 조직 조성물은 탈세포화 조직을 얻는 방법에 의해 제조할 수 있다. 이 경우, 탈세포화 조직 조성물을 효율적으로 얻기 위하여, 또한 본원 발명의 효과를 현저하게 발휘하기 위하여, 고정수압 처리에 의한 방법을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 임의의 방법으로 얻어진 탈세포화 조직에 외부로부터 상기 단백질을 첨가하여 본 발명의 탈세포화 조직 조성물을 얻을 수 있다.
(실시예)
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
《실시예 1》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 고정수압 처리에 의해 탈세포화 조직 조성물을 제작하였다.
소 심막을 절개하여 시트 형상으로 만들고, 지방을 전체적으로 제거하였다(이하, 이 시트 형상의 소 심막을 "심막 시트"라고 함). 폴리에틸렌으로 된 봉지(bag)에, 심막 시트를, 주사용수에 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)을 첨가한 것을 매체로 하여 연구 개발용 고압 처리 장치((주)고베 제강소(Kobe Steel, Ltd.): Dr. CHEF)로 600 MPa로 10분의 고정수압 처리를 수행하였다. 고정수압 처리한 심막 시트를 핵산 분해 효소의 DNase I(125 U/mL)로 처리, 4℃에서 18시간 5분 이상 진탕하고, 계속해서 80% 에탄올 중에서 4℃에서 1시간 이상 처리, 마지막으로 4℃에서 4L의 주사용수로 세정을 수행하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 실시예 1의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 2》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 계면 활성제 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
심막 시트를, 4% 에탄올이 함유되도록 제작한 0.1%(v/v) 과아세트산 용액에 4℃에서 2시간 침지함으로써 멸균한 다음, 주사용수로 4℃에서 1시간 세정하였다. 그런 다음, 0.25 질량%의 도데실 황산 나트륨(이하, SDS) 용액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 4℃에서 24시간 진탕하고, 계속해서 0.5 질량% Triton-X(폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르: 이하, TX) 용액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 4℃에서 24시간 진탕하였다. 그런 다음, 4℃에서 10L의 주사용수를 이용하여 세정 후, 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)으로 4℃에서 1시간 진탕하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 탈세포화 조직 조성물의 중량 당 0.3 질량%가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 2의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 3》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 동결 융해 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
심막 시트를 드라이 아이스로 동결시키고, 드라이 아이스를 넣은 보냉 상자 중(약 -78℃)에서 20시간 보존한 다음, 25℃에서 용해시켰다. 이 동결 융해를 4회 반복한 심막 시트를, 핵산 분해 효소로서 DNase I(125 U/mL)로 처리, 4℃에서 96시간 진탕하였다. 나아가, 80% 에탄올 중 4℃에서 96시간 진탕한 다음, 주사 용수 중 4℃에서 2시간 진탕하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 탈세포화 조직 조성물의 중량 당 0.3 질량%가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 3의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 4》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 초음파 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
심막 시트를 생리 식염수 중에서 초음파 처리(강도: 10 W/cm2, 주파수: 10 kHz, 작용 시간: 2분간)하였다. 초음파 처리한 소 심막에 대하여 1 질량%의 TX 용액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 4℃에서 96시간 진탕하였다. TX 처리한 심막 시트를 핵산 분해 효소로서 DNase I(125 U/mL)로 처리, 4℃에서 96시간 진탕하였다. 나아가, 80% 에탄올 중 4℃에서 72시간 진탕한 다음, 생리 식염수 중 4℃에서 2시간 진탕하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 탈세포화 조직 조성물의 중량 당 0.3 질량%가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 4의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 5》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 고정수압 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
소 심막을 절개하여 시트 형상으로 만들고, 지방을 전체적으로 제거하고, 심막 시트를 얻었다. 폴리에틸렌으로 된 봉지에, 심막 시트를, 주사용수에 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)를 첨가한 것을 매체로 하여 연구 개발용 고압 처리 장치((주)고베 제강소: Dr. CHEF)로 600 MPa로 10분의 고정수압 처리를 수행하였다. 고정수압 처리한 심막 시트를 핵산 분해 효소인 DNase 125 U/mL로 처리, 4℃에서 18시간 5분 이상 진탕하고, 계속해서 80% 에탄올 중에서 4℃에서 1시간 이상 처리, 마지막으로 4℃에서 4L의 주사용수로 세정을 수행하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 탈세포화 소 심낭막을 얻었다. 탈세포화 조직 조성물의 중량 당 1.0 질량%(토탈 함유랑)가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 5의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 6》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 계면 활성제 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
