KR101693831B1 - 스페이스 필러를 이용한 이종이식조직의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스페이스 필러를 이용한 이종이식조직의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 이종이식조직에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제조방법에 의하여 제조된 이종 이식용 생체 조직은 석회화의 발생이 감소하며, 독성이 적으며, 이종 이식시의 면역반응이 현저하게 감소하는 바, 효과적이고 안전한 이종 이식용 생체 조직으로서 활용될 수 있다.

Description

스페이스 필러를 이용한 이종이식조직의 제조방법 {Method of preparing heterograft using space-filler}

본 발명은 스페이스 필러를 이용한 이종이식조직의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 이종이식조직에 관한 것이다.

국내외를 막론하고 과거의 방법에 의한 심장판막이나 판막도관, 심혈관 성형술시 첨포(patch)의 연구개발은 정체기에 있었으나, 이종 면역에 대한 개념과 조직공학, 이종이식의 발전으로 외국에서는 이에 대한 연구가 활발해지고 있다. 국내에서는 과거에도 마찬가지였지만, 아직까지 이종조직판막이나 판막도관, 이종심낭 등 이종보철물등의 심장혈관계 대치물에 관한 이종조직 개발연구는 전무하거나 매우 미미하고, 일부 생명공학팀에서 시도되었으나 그 결과가 구체적이지 못하고 미흡한 실정이며 또한 국내에서는 시제품 시도가 한번도 되지 못한 실정이다.

인체에 삽입된 이종조직판막이나 이종 조직 보철편 등의 부전은 생체와의 화학적, 물리적, 면역학적 반응 등에 의하여, 변성, 퇴행되고 결국 기능상실, 소멸 등의 절차를 밟게 되는데 흔히 그 대표적인 결과로 나타나는 것이 체내에서 완전 석회화되는 것이다. 과거부터 지금까지 그러한 조직의 변성이나 퇴행을 줄이기 위한 연구는 많이 진행되어 왔지만, 아직까지 만족할 만한 결과를 얻지 못하고 있는 실정이다.

이러한 이종 조직들은 조직의 기계적 안정성을 유지하고, 이종항원성을 감소시키며, 멸균 상태를 유지하기 위하여 글루탈알데히드로 고정하여 사용해 왔다. 그러나, 이종 조직들에 대한 글루탈알데히드 고정 후에 세포막에 다량으로 존재하는 인지질, 조직의 교차결합(crosslink)에 참여하지 않고 세포독성을 가지고 있는 자유 알데하이드기(free aldehyde groups), 그리고, 이종조직에 남아 있는 세포 성분의 조직항원에 대한 면역 반응이 조직의 석회화를 유발하는 것으로 알려져 있다.

글루탈알데히드로 고정한 이종 조직에 유기용매를 처리하면 석회화의 재료가 되는 인지질을 제거하는 동시에 collagen 및 elastin의 구조적인 변화를 일으켜서 생체 내에서의 석회화를 감소시킬 수 있고, ethanol과 같은 short chain alcohol을 고농도로 사용할 때 항석회화 효과가 나타나며, octanediol과 같은 long chain alcohol이 구조적으로 인지질과 유사하므로 더 효과적으로 인지질을 제거하여 석회화를 감소시킬 수 있다.

글루탈알데히드 고정 후 collagen의 교차결합에 참여하지 않는 자유 알데하이드기를 제거하기 위하여 아미노산을 이용한 항독소화 (detoxification)처리를 시행하며, 아미노산에 존재하는 아미노기(amino group)가 glutaraldehyde 고정 후 조직내에 남아있는 자유 알데하이드기와 결합함으로써 석회화를 방지할 수 있다.

또한, 글루탈알데히드 고정 후 이종조직에 남아 있는 세포 성분의 조직 항원에 대한 면역 반응을 제거하여 석회화를 감소시키기 위해서 무세포화 과정이 필요하다.

최근에는 이종 조직의 세포 표면에 존재하는 이종항원(xenoantigen) 및 이에 대한 이종 항체(xenoantibody)사이의 면역 반응이 석회화의 기전의 하나로 제시되고 있다. 이 이종 항체는 인간, 유인원 및 일부 원숭이(Old World monkeys)등의 영장류를 제외한 모든 포유류에 존재하는 galactose [alpha] (1,3)-galactose(alpha-GAL)에 대한 자연 항체로서, 이종 조직에 대한 인체의 초급성 거부반응(hyperacute rejection)을 유발하는 것으로 알려져 있다. alpha GAL항원결정인자는 동물의 세포 표면에 존재하며 포유류의 종에 따라 또한 같은 종내에서도 개체에 따라 그 발현 빈도가 다르나 영장류에게 강한 면역학적 반응을 유발한다고 알려져 있다. 이 이종 조직에 존재하는 알파-갈 항원결정인자가 환자의 항-갈 항체와 반응하여 면역 반응을 일으키고 결국 이종 조직의 석회화를 유발하므로, 이종조직의 세포 표면에 광범위하게 존재하는 알파-갈 항원결정인자를 제거하는 방법으로 알파-갈락토시다아제라는 효소를 이용할 수 있다.

이러한 심장판막이나 심장혈관대체물은 국내에서 생산 판매되지 않고, 고가로 외국에서 전량 수입에 의존하고 있으며, 또한 국내의 연구 기술도 전무한 상태에 있다. 이에, 본 발명자는 이러한 문제점들을 해결하고자 예의 노력한 결과 스페이스 필러를 이용하여 이종이식편을 이중고정 처리하고 독소를 제거하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

출원번호 10-2010-0063218

본 발명의 일 양상은 스페이스 필러를 이용한 이종이식조직의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 일 양상은 상기 방법에 의하여 제조된 이종이식조직에 관한 것이다.

이종생체조직을 이용한 심장혈관계대치물은 훌륭한 혈역학적 특징과 항응고제 사용으로 인한 부작용의 감소, 감염에 대한 우수한 내구성 등의 장점으로 많이 사용되고 있으나, 인체 내에 장기간 이식시 석회화로 인한 변성이 이종 조직의 내구성을 감소시키며, 성장하는 소아 환자들에서 특히 문제가 된다.

이에 본 연구진은 GA(glutaraldehyde)과 더불어 독성이 적은 genipin 같은 천연 가교제를 이용하여 조직을 고정하고, 또한 독성이 약한 carbodiimide를 첨가하여 crosslinking agents를 2가지 사용하는 double crosslinking technique도 Genipin이나 GA(glutaraldehyde)의 고정농도를 감소시키면서 crosslinking은 증가시킬 수 있었다.

글루타르알데하이드 처리 후에도 이종조직의 세포막에 부착된 인지질 (phosphpolipid) 은 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 에 의한 가수분해 (hydrolysis) 를 통해 인 (phosphorus) 을 제공하여 석회화의 초기단계에 관여하므로, 조직내 인지질을 제거하는 동시에 collagen 및 elastin의 구조적인 변화를 일으켜서 생체 내에서의 석회화를 감소시키기 위해서 글루탈알데히드로 고정한 이종 조직에 유기용매를 처리하였다.

글루탈알데히드에 의한 콜라젠의 교차결합 (cross-linking) 후 남는 알데하이드기가 체내에서 산화되면서 산을 형성하여 혈장 내 칼슘의 침착에 관여하거나, 중합에 의해 aldol condensate을 형성하여 석회화에 관여하게 되므로, 이를 아미노산을 사용하여 공유결합인 Schiff 염기 (Schiff base)를 형성하여 중화하는 항독소화 방법을 이용하였다.

글루탈알데히드 등의 crosslinking 처리 후에 생기는 잔존세포가 석회화의 원인이 되므로, 세포 제거의 효율을 극대화시키면서 이종 조직의 손상을 최소화하는 무세포화과정을 적용하였다.

본 연구진은 이종조직에 대한 무세포화 과정 후에도 잔존하는 이종항원인 알파-갈 항원결정인자 (α-Gal epitope)를 완전히 제거할 수 있는 방법으로 alpha gal epitope의 끝 말단인 1,3 linkage를 절단 할 수 있는 alpha-galactosidase를 적용하였다.

글루탈알데히드의 조직 내 콜라겐 교차결합에 관여 하지 않는 자유 알데하이드기는 세포독성을 가지며 석회화를 유발하는 것으로 알려져 있는데, space-filler를 처리하여 이러한 자유 알데하이드기를 비활성화 시킬 수 있다. 또한, space-filler는 조직에서 glutaraldehyde가 방출되는 것을 막아주는 막을 형성하며, 무세포화후 세포가 제거된 자리와 콜라겐 사이사이 빈 공간을 채워줌으로써 혈청 내 칼슘, 인지질을 배제시키고 수산화 인회석 결정이 생성될 가능성을 차단하며 또한 콜라겐에 존재하는 혈소판 receptor site도 가려주어 혈소판의 응집이나 부착을 막고 친수성을 높여주는 효과가 있다.

글루탈알데히드의 조직 내 콜라겐 교차결합에 관여 하지 않는 자유 알데하이드기는 세포독성을 가지며 석회화를 유발하는 것으로 알려져 있는데, space-filler를 처리하여 이러한 자유 알데하이드기를 비활성화 시킬 수 있다. 또한, space-filler는 조직에서 glutaraldehyde가 방출되는 것을 막아주는 막을 형성하며 특히 무세포화후 세포가 제거된 자리와 콜라겐 사이사이 빈 공간을 채워줌으로써 혈청 내 칼슘, 인지질을 배제시키고 수산화 인회석 결정이 생성될 가능성을 차단하며 또한 콜라겐에 존재하는 혈소판 receptor site도 가려주어 혈소판의 응집이나 부착을 막고 친수성을 높여주는 효과가 있다. 따라서, epoxy compound로 알려진 polyethylene glycol(PEG)과 jeffamine 같은 space-filler 처리를 시행하여 항석회화 효과를 향상시킬 수 있다.

