KR102473682B1

KR102473682B1 - 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 스텐트 판막의 제조 방법

Info

Publication number: KR102473682B1
Application number: KR1020200174765A
Authority: KR
Inventors: 김용진; 임홍국; 이활; 김기범; 손국희
Original assignee: 서울대학교 산학협력단; 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2022-12-02
Also published as: KR20220002048A

Abstract

본 발명은 3D 프린팅을 이용한 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법, 이로부터 제조된 경피적 심장 반월판 판막, 인공 판막의 성능을 평가하기 위한 체외 모의 순환장치의 제조방법 및 이로부터 제조된 체외 모의 순환장치에 대한 것이다. 본 발명의 크기 및 모양을 맞춤화하여 제작한 스텐트를 포함하는 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막은, 다중 탈석회화 방법을 처리한 판막을 사용하여 이종이식 실패의 원인이 되는 α-Gal을 완벽하게 제거하였고 장기간의 이식에도 칼슘 및 무기화 인의 축적이 발견되지 않는 효과를 보였을 뿐만 아니라, 개인별 심장 동맥의 크기와 모양에 적합하게 맞춤화할 수 있어 복잡한 구조 및 높은 압력 등으로 인한 심장 대동맥 판막 이식의 어려움을 극복하였으므로, 심장 판막의 인공 이식에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 스텐트 판막의 제조 방법{Method for preparing personalized transcatheter heart semilunar valve stent valves}

본 발명은 개인 맞춤형 대동맥용 스텐트 판막의 제조방법 및 이를 통해 제조된 개인 맞춤형 대동맥용 스텐트 판막에 관한 것이다.

심장에는 혈액의 흐름을 전방으로 안내하는 네 개의 판막이 있다. 심장의 좌측(전신성)에는 좌심방과 좌심실 사이에 위치한 승모판막과, 좌심실과 대동맥간에 위치된 대동맥 판막이 있다. 이들 두 개의 판막은 전신으로 전달될 산소화된 혈액을 폐(Lung)로부터 심장의 좌편을 통하여 대동맥으로 들어가도록 이끈다. 심장의 우측(폐성)에는 우심방과 우심실 사이에 위치한 삼첨판막과, 우심실과 폐동맥 사이에 위치한 폐동맥 판막이 있다.

이들은 양쪽 면의 압력차에 반응하여 열리고 닫히는 가동성 판막엽(leaflet)들로 구성되어 있다. 상기 승모판막 및 삼첨판막은 심장의 좌측과 우측의 심방 및 심실 사이에 위치해 있기 때문에 방실판막(atrioventricular valve)으로 지칭된다. 상기 대동맥판막 및 폐동맥판막은 그 판막엽들의 모양이 모두 단일하게 다소 반달과 유사한 형태이어서 반월 판막(semilunar valve)으로 지칭되며, 좀 더 적절하게는 첨(cusp)으로 지칭된다. 상기 대동맥 판막 및 폐동맥 판막은 각각 세 첨을 갖고 있다. 대동맥 판막은 좌심실과 대동맥사이에 위치하며 제일 높은 압력에 견디도록 되어 있다. 대동맥 판막과 판막륜(annulus) 그리고 대동맥 벽과 그 사이의 발살바 동맥류(valsalva aneurysm)를 모두 포함해서 대동맥근 또는 뿌리 (Aortic Root) 라고 부른다. 따라서 대동맥 근부는 사다리꼴 모양의 원통형으로, 아래쪽은 대동맥판막륜(Aortic Annulus), 위쪽은 상행대동맥이행부 (Sinotubular Junction)으로 경계 지어지고 이 사이에 대동맥 판막엽이 위치하고 있다. 그러므로 대동맥 판막은 대동맥 근의 비틀림과 기울임 (Twisting & Tilting)에 의해 열림이 시작되고 좌심실의 수축으로 혈액이 전방으로 지나면서 완전히 열렸다가 좌심실의 이완으로 전방으로 흐르는 혈액이 줄어들면 대동맥 압력에 의해 판막엽끼리 교합되는 폐쇄국면을 만든다.

심장 판막은 선천성 또는 후천성 판막질환의 결과로서 비정상적인 구조 및 작용을 보일 수 있다. 선천성 판막이상(valve abnormality)은 중년 환자에서 생명에 위협을 주는 문제로 발전될 때까지 수년간 허용될 수 있거나 또는 매우 심각하여 태어난 지 몇 시간 내에 긴급 수술을 필요로 할 수 있다. 후천성 판막질환은 류마티스성 열(rheumatic fever), 전기 판막조직의 퇴행성 장애(degenerative disorder), 세균 또는 진균 감염 및 외상(trauma) 등이 원인이 되어 일어날 수 있다. 질환의 초기에는 판막엽 자체의 병변만 있을 수 있으나, 시간이 점점 지나면서 주변 대동맥 근부의 구조적인 변형도 함께 초래하는 경우가 대부분이고, 반대로 대동맥 근부의 병변으로 판막의 교합이 이루어지지 못하는 경우도 있다.

현재 이의 치료법으로 알려진 경피적 대동맥 판막 치환술(Trans-catheter Aortic Heart Valve, TAVI)에 사용되는 인조판막은 크게 두 가지로 나뉠 수 있는데, 첫째는 기계판막으로 금속 또는 고분자 플라스틱으로 구성되어 있고, 둘째는 조직판막으로 동물의 조직을 이용해 만들어진 판막이다. 흔히 사용되는 조직판막으로는 소의 심낭이나 돼지의 대동맥 판막을 화학 처리한 후 스텐트나 프레임에 고정하여 만든 것을 사용하고 있다.

그러나, 기계판막은 평생 혈액 항응고제를 복용하거나, 혈전증이 발생하는 문제로 많은 합병증을 유발해 왔다. 또한 조직판막도 시간이 지남에 따른 구조적 판막 퇴화로 인한 효율성 및 내구성 저하의 문제가 있으며 혈전 형성, 내피 증식, 섬유증, 조직 재형성 및 석회화 형성 등 활용화에 있어 아직 해결되지 못한 문제점이 다수 존재한다. 더불어 이로 인한 판막 주수(paravalvular leakage), 대동맥 역류(aortic regurgitation), 대동맥 협착(aortic stenosis), 영구적인 심박 조율기 이식이 필요한 완전한 방실 차단, 이식된 판막의 이동, 관상 동맥 폐쇄(coronary obstruction) 및 심근 경색 등의 심각한 합병증의 발생 위험도 높다.