심막 시트를 4% 에탄올이 함유되도록 제작한 0.1%(v/v) 과아세트산 용액에 4℃에서 2시간 침지함으로써 멸균한 다음, 주사용수로 4℃에서 1시간 세정하였다. 그런 다음, 0.25 질량%의 SDS 용액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 4℃에서 24시간 진탕하고, 계속해서 0.5 질량% TX 용액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 4℃에서 24시간 진탕하였다. 그런 다음, 4℃에서 10L의 주사용수를 사용하여 세정 후, 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)으로 4℃에서 1시간 진탕하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 탈세포화 조직 조성물의 중량 당 1.0 질량%가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 6의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 7》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 동결 융해 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
심막 시트를 드라이 아이스로 동결시키고, 드라이 아이스를 넣은 보냉 상자 중(약 -78℃)에서 20시간 보존한 다음, 25℃에서 용해시켰다. 이 동결 융해를 4회 반복한 심막 시트를 핵산 분해 효소로서 DNase I(125 U/mL)로 처리, 4℃에서 96시간 진탕하였다. 나아가, 80% 에탄올 중, 4℃에서 96시간 진탕한 다음, 주사용수 중 4℃에서 2시간 진탕하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 탈세포화 조직 조성물의 중량 당 1.0 질량%가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 7의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 8》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 초음파 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
심막 시트를 생리 식염수 중에서 초음파 처리(강도: 10 W/cm2, 주파수: 10 kHz, 작용 시간: 2분간)하였다. 초음파 처리한 소 심막에 대하여, 1 질량%의 TX 용액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 4℃에서 96시간 진탕하였다. TX 처리한 심막 시트를 핵산 분해 효소로서 DNase I(125 U/mL)로 처리, 4℃에서 96시간 진탕하였다. 나아가, 80% 에탄올 중 4℃에서 72시간 진탕한 다음, 생리 식염수 중 4℃에서 2시간 진탕하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 탈세포화 조직 조성물의 중량 당 1.0 질량%가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 8의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《비교예 1》
본 비교예에서는 소의 심막을 사용하여 계면 활성제 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하였다.
심막 시트를 4% 에탄올이 함유되도록 제작한 0.1%(v/v) 과아세트산 용액에 4℃에서 2시간 침지함으로써 멸균한 다음, 주사용수로 4℃에서 1시간 세정하였다. 그런 다음, 0.25 질량%의 SDS 용액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 4℃에서 24시간 진탕하고, 계속해서 0.5 질량% TX 용액(10 mM Tris, pH8.0)으로 4℃에서 24시간 진탕하였다. 그런 다음, 4℃에서 10L의 주사용수를 사용하여 세정 후, 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)으로 4℃에서 1시간 진탕하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 비교예 1의 탈세포화 소 심낭막(탈세포화 재료)을 얻었다.
《비교예 2》
본 비교예에서는 소의 심막을 사용하여 동결 융해 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하였다.
심막 시트를 드라이 아이스로 동결시키고, 드라이 아이스를 넣은 보냉 상자 중(약 -78℃)에서 20시간 보존한 다음, 25℃에서 용해시켰다. 이 동결 융해를 4회 반복한 심막 시트를 핵산 분해 효소로서 DNase I(125 U/mL)로 처리, 4℃에서 96시간 진탕하였다. 나아가, 80% 에탄올 중 4℃에서 96시간 진탕한 다음, 주사용수 중 4℃에서 2시간 진탕하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 비교예 2의 탈세포화 소 심낭막(탈세포화 재료)을 얻었다.
《비교예 3》
본 비교예에서는 소의 심막을 사용하여 초음파 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하였다.
심막 시트를 생리 식염수 중에서 초음파 처리(강도: 10 W/cm2, 주파수: 10 kHz, 작용 시간: 2분간)하였다. 초음파 처리한 소 심막에 대하여, 1 질량%의 TX 용액(10 mM Tris, pH 8.0)으로 4℃에서 96시간 진탕하였다. TX 처리한 심막 시트를 핵산 분해 효소로서 DNase I(125 U/mL)로 처리, 4℃에서 96시간 진탕하였다. 나아가, 80% 에탄올 중 4℃에서 72시간 진탕한 다음, 생리 식염수 중 4℃에서 2시간 진탕하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 비교예 3의 탈세포화 소 심낭막(탈세포화 재료)을 얻었다.
《세포 접착성 시험》
실시예 및 비교예에서 얻어진 탈세포화 조직 조성물 또는 탈세포화 재료를 오토클레이브한 가위와 핀셋을 사용하여 직경 4 mm의 원반 형상으로 오려내고 시험편으로 하고, 이를 96 well plate용의 셀 인서트(cell insert)에 세팅하였다. DMEM 배지를 셀 인서트의 하측에 175 μL, 상측에 15 μL 첨가하고, 37℃에서 24 시간 이상 정치(靜置)하여 탈세포화 조직 조성물 또는 탈세포화 재료의 순화(馴化)를 하였다. DMEM 배지를 제거한 다음, 인간 피부 선유아 세포(NHDF)를 접종(7.0Х104 세포/cm2)하고, 37℃에서 3시간 배양하였다. 시험편으로부터 부착되지 않은 세포를 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)를 사용하여 세정 및 제거한 다음, 시험편을 Wst-8(도진도화학연구소(同人化學硏究所) 제조)로 염색하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 별도로 Wst-8에 의해 염색한 NHDF와 흡광도로부터 검량선을 작성해 두고, 시험편의 흡광도와 검량선으로부터 시험편에 부착된 NHDF 수를 산출하였다.
