KR20120002379A

KR20120002379A - 이종 이식용 생체 조직 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20120002379A
Application number: KR1020100063218A
Authority: KR
Inventors: 김용진; 임홍국; 이철
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2012-01-05
Also published as: KR101217136B1

Abstract

본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 새로운 무세포화, 알파-갈락토시다아제 처리, 글루타르알데히드, 제니핀, 카보디아마이드를 이용한 이중고정 처리방식 및 항독소화 방법을 통한 이종 이식용 생체 조직을 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 생체 조직을 제공하고자 한다. 상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따른 이종 이식용 생체 조직 및 이를 이용한 판막 및 판막 도관, 패치(patch) 등을 적용하는 경우, 석회화의 발생이 많이 감소하며, 독성이 적은 무세포성, 무면역원성의 생체 조직 이식이 가능한 우수한 효과가 있다.

Description

이종 이식용 생체 조직 및 그 제조 방법{TISSUES FOR XENOGRAFT AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 심장판막 이식술, 심장혈관 수술 및 조직첨포(patch)이용 수술시 사용할 수 있는 이종 이식용 생체 조직 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

국내외를 막론하고 과거의 방법에 의한 심장판막이나 판막도관의 연구개발은 정체기에 있으나, 이종 면역에 대한 개념과 조직공학의 발전으로 외국에서는 이에 대한 연구가 활발해지고 있으나, 국내에서는 과거에도 마찬가지였지만, 아직까지 이종조직판막이나 판막도관, 심낭 등의 심장혈관계 대치물에 관한 이종조직 개발연구는 전무하거나 매우 미미하고, 일부 생명공학팀에서 시도되었으나 그 결과가 구체적이지 못하고 미흡한 실정이며 또한 국내에서는 시제품 시도가 한번도 되지 못한 실정이다.

인체에 삽입된 인공조직판막이나 인공 조직 보철편 등의 부전은 생체와의 화학적, 물리적, 면역학적 반응 등에 의하여 변성, 퇴행되어, 결국 기능상실, 소멸 등의 절차를 밟게 되는데 흔히 그 대표적인 결과로 나타나는 것이 체내에서 완전 석회화되는 것이다. 과거부터 지금까지 그러한 조직의 변성이나 퇴행을 줄이기 위한 연구는 많이 진행되어 왔지만, 아직까지 만족할 만한 결과를 얻지 못하고 있는 실정이다.

특히 무세포화가 안된 소나 돼지의 심낭이나 판막에서 석회화의 원천적 자리를 제공하는 죽은 조직세포의 존재와 이종면역 항원의 계속적인 함유나, 이러한 돼지의 판막이나 소나 돼지 심낭 등의 조직 고정시 결합하는 글루타르알데히드(글루타르알데히드)의 알데히드기(-CHO)가 체내의 칼슘과 반응하여 석회화가 일어나는 원인으로 되고 있으나, 이를 적절히 처리하지 않으므로 심장내 이식후 조기 석회화로서 판막부전을 초래하고 있다.

이종조직의 면역반응을 유도하는 주요인자로 알파-갈 항원결정인자 (alpha-gal epitope)는 영장류를 제외한 모든 육지 포유류 척추 동물에 존재하는 폴리글라이칸(polyglycan)으로서 돼지 조직을 사람으로 장기 이식 시에 주요하게 과급성 거부반응(hyperacute rejection)을 일으킬 수 있는 원인으로 알려져 왔다. 최근에는 동물의 조직 세포 표면에 존재하는 대표적인 이종항원(xenoantigen)인 알파-갈 항원결정인자가 글루타르알데히드로 고정(fixation)한 상업적으로 판매되는 조직판막에도 여전히 존재하며, 조직판막을 이식받은 환자들에서 알파-갈 항원결정인자에 대한 자연항체(natural antibody)의 수치가 상승한다는 보고가 있어 조직판막의 구조적 손상에 있어 면역반응, 특히 동물면역반응이 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

알파-갈 항원결정인자는 동물의 세포막 표면에 존재하는 당단백질(glycoprotein) 및 당지질(glycolipid)에 갈락토실(galactosyl)기가 결합한 Galα1-3Galβ1-4GlcNAc로 표현되는 탄수화물 고리의 일종으로 영장류를 제외한 포유류에서 발현되며 포유류의 알파-1,3갈락토실트랜스퍼라아제(α-1,3 galactosyltransferase)에 의해 생성된다. 이는 포유류의 종에 따라, 또한 같은 종 내에서도 개체에 따라 그 발현 빈도가 다르나 일반적으로 세포 한 개당 10⁶개에서 35×10⁶개 정도로 그 양이 많으며 영장류에게 강한 면역학적 반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.

조직판막의 내구성을 증대시키는 방법에는 여러 가지가 있을 수 있으나 최근 동물의 장기이식에서 과급성거부반응을 일으키는 알파-갈 항원결정인자가 동물의 판막조직이나 심낭을 이용한 조직판막에도 존재하며, 환자의 항-갈 항체가 조직판막 안에 존재하는 알파-갈 항원결정인자와 반응하여 면역 반응을 일으키고 결국 판막의 석회화 및 이에 따른 파괴에 일정부분 역할을 할 것이라는 가설이 설득력을 얻고 있으며, 따라서 조직판막 내의 알파-갈 항원결정인자를 제거하는 것이 판막의 내구성 증대에 기여할 것이라고 생각한다.

조직판막을 만드는데 많이 사용되는 돼지의 세포 표면에 광범위하게 존재하는 알파-갈 항원결정인자를 제거하는 방법으로 알파-갈락토시다아제(α-galactosidase)라는 효소를 이용하여 세포의 표면에 존재하는 알파-갈 항원결정인자를 제거하는 방법이 있다. 이 방법은 쉽고 가격이 저렴한 장점이 있으나 살아있는 조직 내에서는 일정 시간이 지나면 알파-갈 항원결정인자가 다시 발현된다는 단점이 있다. 따라서 살아있는 장기가 아닌 고정된 심장판막 조직이나 심낭을 이용하고자 하였을 때에는 효소를 이용하여 동물세포에서 알파-갈 항원결정인자를 제거하는 방법이 유용할 것이다.

또한, 이러한 심장판막이나 심장혈관대체물은 국내에서 생산 판매되지 않고, 고가로 외국에서 전량 수입에 의존하고 있으며, 또한 국내의 연구 기술도 전무한 상태에 있다. 그리하여 인공조직판막이나 판막도관, 심장혈관대체물의 제작에 필수적이고 기초적인 조직의 고정처리법을 개발하는 것이며, 특히 면역학적으로 우수한 공법을 동시에 시도하였고, 또한 글루타르알데히드의 단독 고정방법의 단점을 극복하기 위한 것이다. 글루타르알데히드 고정방법의 발명으로 이종이식 판막 또는 심낭편의 보관이나 취급이 쉬워진 면이 있으나, 면역 반응 및 내구성 등에서 많은 해결 과제들이 남아 있어 완벽하다고 할 수 없고, 이에 여러 가지 새로운 처리기법의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 새로운 무세포화, 알파-갈락토시다아제 처리, 글루타르알데히드, 제니핀, 카보디아마이드를 이용한 이중고정 처리방식 저농도 가교고정재(crosslinking agents)의 사용 및 항독소화 방법을 통한 이종 이식용 생체 조직을 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 생체 조직을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 과제를 해결하기 위하여,

본 발명은,

(1) 인간을 제외한 포유동물의 생체 조직을 무세포화(decellularization)시키는 단계;

(2) 무세포화된 생체 조직을 고정화(fixation)시키는 단계; 및

(3) 고정된 생체 조직의 독성을 제거하는 단계를 포함하는 이종 이식용 생체 조직의 제조 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기 인간을 제외한 포유동물은 돼지 또는 소인 것이 바람직하다.