때문에 이러한 문제점을 해결한 인공 판막의 개발이 요구되고 있다.

삭제

한국등록특허 제10-2231114호 (2020.10.16.)

Denise Todaro et al., "Current TAVR Devices", TAVR: Insights and Perspectives - Cardiac Interventions, Today VOL. 11, NO. 2.

본 발명자들은 개인별 대동맥의 모양 및 크기와 일치하는 맞춤형 인공 판막을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의하여 제조된 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인공 판막의 기능을 평가하기 위한 체외 모의 순환 장치의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의하여 제조된 인공 판막의 기능을 평가하기 위한 체외 모의 순환 장치를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 제 1단계 내지 제 3단계를 포함하는 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법을 제공한다:

심장의 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography, CT) 이미지를 수득하는 단계; 상기 CT 이미지를 3 차원 이미지로 변환하는 단계; 및 상기 변환된 3 차원 이미지로 3 차원 프린팅 모델을 제조하는 단계를 포함하는, 3 차원 프린팅 모델을 제조하는 단계(제 1단계);

상기 3 차원 프린팅 모델을 기반으로 중공 탄성 모델(hollow elastic model)을 제작하는 단계; 상기 중공 탄성 모델 내부의 모양, 높이 및 직경에 맞춰 지그(Jig)를 제작하는 단계; 및 상기 지그의 모양, 높이 및 직경에 맞춰 스텐트 백본(backbone)을 제조하는 단계를 포함하는, 스텐트를 제조하는 단계(제 2단계); 및

소 또는 돼지의 심낭을 탈세포화(decellularization)시키는 단계; 상기 탈세포화된 소 또는 돼지의 심낭의 이종항원을 불활성화하는 단계; 상기 이종항원이 불활성화된 소 또는 돼지의 심낭에 스페이스 필러를 처리하는 단계; 상기 스페이스 필러가 처리된 소 또는 돼지의 심낭을 고정화(fixation)시키는 단계; 상기 고정된 소 또는 돼지 심낭의 독성을 제거하여 판막을 제조하는 단계; 및 상기 제 2단계에서 제조된 스텐트 백본에 상기 판막을 장착하는 단계를 포함하는 인공 판막을 제조하는 단계(제 3단계).

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 제 1단계 내지 제 4단계를 포함하며, 인공 판막의 기능을 평가하기 위한 체외 모의 순환 장치의 제조방법을 제공한다.:

상기 3 차원 프린팅 모델을 기반으로 중공 탄성 모델(hollow elastic model)을 제작하는 단계; 상기 중공 탄성 모델 내부의 모양, 높이 및 직경에 맞춰 지그(Jig)를 제작하는 단계; 및 상기 지그의 모양, 높이 및 직경에 맞춰 스텐트 백본(backbone)을 제조하는 단계를 포함하는, 스텐트를 제조하는 단계(제 2단계);

소 또는 돼지의 심낭을 탈세포화(decellularization)시키는 단계; 상기 탈세포화된 소 또는 돼지 심낭의 이종항원을 불활성화하는 단계; 상기 이종항원이 불활성화된 소 또는 돼지의 심낭에 스페이스 필러를 처리하는 단계; 상기 스페이스 필러가 처리된 소 또는 돼지의 심낭을 고정화(fixation)시키는 단계; 상기 고정된 소 또는 돼지 심낭의 독성을 제거하여 판막을 제조하는 단계; 상기 제 2단계에서 제조된 스텐트 백본에 상기 판막을 장착하는 단계를 포함하는 인공 판막을 제조하는 단계(제 3단계); 및

상기 중공 탄성 모델 내부에 상기 제 3단계에서 제조된 인공 판막을 삽입하고 체외 모의 순환을 수행하는 단계(제 4단계).

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된 인공 판막의 기능을 평가하기 위한 체외 모의 순환 장치를 제공한다.

본 발명의 크기 및 모양을 맞춤화하여 제작한 스텐트를 포함하는 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막은, 다중 탈석회화 방법을 처리한 판막을 사용하여 이종이식 실패의 원인이 되는 α-Gal을 완벽하게 제거하였고 장기간의 이식에도 칼슘 및 무기화 인의 축적이 발견되지 않는 효과를 보였을 뿐만 아니라, 개인별 대동맥 근부의 크기와 모양에 적합하게 맞춤화할 수 있어 복잡한 구조 및 높은 압력 등으로 인한 심장 대동맥 판막 이식의 어려움을 극복하였으므로, 인공 심장 판막의 이식에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 양의 대동맥 근부에 대한 3D 컴퓨터 단층 촬영 이미지(A 및 B)와 스트레오리소그래피(stereolithography) 파일로 저장된 세그먼트화된(segmented) 3D 이미지(C 및 D)이다.
도 2는 양 심장의 대동맥 근부 및 두 관상 동맥에 대한 3D 프린팅 모델(A 및 B) 및 3D 프린팅 기술을 기반으로 제작한 중공 탄성 모델(hollow elastic model)(C 및 D)에 대한 이미지이다.
도 3은 상기 중공 탄성 모델을 기반으로 제작한 맞춤형 지그(A)와 맞춤형 중공 탄성 모델 내부의 지그로 만든 양 맞춤형 니티놀 와이어 백본(sheep-specific nitinol wire backbone)의 피팅 테스트(B)와 본 발명에 따른 자체 확장형 경피적 대동맥 스텐트 판막의 측면(C) 및 평면도(D)에 대한 이미지이다.
도 4는 중공 탄성 모델 내부에 맞춤형 스텐트 판막을 삽입한, 체외 모의 순환 장치에 대한 이미지(A 및 B)이며, 경피적 심장 대동맥 판막 이식 196일 후에 확인한 판막의 이미지(C 및 D)이다.
도 5는 경피적 대동맥 판막 이식(transcatheter aortic valve implantation, TAVI) 후, 적출된 대동맥 판막으로부터 얻은 표본 방사선 사진이다(측면도 : TAVI 후 2일 경과(A), 8일 경과(B), 23일 경과(C), 29일 경과(D), 149일 경과(I), 182일 경과(J), 196일 경과(K) 및 238일 경과(L), 평면도 : TAVI 후 2일 경과(E), 8일 경과(F), 23일 경과(G), 29일 경과(H), 149일 경과(M), 182일 경과(N), 196일 경과(O) 및 238일 경과(P))
도 6은 TAVI 후 적출된 대동맥 판막 판막엽(leaflet)의 석회화 여부를 염색을 통해 확인한 결과이다(현미경: TAVI 후 2일 경과(A, B, C, G, H, I), 29일 경과(D, E, F, J, K, L), 182일 경과(M, N, O, S, T, U) 및 196일 경과(P, Q, R, V, W, X)로, 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-eosin) 염색(A, D, G, J, M, P, S, V), 메이슨트리크롬( Masson’trichrome) 염색(B, E, H, K, N, Q, T, W), 본코사(von Kossa) 염색(C, F, I, L, O, R, U, X), 100배 확대(A~F, M~R) 및 400배 확대(G~L, S~X)).
도 7은 TAVI 후 적출된 대동맥 판막의 T세포의 존재를 염색을 통해 확인한 결과이다(TAVI 후 2일 경과(A, B, E, F), 29일 경과(C, D, G, H), 182일 경과(I, J, M, N) 및 196일 경과(K, L, O, P), F4/80 대식세포 염색(A, C, E, G, I, K, M, O), CD(T세포) 염색(B, D, F, H, J, L, N, P), 100배 확대(A~D, I~L) 및 400배 확대(E~H, M~P)).
도 8은 본 발명에 따른, 항석회화 치료법과 3D 프린팅 기술을 사용한 α-Gal이 제거된 자체 확장형 TAVI와, 이식후 1일 내지 238일 경과 후 판막의 상태를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 제 1단계 내지 제 3단계를 포함하는 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법을 제공한다:

본 발명의 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법에 있어서, 상기 1 단계 및 2단계는 크기와 모양이 다른 개인별 동맥에 있어 맞춤화하기 위한 단계이다. 본 발명은 이를 통해서 기존 크기 및 모양 맞춤형이 아닌 인공 판막을 이식할 시 ,동맥 특히 대동맥 근부와의 크기 및 모양 불일치로 인하여 발생하는 판막 주위 누출, 대동맥 역류, 이식된 판막의 이동 등의 문제점을 해결하였다.

본 발명에서 상기 “맞춤화”란 특정 개체뿐만 아니라 상기 개체가 속하는 종의 동맥 구조 CT 결과의 통계적 평균을 바탕으로 제조하는 것도 포함한다. 상기 특정 개체는 동물 및 인간을 포함하는 포유류일 수 있고, 상기 인간은 지역별 또는 신체적 특성으로 분류될 수 있다. 즉, 상기 인간이 한국인이라면 본 발명은 한국인의 동맥 CT 결과에 있어서 대동맥 또는 판막 구조의 통계적 평균을 바탕으로 제조할 수 있다.

또한 상기 3단계는 본 발명에 따른 인공 판막의 면역원성을 제거하기 위한 방법이다. 상기 3단계의 탈세포화는 조직의 손상을 최대한 배제하면서 면역반응 최대 인자인 세포 및 세포막 등을 완전히 제거하는 데 목적이 있다.

더불어 최근에는 이종 조직의 세포 표면에 존재하는 이종항원(xenoantigen) 및 이에 대한 이종 항체(xenoantibody) 사이의 면역 반응이 석회화의 기전의 하나로 제시되고 있다. 이 이종 항체는 인간, 유인원 및 일부 원숭이(Old World monkeys)등의 영장류를 제외한 모든 포유류에 존재하는 갈락토오스-알파-1,3-칼락토오스(galactose-alpha-1,3-galactose, alpha-GAL)에 대한 자연 항체로서, 이종 조직에 대한 인체의 초급성 거부반응(hyperacute rejection)을 유발하는 것으로 알려져 있다. alpha GAL 항원결정인자는 동물의 세포 표면에 광범위하게 존재하며 포유류의 종에 따라 또한 같은 종내에서도 개체에 따라 그 발현 빈도가 다르나 영장류에게 강한 면역학적 반응을 유발한다고 알려져 있다. 그러므로 이 이종조직에 존재하는 알파-갈 항원결정인자가 환자의 항-갈 항체와 반응하여 면역 반응을 일으키고 결국 이종 조직의 석회화를 유발하는 것으로 알려져 있어, 상기 인자의 제거는 매우 중요하다.

따라서 상기 제 3단계에 있어서, 본 발명의 판막은 하기 단계를 통해 제조될 수 있다.:

(A) 0.1 내지 1% 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS) 및 0.1 내지 1 % 트리톤X-100(Triton X-100)을 처리하여 소 또는 돼지의 심낭을 탈세포화하는 단계;

(B) 0.01 내지 1.0U/m의 α-갈락토시다아제를 처리하여 이종항원을 불활성화하는 단계;

(C) 스페이스 필러로써 20 내지 50% 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 처리하는 단계;

(D) 0.1 내지 1% 글루탈알데하이드(glutaraldehyde), 50 내지 100% 에탄올 및 1 내지 10% 옥탄올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 처리하여 고정하는 단계; 및

(E) 0.1 내지 0.5M의 글리신으로 무독소화 하는 단계.

상기 판막의 제조에 있어서, 이종조직에 대한 탈세포화 과정 후에도 잔존하는 이종항원인 알파-갈 항원결정인자 (α-Gal epitope)를 완전히 제거할 수 있는 방법으로 alpha gal epitope의 끝 말단인 1,3 linkage를 절단할 수 있는 α-갈락토시다아제(alpha-galactosidase)를 적용하였다.

더불어 글루탈알데히드의 조직 내 콜라겐 교차결합에 관여하지 않는 자유 알데하이드기(free aldehyde groups)는 세포독성을 가지며 석회화를 유발하는 것으로 알려져 있는데, 본 발명의 판막은 스페이스 필러(space filler)를 처리하여 이러한 자유 알데하이드기를 비활성화시켰다. 또한, 스페이스 필러는 조직에서 글루탈알데하이드(glutaraldehyde)가 방출되는 것을 막아주는 막을 형성하며, 탈세포화후 세포가 제거된 자리와 콜라겐 사이사이 빈 공간을 채워줌으로써 혈청 내 칼슘, 인지질을 배제시키고 수산화 인회석 결정이 생성될 가능성을 차단하며 또한 콜라겐에 존재하는 혈소판 감수적수용체(receptor site)도 가려주어 혈소판의 응집이나 부착을 막고 친수성을 높여주는 효과가 있다.