세포 접착성 시험의 결과를 도 2에 나타내었다. 비교예 2는 비교예 1과 동일한 정도의 결과였다. 실시예 1∼8은 비교예 1에 비해 세포 접착 수가 많고, 세포의 유인 효과가 양호한 것을 알 수 있었다. 특히, 실시예 1, 5는 세포의 유인 효과가 양호했다.
《실시예 9》
본 실시예에서는 돼지의 간장을 사용하여 고정수압 처리에 의해 탈세포화 조직 조성물을 제작하였다.
돼지 간장을 절개하여 시트 형상으로 만들고, 지방을 전체적으로 제거하였다(이하, 이 시트 형상의 돼지 간장을 "간장 시트"라고 함). 폴리에틸렌으로 된 봉지에, 간장 시트를, 주사용수에 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)을 첨가한 것을 매체로 하여 연구 개발용 고압 처리 장치((주)고베 제강소: Dr. CHEF)로, 600 MPa로 10분의 고정수압 처리를 수행하였다. 고정수압 처리한 간장 시트를 핵산 분해 효소의 DNase I(125 U/mL)로 처리, 4℃에서 18시간 5분 이상 진탕하고, 계속해서 80% 에탄올 중에서 4℃에서 1시간 이상 처리, 마지막으로 4℃에서 4L의 주사용수로 세정을 수행하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 실시예 9의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 10》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 고정수압 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
소 심막을 절개하여 시트 형상으로 만들고, 지방을 전체적으로 제거하고, 심막 시트를 얻었다. 폴리에틸렌으로 된 봉지에, 심막 시트를, 주사용수에 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)을 첨가한 것을 매체로 하여 연구 개발용 고압 처리 장치((주)고베 제강소: Dr. CHEF)로 600 MPa로 10분의 고정수압 처리를 수행하였다. 고정수압 처리한 심막 시트를 핵산 분해 효소의 DNase 125 U/mL로 처리, 4℃에서 18시간 5분 이상 진탕하고, 계속해서 80% 에탄올 중에서 4℃에서 1시간 이상 처리, 마지막으로 4℃에서 4L의 주사용수로 세정을 수행하였다. 동결 건조 처리를 수행하고, 탈세포화 소 심낭막을 얻었다. 탈세포화 조직 조성물의 중량 당 3.0 질량%(토탈 함유랑)가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 10의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 11》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 고정수압 처리에 의해 탈세포화 조직 조성물을 제작하였다.
소 심막을 절개하여 시트 형상으로 만들고, 지방을 전체적으로 제거하였다(이하, 이 시트 형상의 소 심막을 "심막 시트"라고 함). 폴리에틸렌으로 된 봉지에, 심막 시트를, 주사용수에 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)을 첨가한 것을 매체로 하여 연구 개발용 고압 처리 장치((주)고베 제강소: Dr. CHEF)로 600 MPa로 10분의 고정수압 처리를 수행하였다. 고정수압 처리한 심막 시트를 핵산 분해 효소의 DNase I(125 U/mL)로 처리, 4℃에서 18시간 5분 이상 진탕하고, 계속해서 80% 에탄올 중에서 4℃에서 1시간 이상 처리, 마지막으로 4℃에서 4L의 주사용수로 세정을 수행하였다. 동결 건조 처리를 수행한 다음, 감마선 조사(25 kGy)를 함으로써 실시예 11의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 12》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 고정수압 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
소 심막을 절개하여 시트 형상으로 만들고, 지방을 전체적으로 제거하고, 심막 시트를 얻었다. 폴리에틸렌으로 된 봉지에, 심막 시트를, 주사용수에 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)를 첨가한 것을 매체로 하여, 연구 개발용 고압 처리 장치((주)고베 제강소: Dr. CHEF)로 600 MPa로 10분의 고정수압 처리를 수행하였다. 고정수압 처리한 심막 시트를 핵산 분해 효소의 DNase 125 U/mL로 처리, 4℃에서 18시간 5분 이상 진탕하고, 계속해서 80% 에탄올 중에서4℃에서 1시간 이상 처리, 마지막으로 4℃에서 4L의 주사용수로 세정을 수행하였다. 동결 건조 처리를 수행한 다음, 감마선 조사(25 kGy)를 함으로써 탈세포화 소 심낭막을 얻었다. 탈세포화 소 심낭막의 중량 당 1.0 질량%(토탈 함유랑)가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 12의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
《실시예 13》
본 실시예에서는 소의 심막을 사용하여 고정수압 처리에 의해 탈세포화 재료를 제작하고, 아넥신 A2를 첨가하고, 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
소 심막을 절개하여 시트 형상으로 만들고, 지방을 전체적으로 제거하고, 심막 시트를 얻었다. 폴리에틸렌으로 된 봉지에, 심막 시트를, 주사용수에 인산 완충액(PBS, 0.01M, pH 7.4)를 첨가한 것을 매체로 하여 연구 개발용 고압 처리 장치((주)고베 제강소: Dr. CHEF)로 600 MPa로 10분의 고정수압 처리를 수행하였다. 고정수압 처리한 심막 시트를 핵산 분해 효소의 DNase 125 U/mL로 처리, 4℃에서 18시간 5분 이상 진탕하고, 계속해서 80% 에탄올 중에서 4℃에서 1시간 이상 처리, 마지막으로 4℃에서 4L의 주사용수로 세정을 수행하였다. 동결 건조 처리를 수행한 다음, 감마선 조사(25 kG)를 함으로써 탈세포화 소 심낭막을 얻었다. 탈세포화 소 심낭막의 중량 당 3.0 질량%(토탈 함유랑)가 되도록 아넥신 A2를 첨가하고, 실시예 13의 탈세포화 조직 조성물을 얻었다.