상기 생체 조직은 판막, 혈관 또는 심낭인 것이 바람직하다.

상기 생체 조직이 판막 또는 혈관인 경우 상기 단계 (1)은,

(1') 0.75~1.25% SDS가 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 36~60시간 동안 처리하는 단계;

(2') 1.0~2.0% N-라우로일사르코시네이트(N-lauroylsarcosinate)가 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계;

(3') 1.0~2.0% 트리톤 X-100(Triton X-100)이 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계;

(4') 등장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계; 및

(5') 고장성 완충용액을 4℃에서 6~12시간 동안 처리하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 생체 조직이 판막 또는 혈관인 경우 상기 단계 (1)은,

(1'') 0.75~1.25% SDS가 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 36~60시간 동안 처리하는 단계;

(2'') 1.0~2.0% N-라우로일사르코시네이트(N-lauroylsarcosinate) 및 1.0~2.0% 트리톤 X-100(Triton X-100)이 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 24~48시간 동안 처리하는 단계;

(3'') 등장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계; 및

(4'') 고장성 완충용액을 4℃에서 6~12시간 동안 처리하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 생체 조직이 심낭인 경우 상기 단계 (1)은,

(1''') 0.1~0.5% SDS 또는 0.5~1.0% N-라우로일사르코시네이트(N-lauroylsarcosinate)가 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 12~36시간 동안 처리하는 단계;

(2''') 0.5~1.0% 트리톤 X-100(Triton X-100)이 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계;

(3''') 등장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계; 및

(4''') 고장성 완충용액을 4℃에서 6~12시간 동안 처리하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (4')에는 α-갈락토시다아제 0.01~1.0U/ml을 더 처리하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (3'')에는 α-갈락토시다아제 0.01~1.0U/ml을 더 처리하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (3''')에는 α-갈락토시다아제 0.01~1.0U/ml을 더 처리하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (2)의 고정화는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 제니핀(Genipin) 및 카보디이미드(carbodiimide)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 화합물을 포함하는 고정액으로 처리하는 것이 바람직하다.

상기 고정액에서의 상기 화합물의 농도는 0.1~1.0%인 것이 바람직하다.

상기 고정액에는 알코올계 용매가 더 포함되는 것이 바람직하다.

상기 알코올계 용매는 70~80% 에탄올인 것이 바람직하다.

상기 단계 (2)의 고정은 1~3회 반복적으로 수행되는 것이 바람직하다.

상기 단계 (3)의 독성 제거는 L-라이신(L-lysine), 글리신(glycine), 키토산(chitosan), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 헤파린(heparin), 호모시스테인산(homocysteic acid), 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride) 및 소듐 비설페이트(sodium bisulfate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 처리하는 것이 바람직하다.

상기 독성 제거는 4℃, 실온 또는 37℃에서 24~48시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조되는 이종 이식용 생체 조직을 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따른 이종 이식용 생체 조직을 적용하는 경우, 석회화의 발생이 감소하며, 독성이 적은 무세포성, 무면역원성의 생체 조직 이식이 가능한 우수한 효과가 있다.

도 1은 판막 조직의 무세포화의 결과를 나타내는 사진이고,
도 2는 심낭의 무세포화의 결과를 나타내는 사진이고,
도 3은 무세포화 및 DNase 처리에 따른 돼지 심장 조직의 DNA양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 4는 α-갈락토시다아제의 α-갈 활성의 Bio-LC 모니터링의 결과를 나타낸 것이고,
도 5는 α-갈락토시다아제 처리 전후의 PAEC(porcine aortic endothelial cell)의 세포 수의 변화를 나타낸 그래프이고,
도 6은 α-갈락토시다아제 처리 전후의 동맥 판막 동결편의 강도(intensity)를 나타낸 사진이고,
도 7은 조직 내의 N-글라이칸(N-glycan)을 MALDI-TOF-Mass 분석방법으로 모니터함으로써 α-갈락토시다아제의 처리 전후로 α-갈 에피토프의 변화양상을 확인한 그래프이고,
도 8은 무세포화 단독 처리와 무세포화 중에 α-갈락토시다아제를 함께 처리한 소심낭의 H&E 염색 결과를 나타내는 사진이고,
도 9는 무세포화 단독 처리와 무세포화 중에 α-갈락토시다아제를 함께 처리한 소심낭의 masson tricrom 염색 결과를 나타내는 사진이고,
도 10은 무세포화 단독 처리와 무세포화 중에 α-갈락토시다아제를 함께 처리한 소심낭의 α-갈 에피토프 염색 결과를 나타내는 사진이고,
도 11은 무세포화 단독 처리와 무세포화 중에 α-갈락토시다아제를 함께 처리한 소심낭의 투과성 테스트 결과를 나타낸 그래프이고,
도 12는 다양한 조건으로 고정화시킨 생체 조직에 존재하는 아미노산 잔기와 그 양을 측정하여 그래프로 나타낸 것이고,
도 13은 다양한 조건으로 고정화 및 독성을 제거한 효과를 퍼팔트 테스트(Purpald test)로 검정한 결과를 보여주는 사진이고(P1 : 0.6% glutaraldehyde fixation, P2 : 0.6% glutaraldehyde fixation + heparin, P3 : 0.6% glutaraldehyde fixation + chitosan + heparin, P4 : 0.6% glutaraldehyde fixation + EDC (carbodiimide) + heparin),
도 14는 다양한 조건으로 고정화 및 독성을 제거한 최대 강도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이고,
도 15는 다양한 조건으로 고정화 및 독성을 제거한 최대 스트레인(strain)을 측정한 결과를 보여주는 그래프이고,
도 16은 다양한 조건으로 고정화 및 독성을 제거한 결과 황의 농도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고,
도 17은 다양한 조건으로 고정화 및 독성을 제거하고, 쥐 피하 이식 후 칼슘 농도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

이종 생체조직을 이용한 콜라겐 기반 심장혈관 인공삽입물(collagen-based cardiac prosthesis)의 이용이 많아지면서 이종장기의 생산과 면역거부반응의 극복을 위한 효과적인 방법 및 기술 개발을 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 실제로는 이를 뒷받침할 기본적인 각각의 생체 조직에 대한 기초적인 생화학적, 물리학적 정보가 미비한 실정이다.

따라서, 본 발명의 제1관점은 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 이종 이식용 생체 조직의 제조 방법을 제공하는 것이다:

(2) 무세포화된 생체 조직을 고정화(fixation)시키는 단계; 및

(3) 고정된 생체 조직의 독성을 제거하는 단계.

상기 인간을 제외한 포유동물은 예를 들어 돼지 또는 소이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 생체 조직은 판막, 혈관 또는 심낭인 것이 바람직하다.

상기 무세포화 과정은 조직의 손상을 최대한 배제하면서 면역반응 최대 인자인 세포 및 세포막 등을 완전히 제거하는 목적이 있다. 글루타르알데히드나 기타 가교제의 처리과정 중에 생기는 잔존세포가 석회화의 원인이 될 수 있으므로, 최대한 세포를 제거하여 효율을 극대화시켜야 하며 잔존 세포독성물질(protease, DNA, RNA)이나 사용되는 세정제의 독성합병증을 최소화하여야 한다.

따라서, 본 발명은 아래에 설명할 본 발명의 특징적인 무세포화 단계를 제공하며, 세포제거의 효율을 높이면서 동시에 생체 적합하도록 처리 물질로 인한 조직 손상을 최소화하며 나아가 자가 세포의 증식, 배양 재생과 함께 기계 생리 생화학적 부전을 방지하여 내구성을 높이는 효과를 얻을 수 있다.

즉, 상기 생체 조직이 판막 또는 혈관인 경우, 단계 (1)의 무세포화는 다음의 단계들을 포함하는 것이 바람직하다:

(5') 고장성 완충용액을 4℃에서 6~12시간 동안 처리하는 단계.