따라서, 본 발명의 판막은 에폭시 화합물(epoxy compound)로 알려진 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 처리하여 항석회화 효과를 향상시켰다.

본 발명의 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막은 보다 바람직하게는 심장 대동맥 판막에 있어, 맞춤형으로 제작될 수 있다.

상기 심장 대동맥 판막은 대동맥 근의 비틀림과 기울임(Twisting & Tilting)에 의해 열리므로 과격한 움직임이 수반되며, 또한 심장에서 처음으로 나온 혈액이 통하는 동맥이기 때문에 폐동맥 대비 약 5배의 압력을 받게 된다.

때문에 심장 대동맥에 이식되는 인공 판막은 폐동맥에 이식되는 인공 판막보다도 우수한 내구성 뿐만 아니라 우수한 구조적 맞춤성을 통해 이식 후의 판막 이동성 방지, 판막의 누수 등을 방지할 수 있어야만 한다.

한편, 본 발명의 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막은 협착으로 좁아진 내강을 확장시키고, 협착의 진행을 방지하기 위한 기구인 스텐트(stent)를 포함한다. 상기 스텐트의 재질은 니티놀(Nitinol), 스테인레스강, 금, 은, 탄탈, 티탄, 마그네슘 합금, 코발트 크롬 및 폴리머로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 형상 기억 합금일 수 있으며, 상기 형상 기억 합금이란 변형되어도 일정한 온도 이상으로 가열하면 원래의 형상으로 복원되는 금속을 말한다. 본 발명에 따른 스텐트의 재질은 바람직하게는 니티놀일 수 있으며, 이는 36℃ 내지 38℃에서 원 형상으로 복원되는 특성을 가지고 있어 인체의 내강 내에서 원 형상을 유지할 수 있다.

본 발명의 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막에 있어서 크기 및 모양 맞춤화는 상기 스텐트의 크기 및 모양을 조절함으로써 달성한다. 이를 위하여 먼저 3 차원 프린팅 모델을 기반으로 중공 탄성 모델(hollow elastic model)을 제작하고 이의 내부 모양, 높이 및 직경에 맞춘 지그(Jig)를 제작한 후, 상기 지그의 모양, 높이 및 직경에 맞춰 스텐트의 크기 및 모양을 조절할 수 있다.

상기 중공 탄성 모델은 상기에서 제조한 3차원 프린팅 모델의 표면에 실리콘을 균일하게 도포하여 제조할 수 있다.

더불어 본 발명은 상기 제 3단계 이후, 상기 중공 탄성 모델 내부에 본 발명에 따른 경피적 심장 반월판 판막을 삽입하고 체외 모의 순환을 수행하는 단계(제 4단계)를 더 포함할 수 있다.

상기 체외 모의 순환은 혈액과 비슷한 점성(viscosity) 및 농도의 용액을 일정한 간격의 속도로 한 방향으로 흐르게 하여 수행하는 것을 의미하며, 상기 용액으로 물, 생리식염수, 0.1 내지 1 % 글루탈알데하이드(Glutaraldehyde), 30 내지 40 % 글리세롤(glycerol) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 용액은 0.1 % 내지 1% GA와 생리식염수(0.9 % NaCl)의 혼합용액, 35%의 글리세롤과 생리식염수(0.9 % NaCl)의 혼합용액 또는 40%의 글리세롤과 물을 혼합한 용액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이를 통해 인공 판막의 성능을 평가한 후 이식할 수 있어 인공 판막 이식의 성공률을 더 높일 수 있다.

더불어 상기 심장 판막의 탈세포화는 4 내지 37 ℃에서 12 내지 48시간 동안 처리되는 것이 바람직하며, 상기 이종항원의 불활성화는 4 내지 37 ℃에서 12 내지 48시간 동안 처리되는 것이 바람직하다. 또한 상기 스페이스 필러는 4 내지 37 ℃에서 12 내지 48시간 동안 처리되는 것이 바람직하고, 상기 고정화는 4 내지 37 ℃에서 1일 내지 10일 동안 처리되는 것이 바람직하다. 더불어 상기 무독소화는 4 내지 37 ℃에서 12 내지 48시간 동안 처리되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막을 제공한다.

본 발명에 따른 판막은 심장 대동맥 판막 이식용으로 적합하며, 대동맥판막 협착증 치료에 사용하는 것이 바람직하다. 특히 다리 동맥을 통해 넣은 도관을 이용하여 인공 판막을 삽입하는 기술인, 경피적 대동맥 판막 치환술(Trans-catheter Aortic Valve Implantation, TAVI)을 통해 사용되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 하기 제 1단계 내지 제 4단계를 포함하며, 인공 판막의 기능을 평가하기 위한 체외 모의 순환 장치의 제조방법을 제공한다.:

상기 체외 모의 순환은 혈액과 비슷한 점성(viscosity) 및 농도의 용액을 일정한 간격의 속도로 한 방향으로 흐르게 하여 수행하는 것을 의미하며, 상기 용액으로 물, 생리식염수, 0.1 내지 1 % 글루탈알데하이드(Glutaraldehyde), 35 내지 40 % 글리세롤(glycerol) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 용액은 0.1 % 내지 1% GA와 생리식염수(0.9 % NaCl)의 혼합용액, 35%의 글리세롤과 생리식염수(0.9 % NaCl)의 혼합용액 또는 40%의 글리세롤과 물을 혼합한 용액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이를 통해 인공 판막의 성능을 확인하고 평가하는데 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된 인공 판막의 기능을 평가하기 위한 체외 모의 순환 장치를 제공한다.