따라서, 기존의 유기용매처리, 항독소화법, 무세포화법, 및 alpha-galactosidase 처리법의 항석회화 효과를 향상시키기 위해서 epoxy compound로 알려진 polyethylene glycol(PEG)과 jeffamine 같은 space-filler 처리를 함께 적용하여 병용 상승 효과(combined synergistic effect)를 입증하였다.

따라서, 본 발명은

(A) 포유동물의 생체 조직을 무세포화 (decellularization)시키는 단계;

(B) 상기 무세포화된 생체 조직에 스페이스 필러를 처리하는 단계;

(C) 상기 스페이스 필러가 처리된 생체조직을 조정화 (fixation)시키는 단계; 및

(D) 고정된 생체 조직의 독성을 제거하는 단계

를 포함하는, 이종 이식용 생체 조직의 제조 방법을 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

상기 단계 (A)의 무세포화 과정은 조직의 손상을 최대한 배제하면서 면역반응 최대 인자인 세포 및 세포막 등을 제거하 것이다. 글루타르알데히드나 기타 가교제의 처리과정 중에 생기는 잔존세포가 석회화의 원인이 될수 있으므로, 최대한 세포를 제거하여 효율을 극대화시켜야 하며 잔존 세포독성물질(protease, DNA, RNA)이나 사용되는 세정제의 독성합병증을 최소화하여야 한다.

따라서, 무세포화는 바람직하게는

(a1) 0.1 내지 1.5% (v/v) SDS (소듐 도데실 설페이트)를 포함하는 저장성 완충용액을 3 내지 5 ℃에서 12 시간 내지 36시간동안 처리하는 단계;

(a2) 0.1 내지 2.0 % (v/v) 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 포함하는 저장성 완충 용액을 3 내지 5 ℃에서 12 시간 내지 36시간 동안 처리하는 단계;

(a3) 증류수 및 PBS (0.01 M, pH 7.4)로 3 내지 5 ℃에서 각각, 6시간 내지 24시간 및 30분 내지 2시간 동안 세척하는 단계에 의할 수 있다.

또 다른 구체예에서 무세포화는 바람직하게,

(a1') 0.1 내지 1.5% SDS (소듐 도데실 설페이트)를 포함하는 저장성 완충용액을 3 내지 5 ℃에서 12 시간 내지 36시간동안 처리하는 단계;

(a2') 0.1 내지 2.0 % 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 포함하는 저장성 완충 3 내지 5 ℃에서 12 시간 내지 36시간 동안 처리하는 단계;

(a3') 0.1 내지 0.8 % SDS (소듐 도데실 설페이트) 용액을 3 내지 5 ℃에서 12 시간 내지 36시간동안 처리하는 단계; 및

(a4') 0.1 내지 2.0 % 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 포함하는 저장성 완충 3 내지 5 ℃에서 12 시간 내지 36시간 동안 처리하는 단계에 의할 수 있다.

또 다른 구체예에서 무세포화는 바람직하게,

(a1'') 0.1 내지 1.5% SDS (소듐 도데실 설페이트)를 포함하는 저장성 3 내지 5 ℃에서 12 시간 내지 36시간동안 처리하는 단계;

(a2'') 0.1 내지 2.0 % 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 포함하는 저장성 완충 용액을 3 내지 5 ℃에서 12 시간 내지 36시간 동안 처리하는 단계; 및

(a3'') 고장성 완충용액을 3 내지 5 ℃에서 3 내지 6시간 동안 처리하는 단계에 의하여 무세포화될 수 있다.

상기 각 단계는 그 조직의 유래 동물 및 조직 특성에 따라서 1회 이상 반복처리될 수 있다.

본 발명의 저장성 완충용액, 등장성 완충용액 및 고장성 완충용액이라는 용어는 일반적으로 알려진 바와 같이 생리식염수의 소금의 농도가 0.9%인 것을 등장성, 그 보다 작은 경우를 저장성, 그 보다 큰 경우를 고장성으로 정의한다.

상기 생체조직은 인간을 제외한 포유동물의 생체조직일수 있으며, 그 종류를 제한하지 않는다. 상기 포유동물의 예로서는 영장류, 가금류, 멧돼지과 동물, 토끼과, 솟과 동물, 개과 동물 등일 수 있다.

또한, 상기 생체 조직은 조직 이식이 가능한 조직에 해당하면 그 종류를 제한하지 않는다. 예를 들면, 혈관, 판막, 피부, 근막, 각막, 연골, 인대, 양막 등 일 수 있으며, 바람직하게는 심혈관계조직, 즉, 심낭, 심장 판막, 심막, 경막, 혈관, 혈관벽 등 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (B)의 스페이스 필러 (space-filler)란 무세포화후 세포가 제거된 자리와 콜라겐 사이사이 빈 공간을 채울 수 있는 합성 또는 천연의 수지를 의미한다.

상기 스페이스 필러는 조직에서 glutaraldehyde가 방출되는 것을 막아주는 막을 형성하며, 무세포화후 세포가 제거된 자리와 콜라겐 사이사이 빈 공간을 채워줌으로써 혈청 내 칼슘, 인지질을 배제시키고 수산화 인회석 결정이 생성될 가능성을 차단하며 또한 콜라겐에 존재하는 혈소판 receptor site도 가려주어 혈소판의 응집이나 부착을 막고 친수성을 높여주는 효과가 있다.

상기 스페이스 필러는 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol, PEG), 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide, PAAm), 폴리에틸렌(PE), 제파민 (jeffamine), 폴리아세탈(POM), 폴리아크릴(PA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리부틸렌 테레프탈레이드(PBT), 폴리스티렌(PS), 스티렌-아크릴로니트릴(SAN), 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌(ABS), 폴리아마이드(Nylon 6, 6/6, 6/10, 6/12, 11 또는 12), 폴리아미드-이미드 (PAI), 폴리아릴레이트, 폴리우레탄(PU), 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리설폰, 폴리테트라플루오르 에틸렌 (PTFE), 폴리에테르케톤(PEK), 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 열가소성 올레핀(TPO, 즉 폴리프로필렌/에틸렌, 프로필렌 /EPDM), 열가소성 엘라스토머, 폴리아릴설폰(PAS), 폴리에테르설폰(PES), 폴리페닐렌 셀파이드(PPS), 폴리우레탄(PU), 천연고무, 합성고무, 에폭시, 페놀, 폴리에스테르, 폴리아미드, 실리콘 및 이들의 조합일 수 있다. 더욱 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol, PEG), 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide, PAAm), 또는 제파민 (jeffamine)일 수 있다.

본 발명의 구체예에서는 상기 생체 조직이 소의 심낭인 경우, 상기 스페이스 필러는 0.03M~0.06M의 제파민 (Jeffamine)을 실온에서 12시간 내지 36시간 동안 처리할 수 있다.

상기 생체 조직이 소의 심낭인 경우, 상기 스페이스 필러는 0.03M~0.06M의 제파민 (Jeffamine)을 실온에서 12시간 내지 36시간 동안 처리 할 수 있다.

생체 조직이 돼지의 판막 또는 판막도관인 경우, 25%~ 50% (v/v)의 PEG를 실온에서 12시간 내지 36시간 동안 처리할 수 있다.

상기 본 발명에 있어서, 상기 단계 (C)의 고정화는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 제니핀(Genipin), 카보디이미드 (carbodiimide), 또는 EDC/NHS (1-(3-dimethyl aminopropyl)-3-ethyl carbodiimide / Nhydroxysuccinimide)을 고정액으로 이용하여 처리하는 것이 바람직하다.

상기 고정액에서의 상기 화합물의 농도는 0.1~1.0%인 것이 바람직하다. 상기 고정액에는 알코올계 용매가 더 포함되는 것이 바람직하다. 상기 알코올계 용매는 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올, 아세토니트릴, 1,4-디옥산, 이소프로판올, 옥탄올 등 일 수 있다. 상기 단계 (2)의 고정은 1~3회 반복적으로 수행되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (A) 단계의 무세포화 과정 중, 알파-갈 항원결정인자(α-Gal epitope)를 제거할 수 있는 방법으로 알파-갈 에피토프의 끝 말단인 1,3 연결을 절단할 수 있는 알파-갈락토시다아제의 처리할 수 있다. 이 단계는 α-갈락토시다아제 0.01~1.0U/ml를 포함하는 등장액을 처리하는 것으로 수행될 수 있다.

또한, 본 발명의 생체 조직의 제조 방법은 독성을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 L-라이신(L-lysine), 글리신(glycine), 키토산(chitosan), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 헤파린(heparin), 호모시스테인산(homocysteic acid), 소듐 보로하이드라이드 (sodium borohydride) 및 소듐 비설페이트(sodium bisulfate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 처리하는 것에 의할 수 있으며, 상기 화합물의 처리는 바람직하게는 4 내지 37 ℃에서 12~48시간 동안 처리되는 것 일 수 있다.