실시예 9∼13에 대하여 상술한 세포 접착성 시험을 수행하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 실시예 9∼13은 비교예 1에 비해 세포 접착 수가 많고, 세포의 유인 효과가 양호한 것을 알 수 있었다. 특히, 실시예 11은 세포의 유인 효과가 양호했다. 실시예 9에 있어서 돼지 간장을 사용하여도 좋은 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
《강도 시험》
(인장 시험)
실시예 1 및 11 및 비교예 1에서 얻어진 탈세포화 조직 조성물 또는 탈세포화 재료의 인장 시험을 이하와 같이 수행하였다.
(1) 시험편의 채취·제작
동결 건조 상태의 탈세포화 조직 조성물 또는 탈세포화 재료를 생리 식염수에 15분 이상 침지하였다. 팽윤한 탈세포화 조직 조성물 또는 탈세포화 재료로부터 ISO 37에 기재되어 있는 덤벨(dumbbell) 형상 8호 형상 시험편을 채취하였다.
(2) 시험편의 측정
덤벨 시험편의 평행 부분의 두께는 3D 원샷 형상 측정 장치(VR-3200, 키엔스(KEYENCE CORPORATION))를 사용하여 측정하였다. 시험편의 폭(mm)은 평행 부분의 뽑기날 형틀의 절단면 관의 길이(40 mm)를 그대로 사용하였다. 시험편의 두께와 폭으로부터 시험편의 단면적 A(mm2)를 다음 식으로 산출하였다.
A=tХw
(A: 시험편 단면적(mm2), t: 시험편 두께(mm), w: 시험편 폭(mm))
(3) 시험 절차
ISO 37에 준거하여 이하와 같이 인장 시험을 실시하였다. 단면에 균일하게 인장력을 분포시키기 위하여, 시험편의 양단이 대조적으로 유지되도록 시험편을 역학 시험기(MCT 2150, AND사(A&D Company, Limited) 제조)에 부착하였다. 시험기를 작동시키는 표선(標線) 간 거리(Lb)(mm)를 측정하였다. 그리퍼(gripper)의 속도는 200 mm/min으로 하였다. 표선 간의 외측에서 파단한 시험편 데이터는 기각하고, 추가의 시험편으로 반복 시험을 수행하였다. 시험편은 올바르게 3회 측정될 때까지 수행하였다. 측정값으로부터 하기 계산식으로 파단 강도[MPa], 탄성률[MPa](10% 신장 시 및 최대 시)을 계산하였다.
(4) 결과의 계산
<파단 강도>
파단 강도(MPa(N/mm2))는 다음 식으로 산출하였다.
파단 강도(MPa)=최대 하중(N)/시험편 단면(mm2)
<탄성률>
탄성률(응력/신장 변형(일그러짐))은 다음 식으로 산출하였다.
탄성률(MPa)=하중(MPa(N/mm2))/신장 변형((L-L0)/L0)
(인열 강도 시험)
실시예 및 비교예에서 얻어진 탈세포화 조직 조성물 또는 탈세포화 재료의 인열 강도 시험을 이하와 같이 수행하였다.
(1) 시험편의 채취·제작
동결 건조 상태의 탈세포화 조직 조성물 또는 탈세포화 재료를 생리 식염수에 15분 이상 침지하였다. 팽윤한 탈세포화 조직 조성물 또는 탈세포화 재료로부터 20 mmХ15 mm가 되도록 채취하였다. 장변 위로부터 2 mm의 위치에 6 mm 지름의 구멍을 뚫었다. 실을 구멍에 통과시키고, 시험편을 조제하였다.
(2) 시험 절차
시험편의 일단을 역학 시험기(MCT 2150, AND사 제조)의 그리퍼에 부착하고, 실을 후크식의 고정구에 설치하였다. 그리퍼의 속도는 200 mm/min으로 하였다. 시험편은 올바르게 3회 측정될 때까지 수행하였다. 측정값은 파단 시의 최대 하중[N]으로서 산출하였다.