상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 맞춤형 스텐트 판막 준비

1.1 탈세포화(Decellularization)한 판막 준비

돼지 심낭(pericardia)을 0.9 % 일반 식염수로 세척한 다음, 한 시간 동안 0.1% 과산화아세트산(peracetic acid)과 4% 에탄올을 포함하는 증류수로 소독하였다. 그런 후 2시간 동안 증류수로 세척하였다. 세척한 조직을 초기에 4 ℃에서 24시간 동안 0.25 % 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate)을 함유하는 저장성 완충 용액(hypotonic buffer solution)으로 처리하고 증류수로 1 시간 동안 세척하였다. 세척 후 4 ℃에서 24 시간 동안 0.5 % 트립톤 X-100(Triton X-100)을 함유하는 저장액으로 처리하였고, 4 ℃에서 12 시간 동안 증류수로 세척하였다. 이어서, 이들 조직을 4 ℃에서 24 시간 동안 등장액(isotonic solution)으로 처리하였고, 4 ℃에서 6 시간 동안 저장성 완충 용액(II)으로 처리하였다. 그런 후, 4 ℃에서 1 시간 동안 인산완충식염수(PBS)로 세척하였다.

1.2 Bacteroides thetaiotaomicron 로부터 α1,3 galactosidase의 제작 및 준비

박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron, BtGal110B로 지정됨)로부터의 α-갈락토시다아제(α-galactosidase) 유전자는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 의해 상응하는 게놈 DNA로부터 증폭되었고, 대장균(Escherichia coli) Rosetta2 (DE3) (Novagen, Madison, WI, USA)에서 단백질 발현을 위한 적절한 제한 부위를 사용하여 His6-태그된 단백질의 발현을 위해 pET28a 벡터로 도입되었다.

상기 균은 34 μg/ml의 클로람페니콜(chloramphenicol), 30 μg/ml의 카나마이신(kanamycin)이 보충된 Luria-Bertani 배지에서 1 mm의 이소프로필-1-티오-β-d-갈락토피라노시드(isopropyl-1-thio-β-d-galactopyranoside)와 함께 A₆₀₀ nm∼0.6에서 유도하여 성장시켰다. 수거된 세포 펠렛을 초음파세척기(Misonix Inc., Farmingdale, NY, USA)를 사용하여 용해 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸(imidazole))에 용해시켰다.

용해된 용해물을 4 ℃에서 13,000 rpm으로 20 분 동안 원심 분리하고, 발현된 단백질을 제조사의 지시에 따라 니켈-NTA 아가로스 컬럼((Nickel-NTA agarose column), Qiagen, Valencia, CA, USA)을 사용하여 정제하였다.

1.3 이종 항원(α-Gal)의 불활성화를 통한 면역학적 변형

상기 탈세포화된 돼지 심낭에 0.1 units/mL α-갈락토시다아제를 4 ℃에서 24 시간 동안 처리하였다.

1.4 판막에 스페이스-필러 처리

상기 이종항원을 불활성화시킨 돼지 심낭을 30% 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) (1000 MW)를 포함하는 0.01M PBS(pH7.4)에 넣고 4 ℃에서 하루 동안 처리하였다.

1.5 유기 용매내 글루탈알데하이드(glutaraldehyde) 고정

돼지 심낭은 초기에 실온에서 3일 동안 0.5 % 글루탈알데하이드(GA)로 고정하였고, 추가로 실온에서 2 일 동안 75 % 에탄올 + 5 % 옥탄올(octanol)의 유기 용매내 0.25 % GA로 고정하였다. 그리고 마지막으로 실온에서 7일 동안 0.25 % GA로 고정하였다.

1.6 독성 제거

고정 완료 후, 돼지 심낭을 실온에서 24 시간 동안 0.2M 글리신(glycine) 용액(PBS, pH7.4)으로 처리하여 독성을 제거하였다.

1.7 양 맞춤형 경피적 대동맥 판막(transcatheter aortic valve) 제작

심전도-게이트(electrocardiographic-gated)를 이용하여 양의 심장 컴퓨터 단층 촬영 연구(cardiac computed tomography studies)를 수행하였다.

양의 대동맥 근부(aortic root)에 대한 의약 이미지의 디지털 이미징 및 통신을 Mimics Base 버전 16 (Materialize, Leuven, Belgium)을 사용하여 3D 이미지로 변환한 후, 세그먼트화된 3D 이미지를 스트레오리소그래피 파일로 저장하였다(도 1). 그런 다음 파일을 3D 프린터 (uPrint, Stratasys Ltd, MN, US)로 전송하고 대동맥 근부의 3D 모델을 인쇄했다(도 2).

피팅 테스트 및 체외 모의 순환을 위해, 3D 프린팅된 모델의 표면에 액체 실리콘을 균일하게 발라 두 관상 동맥을 갖는 중공 탄성 모델(hollow elastic model)을 제조하였다(도 2). 상기 중공 탄성 모델을 이용해서 맞춤형 지그(jig)를 제작하였고, 양-특정 니티놀(니켈-티타늄 메모리 합금(nickel-titanium memory alloy)) 와이어 백본(nitinol wire backbone)을 제작하였다. 니티놀 스텐트를 상기 중공 탄성 모델 내부에 삽입하여, 스텐트의 피팅 테스트를 수행하였다. 피팅 테스트를 통과한 후, 상기에서 제조한 α-Gal 제거 돼지 심낭을 맞춤형 자체확장형 니티놀 와이어 기반 스텐트에 장착하였다(도 3). 인공삽입물(prostheses)의 주요 치수에 대한 판막 설계는 대동맥 근에 따라 맞춤화되었으며, 평균 총 축 길이는 45mm, 평균 타겟 임플란트 직경은 24mm, 평균 유출 플레어(outflow flare) 직경은 26mm이었으며, 시트 높이의 평균 길이는 19mm이었다(도 3).

실시예 2. 맞춤형 스텐트 판막의 기능 평가 방법

2.1 체외 모의 순환(In vitro mock circulation)

본 발명에 따른 스텐트 벨브의 시험관 내에서의 스텐트 피팅, 밸브 운동(valve motion) 및 관상 동맥의 개방성(coronary patency)을 평가하기 위해 특별히 설계된 모의 순환 모델을 개발했다. 스텐트 밸브는 체외 순환하의 모의 순환 회로에 연결된 맞춤형 실리콘 중공 탄성 모델 내부에 삽입하였다. 순환 용액으로 0.1 % 내지 1% GA와 생리식염수(0.9 % NaCl)의 혼합용액, 35%의 글리세롤과 생리식염수(0.9 % NaCl)의 혼합용액 또는 40%의 글리세롤과 물을 혼합한 용액을 사용하였다. 스텐트 밸브에 120/80mmHg의 맥박압(pulsatile pressure)을 한 방향으로 일정한 간격의 60rpm을 반복적으로 제공하여 생체 내 순환을 재현하였다. 두 관상 동맥 모두 확장 튜브(extension tubing)가 있는 3 방향 스톱콕(3 way stopcocks)에 연결되었고, 관상 혈류(coronary flow)는 이 체외 모의 순환으로 되돌아 왔다(도 2, 4).