특히, 상기 생체 조직이 돼지의 심장판막인 경우,

(A) 0.25 % (v/v)의 SDS 및 0.5 % (v/v)TritonX-100를 이용하여 돼지의 심장판막을 무세포화하는 단계;

(B) 0.1 units/mL의 α-갈락토시다아제를 처리하는 단계;

(C) 25 % (v/v) PEG를 처리하는 단계;

(D) 0.5 % (v/v) 글루탈알데하이드로 고정화 하는 단계;

(E) 75 % (v/v) 에탄올 및 5 % (v/v) 옥탄올로 용매 처리하는 단계; 및

(F) 0.1M의 글리신으로 무독소화 하는 단계를 포함하는, 생체 조직의 제조 방법을 제공할 수 있다.

상기 제조방법에 의하여 제조된 이종 이식용 생체 조직은 석회화의 발생이 감소하며, 독성이 적으며, 이종 이식시의 면역반응이 현저하게 감소하는 바, 효과적이고 안전한 이종 이식용 생체 조직으로서 활용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 양상은 상기 방법에 의하여 제조된 이종 이식용 생체 조직을 제공한다. 상기 생체 조직은 심장판막, 수술용 조직패치, 조직 혈관, 인대, 힘줄 또는 조직공학용 다공성 지지체에 사용되는 이종 이식 보철편으로 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 의하여 제조된 이종 이식용 생체 조직은 석회화의 발생이 감소하며, 독성이 적으며, 이종 이식시의 면역반응이 현저하게 감소하는 바, 효과적이고 안전한 이종 이식용 생체 조직으로서 활용될 수 있다.

도 1은 탈세포화된 심낭에 대한 DAPI (4´,6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) (DAPI)결과이다. DAPI 염색은 무세포화된 소심낭의 DNA가 현저하게 감소함을 보여준다 (방법 1). (a) 신선한 소의 심낭; (b) 탈세포화(decellularized (decell)) 된 소의 심낭 (fluorescence microscopy, original magnification x 200).
도 2는 조직처리를 모두 완료 한 후의 색 변화(1-12)이다 (방법 1).
(a) EDC/NHS 처리 군은 흰색으로 변화, GA 처리 군은 아이보리-노랑색으로 변화, Genipin 처리 군은 블루-블랙으로 변화. (b) Space filler 처리 군(acryl,0.27±0.05, Jeffamine,0.34±0.03 PEG,0.29±0.03)이 GA 그룹을 제외하고 대부분 space filler 처리 전보다 두께가 두꺼워졌다. (각 그룹 N=10)
도 3. In vitro는 교차가교 (cross-linking) 효율의 검사 (방법 1)결과이다. (a) 열 안정성 시험. 모든 처리 군의 수축 온도는 신선한 소심낭에 비해 유의하게 높았다 (69.42℃, P<0.05). (b) Pronase 시험은 열 안정성과 유사하게 나타났다.
도 4는 교차가교 (cross-linking) 효율 (방법 3)의 결과이다. (a) 열 안정성 시험 (b) Pronase 시험.
도 5는 랫트 이식 모델에서의 열 안정성 검사에 대한 결과를 나타낸 도이다 (방법 5).
도 6은 야생형 마우스 이식 모델에서의 열 안정성 검사의 결과를 나타낸 도이다 (방법 5).
도 7은 분해 및 pronase 검사 이후 남은 질량의 확인 결과이다 (방법 4). 돼지 판막은 소의 심낭에 스페이스 필러를 처리한 군보다 감소한 pronase 안정성을 나타내었다(p = 0.016, p = 0.008). 돼지의 판막에서 GA 고정 군과 비교하여 탈세포 및 스페이스 필러가 처리된 군은 통계학적으로 유의적인 pronase 안정성의 감소를 나타내었다 (p = 0.008, p = 0.008). 스페이스 필러의 처리는 또한 돼지 판막에서 GA 고정군과 비교하여 감소한 pronase 안정성을 나타내었다 (p = 0.008).
소의 심낭에서, 1: simple GA fixation, 2: Decell (A) + GA, 3: Decell (B) + GA, 4: Decell (A) + Space filler + GA, 5: Decell (B) + Space filler + GA.
돼지의 판막에서, 6: simple GA fixation, 7: Decell (A) + GA, 8: Decell (A) + Space filler + GA.
Decell: decellularization, GA: glutaraldehyde
도 8은 랫트 이식 모델에서의 pronase 검사 결과를 나타낸 도이다 (방법 5).
도 9은 야생형 마우스 이식 모델에서 pronase 검사 결과를 나타낸 도이다 (방법 5).
도 10은 돼지 대동맥 평활근 세포 (porcine aortic smooth muscle cell)와 소의 심낭의 접촉 세포독성 (Contact cytotoxicity)를 나타낸 결과이다 (방법 1). 각각 조직처리 방법에 따른 세포독성을 확인하였다. 심낭과 접촉된 배양 세포의 위상차 현미경 이미지 (original magnification x40). 세포는 Annexin V fluorescein isothiocyanate (FL1) 및 propidium iodide (FL2)으로 표지하였으며, 유세포분석을 이용하여 특정하였다.
도 11은 적출된 심낭에 대한 칼슘 정량 (방법 1) 결과를 나타낸 도이다. 심낭 조직을 4, 8주 동안 토끼 근육 내로 삽입하였다. 세포 독성의 결과와 석회화의 정도과 상관관계가 있음을 알 수 있었다. 모든 수치는 mean±SEM으로 나타내었다 (ug/mL/mg, dry weight, n = 5).
도 12은 적출된 심낭에 대한 von Kossa 염색 (방법 1)결과를 나타낸 도이다. 조직은 4-8주 동안 토끼의 근육내에 삽입되었다. 특히 GA-PEG 처리 군에서는 석회화가 매우 낮은 수준 (0.62±0.1 ㎍/㎖/mg)을 보였다. 이러한 결과는 von Kossa 염색으로 관찰 할 수 있었다. Light microscopic image of bovine pericardium (original magnification x40).
도 13. PEG-처리 심낭에 대한 von Kossa 염색, hematoxylin and eosin 염색, 및 면역형광검사 (방법 1). 조직은 4-8 주 동안 토끼의 근육내에 삽입하였다. 침윤된 세포들은 CD4와 macrophage로 확인되었다 (immunohistochemistry and immunofluorescence). 소 심낭에 대한 광학 현미경 이미지 (original magnification x40, x100). 소 심낭에 대한 형광 현미경 이미지 (original magnification x40, x100).
도 14는 랫트에 피하 이식 2달 후의 칼슘의 정량 결과이다 (방법 2).
도 15은 랫트에 피하 이식 2달 후 H & E staining (x100) 결과이다 (방법 2). A; 1군, B; 2군, C; 3군.
도 16. von Kossa staining (x100) 2 months after rat subcutaneous implantation(방법 2). A; 석회화가 없는 경우, B; 석회화가 있는 경우. 검게 염색된 부분이 석회화가 된 부분을 나타낸다.
도 17은 토끼의 근육 내 이식 2달 후의 칼슘의 정량 결과이다 (방법 3).
도 18은 토끼의 근육 내 이식 2달 후의 H & E staining 결과이다 (방법 3).
도 19은 토끼의 근육 내 이식 2달 후의 von Kossa staining의 결과이다 (방법 3).
도 20은 모든 군에서의 조직 처리 후 H & E staining결과이다 (방법 4). 다수의 염증 세포가 단순 GA 고정군에서 침윤됨을 알 수 있다. 그러나, 염증세포 침윤은 탈세포화 및 스페이스 필러 처리 후 감소하였다.
A through E: bovine pericardium, F through H: porcine valves
A: GA, B: Decellularization (A) + GA, C: Decellularization (A) + Space filler + GA, D: Decellularization (B) + GA, E: Decellularization (B) + Space filler + GA, F: GA, G: Decellularization (A) + GA, H: Decellularization (A) + Space filler + GA.
GA; Glutaraldehyde
도 21은 조직 및 처리 방법에 따른 칼슘 및 인산의 함량 지수 (content indices)를 나타낸 도이다 (방법 4). 소 심낭은 간단히 GA가 처리된 군에서 돼지의 대동맥 및 폐동맥판에 비해 높은 칼슘 및 인산 함량 지수를 나타내었다.
돼지 대동맥판에서 칼슘 및 인산의 함량 지수는 탈세포 후 GA 군, 및 GA 및 탈세포 및 스페이스 필러 처리 군에서 가장 낮았다.
소 심낭에서, 1: simple GA fixation, 2: Decell (A) + GA, 3: Decell (B) + GA, 4: Decell (A) + Space filler + GA, 5: Decell (B) + Space filler + GA.
돼지 판막에서, 6: simple GA fixation, 7: Decell (A) + GA, 8: Decell (A) + Space filler + GA.
Decell: decellularization, GA: glutaraldehyde
도 22는 랫트 이식 모델에서 각 심낭의 칼슘 함량을 나타낸 도이다 (방법 5).
도 23은 야생형 마우스 이식 모델에서 각 심낭의 칼슘 함량을 나타낸 도이다 (방법 5).
도 24는 랫트 이식 모델에서 각 심낭의 H & E stain 결과이다 (방법 5).
도 25는 랫트 이식 모델에서 각 심낭의 von Kossa stain 결과이다 (방법 5).
도 26은 초기 판막 스텐트의 형태 (D type; A,B) 및 변형된 판막 스텐트 (M type; C,D)의 형태를 나타낸 도이다. 판막의 직경은 20 내지 26 mm 의 범위이고, 스텐트의 양단은 나팔모양이 되게 하였으며, 판막의 직경보다 4 mm 넓게 하였다. 스텐트의 벽은 전체 판막 스텐트 직경을 감소시키기 위하여, M 유형으로 부분적으로 덮었다. 스텐트 내의 판막은 육안적으로 좋은 교합 소견을 나타내었다 (B, D) (방법 6).
도 27은. 판막 스텐트의 운반 카테터를 나타낸 도이다. 운반 카테터의 기단 부분에는 17.5 mm 원뿔모양의 테이퍼된 팁을 가지는 판막 스텐드의 로딩 부위를 포함하였다 (white arrows in A, B).
시계 반대방향으로 둥글게 돌리고 (dotted arrows in C, D), 레버를 당김으로써 (thick arrows in C, D), 판막 스텐드는 자가 확장 본성에 따라서 완벽하게 배치된다. 후크 블록 (arrow head in E)은 목적 부위로의 제어된 배치에 도움이 된다.
도 28은 과정 중의 판막 스텐트 형태를 나타낸 도이다. 단일 평면 C- 암 투시 장치는 주입 전에 판막 스텐트의 좋은 위치를 보여준다 (arrow-head in A). 판막 스텐트를 성공적으로 주입 후, 경흉부 심초음파 검사 (white arrow in B)와 C- 암 투시 장치 (black arrow in C)로 이식된 판막 스텐트의 위치를 확인하였다. RV: right ventricle.
도 29는 이식 후 6개월 후의 판막 스텐드를 관찰한 결과이다 (방법 6). 잘 보존된 이식된 판막 엽. 우심실유출로 스텐트 벽의 잘 내피세포화된 (endothelialized) 내부 면 및 중심 폐동맥 내의 스텐트의 외부면이 나타난다 (arrow head in A).
좋은 위치에 이식된 판막 엽이 경흉부 심초음파 검사 (C)에서 폐동맥 협착이나 폐쇄 부전 없이 매우 좋은 형태로 보존되고 있음을 확인할 수 있었다 (B).
도 30는 11마리의 양에서 이식 10개월 후 조직 판막 엽의 조직학적 소견을 나타낸 도이다 (방법 6). 판막 엽은 눈에 보이는 석회화를 보이지 않았으며, Hematoxylin and eosin staining (A) 및 Masson’s Trichrome staining (B, blue color)에서 콜라겐의 구조의 물결을 잘 유지하고 있었다.
Von Kossa staining 에서는, 명확한 칼슘 염색이 없었다 (C, calcium deposition: 3.92 ug/mg).