10% 신장 시 탄성률, 최대 탄성률, 파단 강도 및 인열 강도의 시험 결과를 각각 도 3∼6에 나타내었다. 실시예 1 및 11은 비교예 1에 비해 10% 늘이는 데 필요한 힘이 적다는, 즉 부드럽고 핸들링성이 좋다는 것을 알 수 있었다. 또한, 실시예 1 및 11은 비교예 1에 비해 최대 탄성률이 크고, 인간 심막의 탄성률 49.62±3.22(MPa, Interactive Cardio Vascular and Thoracic Surgery 22(2016) 72-84 참조)에 가까운 값을 보이고 있었다. 이에 따라, 환자에게 이식되었을 때 환자 조직과 융화되기 쉽고, 맥박·맥동 등에 대하여 구조의 안정성을 유지할 수 있다. 특히, 실시예 1은 53.9 MPa의 최대 탄성률을 보인다. 또한, 실시예 1 및 11은 비교예 1에 비해 파단 강도가 높다는, 즉 강도가 높고 튼튼하다는 것을 알 수 있었다. 또한, 실시예 1 및 11은 비교예 1에 비해 인열 강도가 높다는, 즉 수술에서 사용할 때 실걸기에 강한, 봉합 강도가 높다는 것을 알 수 있었다. 이와 같이 실시예 1 및 11은 비교예 1에 비해 핸들링성이 양호함과 아울러 튼튼하다는 것을 알 수 있었다.
《단백질의 분석》
상기 실시예 1의 탈세포화 조직 조성물 및 비교예 1의 탈세포화 재료의 조성의 차이를 이차원 전기 영동으로 분석하였다.
실시예 1의 탈세포화 조직 조성물 또는 비교예 1의 탈세포화 재료 20 mg을 각각 2개의 마이크로 튜브에 칭량하였다(1개 10 mg). 한쪽에 단백질 추출 버퍼 1(요소 함유), 다른 쪽에 단백질 추출 버퍼 2(요소 및 계면 활성제 함유)를 첨가하고, 실온 하에서 진탕한 다음, 원심하고 웃물을 회수하였다. 한외 여과 유닛(Amicon Ultra-4, Ultracel 3k, Millipore)에 의해 버퍼 치환 후, 요소 함유 버퍼를 가하고, 원심으로 농축하고, 단백질을 정제하였다. 단백질 추출 버퍼 1 및 2로 추출한 용액에 대하여 각각 단백질의 정량을 수행하였다(Pierce 660nm Protein Assay, Thermo Scientific). 단백질 추출 버퍼 1 및 2로 추출한 단백질을 혼합하였다. 실시예의 탈세포화 조직 조성물 또는 비교예의 탈세포화 재료 20 mg로부터 각각 4.91 mg 및 6.06 mg의 단백질을 회수하였다. 실시예 또는 비교예의 샘플 용액으로부터 200 μg의 단백질을 분취하여 이차원 전기 영동용의 샘플로 하였다.
샘플에 완충액을 가한 다음, 단백질 용해 용액(요소 및 계면 활성제 함유)을 가하여 총량을 0.34 mL(단백질 200 μg)로 조제하고 시료 용액으로 삼았다. 팽윤용 트레이에 시료 용액을 넣고, 일차원째 전기 영동 프리캐스트(precast) 겔을 용액 위에 덮어씌웠다. 나아가 드라이 스트립 커버액을 중층(重層, overlay)하여 하룻밤 정치하였다. 팽윤한 프리캐스트 겔을 전기 영동 장치에 세팅하고, 영동하였다(500V로 1분, 3500V로 7.5시간, 20℃)
10∼20%의 농도 구배를 갖는 아크릴아미드 겔을 사용하였다. 제작 후 24시간 정치하고, 아크릴아미드를 완전히 중합시켰다. 평형화한 일차원째 전기 영동 프리캐스트 겔을 아크릴아미드 겔에 올리고, 0.125% 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)가 들어간 1% 아가로스 용액으로 고정하였다. 겔 좌단에 분자량 마커를 어플라이(apply)하고, 분자량의 스탠다드(standard)로 하였다. 80V로 17시간, 브로모페놀 블루의 밴드가 겔 하단에 보일 때까지 영동하였다.
영동 후의 겔은 토탈(全) 단백질 검출용 형광 염색제(SYPRO Ruby protein gel stain, S21900, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 사용하여 염색하고, 형광 스캐너를 사용하여 이미지를 저장하였다. 스캐너에 의한 영상의 가져오기(스캐닝)는 여기 파장: 488 nm, 형광 필터: 640 nm Bandpass, 해상도: 100 micrometer로 수행하였다. 형광 염색 상(像)의 가져오기 후, 질산 은(195-09382, 후지 필름 와코 순약 주식회사(FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation))을 사용하여 은 염색을 수행하였다. 현상 후의 은 염색 상(像)은 플랫 베드(flat bed)형 스캐너를 사용하여 가져오기를 수행하였다.
이차원 전기 영동의 결과를 도 1에 나타내었다. 실시예 1은 등전점 pI 6∼9, 분자량 30,000∼40,000 당 3개의 스팟(1∼3)이 검출되었다. 이에 대해, 비교예 1은 실시예 1에서 검출된 3개의 스팟은 검출되지 않았다. 비교예 2, 3에 있어서도 실시예 1에서 검출된 3개의 스팟은 검출되지 않았다. 실시예 1은 비교예 1∼3에는 없는 특정한 단백질을 함유하고 있음을 알 수 있었다.