2.2 임상전시험

서울대학교 병원의 임상 연구센터의 동물 실험 및 사용위원회의 승인을 받아 전임상시험을 수행하였다. 이 시설은 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회에 의해 인증되었다. 약 24개월령, 체중 범위 41~55 kg의 양을 준비하였고 각 양에 세파졸린(Cefazolin)을 20mg/kg으로 정맥 내 투여하였다. 전마취약(preanesthetic)으로써 5 mg/kg 졸레틸(Zoletil) 및 0.25 mg/kg 럼푼(Rompun)을 근육 내 주사하였다. 양에 기관내 삽관을 진행하였고, O₂에서 1.3~2.0% 엔플루란(enflurane)으로 마취하여 혈류역학 모니터링을 수행하였다. 양은 전신 마취하에 좌측와위(left lateral decubitus position)에 놓였다. 그런 후, 우측 경부 부위를 절개해서 경동맥을 노출시켰다. 경동맥에 5-Fr 피복을 삽입한 후, 정기적인 혈류역학적 연구 및 혈관조영술(angiography)을 수행하였다. 23 ~ 26mm 직경의 본 발명의 자체 확장 밸브 스텐트를 18 ~ 22Fr 전달 시스템에 장착하고 역행 동맥 접근 방식(retrograde transarterial approach)을 사용하여 이식하였다. 혈관조영술, 형광 투시법(fluoroscopy) 및 심초음파 검사(echocardiography)를 사용하여 카테터 핸들(catheter handle)을 세심하게 제어하여 대동맥 근부 내부로 배치를 유도하였다. 본 발명의 자체 확장 밸브 스텐트를 이식한 후, 가슴경유심장초음파검사(transthoracic echocardiography)와 심장카테터법(Cardiac catheterization)을 시행하여 혈류역학적 변화를 평가하였다. TAVI 후 관리는 심전도(electrocardiogram), 산소포화도(oxygen saturation), 혈압 및 중심정맥압(central venous pressure)을 통한 지속적인 모니터링 및 약물과 수액 투여로 구성되었다. 활력 징후(vital sign)가 안정된 후, 양을 케이지로 옮겼으며 식이 섭취(dietary intake), 전신 상태, 혈전색전증(thromboembolic evnets) 및 심부전(heart failure)과 같은 임상 과정을 면밀히 관찰하였다. 더불어 세파졸린(20 mg/kg, 3일 동안 하루 한번)을 정맥 내 투여하였다.

2.3 면역분석(Immunoassay)

양으로부터 혈액 샘플을 수득하였다. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하여 양에서 α-Gal에 대한 특이적 혈청 항체 농도(IgM 및 IgG)를 측정하였다.

미량정량판(Microtiter plate)은 PBS(pH 7.4) (IgM 및 IgG 이소타입(isotypes)에 있어 1 μg/ml)내 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)과 결합되어 있는 합성된 α-Gal(Dextra Laboratories, Reading, UK) (α-Gal-BSA)로 코팅하였고(웰당 100μl), 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 후 플레이트를 0.05%(v/v) 트윈 20(tween 20)을 함유한 PBS로 세척하였다. 양의 혈청(웰당 100μl)은 BSA-트윈 20((PBS, pH 7.4, 3% BSA, 0.01% Tween 20)의 α-Gal-BSA 고정화된 웰에 첨가하였고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. BSA-트윈20의 IgM 및 IgG 희석에서 겨자무과산화효소(Horseradish peroxidase)가 결합된 토끼 안티-양 IgM 및 IgG(AbD SeroTec, Oxford, UK)를 2차 항체(BSA-트윈20로 1:10,000 희석하여 사용)로 사용하였다. 발색 반응은 3,3 ', 5,5'- 테트라메틸벤지딘(3,3‘5,5’-tetramethylbenzidine) 용액(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)으로 전개시켰다. 그리고 ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.4 석회화 정량화를 통한 방사선학적 확인

양을 희생시킨 후, 스텐트 판막을 수거하고, 철저한 육안 검사(visual inspection)를 위해 세로로 절단하여 방사선 확인을 위해 간단한 X-rays로 테스트하였다.

2.5 칼슘 분석

수거된 조직 샘플들은 표준 식염수로 세척하였고, 24시간 동안 70℃에서 건조하여 계량하였다. 이어서, 샘플을 5.0N HCl 용액으로 가수분해하였다. 가수분해물의 칼슘 함량은 o-크레졸프탈레인 복합체-한가지 기법(o-cresolphthalein complex-one method) 및 자동 화학 분석기(automatic chemistry analyzer, (Hitachi 7070, Tokyo, Japan))를 사용하여 비색적으로(colorimetrically) 측정되었다. 칼슘 함량은 μg/mg 건조 중량으로 표현되었다.

2.6 현미경 검사

대표적인 조직 샘플을 광학 현미경으로 검사하였다. 조직 샘플을 10% 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 매립한 후, 2-4㎛ 두께로 구획하여 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin), 메이슨트리크롬(Masson’trichrome) 및 폰코사법(von Kossa)으로 염색하였다.

2.6 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC) 염색

대표적인 조직 샘플을 양의 대식세포 및 T 세포에 대해 염색하였다. 1차 항체는 양의 대식세포에 대한 마커로 알려진 안티-양 F4/80 항원(eBioscience, San Diego, CA)을 1:3000으로 희석해서 사용하거나, 양의 T 세포에 대한 마커로 알려진 안티-양 CD4(eBioscience, San Diego, CA)을 1:1000으로 희석해서 사용하였다. 2차 항체는 겨자무과산화효소(Horseradish peroxidase)가 결합된 토끼 안티-양 IgG(AbD SeroTec, Oxford, UK)를 1:500으로 희석하여 사용하였다. 디아미노벤지딘(Diaminobenzidine)을 색소원(chromogen)으로 사용하였고 헤마톡실린을 대조염색(counter staining)으로 사용하였다.