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: space-filler 첨가의 물리역학적인 평가>

본 실시예에서는, space-filler 첨가에 따른 물리역학적인 평가를 시행하였다.

1-1. 재료의 수집, 처리 및 보관

(1) 방법 1 : 도살장에서 도살된 소의 심낭을 수의사의 협조 하에 채취하여 혈액을 세척한 후, 4℃ 생리 식염수에 담아 냉장상자에 보관하여 실험실로 가져온다. 채취한 신선한 심낭 절편을 박리한 후 생리식염수로 세척한다. 0.1% peracetic acid (PAA)로 실온에서 소독을 하고 증류수로 1시간 동안 세척한다. 심낭 무세포화를 위해 저장성 용액 (1L of distilled water, 10mM Tris, pH 8)에서 0.25% SDS 를 이용하여 24시간 처리하고, 같은 저장성 용액에서 0.5% Triton X-100 를 24시간 처리한다. 그 후에 4℃에서 12시간 동안 증류수로 세척한다. 마지막으로 4℃에서 1시간 동안 phosphate-buffered solution (PBS, 0.01 M, pH 7.4)로 세척한다.

이 무세포화된 심낭은 다양한 space filler들(Jeffamine, pAAm, or PEG)로 처리한 후, GA, 1-(3-dimethyl aminopropyl)-3-ethyl carbodiimide / Nhydroxysuccinimide (EDC/NHS), 또는 genipin을 이용하여 고정한다 [표1].

(2) 방법 2 : 소심낭을 탈세포화 중에 등장성 용액에서 0.1U/mL α-galactosidase로 처리하였으며, 탈세포화 후에 0.01 M PBS (pH 7.4)의 50% 폴리에틸렌 글리콜 (MW 1000) 용액을 실온에서 하루 동안 조직에 첨가 하였다[표 2].

Groups	Bovine pericardium
1 2	GA 고정 탈세포화 ± alpha-galactosidase + GA 고정
3	탈세포화 ± alpha-galactosidase + Space filler treatment + GA 고정

(3) 방법 3 : 소심낭과 폐동맥벽을 탈세포화 중에 등장성 용액에서 0.1U/mL α-galactosidase로 처리하였으며, 탈세포화 후에 0.01 M PBS (pH 7.4)의 50% 폴리에틸렌 글리콜 (MW 1000) 용액을 실온에서 하루 동안 조직에 첨가 하였다[표 3].

Groups	Bovine pericardium
1 2	Fresh bovine pericardium GA 고정
3	탈세포화 + GA 고정
4	탈세포화 + Space filler treatment + GA 고정
5	탈세포화 + alpha-galactosidase + Space filler treatment + GA 고정

(4) 방법 4 : 소의 심낭 조직 및 돼지 판막 조직을 임의로 사용된 조직 처리 방법에 따라서 3 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다.

간단한 GA 고정 방법 (simple GA fixation treatment) (GA 고정 그룹)

탈세포화 (A) + GA 고정 방법 (탈세포화 A그룹)

탈세포화 (A) + spacefiller + GA 고정 방법(Spacefiller A그룹)

소심낭 조직의 조직 성질을 알아보기 위해 다른 간단한 탈세포화 방법(B)를 적용하였다.

탈세포화 (B) + GA 고정 방법 (탈세포화 B 그룹)

탈세포화 (B) + spacefiller + GA 고정 방법 (Spacefiller B 그룹) [표 4]

실험 방법

Tissue material	Group
소심낭	단순 GA 고정 탈세포화(A)+GA 고정 탈세포화(A)+Space filler treatment+GA 고정 탈세포화(B)+GA 고정 탈세포화(B)+Space filler treatment+GA 고정
돼지 판막	단순 GA 고정 탈세포화(A)+GA 고정 탈세포화(A)+Space filler treatment+GA 고정

GA; glutaraldehyde

소 심낭과 돼지의 심장 판막 에 대한 탈세포화 (A) 방법 : 모든 소 심낭 및 돼지 심장 판막 조직은 2시간 동안 증류수에서 4% (v/v) 에탄올 0.1% 아세트산 (PAA)을 사용하여 소독하였다. 이어서 모든 조직은 증류수로 30분간 세척 하였다. 1.0% 소듐 도데실 설페이트 (SDS)와 저장성 용액은 4°C에서 24 시간 동안 첨가하였고, 저장성 용액과 함께 1.0% 트리톤 X-100를 4°C에서 24 시간 동안 첨가하였다. 이 용액은 4~5번 반복하여 세척을 한 다음 0.5% SDS 용액 4°C에서 24시간 동안 첨가하였고, 1.0% 트리톤 X-100 용액 함께 저장성 용액을 4°C에서 24시간 동안 첨가하였다. 추가적인 세척을 두 번 반복 한 후 조직을 4°C에서 24시간 동안 인산염 완충 용액 (PBS) 로 세척하였다.

소 심낭에 대한 탈세포화 (B) 방법 : 소 심낭에서 탈세포화 방법에 따른 기계적, 화학적 특성을 비교하기 위해, 다른 탈세포화 방법을 계획하였다. 모든 소 심낭 조직을 실온에서 2 시간 동안 증류수 에서 4% (v/v) 에탄올 0.1% PAA 에 소독 및 바이오 버든(bioburden)의 감소를 유도하고 증류수로 30분간 세척 하였다. 0.25% SDS와 함께 저장성 용액을 4°C 에서 24 시간 동안 첨가하고, 0.5% 트리톤 X-100 과 저장성 용액을 4°C 에서 24 시간 동안 추가 된 조직을 첨가한 다음 증류수로 30분 동안 세척하고, 고장성 용액은 4°C 에서 4시간 동안 추가된 조직을 다음 4°C 에서 24시간 동안 PBS로 세척하였다.

Spacefiller 처리 방법: 0.01 M PBS (pH 7.4)의 25% 폴리에틸렌 글리콜 (MW 1000) 용액을 탈세포화 후에 실온에서 하루 동안 조직에 첨가 하였다.

(5) 방법 5 : 소 심낭을 아래와 같이 처리하였다.

GA(glutaraldehyde) 군: GA 로 고정만 하였다.

Decell(Decellularization) + GA 군: 무세포화를 한 후 GA 로 고정하였다.

Decell + PEG(polyethylene glycol) + GA 군: 무세포화 후 space filler 인 PEG 로 처리하고 GA 로 고정하였다.

Decell + Jeffamine + GA 군: 무세포화 후 space filler 인 Jeffamine 으로 처리하고 GA 로 고정하였다.

무세포화(Decellularization) : 증류수에 0.1% peracetic acid 와 4% 에탄올을 섞은 용액으로 실온에서 2시간 동안 처리한 후 30분간 세척하였다. 4°C에서 0.25% SDS(sodium dodecyl sulfate)를 포함한 저장용액으로 24시간 처리한 후 같은 환경에서 0.5% Triton X-100를 포함한 저장용액으로 24시간 처리하고 증류수로 세척하였다. 이후 4°C에서 고장용액으로 4시간 동안 처리하고 PBS(phosphate buffered saline) 으로 24시간 동안 세척하였다.

PEG(polyethylene glycol) 처리: 25% PEG와 0.01% neomycin을 0.01M PBS에 넣어 24시간 동안 실온에서 섞었다. 이후 4°C에서 고장용액으로 3시간 동안 처리하고 같은 온도에서 24시간 동안 PBS 용액으로 세척하였다.