다른 구체예로서 상기 생체 조직이 판막 또는 혈관인 경우, 단계 (1)의 무세포화는 다음의 단계들을 포함하는 것이 바람직하다:

(4'') 고장성 완충용액을 4℃에서 6~12시간 동안 처리하는 단계.

또 다른 구체예로서 상기 생체 조직이 심낭인 경우, 상기 단계 (1)의 무세포화는 다음의 단계들을 포함하는 것이 바람직하다:

(1''') 0.1~0.5% SDS 또는 0.5~1.0% N-라우로일사르코시네이트 (N-lauroylsarcosinate)가 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 12~36시간 동안 처리하는 단계;

(4''') 고장성 완충용액을 4℃에서 6~12시간 동안 처리하는 단계.

본 발명의 저장성 완충용액, 등장성 완충용액 및 고장성 완충용액이라는 용어는 일반적으로 알려진 바와 같이 생리식염수의 소금의 농도가 0.9%인 것을 등장성, 그 보다 작은 경우를 저장성, 그 보다 큰 경우를 고장성으로 정의한다.

본 발명에서는 상기 무세포화 과정 중, 알파-갈 항원결정인자(α-Gal epitope)를 제거할 수 있는 방법으로 알파-갈 에피토프의 끝 말단인 1,3 연결을 절단할 수 있는 알파-갈락토시다아제의 처리 방법을 제공한다.

즉, 상기 단계 (4'), 단계 (3'') 또는 단계 (3''')에서 α-갈락토시다아제 0.01~1.0U/ml가 처리될 수 있다.

한편, 본 발명의 단계 (2)에 해당하는 고정화 단계는 글루타르알데히드와 같은 널리 이용되었던 일반적인 가교제뿐만 아니라 독성이 적은 제니핀과 같은 천연 가교제를 추가적으로 이용하여 조직을 고정함으로써 조직 처리방법에 따른 조직 내 화학적 반응과 관련하여 독성이 적으면서도 가교 능력은 월등히 향상되는 효과를 얻을 수 있었다.

또한, 독성이 약한 카보디이미드를 첨가하여 함께 사용함으로써 제니핀이나 글루타르알데히드의 고정 농도를 감소시킬 수 있으면서 가교 효율을 증가시킬 수 있다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 글루타르알데히드, 제니핀 및 카보디이미드의 농도, 고정처리기간, pH, 온도, 용매의 첨가 여부 등에 따라 조직의 유연성, 강도, 석회화의 경중, 감염가능성 여부 등으로 분류하여 접근하였고, 이에 따라 달라지는 양상을 생화학적인 인자의 변화로 분석하였으며 또한 물리역학적인 분석방법도 함께 적용하였다.

또한, 본 발명의 고정화는 석회화를 일으키는 재료가 되는 조직 내 인지질의 제거를 위한 고농도 에탄올과 같은 용매의 추가적인 첨가 방법을 제공한다.

즉, 본 발명의 상기 단계 (2)의 고정화는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 제니핀(Genipin) 및 카보디이미드(carbodiimide)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 화합물을 포함하는 고정액으로 처리된다.

상기 알코올계 용매는 70~80% 에탄올인 것이 바람직하다.

나아가, 본 발명은 조직 고정시에 발생하는 글루타르알데히드와 같은 반응 부산물들을 제거하기 위해 아미노산을 쉬프(Schiff) 염기로 사용하여 알데히드에 대한 항독소화 용도로 사용함으로써 수소 이온이나 나트륨 이온을 제공하여 줌으로써 알데히드나 케톤을 환원하여 반응 부산물들의 독성을 중화하는 독성 제거 단계 (3)을 포함한다.

즉, 본 발명의 상기 단계 (3)의 독성 제거는 L-라이신(L-lysine), 글리신(glycine), 키토산(chitosan), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 헤파린(heparin), 호모시스테인산(homocysteic acid), 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride) 및 소듐 비설페이트(sodium sulfate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 처리하는 것이 바람직하다.

상기 독성 제거는 4℃, 실온 또는 37℃에서 24~48시간 동안 처리되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 제2관점은 상기 본 발명의 제1관점에 의한 이종 이식 생체 조직의 제조 방법에 의하여 제조되는 이종 이식용 생체 조직을 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 이종 이식용 생체 조직은 인공 판막, 판막 도관을 수술적 또는 비수술적 방법으로 체내에 이식하는데 사용된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

실시예 1: 이종조직의 무세포화

이종 조직의 무세포화 과정은 조직의 손상을 최대한 배제하면서 면역반응 최대 인자인 세포 및 세포막등(alpha-gal, X107 /porcine aortic endothelial cell)을 완전히 제거하는 목적이 있다. GA 나 가교 처리과정 중에 생기는 잔존세포가 석회화의 원인이 될 수 있으므로, 최대한 세포를 제거하는 효율을 극대화시켜야 하며, 잔존 세포독성(protease, DNA, RNA)이나 사용되는 세정제의 독성합병증을 최소화하여야 한다. 이러한 세포제거의 효율을 높이면서 동시에 생체 적합하도록 처리 물질로 인한 조직 손상을 최소화하며 나아가 자가 세포의 증식, 배양 재생과 함께 기계 생리 생화학적 부전을 방지하여 내구성을 높이는 효과를 얻을 수 있다.

이러한 관점에서 본 실시예에서는 여러 종류의 이온성, 비이온성 세정제 및 완충액의 처리 조합으로 세포의 제거 정도를 H & E 염색 조직검사방법을 통하여 최소한의 시간을 가지면서 최대 제거 효과를 기대할 수 있는 2~3가지 방법을 선택하였다(도 1, 2). 저장액 전 처치를 시행하고, 트립신 효소를 이용하여 세정제의 침투를 향상시킴으로써, 무세포화 제거의 효율을 향상시킬 수 있는 방법을 고안하였으며, 다양한 농도와 조직손상을 최소화할 수 있는 저온, 보조적인 물리적 진동법 (oscillating shaker) 및 세정제의 처리, 그후 고장액과 등장액들을 시간차를 이용하여 무세포화하는 방법도 정립하였다. 세포의 잔여 물질 중에 강력한 면역반응 유도 인자로 볼 수 있는 DNA를 제거하기 위하여 DNase를 처리하여 DNA 양을 측정하여 무세포화 과정이 핵산의 감소를 유도함을 알 수 있었다(도 3).

1. 실험조직채취

도살장에서 도살된 건강한 돼지의 심장과 심낭 및 소의 심낭을 수의사의 협조하에 채취하여, 즉시 잔존 혈액을 세척한 후 4℃, 생리식염수에 담아 냉장 상자에 보관하여 실험실로 가져왔다. 실험실에서, 채취된 신선한 돼지 심장을 박리하여 대동맥판막 도관과 폐동맥판막 도관을 얻었다.

2. 무세포화(Decellularization) 과정

(1) 돼지 대동맥 및 폐동맥 판막 (Valve tissue)

찬 생리 식염수에 세척하고, 1~3 시간 동안 증류수에 0.1 PAA와 4% (v/v) 에탄올로 처리한 후, 3시간 동안 증류수에 세게 세척하였다.

4℃에서 48시간 동안 1% SDS가 포함된 저장액에서 처리하고, 1시간 동안 PBS 용액으로 세척한다. 4℃에서 12시간 동안 1.0% N-lauroylsarcosinate가 포함된 저장액에서 처리하고, 4℃에서 12시간 동안 1.0% TritonX-100이 포함된 저장액에서 처리한 다음, 4℃에서 12시간 동안 증류수로 세척하였다. 4℃에서 12시간 동안 등장액에서 처리하고, 4℃에서 6시간 동안 고장액(II)로 처리한 다음 1시간 동안 PBS 용액에 세척한 후 보관하였다.