(스팟의 동정)
은 염색에 의해 가시화한 스팟을 절취하고, 1 mm 정사각형의 크기로 절단한 겔편(겔 조각)에 15 mM 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide), 50 mM 티오황산 나트륨을 100 μL 가하여 10분 진탕하였다. 용액을 버려 Milli-Q 물을 가하여 진탕하고, 겔편으로부터 색이 빠질 때까지 세정하였다. 겔편에 아세트니트릴을 가하여 탈수하였다. 100 mM 탄산수소 암모늄, 0.01 μg/μL 트립신의 효소 용액을 10 μL 가하여 겔편을 팽윤시켜, 37℃에 16시간 두었다. 50 μL의 0.1% TFA, 50% 아세트니트릴을 가하여 20분 진탕하고 펩티드를 추출하였다. 추출은 2회 수행하였다. 펩티드 추출액이 약 10 μL가 될 때까지 진공 원심기로 농축하였다. 샘플을 ZipTip C18(millipore, ZTC18S960)에 흡착시키고, 60% 아세트니트릴, 0.1% TFA 용액 2.5 μL로 펩티드를 용출시켰다. 샘플 용액 1 μL와 CHCA 매트릭스 용액 1 μL를 혼합하고, 타겟 플레이트에 적하(滴下)하고 건조시킨 다음, 질량 분석계(ultrafleXtreme)로 측정하였다. 얻어진 질량값을 바탕으로 데이터베이스(NCBI RefSeq)에 등록되어 있는 단백질의 동정을 수행하였다.
분석 장치 ultrafleXtreme(Bruker Daltonics)
타겟 플레이트 MTP Anchorchip 600/384(209513, Bruker Daltonics)
극성 positive mode
검출 모드 reflector mode(300-6,000 m/z)
CHCA 매트릭스 용액 0.3 g/L CHCA, 33% 아세톤, 66% 에탄올
MS/MS Ion Search 검색 조건
동정 소프트 Mascot(Matrix Science)
데이터베이스 NCBI RefSeq
검색 생물종 Bos taurus
효소 트립신
고정 수식 카바미드메틸화(Carbamidomethyl)
실시예 1의 3개의 스팟을 질량 분석계를 사용하여 동정한 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1 및 후술하는 표 2의 스팟 번호는 도 1의 3개의 스팟 번호와 대응해 있다. 3개의 스팟은 아넥신 A2인 것이 동정되었다.
스팟 번호 단백질명 분자량 등전점
Annexin A2 38873 7.15
Annexin A2 38873 7.58
Annexin A2 38873 8.07
(스팟 시그널 농도의 산출: 영동 수치 분석)
얻어진 형광 염색 상의 tiff 이미지 파일을 ImageMaster Platinum(GE)에 불러오기(import)하고 수치화 분석을 수행하였다. 수치화 분석에 있어서는 먼저 각 겔의 공통 스팟에 수동으로 랜드 마크를 달았다. 겔 당 300 스팟까지 랜드 마크 부여 작업을 수행한 다음, 겔의 매칭을 수행하였다. 해당 작업에 의해 양 검체의 겔 위에서 전개된 스팟에 공통의 스팟 ID가 주어졌다. 그런 다음, 겔의 스팟 검출을 수행하고, 스팟 시그널 농도(%Volume)를 산출하였다.
스팟 시그널 농도는 겔 내의 모든 스팟의 시그널의 총합에 대하여 스팟의 시그널이 차지하는 비율로부터 산출하였다. %Volume 값은 백분율 표시로 하고, 최소 표시는 0.001%로 하였다.
(스팟 중량의 산출)
이차원 전기 영동한 단백질의 중량 200 μg과 스팟 시그널의 총합에 대한 각 스팟 시그널(스팟 시그널 농도) 간의 비율로부터 각 스팟 당 단백질 중량을 산출하였다. 200 μg의 단백질을 이차원 전기 영동에 어플라이하였을 때의 각 스팟 당 단백질 중량을 산출한 결과, 실시예 1에서는 스팟 1로부터 0.7 μg, 스팟 2로부터 2.0 μg, 스팟 3으로부터 0.8 μg, 3개의 스팟으로부터 합계 3.5 μg의 단백질 중량이 산출되었다.
(탈세포화 조직 조성물에 포함되는 3개의 스팟의 단백질 중량의 산출)
정제되고 회수된 단백질의 중량과 이차원 전기 영동한 단백질의 중량 간의 관계로부터 탈세포화 조직 조성물 20 mg 당 3개의 스팟의 단백질 중량을 산출하였다. 결과를 표 2에 나타내었다. 실시예 1에서는 3개의 스팟으로부터 단백질 중량이 산출되었다. 실시예 1은 단백질 A를 0.43 질량% 포함하고 있었다. 이에 대해, 비교예 1에서는 이 3개의 스팟에 해당하는 단백질 중량은 산출되지 않았다. 비교예 2, 3에 있어서도 3개의 스팟에 해당하는 단백질 중량은 산출되지 않았다.