Jeffamine 처리 : 0.25M MES(2-morpholinoethanesulfonic acid)에 0.03M Jeffamine과 0.01% neomycine을 넣어 24시간 동안 실온에서 섞었다. 이후 4°C에서 고장용액으로 3시간 동안 처리하고 같은 온도에서 24시간 동안 PBS 용액으로 세척하였다.

고정(fixation) : 실온에서 0.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 3일간 처리하고 0.25% 글루타르알데히드에 7일간 처리하였다. 고정이 끝나면 지름 5mm 의 원형 절편으로 잘라 4% propylene oxide 용액에 보관하였다.

(6) 방법 6 : 돼지의 심낭을 0.25% sodium dodecyl sulfate와 0.5% TritonX-100를 이용하여 무세포화하고, 면역원성을 감소시키기 위해서 0.1 units/mL alpha-galactosidase처치를 시행하고, 25% polyethylene glycol를 이용한 space filler처리를 시행하고, 0.5 % glutaldehyde fixation을 시행하고, 75% ethanol + 5% octanol을 이용한 solvent 처리를 시행하고, 0.1M glycine을 이용한 무독소화처리를 시행하였다.

1-2. 물리역학적인 평가

(1) Tensile strength

소의 심낭은 교원 섬유들이 일정하지 않은 방향으로 달리면서 서로 교차하기도 하고 소용돌이도 치며 부위마다 그 분포가 균일하지 못하다. 따라서 무작위로 한 부분을 떼어서는 그 심낭의 인장 강도를 대표할 수 없게 된다. 따라서 처리된 심낭을 펼치고 30도씩 각도를 달리하여서 얻어낼 수 있는 6가지의 방향에 대하여 0.5cm×5 cm의 장방형 절편을 취하여서 폭 5 mm에 대한 인장 강도를 측정함으로써 그를 평균한 값이 그 심낭의 인장 강도의 대표값이 되도록 하였다. 장력의 측정은 Japan Tech & Manufacture (Mitutoyo, Japan), Digital Force Gauge (IMADA, Japan), Model 5FGN, automated materials testing system을 이용 load speed 100 mm/min로 측정하여 단위는 MPa (=kgf/width 5 mm)로 표기하였다. 또한 심낭의 두께와 장력과의 관계를 보기 위하여 캘리퍼스 Mitutoyo Thickness Gauge (Digimatic 543-122-15, Mitutoyo, Japan)로 표본들의 두께도 한 샘플에서도 여러 번 동시에 측정하였다.

(2) Elasticity test

신장도는 양방향으로 늘여 끊어지는 시점에서의 길이를 측정하여 늘어난 정도를 %로 표시하였다.

(3) 투과도 검사(Permeability test)

한 시간 동안 생리식염수로 심낭편의 한쪽에서 압력을 가한 후, 투과된 생리식염수의 양을 측정하여 이를 투과도로 정의하였으며, 이를 mL/hrㆍcm²로 나타냈다. 각 군마다 샘플 수는 10개였다.

(4) 유순도 검사(Compliance test)

심낭편에 생리식염수를 이용하여 100mmHg에서 200mmHg까지 압력을 증가시켰을 때 늘어난 심낭편으로 인해 증가한 부피를 유순도로 정의하였고, 이를 μL/mmHgㆍ cm²로 나타냈다. 각 군마다 샘플 수는 30개였다.

1-3. 결과

(1) DAPI staining, color and thickness

방법 1에서 소심낭의 무세포화를 확인하기 위해서 조직의 DAPI 염색을 시행하였으며, DAPI 염색은 무세포화된 소심낭의 DNA가 현저하게 감소함을 보여주었다[도 1]. 무세포화 한 조직에 space fillers (Jeffamine, acrylamide, PEG)를 처리한 후, EDC/NHS, GA 그리고 genipin 으로 고정시켰으며, EDC/NHS 처리 군은 흰색으로, GA 처리 군은 진한 노랑색으로, Genipin 처리 군은 블루-블랙으로 변화하였다 [도 2a]. space filler 처리 후에 전반적으로 색이 더 선명해졌다.

Space filler 처리 군(acryl,0.27±0.05, Jeffamine,0.34±0.03 PEG,0.29±0.03)이 GA 그룹을 제외하고 대부분 space filler 처리 전보다 두께가 두꺼워졌다[도 2b] [표 5].

(2) Tensile strength

(2-1) 방법 1 [표 1]에 대한 Tensile strength와 strain 수치는 표 5에 기술하였다. GA, EDC/NHS,과 genipin은 tensile strength가 양호하여 모두 효과적인 교차결합제였다.

(2-2) 방법 2의 Tensile strength와 strain 수치는 표 6에 기술하였다. 무세포화 후 PEG 처리를 한 3군만 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 낮게 나왔다.

투과도 검사를 시행한 결과를 대조군과 비교해 보았을 때 무세포화 처리만 한 2군에서는 대조군보다 투과도가 유의하게 증가되어 있었다. 반면 무세포화 후 PEG 로 space filler 처리를 시행해 준 3군에서는 투과도에 있어서 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다. 투과도 검사의 결과와 마찬가지로, space filler 인 PEG 를 처리해 준 3군은 대조군과 비교해 보았을 때 유의한 차이가 없었으나 PEG를 처리하지 않고 무세포화만 시행한 2군은 대조군과 비교했을 때 유순도가 유의하게 증가된 것으로 나타났다[표 7] [표 8].

(2-3) 방법 3의 Tensile strength와 strain 수치는 [표 9]에 기술하였다. 여러 처리 과정을 통해 소심낭의 두께가 증가함에 따라 단위 면적이 변화되어 단위 장력에 큰 영향을 미쳤을 것이라 생각된다.

(2-4) 방법 4의 인장 강도와 탄성 시험의 결과를 [표 10]에 나타내었다. 인장 강도 시험에서는 탈세포화 그룹 (9.1±4.3, n=12)이 GA 고정 그룹 (13.8±3.6, N=12) (p=0.005) 에 비해 인장 강도 의 감소를 나타냈다. 그러나 Spacefiller 처리 (11.7±3.6, N=12)후 인장 강도를 비교하여 보았을 때 GA 고정 그룹과 비교하여 통계학적 차이는 관찰되지 않았다(P=0.195). 탄성 테스트에서 Spacefiller 처리 그룹(87.8±20.9, N=12)에서 다른 그룹 (GA 고정그룹, 69.1±14.3, 탈세포화그룹 70.6±6.1, N=12)과 비교하여 탄성력의 증가를 관찰할 수 있었다(P= 0.008, P=0.004).

소 심낭의 인장 강도 시험 및 탄성 테스트

	N	Thickness (mm)	Tensile strength (MPa)	Elasticity (%)
GA	12	0.43±0.06	13.8±3.6	70.6±6.1
Decell (A) + GA	12	0.50±0.05	9.1±4.3	69.1±14.3
Decell (A) + space filler + GA	12	0.52±0.04	11.7±3.6	87.8±20.9
Decell (B) + GA	12	0.37±0.04	12.0±5.4	38.2±6.2
Decell (B) + space filler + GA	12	0.36±0.04	9.8±4.0	43.5±11.4

Decell (A); decellularization (A), Decell (B); decellularization (B), GA; glutaraldehyde, MPa = Kgf / 5 mm²

두가지의 탈세포화 방법에 대하여 인장 강도와 탄성을 분석하면, 탈세포화 (B) 방법은 (38.2±6.2 versus 69.1±14.3, n=12, p<0.001) 탈세포화 (A) 방법에 비해 탄성력의 통계적으로 유의한 감소를 보였다.

(2-5) 방법 5의 Mechanical test: rat 실험군 과 wide type mouse 실험군 모두에서 각 군 사이에 유의한 차이는 없었다[표 11] [표 12].

The results of tensile strength test in rat implantation model.

Groups (Bovine Pericardium)	Tensile Strength
	Sample	Thickness (mm)	Peak load (N)	Ultimate Strength (Mpa)	Elongation at ultimate strength (%)
GA	n=12	0.39±0.02	24.26±4.77	12.44±2.60	55.92±5.95
De+GA	n=12	0.39±0.01	22.08±1.60	11.24±0.93	51.28±8.28
De+PEG+GA	n=12	0.40±0.01	22.89±2.15	11.51±0.99	55.49±9.32
De+Jeffamine+GA	n=12	0.40±0.01	21.39±1.78	10.59±0.85	52.41±10.08

The results of tensile strength test in wide type mouse implantation model.

Groups (Bovine Pericardium)	Tensile Strength
	Sample	Thickness (mm)	Peak load (N)	Ultimate Strength (Mpa)	Elongation at ultimate strength (%)
GA	n=12	0.40±0.02	20.28±2.31	10.16±2.60	71.64±14.45
De+GA	n=12	0.39±0.01	21.28±1.79	10.93±1.05	57.64±6.63
De+PEG+GA	n=12	0.41±0.01	20.67±2.69	10.27±0.74	61.24±10.67
De+Jeffamine+GA	n=12	0.41±0.02	21.25±1.68	10.59±0.85	59.43±8.95

<실시예 2: space-filler 첨가의 cross-linking 평가>

본 실시예에서는, space-filler 첨가에 따른 cross-linking의 효율성을 평가하였다.