(2) 돼지 및 소 심낭 (Pericardium)

찬 생리 식염수에 세척하고, 1시간 동안 증류수에 0.1 PAA와 4% (v/v) 에탄올로 처리한 후, 1~3 시간 동안 증류수에 세게 세척한다.

4℃에서 24시간 동안 0.25% SDS가 포함된 저장액에서 처리하고, 1시간 동안 PBS 용액으로 세척한다. 4℃에서 14시간 동안 0.5% TritonX-100가 포함된 저장액에서 처리한 다음, 4℃에서 1시간 동안 증류수로 세척하였다. 4℃에서 12시간 동안 등장액에서 처리하고, 4℃에서 6시간 동안 고장액(II)로 처리한 다음, 4℃에서 1시간 동안 PBS 용액에 세척한 후 보관한다.

3. 무세포화 검사

탈세포화 과정 후에는 조직을 생리식염수에 세척하고 10% 포르말린에 고정하여 조직검사와 그 외 필요한 검사들을 의뢰하였다. 탈세포화와 세포 외 기질의 보존 정도는 hematoxylin-eosin (H&E)염색으로 표본을 만들고 100, 200, 400배율에서 관찰하였다. 탈세포화를 평가하기 위해 탈세포화 처리를 하지 않은 시료를 H&E 염색하여 대조군 표본으로 사용하였다.

4. 무세포화 결과

(1) 판막 조직(Valve tissue)

상기 실시예의 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 탈세포화 처리를 한 돼지 대동맥판막, 대동맥벽, 및 대동맥근육의 H & E 염색 결과로, 탈세포화가 이루어져 세포핵이 제거되었음을 확인할 수 있다. 또한 상기 탈세포화 처리를 한 돼지 폐동맥판막, 폐동맥벽, 및 폐동맥근육의 H&E 염색 결과로, 탈세포화가 이루어져 세포핵이 제거되었음을 확인할 수 있다.

(2) 심낭조직 (Pericardium)

상기 실시예의 결과를 도 8에 나타내었다. 상기 탈세포화 처리를 한 돼지 심낭과 소 심낭의 H & E 염색 결과로, 탈세포화가 이루어져 세포핵이 제거되었음을 확인할 수 있다(도 2).

실시예 2: 이종조직 항원인 알파-갈 에피토프의 제거로 면역반응 감소 유도

본 실험에서는 알파-갈 항원결정인자(α-Gal epitope)를 제거할 수 있는 여러 가지 방법 중에 알파-갈 에피토프의 끝 말단인 1,3 연결을 절단할 수 있는 알파-갈락토시다아제를 적용하였다.

1. α-갈락토시다아제 처리

잔존 혈액을 제거하기 위해서 조직을 항생제 (100 U penicillin, 0.1 mg streptomycin, 0.5 mcg/mL amphotericin B)를 포함하는 인산완충염(PBS)에서 세척하거나, 찬 염수로 세척한 다음 증류수에 4% 에탄올을 함유하는 0.1% PAA에서 1시간 동안 처리하고 2시간 동안 증류수로 세게 세척하였다.

실시예 1의 2. 무세포화(Decellularization)과정 [(1) 돼지 대동맥 및 폐동맥 판막 (Valve tissue) 및 (2) 돼지 및 소 심낭 (Pericardium)]을 시행하였다.

4℃에서 24시간 동안 무세포화 과정의 등장액 처리 동안에 α-갈락토시다아제 (0.1U/ml)를 처리하였다. 다음으로, 4℃에서 6시간동안 고장액(II)으로 처리하였다. 그리고 4℃에서 1시간 동안 PBS로 세척하여 보관하였다. 이를 기계적 테스트, 투과성 테스트, 면역혈청 검사, 아미노산 분석, 질량 분석(MALDI-TOF)을 시행하였다.

2. 결 과

녹색커피콩 식물에서 추출한 효소를 이용하여 형광 염색방법으로 갈을 염색하여 접근하였다. 또한, 유전자 재조합 단백질 제작의 기술을 도입하여 얻은 효소를 가지고 갈 물질로부터 조직에 이르기까지 최적화를 진행하고, 절단하는 효율을 Bio-LC chromatography, ELISA, FACS, lectin을 이용한 SA-biotin 간접 염색으로 정성 분석을 하였다. 더 나아가, gal epitope glycan을 정량할 수 있는 MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 분석 툴을 적용하였다(도 4 내지 도 7). 재조합 단백질을 통하여 나중에 소요될 수 있는 가격과 실험자의 용이에 맞게 이용할 수 있는 장점을 얻을 수 있었다.

α-갈락토시다아제를 소심낭에 처치하여 달라지는 효과를 물리화학적, 병리학적으로 분석하여, 효소를 처치한 군이 무처리군 및 무세포화 처리만 한 군과 차이가 나는지를 확인하였다. 기계적 테스트에서 인장 강도와 온도 안정성에서는 차이가 나지 않았으며, 투과성 테스트에서는 1.5배 조직의 포어(pore)를 통하여 용액이 유출되나 이것은 트립신 처리군보다 현저하게 적은 결론을 얻었다(도 8 내지 도 11 및 표 1~3, 표 1은 투과성 테스트의 결과이고, 표 2는 인장 강도 테스트 결과이고, 표 3은 온도 안정성 테스트 결과이다).

- 소 심낭 (면적:1 cm x 1 cm x π = π cm²)

- 조직 스트립 : 8 x 30 mm

- 수축 온도 측정(Shrinkage temperature measurement) : Water Proof Digital Thermometer (-50℃~200℃/-58℉~392℉)

- 온도 경사(Temperature slope) : 약 1-2.5℃/min

- 저장(Storage) : 일반 생리식염수 내의 2% 벤질알코올

실시예 3: 글루타르알데히드와 제니핀 고정의 생화학적 평가

본 실시예에서는, 소 심낭과 돼지 심낭 및 판막에 대한 지방함량, 칼슘함량, 무기인 및 인지질 함량, 아미노산 량에 대한 기본적 정보를 마련하고, 그와 관련하여 이종이식 판막 및 심장의 인체 내 이식이나 대체사용을 위해 글루타르알데히드나 제니핀 및 유기용매를 이용해 고정했을 때 소 심낭과 돼지 심낭 및 판막에서 생화학적으로 어떤 변화가 일어나는지 확인하였다.

처리 전 조직 (Group 1), 0.5% 글루타르알데히드로 고정한 조직 (Group 2), 0.5% 글루탈알데히드와 유기용매로 고정한 조직 (Group 3), 0.3% 제니핀으로 고정한 조직 (Group 4), 그리고 0.3% 제니핀과 유기용매로 고정한 조직 (Group 5)을 가지고 조직내의 총 콜레스테롤 (T-Chol), 중성지방 (TG), 칼슘, 무기인 및 18종류의 아미노산들을 정량하였다.

1. 재료의 수집, 처리 및 보관

(1) Group 1 (Fresh)

도살장에서 도살된 건강한 돼지의 심장과 심낭 및 소의 심낭을 수의사의 협조 하에 채취하여, 즉시 잔존 혈액을 세척한 후 4℃ 생리식염수에 담아 냉장상자에 보관하여 실험실로 가져왔다. 채취된 신선한 돼지 심장을 박리하여 얻은 대동맥판막 도관, 폐동맥판막 도관, 심낭 절편 및 소의 심낭 절편을 생리식염수로 여러번 세척하여 복합항균제제 (1cc/L, antibiotic & antimycotic solution, Sigma)를 섞은 인산염완충 식염수 (phosphate buffered saline, PBS pH 7.4)에 약 1-2시간 동안 4℃에서 냉장 보관하였다.