스팟 번호 실시예 1
[μg]
비교예 1
[μg]
비교예 2
[μg]
비교예 3
[μg]
17.7 0.00 0.00 0.00
47.9 0.00 0.00 0.00
20.6 0.00 0.00 0.00
실시예 9 및 11∼13의 탈세포화 조직 조성물에 대하여 동일하게 단백질의 분석을 수행하였다. 실시예 9의 이차원 전기 영동의 결과를 도 7A에 나타내었다. 실시예 1과 마찬가지로, 등전점 pI 6∼9, 분자량 30,000∼40,000 당 3개의 스팟(4∼6)이 검출되었다. 실시예 11의 이차원 전기 영동의 결과를 도 7B에 나타내었다. 등전점 pI 6∼9, 분자량 30,000∼40,000 당 3개의 스팟(7∼9)이 검출되었고, 또한, 등전점 pI 4∼5, 분자량 8,000∼12,000 당 스팟(10)이 검출되었다. 스팟 10은 실시예 11∼13에서만 검출되었다.
실시예 9 및 11의 스팟에 대하여 상기 스팟의 동정을 수행하였다. 실시예 9의 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3 및 후술하는 표 5의 스팟 번호는 도 7A의 스팟 번호와 대응해 있다. 실시예 9의 스팟 4∼6은 실시예 1과 마찬가지로(표 1 스팟 번호 1∼3 참조), 아넥신 A2인 것이 동정되었다.
스팟 번호 단백질명 분자량 등전점
Annexin A2 38873 7.15
Annexin A2 38873 7.58
Annexin A2 38873 8.07
실시예 11의 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4 및 후술하는 표 6의 스팟 번호는 도 7B의 스팟 번호와 대응해 있다. 실시예 11의 스팟 7∼9는 실시예 1과 마찬가지로 아넥신 A2인 것이 동정되었고, 스팟 10은 피브로모듈린 유래 펩티드인 것이 동정되었다.
스팟 번호 단백질명 분자량 등전점
Annexin A2 38873 7.15
Annexin A2 38873 7.58
Annexin A2 38873 8.07
Fibromodulin의 단편 10000 4.65
실시예 9 및 11에 대하여, 상기 스팟 시그널 농도의 산출, 스팟 중량의 산출을 수행하였다.
200 μg의 단백질을 이차원 전기 영동에 어플라이하였을 때의 각 스팟 당 단백질 중량을 산출한 결과, 실시예 9에서는, 스팟 4로부터 0.14 μg, 스팟 5로부터 0.27 μg, 스팟 6으로부터 0.03 μg, 3개의 스팟으로부터 합계 0.44 μg의 단백질 중량이 산출되었다. 또한, 실시예 11에서는, 스팟 7로부터 0.7 μg, 스팟 8로부터 1.6 μg, 스팟 9로부터 0.4 μg, 3개의 스팟으로부터 합계 2.7 μg의 단백질 중량이 산출되었고, 또한, 스팟 10으로부터 0.24 μg의 단백질 중량이 산출되었다.
실시예 9, 11에 대하여 상술한 탈세포화 조직 조성물 20 mg 당 스팟의 단백질 중량의 산출을 수행하였다. 결과를 표 5, 6에 나타내었다. 실시예 9는 단백질 A를 0.05 질량% 포함하고 있었다. 실시예 11은 단백질 A를 0.33 질량%, 단백질 B를 0.03 질량% 포함하고 있었다.
스팟 번호 실시예 9
[μg]
3.4
6.6
0.8
스팟 번호 실시예 1
[μg]
17.2
39.3
9.8
5.89
《탈세포화 DNA비의 산출》
실시예 1, 9 및 11의 탈세포화 조직 조성물 및 비교예 1∼3의 탈세포화 재료의 질량을 측정하고, 이를 샘플로 하고, 단백질 분해 효소 용액에 침지하여 용해한 다음, 페놀/클로로포름으로 처리하여 단백질을 제거하고, 에탄올 침전법에 의해 DNA를 회수하였다. 회수한 DNA를 피코그린(Life Technologies사)에 의해 형광 염색하여 형광 강도를 측정함으로써 DNA를 정량하고, 샘플의 질량과 DNA의 양으로부터 샘플의 DNA 함유량을 산출하였다. 아울러, DNA의 정량에는 피코그린에 첨부된 표준 DNA를 사용하여 작성한 검량선을 사용하였다. 다른 샘플을 사용하여 샘플의 질량(수분량 70%)과 건조한 샘플(60℃의 항온조에 12시간 보존한 것)의 질량으로부터 건조 감량비를 구하고, 샘플의 DNA 함량과 건조 감량비로부터 샘플의 건조 질량 당 DNA 함량을 산출하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.