2-1. cross-linking 평가

(1) Thermal stability test

각각 다른 방법으로 고정한 심낭편을 각 군당 5개씩, 8x30mm의 절편으로 잘라 95g의 추로 지속적인 장력을 가하게 한 후 55°C의 증류수에 넣고 2°C/min의 속도로 물의 온도를 올리면서 심낭 절편이 급격하게 수축하는 시점, 즉 조직의 콜라겐 변성이 일어나는 시점의 온도를 군별로 각각 비교 측정하였다.

(2) Resistance towards protease digestion

증류수로 심낭편을 세척(rinsing)하여 70°C에서 24시간 건조한 후 무게(weight 1)를 측정한다. 0.01M HEPES (pH 7.4)로 완충된 0.5mg/mL Pronase^®®용액에 0.1M glycine, 0.01M CaCl₂를 첨가한 뒤 심낭편을 넣고 50°C에서 24시간 반응시킨다. 증류수로 세척한 후 70°C에서 24시간 건조한 뒤 무게(weight 2)를 측정한다. 프로나아제에 대한 저항성을 잔여무게량% (=weight 2/weight 1 x 100)으로서 나타낸다.

2-2. Crosslinking efficiency 결과 [도 3]

(1) 열안정성 결과

(1-1) 방법 1에서 열에 의한 콜라겐의 변성 실험을 통하여 조직 처리 조건에 따른 결과로 cross link 과 관련하여 열안정성에는 문제가 없었다.

모든 처리 군의 수축 온도는 신선한 소심낭에 비해 유의하게 높았다 (69.42 ℃, p<0.05). GA-처리 군이 86.28 ℃, 84.23 ℃, 84.44℃, 86.14 ℃로 가장 높은 수축 온도를 보여 주어 열안정성이 가장 우수하였다. Genipin-처리 군의 수축 온도는 82.28℃, 79.82℃, 79.70℃, 79.20℃이었으며, EDC/NHS-처리 군의 수축 온도인 74.72℃, 81.68℃, 77.74℃, 76.87℃ 보다 열 안정성이 약간 높았다

EDC/NHS-처리 군에서는 space filler가 열 안정성을 증가시켰으며, Jeffamine 군에서는 81.68 ℃까지 증가하였다. GA-처리 군과 Genipin-처리 군에서는 space filler가 열 안정성에 유의한 영향을 미치지 않았다[도 3a].

(1-2) 방법 3에서 Collagen 변성이 일어나는 수축온도는 무세포화를 시행한 대조군과 space filler PEG와 α-galactosidase 를 처리한 군에서 유의하게 별다른 차이를 보이지 않았다[도 4a].

(1-3) 방법 4에서 Spacefiller A 그룹은 (84.4±0.2, N=5) 다른 그룹 (GA 그룹: 83.5±0.4, N=5, 탈세포화 그룹: 83.5±0.4, N=5)에 비해 통계적으로 유의한 열 안정성을 보여 주었다 (p=0.007).그러나, 우리는 탈세 포화 방법 사이에 유의한 차이점은 발견하지 못했다 (탈세포화 B 그룹: 83.6±0.64, n=5, space filler B 그룹: 83.8±0.6, n=5) (p=0.910 and p=0.104).

(1-4) 방법5에서 rat 실험군과 wide type mouse 실험군 모두에서 각 군 사이에 유의한 차이는 없었다[도 5] [도 6].

(2) pronase test 결과

(2-1) 방법 1에서 이 결과는 열 안정성과 비슷한 양상을 보였다. GA-처리군과 Genipin-처리군은 신선한 소심낭보다 protease resistance가 증가하였으며, Genipin-처리군은 GA-처리 군보다 훨씬 덜 효과적이었다. EDC/NHS-처리군은 space filler를 처리하지 않은 경우에 protease resistance가 아주 약하여 90% 이상이 분해되었으나, space filler를 처리한 경우에 protease resistance가 많이 증가하였다. GA-처리군은 효소분해 이후에 89.3%-95.4%가 남아서, space filler 처리와 관계없이 가장 효과적인 교차결합을 보여주었다 [도 3b].

(2-2) 방법 3에서 대조군에 비해 모든 처리군에서 pronase 에 대한 저항이 낮게 나타났다. Space filler 처리 방법에 따른 유의한 차이는 없었다 [도 4b].

(2-3) 방법 4에서 처리 방법 에 따른 분석 : GA 고정 군에서는 소 심낭(71.7±8.1, N=5)과 돼지 판막 (78.2±4.2, N=10) 사이에 통계학적으로 유의한 차이는 없었다(p = 0.059). 탈세포화 A 군에서 소심낭 (61.0±13.1, N=5) 과 돼지판막(74.5±17.8, N=10)간의 통계적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다 (P=0.161). 그러나 돼지의 심장 판막(58.4±6.1, n=10)은 소심낭(83.3±4.5, n=5)과 비교하여 프로나제 안정성의 감소를 보여주었다(P<0.001).

방법4에서 조직 형태에 따른 분석: 소 심낭에서 조직의 제조 방법 (P=0.09)에 따른 통계학적 차이는 없었다. 그러나 Spacefiller A 그룹 (58.4±6.1, N=10)은 돼지 판막에서 GA 고정 군 (78.2±4.2, N=10) 및 탈세포화 A군 (74.5±17.8, N=10)에 비해 프로나제 안정성의 감소를 보였다 (P<0.001, P=0.003) [도 7].

(2-4) 방법 5에서 rat 실험군과 wide type mouse 실험군 모두에서 각 군 사이에 유의한 차이는 없었다 [도 8] [도 9].

<실시예 3: space-filler 첨가의 contact cytotoxicity 평가>

본 실시예에서는, space-filler 첨가에 따른 contact cytotoxicity를 평가하였다.

3-1. Contact cytotoxicity 평가

돼지의 평활근 세포를 6-well에 심는다. 여기에 DMSO 를 세포에 처리한 것을 대조군으로 하고, 48시간 동안 공기 중의 5%의 CO₂ 안의 37 ℃에서 배양시킨다.

세포의 형태를 현미경으로 관찰하고 plate에 붙어있는 세포를 차가운 PBS로 세척하였다. 그 후에 1X binding buffer 를 넣는다. 5mL 튜브에 위의 액을 100㎕와 FITC 5㎕, Annexin V와 propidium iodide (PI) 5㎕ 를 넣고 vortexing 한 후에 25℃ 암실에서 15분동안 배양시킨다. 그 후 튜브에 1X binding buffer 400㎕를 첨가한 후에 1시간 이내로 FACS 로 분석한다.

3-2 Contact cytotoxicity 결과 [도 10]

방법 1에서 세포 독성을 측정 한 결과 EDC/NHS-처리 군에서 75.3% (none), 71.3% (Jeffamine), 84.7% (Acryl), 82.8% (PEG) 세포가 생존하였다. EDC/NHS-처리 방법이 가장 독성이 강했다.

GA-처리 군에서 76.8% (none), 87.3% (Jeffamine), 88.5% (Acryl), 90.3% (PEG) 세포가 생존하여, space filler 처리가 세포의 생존을 약 10% 정도 상승시키는 것으로 나타났다.

Genipin 처리군 에서 88.8% (none), 84.9% (Jeffamine), 88.3% (Acryl), 91.8% (PEG) 세포가 생존하여, space filler 처리와 관계 없이 genipin 그룹에서 독성이 없었다는 사실을 확인했다.

<실시예 4: space-filler 첨가의 in-vivo calcification 평가>

본 실시예에서는, space-filler 첨가에 따른 in-vivo calcification을 평가하였다.

4-1 Small animal experiment

(1) 방법 1에서 rabbit intramuscular implantation : Male New Zealand white rabbits을 사용하여 모든 수술과정은 무균상태로 진행되었다. 각각의 토끼 뒷다리 피부를 절개하여 근육 층 사이에 조직 절편을 삽입하고 4-8주 후에 적출한 다음 칼슘정량을 실시하였다.

(2) 방법 2에서 rat subcutaneous implantation : 생후 4주령의 수컷 Sprague-Dawley Rat 10마리를 사용하였다. Rat의 체중에 따라 이후의 석회화의 정도에 차이가 생길 가능성이 있어 수술 전, 수술 후, 2주, 1개월, 2개월 되는 시점에서 Rat의 몸무게를 측정하였다. 각각 처리과정을 마친 소 심낭편을 Rat의 피하에 이식한 후 2개월 후에 이식편을 수거하여 칼슘을 정량적으로 측정하여 각각의 처리과정이 석회화의 정도에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 모든 수술과정은 무균상태로 진행되었다.

(3) 방법 3에서 rabbit intramuscular implantation : Male New Zealand white rabbits을 사용하여 모든 수술과정은 무균상태로 진행되었다. 조직을 다리와 등 부위에 이식 한 후 2개월 간 사육한 뒤, 이식되어 있는 조직들을 적출하였다. 조직에 붙어있는 토끼의 조직들을 박리하여 제거한 후 칼슘정량을 실시하였다.

(4) 방법 4에서 rat subcutaneous implantation : zolazepam + Tiletamine (0.2 CC , zoletil , Virbac , 프랑스)과 자일라진 (0.2 CC, Rumpun, 바이엘, 독일)을 사용하여 복강 내 주사를 통하여 마취를 하였다. 쥐를 면도 한 후, 네 개의 피하 주머니를 등에 만들었다. 각각 처리 된 조직 디스크 (직경 5mm)를 주머니에 주입하고, 상처는 4-0 모노 필라멘트 봉합사를 이용하여 봉합하였다. cefazoline (20 ㎎/kg, 유한 양행, 한국) 를 포함한 항생제를 조직 이식 후 3일 동안 사용하였다. 실험 2개월후에 CO2 가스를 흡입하여 희생시키고, 이식 조직 샘플을 수거하였다.

(5) 방법 5에서 rat 과 wide type mouse subcutaneous implantation 이식: rat 과 wide type mouse 를 실험 동물로 선정하였다. 각 실험군마다 10마리를 배정하여 총 Rat 40마리, wide type mouse 40마리를 실험에 사용하였다. 전신 마취된 실험 동물의 등에 4개의 피부 절개를 가한 후 처리된 소심낭 절편 4개를 각각의 절개를 통해 피하에 심고 피부를 봉합하였다.

채취: rat 은 8주, wide type mouse 는 12주 후에 피하에 이식되었던 소심낭 절편을 채취하여 결과를 분석하였다.

4-2 Calcium analysis

적출한 조직을 생리 식염수로 세척하고, 24 시간 동안 90 ℃에서 건조한 후 무게를 측정한다. 다음 5N HCl 용액으로 가수 분해 및 건조 하였다. HITACHI 7070으로 흡광도를 측정함으로써 칼슘과 무기 인산의 양을 결정 하였다.

4-3 in-vivo calcification 결과

(1) 방법 1에서 생체내 석회화를 분석하기 위해 4, 8주 동안 토끼 의 근육 내 조직을 삽입하였다. 4주는 생체내 석회화를 평가하기에 부족하였다[도 11]. Genipin 처리 군 에서 석회화가 거의 되지 않았다(1㎍/㎖/mg 이하) [도 11b]. EDC / NHS 또는 GA 처리군 에서는 space filler 처리 효과로 인한 석회화가 감소 되었으며(p < 0.05), 이 생체내 석화화 양상은 세포 독성 분석법의 결과와 유사했다. GA- PEG 군에는 특히 석회화가 매우 낮은 수치 (0.62±0.1㎍/㎖/mg)를 보였다. von Kossa 염색도 유사한 결과를 보여 주었다 [도 12]. 석회화가 많이 되는 경우에, 조직으로 더 많은 세포의 침윤이 관찰되었다 (hematoxylin and eosin stain) [도 13]. 이 세포들은 CD4 antibody positive (abcam, ab61131; Sigma-Aldrich, A0545) 및 macrophages로 확인되었다 (immunohistochemistry and immunofluorescence) [도 13]. 이 결과들에 따라, 세포 독성에 의한 면역세포들의 침윤이 조직 석회화를 유발함을 알수 있다.

(2) 방법 2에서 rat 의 피하에 조직을 이식하고 2개월 동안 사육하여 칼슘을 측정하였다[표 13] [도 14]. 그 결과 무세포화 및 PEG 처리는 대조군에 비해 석회화 정도에 있어 모두 약간의 감소를 보이지만 통계학적인 유의한 경감을 나타내지는 못하였다.

H&E 염색 후 현미경에서 100배의 배율로 본 결과, 무세포화를 시행하지 않은 대조군에서는 조직이 좀 더 치밀하고 손상이 덜하며 세포 성분이 그대로 관찰되지만 나머지 두 군에서는 세포 성분이 무세포화로 인해 없어지고 조직의 치밀도가 대조군에 비해 좀 떨어져 보이는 점 외에 크게 특이할 만한 점은 관찰되지 않았다[도 15]. 또한 칼슘을 검게 염색시키는 von Kossa 염색으로 한 후 마찬가지로 현미경으로 칼슘의 침착 정도를 관찰하였고, 석회화된 부분이 검게 염색되어 나타나 있음을 확인 할 수 있었다[도 16].

(3) 방법 3에서 토끼의 등과 하지 부위를 서로 비교하였다[도 17]. 일반적으로 무세포화를 하고 난 후보다는 PEG와 α-galactosidase 처치했을 때 석회화의 정도를 낮추는 것으로 나타났다. 그리고 소심낭과 돼지 폐동맥으로 비교해보면 폐동맥보다 소심낭에서 낮은 석회화를 볼 수 있었고, 등과 하지부위에서는 space filler 처리군이 무세포화만 시행한 군보다 현저히 낮게 나타났다.

H&E 염색 후 현미경으로 관찰하였다. Rabbit의 등의 경우에 비해 다리 부분에서 침착 정도가 높게 나타났다. 소심낭과 돼지 폐동맥 두 그룹에서는 심낭 보다는 폐동맥에서 석회화, 섬유세포의 침윤이 전반적으로 심하였다[도 18].

마찬가지로 현미경으로 칼슘의 침착 정도를 von Kossa 염색으로 확인하였다[도 19].

(4) 방법 4에서 현미경 검사 - H & E 염색을 통해 염증 세포의 침윤을 확인했다. 간단한 GA 고정 군에서 많은 양의 염증 세포가 조직에 침투한 모습을 보여주었다. 그러나, 염증 세포의 침윤은 탈세포화 처리 및 Spacefiller 처리 후 감소 하였다. 또한 모든 그룹에 칼슘 침착을 확인하였는데, 돼지 판막에서Von Kossa 염색법에 의해 상대적으로 낮은 칼슘 침착을 관찰하였다 [도 20].

칼슘 분석

방법 4에서 처리 방법에 따른 분석 : GA 고정 군에서 소 심낭의 칼슘 함량 지수가 (93.5±47.6, N=17) (p<0.001), 돼지의 심장 판막 (55.25±17.2 ㎍/mg, N=42)에 비해 높았다. 소심낭 의 인산 함량 지수 (88.4±64.8 ㎍/㎎, N=17)도 돼지의 심장 판막 (52.2±12.6 ㎍/㎎, N=42) (P=0.035)에 비해 높았다. 탈세포화 그룹에서 소심낭의 칼슘 함량 지수(63.3±10.6 ㎍/㎎, N=23)가 돼지의 심장 판막 (44.1±5.8, N=44)에 비해 높았다(p<0.001). 돼지 심장 판막의 인산 함량 지수(37.3±8.6 ㎍/㎎, N=44) 는 소심낭의 인산 함량 지수 (78.1±19.0 ㎍/㎎, N=23)보다 낮게 관찰되었다 (p<0.001).

Spacefiller그룹에서 칼슘 콘텐트 인덱스는 돼지 심장 판막에서(58.5±25.8 ㎍/㎎, N=46) 소심낭 그룹 (71.2±13.3 ㎍/㎎, N=27)에서 보다 낮은 값을 보였다 (p<0.001). 그러나, 인산염 콘텐츠 인덱스는 두 군 (소 심낭 군: 67.4±17.5 ㎍/㎎, N=27, 돼지 심장 판막 그룹: 63.5±34.5 ㎍/㎎, N=46) 사이에 유의 한 차이가 없었다 (p=0.596).

방법 4에서 tissue material에 따른 분석: 소심낭 그룹에서는 단순 GA 고정 그룹(93.5±47.6, n=17) 에서 칼슘 함량 지수가 다른 그룹에 비교하여 가장 높게 관찰되었다(탈세포화 A 그룹: 63.3±10.6, n=23, space filler A 그룹: 72.4±30.9, n=22) (각각 p=0.002, p=0.027). 또한 단순 GA 고정 그룹(88.4±64.8, n=17) 에서 인 함량 지수가 다른 그룹(탈세포화 A 그룹: 78.1±19.0, n=23, space filler A 그룹: 44.8±21.3, n=22) (각각 p=0.396, p=0.001)에 비교하여 가장 높게 관찰되었다. 탈세포화 A 및 B 방법에 따라 분석하였을 때 탈세포화 B 그룹(71.3±13.3, n=27)에서 A 그룹(63.3±10.6, n=23)보다 칼슘 함량 지수가 높게 관찰되었다(p=0.024). 그러나 두 그룹에 spacefiller를 첨가하였을 때 통계학적 차이는 관찰하지 못하였다(74.5±19.8, n=23 versus 72.4±30.9, p=0.741). 탈세포화 B 그룹(67.4±17.5, n=27)은 A 그룹(78.1±19.0, n=23)에 비교하여 낮은 인 함량 지수를 보였다(p=0.043). 그러나 탈세포화 A 그룹(44.8±21.3, n=22) 은 Spacefiller B 그룹(72.5±20.1, n=23) 과 비교하여 통계학적으로 유의하게 높은 인 함량 지수가 관찰되었다(p<0.001).

돼지 판막 그룹에서 분석하였을 때, 탈세포화 A 그룹(44.1±5.8, n=44) 이 다른 그룹(단순GA 그룹: 55.2±17.2, n=42, p=0.006, space filler A 그룹: 58.5±25.8, n=46, p<0.001)과 비교하여 가장 낮은 칼슘 함량 지수를 보였다. 인 함량 지수 또한 탈세포화 A 그룹(37.3±8.6, n=44) 에서 다른 그룹(단순GA 그룹: 52.2±12.6, n=42, p=0.002, space filler A 그룹: 63.5±34.5, n=46, p=0.017) 에 비교하여 가장 낮게 관찰되었다[도 21].

(5) 방법 5에서 칼슘 정량 : rat에서는 PEG를 처리한 조직과 Jeffamine를 처리한 조직의 칼슘 함량이 다른 실험군에 비해 유의하게 낮았다 (p<0.001). wild type mouse 에서는 PEG 를 처리한 조직의 칼슘 함량이 다른 실험군에 비해 유의하게 낮았다 (p<0.001). PEG와 Jeffamine을 비교하면 PEG가 Jeffamine에 비해 유의하게 조직의 칼슘 침착을 줄여주었다 (p=0.001)[도 22][도 23].

방법 5에서 조직 염색 : H&E 염색에서 space filler를 처리한 조직의 염증 세포의 침윤 정도가 적었다. von Kossa 염색에서 space filler를 처리한 조직의 염색 정도가 덜했다 [도 24][도 25].

<실시예 5: space-filler를 첨가한 이종조직에 대한 대동물실험을 이용한 전임상실험의 안전성 및 유효성 평가>

본 실시예에서는 space-filler를 첨가하여 처리한 이종조직을 Nitinol-wire based self-expandable valved-stent에 장착하고, 이 스텐트 판막을 양(sheep)의 정맥(대퇴정맥, 경정맥)을 통해 삽입하여 폐동맥 판막에 위치시켜, 대동물을 이용한 전임상 실험에서 6개월 이상 중기 결과의 안전성 및 유효성 평가를 시행하였다.

5-1. 스텐트 판막의 제작 및 삽입

Nitinol-wire based self-expandable valved-stent를 자체 제작하였다[표 14] [도 26]. 판막엽은 돼지의 심낭을 이용하였으며, 돼지의 심낭을 0.25% sodium dodecyl sulfate와 0.5% TritonX-100를 이용하여 무세포화하고, 면역원성을 감소시키기 위해서 0.1 units/mL alpha-galactosidase처치를 시행하고, 25% polyethylene glycol를 이용한 space filler처리를 시행하고, 0.5 % glutaldehyde fixation을 시행하고, 75% ethanol + 5% octanol을 이용한 solvent 처리를 시행하고, 0.1M glycine을 이용한 무독소화처리를 시행하였다 (방법 6).

대동물실험은 12마리의 양을 이용하였고, 18 Fr. delivery catheter를 이용하여 대퇴정맥이나 경정맥을 통하여 스텐트판막을 삽입하였다 [도 27]. Fluoroscopy [도28A] 와 심초음파를 이용하여 catheter handle과 hook block 제어하여 스텐트 판막을 배치하였다[도 27] [표 14].

Inventory of valved-stent in pulmonic position

Type	D type	M type
	Can be folded in longitudinal axis	No folding in longitudinal axis
Wire thickness	0.008 inch (0.2mm)	0.010 inch (0.25mm)
Delivery system	18Fr	18Fr
Valve wall	Full covered	Partially covered
Diameter x Total length	20 mm x 24 mm 22 mm x 25 mm 24 mm x 28 mm 26 mm x 33 mm	20 mm x 30 mm 22 mm x 33 mm 24 mm x 36 mm 26 mm x 38 mm
Radial force	0.17~0.20 kgf	0.40~0.5 kgf

5-2. space-filler를 첨가한 이종조직에 대한 대동물실험을 이용한 전임상실험의 안전성 및 유효성 결과

방법 6에서 경정맥 폐동맥 스텐트 판막 삽입의 전체 결과가 표15에 기술되어 있다. 양의 체중은 43.9 kg이었다. 12마리의 양에서 성공적으로 스텐트 판막(7마리 양에서 직경 24 mm, 5마리 양에서 직경 26 mm)을 대퇴정맥 (8마리) 및 경정맥(4마리)을 통해 삽입하였다. 8마리의 양은 좋은 위치에 삽입되었으며[도 28B] [도 28C], 2마리의 양은 주폐동맥 위치에 삽입되었고, 2마리의 양은 우심실유출로에 삽입되었다. 삽입직후 시행한 경흉부 도플러 심초음파 결과는 폐동맥폅착이나 역류 없이 좋은 판막기능을 보여주었다.

표 15의 3번째 양 (사망원인은 감염으로 추정)의 부검 소견에서, 스텐트 판막 삽입 후 3개월 후에 우심실유출로의 스텐트 벽의 내면과 주폐동맥의 스텐트 벽의 외면에 내막화가 잘 되어 있었다 [도 29A].

6개월 추적관찰 후에 8마리의 양(스텐트 판막이 6마리에서는 폐동맥판막 좋은 위치에, 1마리는 주폐동맥위치에, 1마리는 우심실유출로에)을 희생하였다. 희생직전 시행한 경흉부 초음파검사에서 5마리의 양에서는 폐동맥판막역류가 없었으며, 2마리의 양에서는 경미한 폐동맥판막역류가 있었으며, 1마리의 양에서는 경도의 폐동맥판막역류가 있었다. 8마리의 양에서 희생직전 시행한 심도자검사에서는 우심실과 주폐동맥사이의 수축기압력차이는 6 ± 3.8 mm Hg (범위: 1~11)였으며, 평균 우심실 수축기 압력은 22.9 ± 3.2 mm Hg (범위: 18~26)였다.

희생시에, 스텐트 판막이 좋은 위치에 있는 6마리의 양 중에서 5마리의 양에서는 삽입한 판막의 모양과 기능이 잘 유지되어 있었다. 삽입 6개월 후, 좋은 폐동맥판막 위치에서 기능하는 심초음파소견과, 판막모양이 잘 보존되어 있는 육안소견을 보였다[도 29B] [도 29C].

우심실유출로에 삽입된 2마리의 양과 주폐동맥에 삽입된 2마리의 양에서는 판막엽이 스텐트 벽에 붙어 판막의 기능을 하지 않고 있었다.

통상적인 희생 후 시행한 조직검사에서 적출된 모든 판막엽에서 collagen구조가 잘 유지되고 (Hematoxylin & Eosin와 Masson’s Trichrome staining) [도 30A] [도 30B), 내막증식 및 석회화가 없었다.

10개월 이상 삽입된 표15의 11번째 양의 이종 판막에서, 칼슘 정량 수치는 낮았으며 (3.92 ug/mg) 6개월 삽입한 이종판막의 칼슘 정량 수치와 유사하였다 [표15] [도 30C].

경정맥 폐동맥 판막 스텐트 삽입술의 전체 결과.

*From the final transthoracic echocardiography, †From cardiac catheterization at the time of sacrification, ‡From autopsy findings.

FV: femoral vein, JV: jugular vein, PR: pulmonary regurgitation, PA: pulmonary artery, RVOT: right ventricular outflow tract, NA: not applicable, Ca: calcium

Claims (14)

1. (A-1) 인간을 제외한 포유동물로부터 분리된 생체 조직을 SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 TritonX-100를 이용하여 무세포화(decellularization)시키는 단계;
   (A-2) 상기 무세포화된 생체 조직에 알파-갈락토시다아제를 처리하는 단계;
   (B) 상기 무세포화된 생체 조직에 25 내지 50% 폴리에틸렌글리콜을 처리하는 단계;
   (C) 상기 폴리에틸렌글리콜이 처리된 생체조직을 고정화 (fixation)시키는 단계; 및
   (D) 에탄올 및 옥탄올로 용매처리하는 단계
   (E) 용매처리된 고정 생체 조직의 독성을 제거하여 인공판막을 얻는 단계;
   (F) 스텐트에 상기 인공판막을 장착하는 단계,
   를 포함하는, 인간 및 대동물 이종 이식용 스텐트 판막의 제조 방법으로,
   상기 스텐트 판막은 콜라겐 구조를 유지하고, 내막증식 및 석회화를 억제하는 것을 특징으로 하는 인간 및 대동물 이종 이식용 스텐트 판막의 제조 방법.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 생체조직은 심낭, 심장 판막, 경막 및 혈관으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 인간 및 대동물 이종 이식용 스텐트 판막의 제조 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 인간을 제외한 포유동물은 소 또는 돼지인, 이종 이식용 스텐트 판막의 제조 방법.
5. 삭제
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 생체 조직은 소 또는 돼지의 심낭이며, 상기 25~50%의 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 실온에서 12시간 내지 36시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 이종 이식용 스텐트 판막의 제조 방법.
7. 삭제
8. 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (C)의 고정화는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 제니핀(Genipin) 및 EDC/NHS (1-(3-dimethyl aminopropyl)-3-ethyl carbodiimide / Nhydroxysuccinimide)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 화합물을 포함하는 고정액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 이종 이식용 스텐트 판막의 제조 방법.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 알파-갈락토시다아제는 0.01~1.0U/ml인, 이종 이식용 스텐트 판막의 제조 방법.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 (E) 단계의 독성 제거는 L-라이신(L-lysine), 글리신(glycine), 키토산(chitosan), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 헤파린(heparin), 호모시스테인산(homocysteic acid), 소듐 보로하이드라이드 (sodium borohydride) 및 소듐 비설페이트(sodium bisulfate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물을 처리하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 이종 이식용 스텐트 판막의 제조 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 독성 제거는 화합물을 4 내지 37 ℃에서 12~48시간 동안 처리하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 이종 이식용 스텐트 판막의 제조 방법.
12. 청구항 1에 있어서,
    상기 생체 조직이 돼지의 심장판막인 경우, 각 단계가
    (A-1) 0.25 % 의 SDS 및 0.5 % TritonX-100를 이용하여 돼지의 심장판막을 무세포화하는 단계;
    (A-2) 0.1 units/mL의 알파-갈락토시다아제를 처리하는 단계;
    (B) 25 % 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 처리하는 단계;
    (C) 0.5 % 글루탈알데하이드로 고정화 하는 단계;
    (D) 75 % 에탄올 및 5 % 옥탄올로 용매 처리하는 단계; 및
    (E) 0.1M의 글리신으로 무독소화 하는 단계인 것을 특징으로 하는, 인간 및 대동물 이종이식용 스텐트 판막의 제조방법.
13. 청구항 1의 방법에 의하여 제조되는 인간 및 대동물 이종이식용 스텐트 판막.
    
    
14. 삭제

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