(2) Group 2 (0.5% GA 고정)

Group 1의 돼지 대동맥판막 도관, 폐동맥판막 도관, 심낭 절편 및 소의 심낭 절편을 5일간 상온에서 0.5% 글루타르알데히드(GA)로 고정한다. 0.5% GA는 50% 용액 (Junsei Cheminal Co. Ltd., Japan)을 인산염완충 식염수 (phosphate buffered saline, PBS pH 7.4)로 희석하여 준비하였다.

(3) Group 3 (유기용매 하에서 0.5% GA 고정)

Group 1의 돼지 대동맥판막 도관, 폐동맥판막 도관, 심낭 절편 및 소의 심낭 절편을 5일간 상온에서 2% 글루타르알데히드(GA)로 고정한 후 유기용매 (0.5% GA, 75% 에탄올 및 5% 1-옥탄올)를 가지고 2일간 더 고정하였다.

(4) Group 4 (0.3% 제니핀 고정)

Group 1의 소심낭 절편을 4일간 상온에서 0.3% 제니핀 용액으로 고정하였다. 0.3% 제니핀 용액은 제니핀 (Wako Pure Chemical Industies., Ltd.)을 인산염완충 식염수 (phosphate buffered saline, PBS pH 7.4)로 희석하여 준비하였다.

(5) Group 5 (유기용매 하에서 0.3% 제니핀 고정)

Group 1의 소심낭 절편을 2일간 상온에서 0.3% 제니핀 용액으로 고정한 후 유기용매 (0.3% 제니핀 , 75% 에탄올 및 5% 1-옥탄올)를 가지고 2일간 더 고정하였다.

2. 생화학 검사

(1) 지방(lipid)의 정량

수거한 우심낭편, 돼지 심낭편, 돼지 폐동맥 판막, 돼지 대동맥 판막을 1cm ×1cm 크기로 잘라 특수제작된 강화유리 튜브에 넣고 1ml의 인산염완충 식염수 (phosphate buffered saline, PBS pH 7.4)을 첨가한 후, 균질기 (X120, Ingenieurburo CAT M. Zipperer GmbH, Germany)를 이용해 조직을 완전히 분쇄하였다. 이 조직 용액에 클로로포름과 메탄올을 2:1로 3ml 첨가한 후, Centrifuge 5810R (Eppenforf AG, 22331 Hamburg, Germany)을 이용해 4℃에서 3000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 이 용액의 하층액만을 2 ml Effendorf tube에 담아 Speeed Vac Concentrator AES1010 (Savant Instruments, INC. Holbrook. NY )이용해 휘발시켜 Pellet을 얻었다. 여기에 200μl의 0.01% Triton-X100이 포함된 인산염완충 식염수를 첨가한 후, Wet chemistry법을 이용하여 Automatic chemistry analyzer (HITACHI-7070)로 총 콜레스테롤 (T-Chol)과 중성지방 (TG)을 정량하였다.

T-Chol과 TG는 건조 조직의 단위 무게당 포함된 정도를 nmol/mg로 표시하였다(실험상의 건조 중량은 조직 내 수분량을 70%로 보고 건조중량으로 보정하여 계산되었다).

(2) 칼슘과 무기인의 정량

수거한 우심낭편, 돼지 심낭편, 돼지 폐동맥 판막, 돼지 대동맥 판막을 24시간 이상 hot dryer (650G Fisher Scientific, U.S.A.)에서 건조시킨 후 각각 조직의 무게를 재고, 2 ml Effendorf tube에 담아 5N HCl 용액 1.5 ml를 첨가하고 70 ℃ hot dryer (650G Fisher Scientific, U.S.A.)에서 완전 용해될 때까지 24시간 이상 기다렸다. 이 조직 용액을 Effendorf tube에 옮겨 담은 후 24시간 동안 HCL을 모두 휘발시켜 펠릿만 남은 상태에 1ml의 증류수를 첨가하여 모두 1 ml가 되도록 표준화한 후, Wet chemistry법을 이용하여 Automatic chemistry analyzer (HITACHI-7070)로 칼슘과 무기인을 정량하였다.

칼슘과 무기인은 조직의 단위 무게당 침착된 정도를 μg/mg 단위로 표시하였다.

(3) 아미노산의 정량

수거한 우심낭편, 돼지 심낭편, 돼지 폐동맥 판막, 돼지 대동맥 판막을 24시간 이상 hot dryer (650G Fisher Scientific, U.S.A.)에서 건조시킨 후 각각 조직의 무게를 재고, 2 ml Effendorf tube에 담아 5N HCl 용액 1.5 ml를 첨가하고 70 ℃ hot dryer (650G Fisher Scientific, U.S.A.)에서 완전 용해될 때까지 24시간 이상 기다린다. 이 조직 용액을 Effendorf tube에 옮겨 담은 후 24시간 동안 HCl을 모두 휘발시켜 펠릿만 남은 상태에서 ion pairing method를 사용하여 LC MC/MS (Waters ,USA)이용해 18종류의 아미노산들을 정량하였다.

각각의 아미노산들은 조직의 단위 무게당 포함된 정도를 μmol/L·g 단위로 표시하였다.

3. 결 과

돼지 폐동맥 판막과 대동맥 판막의 처리 전 정상조직의 T-Chol(total cholesterol) 함량은 13.33 ± 2.11 nmol/mg, 9.68 ± 2.25 nmol/mg 이었으며, TG(triglyceride) 함량은 1.90 ± 0.55 nmol/mg, 1.88 ± 1.03 nmol/mg 이었다. 돼지 심낭과 소 심낭의 정상조직의 경우 T-Chol 함량은 0.88 ± 0.18 nmol/mg, 3.26 ± 1.36 nmol/mg 이었으며, TG 함량은 17.34 ± 1.35 nmol/mg, 12.09 ± 3.87 nmol/mg 으로 나타났다.

처리전의 소심낭과 돼지 심낭 및 판막에서 칼슘은 0.15 ~ 0.27 μg/mg, 무기인은 1.88 ~ 6.8 μg/mg의 수치를 나타냈다. 무기인 수치를 가지고 환산한 인지질의 양은 돼지 심낭 및 판막에서 72.22~ 170.08 μg/mg, 소심낭에서 47.04 μg/mg 이었다.

아미노산의 경우 소 심낭과 돼지 심낭 및 판막에서 글리신 (33.1~34.87 %), 프롤린 (11.36~17.09 %), 알라닌 (10.24~12.32%)의 순서로 높은 함량을 보였다. 이러한 처리전의 정상 조직의 아미노산 잔기들에 대하여 글루타르알데히드는 우심낭의 세린, 히스티딘, 프롤린, 타우린, 리신 잔기들과 주요하게 반응하였으며, 제니핀은 우심낭의 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 프롤린, 트레오닌, 아르기닌, 타우린, 티로신, 메티오닌, 발린, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 리신 잔기들과 주요하게 반응하는 것을 확인하였다. GA(글루타르알데히드)나 제니핀을 유기용매와 함께 사용하여 고정한 조직의 경우, 반응하는 아미노산의 종류는 같았으나 더 많은 량의 아미노산 잔기들이 반응하였다(도 12). Group 1의 각 조직의 TG양은 GA와 유기용매를 함께 사용하여 고정하였을 때 (Group 3) 효과적으로 감소하였으며, T-Chol 양은 GA, 제니핀, 그리고 GA 및 제니핀을 유기용매와 함께 사용하여 고정한 조직 (Group 2, 3, 4, 5)에서 모두 효과적으로 감소하였다.

Group 1의 각 조직의 인지질의 양은 0.5% GA를 사용하여 고정하였을 때 감소하였으며, 0.3% 제니핀, 그리고 GA 및 제니핀을 유기용매와 함께 사용하여 고정하였을 때(Group 3, 4, 5) 더욱 효과적으로 감소하는 것으로 나타났다. 조직내의 석회화는 결합조직 내 산성 인지질과 칼슘사이의 정전기적 인력으로부터 시작될 수 있다. 이와 관련하여, 세포 내 지질을 제거한 후 이종이식 했을 때, 석회화가 덜 되었다는 보고가 있다. 때문에 지질, 특히 인지질에 대한 본 연구는 대조군에 대한 지질 수치 보고가 극소수인 현실수준의 단계를 넘어 괄목할 만한 결과이며 앞으로 이식 후에 달라지는 양상을 포괄적으로 모니터할 수 있는 토대를 마련하게 되었다.

실시예 4: 글루타르알데히드 및 제니핀 고정과 용매 첨가의 물리역학적인 평가

유연성, 물리적 특성(physical property), 조직의 인장 강도 검사, 열에 의한 콜라겐 변성 실험(thermal stability test), 가속 내구 시험(accelerated fatigue test)을 통하여 조직의 처리조건에 따른 결과로서 글루타르알데히드 고농도나 용매첨가는 조직의 유연성이나 물리적 활동성은 약간 감소하는 경향이 있으나, 가교와 관련하여 조직의 열안정도검사에 전혀 문제가 없으며, 조직의 강도나 피로에 장기간 노출 시 조직의 손상이 적고 원래 모습을 잘 유지함을 보여줌으로 70-80% 정도의 에탄올 혼합 용매의 사용은 이종조직에서 구조적으로 유리한 형태학적인 형태 변화를 주는 것 외에 크게 차이가 없었다. GA 고정한 것에 비해 제니핀의 고정은 조직의 두께가 두꺼워지고 인장력이 증가한다. 열안정성 검사에서는 GA가 약 85℃이고 제니핀은 약 80℃ 정도이다.

GA 농도별 (0.15%, 0.25%, 0.5%, 0.65%) 검사에서 인장강도와 열안정성은 별 차이를 보이지 않았다. 이는 GA 고정은 0.25%-0.5% 농도 사이가 가장 바람직하며, 낮은 온도 (4℃)에서 효과적으로 고정할 수 있었으며, GA 고정시나 제니핀 고정시 70-80% 정도의 알코올 혼합 용매 사용은 이종조직에서 구조적으로 유리한 형태학적인 변화를 줄 수 있었다.

각 고정 방법에 따른 기계적 테스트의 결과는 아래 표 6 내지 표 10과 같다.

아래의 표 11 부터 14는 위의 각각의 고정방법에 대한 기계적 테스트 및 안정성의 결과를 나타낸 것이다.

실시예 5: 글루타르알데히드 고정과 용매 첨가 및 독성 제거의 생체 내 평가

석회화를 일으키는 재료가 되는 조직내 인지질의 제거를 위한 고농도 에탄올, 그 외 용매 첨가 시도 방법, 조직 고정시에 발생하는 글루타르알데히드 반응 부산물들을 제거하기 위한 아미노산을 사용하여 독성을 제거하는데, L-리신, 글리신, 키토산, 글루탐산, 아르기닌, 헤파린, 호모시트테인산과 그 외 산화 환원제(reducing agents)인 소듐 보로하이드라이드, 소듐 비설페이트를 사용하여 수소 이온과 나트륨 이온을 제공하여 알데히드나 케톤을 환원해줌으로 GA의 독성에 대하여 중화 처리한 후 소동물(쥐)에 이식하여 석회화 정도를 분석하였다.

1. 조직 고정

글루타르알데히드 고정 : 도살장에서 얻은 소의 심낭을 phosphate buffered saline (PBS) 용액(0.1 M, pH 7.4)에 넣은 후 얼음 상자에 담아 실험실로 운반하였다. 실험실에 도착한 즉시 심낭 조직을 생리식염수로 세척한 후, 심낭 조직 표면의 지방 조직들을 박리하여 제거하였다. 이렇게 준비한 조직들을 PBS로 완충된 0.15-0.65% 글루타르알데히드 용액(pH 7.4)에 넣고 고정하였다. 더 이상의 처리가 필요 없는 조직은 생리식염수로 10분간 철저히 세척한 후 2% benzyl alcohol 용액에 넣어 4℃에서 보관하였다. 추가적인 처리가 필요한 조직들은 생리식염수로 10분간 철저히 세척한 후 다음 단계로 진행하였다.

2. 독성 제거 처리

(1) L-리신 처치

GA 고정 및 용매 첨가, 무세포화를 시행한 소의 심낭편들을 PBS 용액으로 세척한 후, 0.1M L-리신 용액 (PBS, 0.1M, pH 7.4)에 담가 37℃에서 48시간 동안 처리하였다. 이후 PBS 용액으로 세척한 후, 쥐에게 이식할 때까지 2% 벤질알코올 용액 (0.9% normal saline)에 넣어 4℃에서 보관한다.

(2) 글리신 처치

GA 고정 및 용매 첨가, 무세포화를 시행한 소의 심낭편들을 PBS 용액으로 세척한 후, 0.1M 글리신 용액 (PBS, 0.1M, pH 7.4)에 담가 37℃에서 48시간 동안 처리하였다. 이후 PBS 용액으로 세척한 후, 쥐에게 이식할 때까지 2% 벤질알코올 용액 (0.9% normal saline)에 넣어 4℃에서 보관하였다.

(3) L-글루탐산 처치

GA 고정 및 용매 첨가, 무세포화를 시행한 소의 심낭편들을 PBS 용액으로 세척한 후, 0.12M L-글루탐산 용액 (PBS, 0.1M, pH 7.4)에 담가 실온에서 48시간 동안 처리한다. L-글루탐산 용액은 PBS 용액에 0.12M L-글루탐산을 녹인 후 pH를 7.0으로 맞춘다. 이후 PBS 용액으로 세척한 후, 쥐에게 이식할 때까지 2% 벤질알코올 용액 (0.9% normal saline)에 넣어 4℃에서 보관하였다.

(4) 소듐 보로하이드라이드 처치

GA 고정 및 용매 첨가, 무세포화를 시행한 소의 심낭편들을 PBS 용액으로 세척한 후, 0.1M 소듐 보로하이드라이드(PBS, 0.1M, pH7.4)에 담가 실온에서 48시간 동안 처리하였다. 이후 PBS 용액으로 세척한 후, 쥐에게 이식할 때까지 2% 벤질알코올 용액 (0.9% normal saline)에 넣어 4℃에서 보관하였다.

(5) 소듐 비설페이트 처치

GA 고정 및 용매 첨가, 무세포화를 시행한 소의 심낭편들을 PBS 용액으로 세척한 후, 40% 소듐 비설페이트 포화용액에 담가 4℃에서 24시간 동안 처리하였다. 이후 PBS 용액으로 세척한 후, 쥐에게 이식할 때까지 2% 벤질알코올 용액 (0.9% normal saline)에 넣어 4℃에서 보관하였다.

3. 이식 전 심낭 조직의 현미경 검사

각종 처리에 의해 발생할 수 있는 심낭 조직 미세구조의 변화를 알아보기 위하여 각 군당 대표적인 1개씩의 조직들을 광학현미경(hematoxylin-eosin 염색, H-E stain) 및 전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)으로 검사하였다.

4. 쥐 피하 이식(Rat subcutaneous implantation)

수컷 쥐(Sprague-Dawley rats)들을 사용하였으며, Zoletil (20 mg/kg) 및 Rompun (5 mg/kg)을 복강내 투여하여 마취시킨 후, 등 부위를 제모하고 알코올로 소독하였다. 항생제(cefazolin 20 mg/kg)를 피하 주사한 후, 등 부위에 4개의 피부 절개를 가한 뒤 피하 조직을 박리하여 공간을 만들고 각각의 공간에 생리식염수로 세척한 1개씩의 심낭 조직(가로 세로 1 cm)들을 이식하였다. 각 군당 이식한 심낭 조직의 갯수는 8∼10개였다. 이식 후 상처 부위는 3-0 나일론으로 봉합하였다. 이후 12-16주간 사육한 쥐들을 이산화탄소로 질식시켜 안락사시킨 후, 체중을 측정하였다. 등 부위를 제모하고 이전의 상처 부위를 절개하여 피하 조직을 박리한 후, 이식되어 있는 심낭 조직들을 수거하였다. 심낭 조직에 붙어있는 쥐의 피하 조직들을 박리하여 제거한 후 생리식염수로 세척하고, 칼슘정량을 위하여 2% 벤질알코올 용액에 보관하였다.

5. 칼슘 정량 분석

각 군당 6∼9개 조직들의 칼슘 함량을 측정하였다. 수거한 심낭 조직들을 생리식염수로 세척한 후 건조시키고 (90℃, 48시간) 질량을 측정하였다. 건조된 조직들을 질산 (nitric acid, HNO3)으로 전처치한 후, 유도결합 플라즈마-원자 방출분광기(Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrophotometer, ICP-AES)를 이용하여 조직내 칼슘 함량을 측정하였다.

6. 이식 후 심낭 조직의 현미경 검사

각 군당 대표적인 1개씩의 조직들을 전자현미경(TEM)으로 검사하여 석회화 유무 및 그 정도를 알아보았다.

7. 야생형 쥐의 피하이식 결과

글리신, 글루탐산, 소듐 보로하이드라이드, 소듐 비설페이트 등이 효과가 탁월하였으며, 용매처리 역시 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 이와 같이 여러 가지 아미노산의 공유결합을 유도하여 항독소화의 유효성을 입증할 수 있었으며, 비교적 저 농도의 글루타르알데히드 결합이 우수하며 유기용매의 첨부 사용이 상승효과를 보였다.

표 15와 표 16은 실험 기간 동안 시행되었던 쥐에게 생체내 이식모델의 결과로서 각각의 고정방법과 항독소화 처리후 쥐 피하 이식 시행 후 칼슘과 무기 인의 정량 결과들이다.

- Rat implantation, 16 weeks, n=5

- Rat implantation, 12 weeks, n=6

실시예 6: 카보디이미드 이중 교차결합 및 헤파린을 이용한 항석회화 처리

카보디이미드 이중 교차결합을 위하여 0.2~1%(20-100mM) 카보디이미드와 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 용액에 담가 12~24시간 실온에 둔 뒤 GA 고정후 헤파린 처리를 시행하여 이중 교차결합의 유용성을 시행하였다.

소, 돼지 심낭편에 다양한 항석회화 처리를 한 후 이를 쥐의 등부위 피하조직에 이식하여 2-3개월간 사육하였다. 이후 이식한 심낭편을 적출하여 석회화 정도를 정량하고, 광학 및 전자현미경으로 미세구조를 관찰하였다.

1. 심낭조직의 고정 및 항석회화처리

심낭조직의 고정은 0.625% 글루타르알데히드를 사용하고, 이후 독성 제거를 위하여 헤파린처리를 하였다. 헤파린 처리에는 3가지 다른 프로토콜을 사용하는데 첫번째는 고정된 이식편과 헤파린을 직접 섞어 공유결합을 유도하는 방법, 두번째는 헤파린을 탈중합화(depolymerization)시킨 뒤 키토산을 이용하여 결합을 유도하는 방법, 세번째는 이미드기를 가지고 있는 또 다른 조직 고정액인 카보디이미드로 다중 가교를 유도한 뒤 헤파린을 직접 결합시키는 방법이며, 각각 헤파린 결합 전과 후를 다음과 같이 비교하였다.

(1) 1군 : GA 고정

도살된 돼지에서 즉시 심낭을 적출하여 PBS 용액(0.1M, pH 7.4)에 넣어 아이스 박스에 담아 실험실로 운반하였다.

돼지 심낭을 0.625%의 GA 용액 (PBS buffer, pH 7.4)에 담가 4℃에서 48시간 고정한 후, 상온에서 0.25% GA에 담가 7일간 추가로 고정하였다. 고정이 끝나면 멸균 증류수로 세척한 뒤 심낭을 가로 세로 1.5cm 크기의 심낭편들로 나누어서 더 이상의 처치가 필요하지 않은 심낭편들은 쥐에게 이식할 때까지 4℃의 PBS 용액에 보관하였다.

추가적인 항석회화 처리가 필요한 심낭편들은 바로 다음 단계로 진행하였다.

(2) 2군 : 직접적인 헤파린 커플링

고정된 심낭편을 2.5% (w/v) 헤파린에 담가 2일간 처리(PBS pH 11 at 4℃)한 뒤 PBS로 씻고 0.01N NaBH4 로 처리하였다(4℃에서 16 hr).

(3) 3군 : 중간 물질에 탈중합화된 헤파린 결합

헤파린의 탈중합화를 위해 질산으로 처리하였다. 4℃, 염수에 1g의 헤파린을 넣고 10mg의 NaNO2를 첨가한 뒤 HCl로 pH를 2.0에 맞추고 3시간 동안 저은 뒤 마지막에 1N NaOH를 이용하여 pH를 7.4로 맞추었다.

중간체 표면 결합 기질로 탈이온수(pH 6.5)에 0.1% 키토산과 0.015% 젠타마이신 셀페이트를 섞은 뒤 준비된 GA 고정 심낭을 1주일간 실온에서 담가두었다.

이 심낭과 앞에서 준비한 헤파린을 0.1%농도로 1주일간 실온에 둔 뒤 일반 염수에 0.0125% NaBH4(pH 8.4-8.8)를 섞어 24시간 실온에 두어 공유결합을 안정화시켰다.

(4) 4군 : 이중 교차 결합 후 헤파린 결합

고정된 심낭을 2.5% EDC 용액에 담가 48시간 동안 실온에 담근 뒤 멸균 증류수로 씻었다. 헤파린을 처리하기 위해서는 2군에서와 같이 2.5% (w/v) 헤파린에 담가 2일간 처리(PBS pH 11, 4℃)한 뒤 PBS로 씻고 0.01N NaBH4로 처리하였다(4℃, 16시간).

2. 예비 실험

(1) 미세 구조 관찰

각 군당 1개의 심낭편들은 쥐에게 이식하지 않고 광학 및 전자현미경으로 미세구조를 관찰하였다. 대조군 외에 군에서는 심낭편의 글루타르알데히드 독성 제거가 얼마나 이루어졌는지 알아보기 위해 Purpald solution test (aldehyde residue evaluation)를 수행하였다. 이를 위해서 심낭편을 일반 염수로 세척한 후 1M NaOH 용액 내의 0171M Purpald (25g Purpald 분말을 1M NaOH 용액 1 liter에 녹인다)에 15분간 담근 후 공기중에 노출시켜 심낭편의 색이 변하는데(보라색 혹은 옅은 핑크색) 걸리는 시간 및 색상의 정도를 정성적으로 분석하였다. 독성 제거 처리를 한 경우에는 약 10분 후에 옅은 핑크색으로, 처리를 하지 않은 경우에는 몇분후에 보라색으로 변할 것이 예상된다. 색이 변하는 데 걸리는 시간을 기록하였다(1분 간격 10분까지 디지털 카메라 촬영). 독성 제거 처리를 하지 않은 심낭편들에도 같은 검사를 해서 그 결과를 비교하였다.

(2) 황 함량 측정

이식편의 황 함량을 측정하여 간접적으로 이식편에 헤파린이 얼마나 부착되었는가를 비교해보았다. 심낭편을 냉동건조시킨 뒤 무게를 재고 121℃ 6.0 N HCl 용액에 48시간 가수분해시킨 뒤 추출액에서 ICP(inductively coupled plasma) 법을 이용하여 황 함량을 측정하였다.

3. 쥐의 피하 이식

(1) 쥐의 이식 프로토콜

카타민(10-50mg/kg IP)으로 쥐를 마취한 다음 등 부위 피하조직에 4개의 파우치를 만든 후, 각각의 파우치에 위의 방법대로 처리한 심낭편들을 랜덤하게 이식한 후 상처를 봉합하였다. 이후 2-3개월간 사육하였다.

(2) 이식된 심낭의 수집

심낭편 이식 후 3개월이 지나면 실험을 종료하게 되며, CO2 질식으로 쥐를 죽였다. 이식 시에 만들었던 피하 파우치를 박리하여 심낭편들을 적출해내었다. 적출해낸 각각의 심낭편들을 3등분하여 결과 분석에 사용하게 된다.

(3) 항석회화의 효과 평가

각 군의 심낭편의 석회화 정도를 알아보기 위해 칼슘 정량을 시행하였다. 이를 위해서 심낭편을 탈이온수로 세척한 후 건조시키고 무게를 측정한 후 atomic absorption spectroscopy를 이용하여 칼슘 함량을 정량하였다.

4. 결 과

Purpald solution test (aldehyde residue evaluation)에서 헤파린 독소 제거 처리를 한 군(2, 3, 4군)이 GA 고정 (1군) 보다 알데히드 잔기가 적었으며, 3군과 4군의 독소 제거 처리가 2군보다 더 잘되었다(도 13). 기계적 테스트에서 헤파린 독소 제거 처리를 한 군의 기계적인 특징이 양호하였다(도 14, 도 15). 이식편의 황 함량을 측정하여 간접적으로 이식편에 헤파린이 얼마나 부착되었는가를 비교해 보았을 때, 3군과 4군이 많이 부착되었다(도 16). 쥐 피하 이식 2-3개월 후에 헤파린 처리를 한 군(2, 3, 4군)에서 심낭편의 석회화가 현저히 감소하였다(도 17).

심장 수술의 증가에 따르는 보철편의 수요 증가가 계속 되는 상황에서 인공보철편들과 타 동물로부터 채취 제작한 보철편들은 정도의 차이는 있지만 심장 내 이식 후 석회화의 진행에 따르는 중장기 수술 성적의 미흡함이 계속 문제점으로 남아 있다. 이에 본 발명에 따른 이종이식 생체 조직 제조방법에 의하여 기존의 보철편보다 한결 우수한 석회화 방지 및 완화 효과와 세포독성과 면역성이 제거된 생체 조직을 제작, 상품화할 수 있을 것으로 기대되며, 특히 심장판막질환이나 심장혈관수술시 사용할 수 있는 완전 이식 가능한 심장판막이나 심장 판막도관, 혈관대체물들의 제작에 적용할 수 있을 것이다.

특히, 심장혈관계통의 인공조직이식편의 임상적 사용에는 크게 나누어 이종이식 심낭과 판막, 혈관 등으로 볼 수 있다. 이종이식 심낭은 간단한 결손심낭의 보충에서부터 심장혈관계 결손부위의 폐쇄, 보강 등으로부터, 복잡심기형 교정 수술 등에 필요한 보철편으로서의 활용 등 여러 가지가 있다. 주로 혈관 내지 심장의 일부로서 혈액이 누출없이 원하는 방향으로 흐르도록 하는 판막 재료로서의 역할을 하게 된다. 이때 면역원성을 개선하여 석회화 등이 일어나지 않고 오랫동안 제 역할을 하도록 하며, 물리학적 특성의 개선으로 수술 중 조작성도 개선될 것으로 기대하고 있다.

또한, 이식조직 판막은 심장혈관계 수술 중 특히 판막질환에 적용하고자 하는 것으로 특히 지금까지 내구성의 문제로 소아나 젊은 층에서 사용이 기피되던 단점을 극복하고, 장년, 노령층에서도 역시 내구성의 향상으로 재수술을 줄이고, 장기간의 혈역학적으로 개선된 모델을 제작할 수 있을 것으로 기대된다.

또한 이종 이식 판막도관은 가장 많이 쓰일 것으로 생각되는 분야는 선천성 심장 기형 중 라스텔리 수술(판막도관 이식 수술)을 받은 환자에서 우심실-폐동맥도관에 사용할 판막으로서이다. 기존의 우심실-폐동맥도관에 사용중인 판막은 그 내구성이 만족스럽지 못하고 수년 내에 판막구조가 파괴되거나 운동성이 저하되어 재수술(교체)이 필요하다. 본 발명에서 개발한 방법으로 고정한 이종이식 판막은 석회화가 적게 일어나고 판막 고유의 기능이 오랫동안 유지되어 한 번의 수술로 더 긴 기간동안 환자가 문제 없이 생활할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 이종 이식용 생체 조직의 제조 방법:
(1) 인간을 제외한 포유동물의 생체 조직을 무세포화(decellularization)시키는 단계;
(2) 무세포화된 생체 조직을 고정화(fixation)시키는 단계; 및
(3) 고정된 생체 조직의 독성을 제거하는 단계.
제 1항에 있어서,
상기 인간을 제외한 포유동물은 돼지 또는 소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 생체 조직은 판막, 혈관 또는 심낭인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서,
상기 생체 조직이 판막 또는 혈관인 경우, 상기 단계 (1)은 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(1') 0.75~1.25% SDS가 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 36~60시간 동안 처리하는 단계;
(2') 1.0~2.0% N-라우로일사르코시네이트(N-lauroylsarcosinate)가 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계;
(3') 1.0~2.0% 트리톤 X-100(Triton X-100)이 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계;
(4') 등장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계; 및
(5') 고장성 완충용액을 4℃에서 6~12시간 동안 처리하는 단계.
제 3항에 있어서,
상기 생체 조직이 판막 또는 혈관인 경우, 상기 단계 (1)은 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(1'') 0.75~1.25% SDS가 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 36~60시간 동안 처리하는 단계;
(2'') 1.0~2.0% N-라우로일사르코시네이트(N-lauroylsarcosinate) 및 1.0~2.0% 트리톤 X-100(Triton X-100)이 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 24~48시간 동안 처리하는 단계;
(3'') 등장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계; 및
(4'') 고장성 완충용액을 4℃에서 6~12시간 동안 처리하는 단계.
제 3항에 있어서,
상기 생체 조직이 심낭인 경우, 상기 단계 (1)은 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(1''') 0.1~0.5% SDS 또는 0.5~1.0% N-라우로일사르코시네이트(N-lauroylsarcosinate)가 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 12~36시간 동안 처리하는 단계;
(2''') 0.5~1.0% 트리톤 X-100(Triton X-100)이 포함된 저장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계;
(3''') 등장성 완충용액을 4℃에서 12~24시간 동안 처리하는 단계; 및
(4''') 고장성 완충용액을 4℃에서 6~12시간 동안 처리하는 단계.
제 4항에 있어서,
상기 단계 (4')에 α-갈락토시다아제 0.01~1.0U/ml을 더 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 단계 (3'')에 α-갈락토시다아제 0.01~1.0U/ml을 더 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 단계 (3''')에 α-갈락토시다아제 0.01~1.0U/ml을 더 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 (2)의 고정화는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 제니핀(Genipin) 및 카보디이미드(carbodiimide)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 화합물을 포함하는 고정액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 고정액에서의 상기 화합물의 농도는 0.1~1.0%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 고정액에는 알코올계 용매가 더 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서,
상기 알코올계 용매는 70~80% 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 (2)의 고정은 1~3회 반복적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 (3)의 독성 제거는 L-라이신(L-lysine), 글리신(glycine), 키토산(chitosan), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 헤파린(heparin), 호모시스테인산(homocysteic acid), 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride) 및 소듐 비설페이트(sodium bisulfate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서,
상기 독성 제거는 4℃, 실온 또는 37℃에서 24~48시간 동안 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되는 이종 이식용 생체 조직.