2.7 통계 분석

통계 분석은 SPSS 소프트웨어 패키지 (version 25.0; SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균 ±표준 편차로 표현되었다. α-Gal에 대한 항체 역가의 변화는 분산의 반복 측정 분석(repeated-measures analysis)을 사용하여 TAVI 후 지속 시간에 따라 비교되었다.

실시예 3. 맞춤형 스텐트 판막의 기능 평가 결과

3.1 체외 모의 순환 기능 평가

체외 모의 순환 동안, 맞춤형 중공 탄성 모델 내부에 삽입된 본 발명에 따른 스텐트의 우수한 적합성을 확인하였고, 스텐트 판막의 우수한 움직임을 확인하였다.

대동맥 근부에서 판막주위누출(paravalvular leakage)이 없는 스텐트의 완벽한 얼라인먼트(alignment)가 확인되었고, 전신 압력 하에서 대동맥 근부 내부의 불완벽한 배치의 위험은 완전히 피한 것을 확인하였다. 두 관상 혈류는 막힘없이 잘 유지되었다(도 4).

3.2 혈류역학적 확인

TAVI 이후, 1개월 이하 생존(5 마리) 및 5개월 이상 생존(4 마리)에서의 안정성 및 효능을 비교하기 위해 9 마리의 양을 순차적으로 희생시켰다.

심장초음파검사와 심장카테터법의 평가는 TAVI 후 8개월 동안 체외 모의 순환과 동일한 방식으로 스텐트 이동이 없는, 기존에 공지된 문헌을 대조군으로 하여 비교하였다(대동맥 위치: 대조군(1) Korean J Thorac Cardiovasc Surg. 2010;43:11-9, 폐동맥 위치: 대조군(2) Interact Cardiovasc Thorac Surg. 2017;25(3):391-399., 대조군(3) Korean J Thorac Cardiovasc Surg. 2012;45:287-94 참고). 그 결과, 본 발명은 대조군 대비 임상적으로 더 나은 결과를 보여주었다. 이때 대조군은 α-Gal 제거, 다중 탈석회화 기법을 적용하지 않은 비맞춤형 돼지 이종 이식을 수행했으며, 본 발명은 다중 탈석회화 기법을 적용하여, α-Gal이 제거된 맞춤형 스텐트를 이용하여 돼지 이종 이식을 수행하였다.

그 결과, α-Gal 제거, 다중 탈석회화 기법을 적용하지 않고, 크기도 맞춤화하지 않은 대조군 모두 이식 후 1 개월까지는 이식 실패가 명확하게 확인되지 않았지만 이식 후 5 개월부터 이식 실패가 분명하게 확인되었다. 반면, 본 발명에서의 모든 실험군은 이식 후 5 개월 후에도 이식 실패 없이 수술 전 상태와 동일하게 유지되었다.

더불어 잠재성 혈전증의 증거도 확인되지 않았다. 적출된 대동맥 판막의 리플렛(leaflet)에도 칼슘 침착물이나 플라크가 보이지 않았으며, 총 검사에서 움직임 상태를 유지하였다. 또한 스텐트는 잘 내피화되었으며, 두 관상 동맥 모두 대동맥 판막 위에서 개방되었다(도 4 중 C 및 D).

3.3 α-Gal 항체에 대한 면역학적 분석

TAVI 전, 직후, 1일~1개월 후 및 5~8개월 후에 수집된 혈청에서 측정된 α-Gal IgM 항체 역가는 각각 0.2298±0.0226, 0.2194±0.0181, 0.2221±0.0079 및 0.2131±0.0173이었다. 더불어 α-Gal IgG 항체 역가는 각각 0.2208±0.0157, 0.2080±0.0120, 0.2098±0.0042 및 0.2174±0.0126이었다. TAVI 후 기간에 따른 α-Gal IgM 및 IgG 항체 역가의 차이는 관찰되지 않았다(P>0.05).

3.4 표본 방사선 촬영, 칼슘 및 무기성 인 분석

적출된 대동맥 판막에서 채취한 표본 방사선 촬영 결과는 TAVI 후 8개월 동안 석회화가 없음을 보여주었다(도 5). 더불어 적출된 대동맥 판막의 리플렛들의 칼슘 및 무기성 인의 농도는 TAVI 후 2일 경과에서 1.59 ±0.03 μg/mg 및 1.58 ±0.05 μg/mg, TAVI 후 8개월 경과에서 0.60±0.01 μg/mg 및 0.59±0.02 μg /mg로 매우 낮게 유지되었다.

3.5 TAVI 후 적출된 대동맥 판막 리플렛의 현미경 검사

TAVI 후 8 개월 동안, 콜라겐 섬유는 정상적으로 밴딩된 구조로 잘 보존된 것으로 보였으며, 헤마톡실린-에오신 염색된 표본에서는 특이적인 매트릭스 배열의 혼란이 눈에 띄지 않았다. 더불어 완전한 탈세포화로 인해 세포핵은 관찰되지 않았다. 메이슨트리크롬 방법으로 염색된 표본의 대동맥 판막 리플렛에서는 구조적 무결성이 유지된 치밀한 콜라겐 섬유 배열을 관찰할 수 있었다. 폰코사법으로 염색된 대동맥 판막 리플렛에서 또한 석회화의 증거를 발견할 수 없었다(도 6).

3.6 TAVI 후 적출된 대동맥 판막 리플렛의 IHC 염색

양의 대동맥 근부에 이식된 돼지 심낭 조직에서, TAVI 이후 8개월 동안 F4/80 염색을 통해 대식세포가 없거나 드문 것을 확인하였으며, CD4 염색을 통해 T세포가 없거나 드물게 존재하는 것을 확인하였다(도 7 및 도 8).

종합적으로, 본 발명의 3D 프린팅을 이용하여 크기 및 모양을 맞춤화하여 제작한 스텐트를 포함하는 개인 맞춤형 경피적 심장 대동맥 판막은 다중 탈석회화 방법을 처리한 판막을 사용하여 이종이식 실패의 원인이 되는 α-Gal을 완벽하게 제거하였으며, 개인별 심장 대동맥의 크기와 모양에 적합하게 맞춤화할 수 있어 복잡한 구조 및 높은 압력 등으로 인한 심장 대동맥 판막 이식의 어려움을 극복하였다. 때문에 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막으로 유용하게 활용될 수 있다.

Claims

하기 제 1단계 내지 제 3단계를 포함하는 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법:
심장의 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography, CT) 이미지를 수득하는 단계; 상기 CT 이미지를 3 차원 이미지로 변환하는 단계; 및 상기 변환된 3 차원 이미지로 3 차원 프린팅 모델을 제조하는 단계를 포함하는, 3 차원 프린팅 모델을 제조하는 단계(제 1단계);
상기 3 차원 프린팅 모델을 기반으로 중공 탄성 모델(hollow elastic model)을 제작하는 단계; 상기 중공 탄성 모델 내부의 모양, 높이 및 직경에 맞춰 지그(Jig)를 제작하는 단계; 및 상기 지그의 모양, 높이 및 직경에 맞춰 스텐트 백본(backbone)을 제조하는 단계를 포함하는, 스텐트를 제조하는 단계(제 2단계); 및
소 또는 돼지의 심낭을 탈세포화(decellularization)시키는 단계; 상기 탈세포화된 소 또는 돼지의 심낭의 이종항원을 불활성화하는 단계; 상기 이종항원이 불활성화된 소 또는 돼지의 심낭에 스페이스 필러를 처리하는 단계; 상기 스페이스 필러가 처리된 소 또는 돼지의 심낭을 고정화(fixation)시키는 단계; 상기 고정된 소 또는 돼지 심낭의 독성을 제거하여 판막을 제조하는 단계; 및 상기 제 2단계에서 제조된 스텐트 백본에 상기 판막을 장착하는 단계를 포함하는 인공 판막을 제조하는 단계(제 3단계).
제 1항에 있어서,
상기 판막은 하기 단계를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법:
(A) 0.1 내지 1% 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS) 및 0.1 내지 1 % 트리톤X-100(Triton X-100)을 처리하여 돼지의 심장 판막을 탈세포화하는 단계;
(B) 0.01 내지 1.0U/m의 α-갈락토시다아제를 처리하여 이종항원을 불활성화하는 단계;
(C) 스페이스 필러로써 20 내지 50% 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 처리하는 단계;
(D) 0.1 내지 1% 글루탈알데하이드(glutaraldehyde), 50 내지 100% 에탄올 및 1 내지 10% 옥탄올로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 처리하여 고정하는 단계; 및
(E) 0.1 내지 0.5M의 글리신으로 무독소화 하는 단계.
제 1항에 있어서,
상기 심장 반월판은 심장 대동맥 판막인 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 스텐트의 재질은 니티놀(Nitinol), 스테인레스강, 금, 은, 탄탈, 티탄, 마그네슘 합금, 코발트 크롬 및 폴리머로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 형상기억합금인 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 중공 탄성 모델은 3 차원 프린팅 모델의 표면에 실리콘을 균일하게 도포하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 제 3단계 이후 상기 중공 탄성 모델 내부에 상기 경피적 심장 반월판 판막을 삽입하고 체외 모의 순환을 수행하는 단계(제 4단계)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 6항에 있어서,
상기 체외 모의 순환은 물, 생리식염수, 0.1 내지 1 % 글루탈알데하이드(Glutaraldehyde), 30 내지 40 % 글리세롤(glycerol) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용액을 일정한 간격의 속도로 한 방향으로 흐르게 하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 탈세포화는 4 내지 37 ℃에서 12 내지 48시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 이종항원의 불활성화는 4 내지 37 ℃에서 12 내지 48시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 스페이스 필러는 4 내지 37 ℃에서 12 내지 48시간 동안 처리되는 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 고정화는 4 내지 37 ℃에서 1일 내지 10일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 무독소화는 4 내지 37 ℃에서 12 내지 48시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막의 제조방법.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 개인 맞춤형 경피적 심장 반월판 판막.
하기 제 1단계 내지 제 4단계를 포함하며, 인공 판막의 기능을 평가하기 위한 체외 모의 순환 장치의 제조방법:
심장의 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography, CT) 이미지를 수득하는 단계; 상기 CT 이미지를 3 차원 이미지로 변환하는 단계; 및 상기 변환된 3 차원 이미지로 3 차원 프린팅 모델을 제조하는 단계를 포함하는, 3 차원 프린팅 모델을 제조하는 단계(제 1단계);
상기 3 차원 프린팅 모델을 기반으로 중공 탄성 모델(hollow elastic model)을 제작하는 단계; 상기 중공 탄성 모델 내부의 모양, 높이 및 직경에 맞춰 지그(Jig)를 제작하는 단계; 및 상기 지그의 모양, 높이 및 직경에 맞춰 스텐트 백본(backbone)을 제조하는 단계를 포함하는, 스텐트를 제조하는 단계(제 2단계);
소 또는 돼지의 심낭을 탈세포화(decellularization)시키는 단계; 상기 탈세포화된 소 또는 돼지 심낭의 이종항원을 불활성화하는 단계; 상기 이종항원이 불활성화된 소 또는 돼지의 심낭에 스페이스 필러를 처리하는 단계; 상기 스페이스 필러가 처리된 소 또는 돼지의 심낭을 고정화(fixation)시키는 단계; 상기 고정된 소 또는 돼지 심낭의 독성을 제거하여 판막을 제조하는 단계; 상기 제 2단계에서 제조된 스텐트 백본에 상기 판막을 장착하는 단계를 포함하는 인공 판막을 제조하는 단계(제 3단계); 및
상기 중공 탄성 모델 내부에 상기 제 3단계에서 제조된 인공 판막을 삽입하고 체외 모의 순환을 수행하는 단계(제 4단계).
제 14항에 있어서,
상기 체외 모의 순환은 물, 생리식염수, 0.1 내지 1 % 글루탈알데하이드(Glutaraldehyde), 30 내지 40 % 글리세롤(glycerol) 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용액을 일정한 간격의 속도로 한 방향으로 흐르게 하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 체외 모의 순환 장치의 제조방법.
제 14항 또는 제 15항 중 어느 한 항의 방법을 통해 제조된 인공 판막의 기능을 평가하기 위한 체외 모의 순환 장치.