(탈세포화 DNA비)=(샘플의 건조 시험편의 DNA 함유량)/(샘플의 질량)Х100
DNA 양(ng)
(A)
샘플의 질량(mg)
(B)
탈세포화 DNA비
(A/B×100; 질량%)
실시예 1 6012 54.4 0.0110
실시예 9 7080 50.0 0.0142
실시예 11 7503 68.4 0.0111
비교예 1 27920 52.0 0.0536
비교예 2 18004 64.3 0.0280
비교예 3 9632 57.3 0.0168
고정수압 처리의 실시예 1, 9 및 11은 비교예보다 탈세포화가 양호하게 수행되어 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 탈세포화 조직 조성물은 양호한 조직 재생을 보이는 이식용 조직으로 사용할 수 있다.

Claims (8)

  1. 탈세포화 조직과, (a) 분자량: 30,000∼70,000 및 (b) 등전점: pI 6.00∼9.00의 단백질 A를 함유하는 탈세포화 조직 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, (a) 분자량: 3,000∼15,000 및 (b) 등전점: pI 3.00∼5.50의 단백질 B를 추가로 함유하는 탈세포화 조직 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 단백질 A의 함유량이 탈세포화 조직 조성물에 대하여 0.01∼5.0 질량%인 탈세포화 조직 조성물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 B의 함유량이 탈세포화 조직 조성물에 대하여 0.001∼3.0 질량%인 탈세포화 조직 조성물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 및 단백질 B의 조성물 중의 질량비가 A:B=5:1∼150:1인 탈세포화 조직 조성물.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 건조 질량 당 DNA 함유량이 탈세포화 조직 조성물에 대하여 0.0300 질량% 이하인 탈세포화 조직 조성물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 A가 아넥신(Annexin)인 탈세포화 조직 조성물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 B가 피브로모듈린(Fibromodulin) 유래 펩티드인 탈세포화 조직 조성물.
KR1020237018831A 2020-11-12 2021-11-12 탈세포화 조직 조성물 KR20230107827A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2020-188489 2020-11-12
JP2020188489 2020-11-12
PCT/JP2021/041694 WO2022102739A1 (ja) 2020-11-12 2021-11-12 脱細胞化組織組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230107827A true KR20230107827A (ko) 2023-07-18

Family

ID=81602364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237018831A KR20230107827A (ko) 2020-11-12 2021-11-12 탈세포화 조직 조성물

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4245845A4 (ko)
JP (1) JPWO2022102739A1 (ko)
KR (1) KR20230107827A (ko)
CN (1) CN116615528A (ko)
AU (1) AU2021379450A1 (ko)
CA (1) CA3204817A1 (ko)
TW (1) TW202233828A (ko)
WO (1) WO2022102739A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024122558A1 (ja) * 2022-12-06 2024-06-13 株式会社Adeka 脱細胞化細胞凝集体及びその製造方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0214212A (pt) 2001-11-16 2004-10-26 Childrens Medical Center Criação de órgãos reprodutores femininos construìdos por tecido
US20030187515A1 (en) 2002-03-26 2003-10-02 Hariri Robert J. Collagen biofabric and methods of preparing and using the collagen biofabric
AU2003238162A1 (en) 2002-06-28 2004-01-19 Cardio Inc Decellularized tissue
US8568761B2 (en) * 2005-07-15 2013-10-29 Cormatrix Cardiovascular, Inc. Compositions for regenerating defective or absent myocardium
JP6271298B2 (ja) * 2014-02-28 2018-01-31 国立大学法人 東京医科歯科大学 脱細胞組織の製造方法
EP3782629A1 (en) * 2015-02-27 2021-02-24 Adeka Corporation Decellularized tissue
US10517903B2 (en) * 2015-09-14 2019-12-31 Amnio Technology Llc Amnion derived therapeutic composition and process of making same
JP6841650B2 (ja) * 2016-12-26 2021-03-10 株式会社Adeka 医療材料用シート及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021379450A1 (en) 2023-06-29
EP4245845A4 (en) 2024-06-26
CN116615528A (zh) 2023-08-18
EP4245845A1 (en) 2023-09-20
CA3204817A1 (en) 2022-05-19
WO2022102739A1 (ja) 2022-05-19
TW202233828A (zh) 2022-09-01
JPWO2022102739A1 (ko) 2022-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10709813B2 (en) Solubilization of antigen components for removal from tissues
ES2846758T3 (es) Métodos para eliminar la alfa-galactosa
JP6816202B2 (ja) 組織製品の酵素処理方法
KR20130118418A (ko) 생체조직 유래 소재의 탈세포 처리제, 이를 이용한 처리방법 및 이로부터 수득된 생체 재료
KR20170122178A (ko) 탈세포화 조직
KR20230107827A (ko) 탈세포화 조직 조성물
Kumar et al. Effects of crosslinking treatments on the physical properties of acellular fish swim bladder
EP4361253A1 (en) Decellularized cell structure
KR20120002379A (ko) 이종 이식용 생체 조직 및 그 제조 방법
WO2014077934A1 (en) Solubilization of antigen components for removal from tissues
JP6712160B2 (ja) エンドトキシン測定のための前処理方法及びその測定方法
EP3125962B1 (en) Microbial enzymes for reduction of alpha-galactose from collagen based tissue

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination