JP2022134125A - 免疫適合性組織骨格及びその形成方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】レシピエントに免疫適合性である骨格を形成する方法に関する。【解決手段】脱細胞化された組織マトリクスを、レシピエントに免疫適合性である真核細胞とインビトロで接触させ、当該脱細胞化された組織マトリクスの外表面を覆い、免疫適合性である骨格を形成する。当該脱細胞化された組織はレシピエントに対して異種の組織から形成される。当該脱細胞化された組織マトリクスは、再細胞化する前に、α－ガラクトシダーゼと接触させることができる。このプロセスは、数週間でなく、数日で完了することができる。免疫適合性である骨格は、グルタルアルデヒド等の固定剤で固定して、常温保存可能な生成物を形成することができる。【選択図】 図１
Description
本発明は、異種組織を脱細胞化する方法、及び免疫適合性である骨格を形成する方法に関し、特に、組織工学的生体人工心臓弁の置換に関する。
弁膜性心疾患（ＶＨＤ）は比較的一般的な疾患で、世界人口の２．５％、７５歳以上では最大１３．３％がＶＨＤであると推定される。毎年、世界中で約２５０，０００件の心臓弁置換術が実施されており、ＶＨＤの罹患率は増加している。２０５０年には、バルブ交換回数は年間８５万回に達すると予測されている。大動脈弁狭窄症と僧帽弁閉鎖不全症は、現在の弁膜症患者の最大７５％を占める。歴史的には、過去に化膿連鎖球菌に感染したことによるリウマチ性心疾患が、弁膜症の大部分を占めていた。しかし、抗生物質の使用により、先進国ではこの原因が大幅に減少し、退行性疾患に置き換わった。ＶＨＤ発症の危険因子としては、年齢、男性、高血圧、喫煙、脂質異常症、冠動脈疾患などが挙げられる。ＣＯＶＩＤ－１９が心臓障害を起こし、その結果、ＶＨＤの発生が増加する可能性があることを示唆する証拠が増えている。
現在、ＶＨＤの治療に有効な治療方法は存在しない。重度の症候性ＶＨＤに対する唯一の決定的な管理は、患部の弁の外科的修復又は置換である。外科的手技及び技術が向上するにつれて、弁修復手術はますます一般的になっているが、修復不能な弁には交換が必要である。現在用いられている心臓弁置換術には、生体弁又は組織弁、機械弁、ホモグラフト（同種）弁の３種類がある。生体弁は、ウシ心膜組織やブタ心臓弁が最も一般的である。生体弁の利点としては、本来の心臓弁に近い特性があり、機械弁と比較して出血率が低く、低侵襲な経カテーテル大動脈弁置換術（ＴＡＶＲ）で移植することができることがあげられる。生体弁の限界は、主に耐久性である。生体弁は、弁のレシピエントからの異種免疫応答のため、経時的に劣化する。故障の比率は様々で、高齢患者では平均１０～２０年後に発生するが、若年患者では有意に短くなる場合がある。対照的に、機械弁は生体弁よりも耐久性が高いが、血栓形成性が高く、血栓塞栓症予防のために生涯にわたる抗凝固療法が必要であり、有害な出血イベントのリスクも高まる。現在の選択肢はどれも理想的とはいえず、それぞれの欠点は重大である。抗凝固療法による再手術及び合併症は、ＶＨＤ患者のＱＯＬに重大な影響を及ぼすだけでなく、世界中の医療制度の大きな経済的負担となっている。生体弁は、ウシ又はブタの組織から作られ、弁のレシピエントからの炎症性免疫応答のために、経時的に構造的な劣化が起こりやすい。故障率は様々であるが、ある集団では５年時点で５０％に達することもあり、特に若年患者ではこの傾向が顕著である。ホモグラフトは死体ドナーから採取した弁である。これらの弁は一般に、異種弁（動物組織から作製された弁）よりも耐久性が向上しているが、これらの弁は極めてまれであり、心臓移植ほど一般的ではない。ホモグラフトは入手可能性が限られているため、現在および将来の心臓弁置換の需要に対応する現実的な選択肢ではない。
一実施形態では、レシピエントに免疫適合性である骨格を形成する方法が開示される。脱細胞化された組織マトリクスを、インビトロで、レシピエントに免疫適合性である真核細胞に接触させて、当該脱細胞化された組織マトリクスの外面を覆い、免疫適合性である骨格を形成する。当該脱細胞化された組織は、レシピエントに対して異種である組織から形成される。
様々な実施形態では、以下の特徴のうちの１以上を含んでよい：真核細胞は、さらに、多能性細胞を含む；多能性細胞は、間葉系幹細胞をさらに含む；脱細胞化された組織マトリクスは、さらに、脱細胞化細胞外マトリクスを含む；レシピエントに免疫適合性のある真核細胞は、さらに、レシピエントに対して同種又は自己の細胞を含む；前記脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化する前に、さらに、前記脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼと接触させる；さらに、異種の細胞培養骨格を固定剤で固定する；固定剤は、グルタルアルデヒドである；前記脱細胞化された組織マトリクスは、さらに、心臓弁組織を含む；レシピエントはヒトであり、かつ、組織は哺乳類組織である；組織は、ブタ又はウシの組織である；前記脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化する前に、レシピエントに対して異種である組織を、脱細胞化剤を含む１つ以上の溶液で脱細胞化し、脱細胞化された組織マトリクスを生成すること、及び前記脱細胞化された組織マトリクスを洗浄し、前記脱細胞化剤を除去すること、により、前記脱細胞化された組織マトリクスを得ること；かつ、前記脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化する前に、レシピエントに対して異種である組織をアニオン性界面活性剤溶液に浸すこと、前記組織からアニオン性界面活性剤溶液を除去すること、前記組織を非イオン性界面活性剤溶液に浸すこと、前記組織から非イオン性界面活性剤溶液を除去すること、前記組織を１つ以上の洗浄液ですすぎ、脱細胞化された組織マトリクスを形成すること、かつ、前記脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼと接触させること、により、脱細胞化された組織マトリクスを得ることである。
他の実施形態ではレシピエントに対して異種である組織を脱細胞化する方法が開示される。当該組織をアニオン性界面活性剤溶液に浸す。前記組織からアニオン性界面活性剤溶液を除去する。前記組織を非イオン性界面活性剤溶液に浸す。前記組織から非イオン性界面活性剤溶液を除去する。前記組織を１つ以上の洗浄液ですすぎ、脱細胞化された組織マトリクスを形成する。前記脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼと接触させる。
様々な実施形態では、以下のうちの１つ以上を含むことができる：１つ以上のすすぎ液は、緩衝液、二重蒸留水、塩化ナトリウム、ヌクレアーゼ及び抗生物質を集合的に含む；さらに、脱細胞化された組織をレシピエントに免疫適合性である真核細胞と接触させることによって、脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化して、前記脱細胞化された組織マトリクスを覆う免疫適合性である細胞の層を形成し、免疫適合性の骨格を形成する；真核細胞はさらに多能性細胞を含む；多能性細胞は、さらに間葉系幹細胞を含む；レシピエントに免疫適合性の真核細胞は、前記レシピエントと同種又は自己の細胞を含む；免疫適合性である骨格は、固定剤で固定される；固定剤はグルタルアルデヒドである；組織は、心臓弁組織を含む；レシピエントは、ヒトであり、かつ、組織は哺乳動物組織である；組織は、ブタ又はウシの組織である；アニオン性界面活性剤溶液に浸す工程は、組織をアニオン性界面活性剤溶液に４回浸漬し、かつ、各浸漬後に前記組織から前記アニオン性界面活性剤溶液を除去することを含み；４回の浸漬のうちの１回は、振動により行われる；４回の浸漬のうちの最終回の時間は、１６～２４時間である；、非イオン性界面活性剤溶液に浸す工程では、組織を非イオン性界面活性剤溶液に５回浸漬し、かつ、各浸漬後に、前記組織から前記非イオン性界面活性剤を除去することを含む；５回の浸漬のうちの４回は、振動により行われる；５回の浸漬のうちの最終回の時間は、１６～２４時間である；、この方法は４日未満で完了する；アニオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムである；非イオン性界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００である；ヌクレアーゼはデオキシリボヌクレアーゼである；組織は、新鮮な組織、死体の組織、固定された組織又は固定されていない組織を含む；すすぐ工程の後に、脱細胞化された組織マトリクスは、前記脱細胞化された組織マトリクスが容易に再細胞化されうるように、アニオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤を実質的に含まない；かつ、組織を１つ以上の溶液ですすぐ工程は、組織をリン酸緩衝生理食塩水と二重蒸留水を交互に用いてすすぐこと、前記組織を塩化ナトリウム溶液で洗浄すること、前記組織をリン酸緩衝生理食塩水と二重蒸留水を交互に用いてすすぐこと、前記組織をヌクレアーゼと塩化マグネシウムの溶液と接触させること、前記組織を二重蒸留水ですすぐこと、前記組織をリン酸緩衝生理食塩水と抗生物質の溶液に接触させること、かつ、前記組織を緩衝液及び抗生物質溶液に保存すること、を含む。
他の実施形態では、レシピエントに免疫適合性である、固定された真核細胞で覆われ、かつ、常温保存可能な生成物を形成する脱細胞化された異種細胞組織を含む、免疫適合性である骨格が開示される。
様々な実施形態では、真核細胞は、脱細胞化された組織マトリクスの外表面の少なくとも５０％を覆い、真核細胞は、前記脱細胞化された組織マトリクスの外表面の少なくとも８０％を覆い、真核細胞は、さらに、多能性細胞を含み、多能性細胞は、さらに、間葉系幹細胞を含み、真核細胞は、さらに、レシピエントと同種又は自己の細胞を含み、脱細胞化された異種組織は、さらに、脱細胞化された組織マトリクスを含み、前記脱細胞化された組織マトリクスは、未変性の細胞外マトリクスであり、脱細胞化された異種組織は、さらに、異種心臓弁組織を含み、レシピエントはヒトであり、かつ、脱細胞化された異種組織は脱細胞化された哺乳動物組織であり、脱細胞化された異種組織は、脱細胞化されたブタ又はウシの組織であり、真核細胞は、脱細胞化された異種組織上に単層を形成する。
上記要約は、本開示の主題の各潜在的実施形態又はあらゆる態様の要約を意図するものではない。
方法のこれら及び他の態様は、請求項に記載される。
以下に、実施形態を、図を参照して説明するが、図中、同様の参照文字は、例として、同様の要素を示す。
一実施形態では、最初の多段階の、溶液系で、異種組織に存在する表面マーカーを除去しうる、脱細胞化がある。免疫適合性ヒト間葉系幹細胞等のレシピエントと免疫適合性のある細胞を、脱細胞化されたマトリクスの再細胞化に用いる。これにより、免疫系が異物として認識しない、心臓弁等の組織で処理された免疫適合性である骨格が生成され、炎症性免疫応答が軽減する結果、脱細胞化した組織マトリクスから、生体弁等の免疫適合性である骨格の劣化が軽減され、耐久性が高まる。
組織工学的心臓弁の実施形態は、現在の心臓弁置換の選択肢の特定の制限に対処することができる。組織工学には様々なアプローチがあるが、一般的な考え方は、レシピエントから炎症性免疫応答を誘導すると考えられている異種抗原を除去又は密封することである。これにより、経年劣化の速度が低下し、組織弁の耐久性が高まる。抗凝固療法が必要なく、費用対効果が高く、貯蔵安定性があり、比較的入手しやすい耐久性が高められた組織弁は、弁置換の選択肢の現在の限界に対処するであろう。
図１に示す実施形態では、レシピエントに免疫適合性である骨格を形成する方法１００がある。１０２では、このプロセスは、脱細胞化された組織マトリクスから始まる。当該マトリクスを１０４にて、インビトロでレシピエントに免疫適合性の真核細胞と接触させて、脱細胞化された組織マトリクスの外表面に付着させて覆い、１０６にて免疫適合性である骨格を形成する。
一実施形態では、用語「免疫適合性である骨格細胞」又は「免疫適合性である細胞」は、レシピエントの血液に曝露された場合の炎症性サイトカイン放出が、同じ条件下でレシピエントに対する自己組織又は細胞において予測される炎症性サイトカイン放出に対して１０％以内であり、同量のインビトロでのレシピエントの血液に対する最大サイトカイン放出の比率として表されることを意味する。相同細胞及び自己（原）細胞は、免疫適合性である細胞であると考えられる。
好ましい実施形態では、組織は心臓弁組織であってよい。レシピエントはヒトであってよく、脱細胞化された組織マトリクスを形成する組織は、ブタ又はウシ組織等の哺乳動物組織であってよい。組織は、新鮮な組織、死体組織、固定された組織又は固定されていない組織のいずれであってよい。真核細胞は、脱細胞化された組織マトリクスを再形成することができるいかなる細胞であってよく、例えば、多能性、全能性又は多能性細胞であってよい。真核細胞は、内皮細胞であってよい。真核細胞は間葉系幹細胞であってよい。真核細胞は、レシピエントに対して同種異系細胞又は自己細胞であってよい。真核細胞は異種細胞であってよい。真核細胞は、同系（同種）細胞であってよい。例えば、真核細胞は、その細胞がレシピエントと免疫適合性である限り、霊長類細胞又はヒト受容体に近接した他の進化上の隣接細胞であってよい。真核細胞は、脱細胞化された組織マトリクスに密に接着する細胞であってよい。脱細胞化された組織マトリクスは、脱細胞化された細胞外マトリクスであってよい。脱細胞化された組織は、ブタ心臓弁及びウシ心臓弁を含むいかなる異種組織から最初に形成されてよい。間葉系幹細胞等の真核細胞は、当該分野で公知の技術又は本明細書に記載の技術を用いて、患者又は他の供給源から採取することができる。
図１に記載した再細胞化プロセスはまた、未変性若しくは合成組織から形成される組織、又は合成マトリクス又は骨格上で用いられてよい。組織は、レシピエントに対して異種、同種、又は自己由来であってよい。組織は、最初は、合成組織、組換え組織又は人工組織から形成することができる。組織マトリクスは、未変性又は合成又は人工のマトリクス又は骨格であってよい。脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化する前に、脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼと接触させることができる。異種骨格は固定剤で固定することができる。
脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化する前に、脱細胞化された組織マトリクスを様々な方法によって得ることができる。例えば、レシピエントに対して異種である組織を、脱細胞化剤を含む１つ以上の溶液で脱細胞化して、脱細胞化された組織マトリクスを生成することができる。脱細胞化された組織マトリクスは、１つ以上の溶液の各々と接触した後に洗浄されて、脱細胞化剤及び細胞残屑を除去することができる。レシピエントに対して異種である組織とは、その通常の意味である。
実施形態では、脱細胞化された組織マトリクスは、レシピエントに対して異種の組織をアニオン性界面活性剤溶液に浸すこと、前記組織からアニオン性界面活性剤溶液を除去すること、前記組織を非イオン性界面活性剤溶液に浸すことと、前記組織から非イオン性界面活性剤溶液を除去すること、前記組織を１つ以上の洗浄液ですすぎ、脱細胞化された組織マトリクスを形成すること、かつ、前記脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼと接触させること、によって得ることができる。
図２に示す実施形態では、レシピエントに対して異種である組織を脱細胞化する方法２００が開示されている。例えば、図１に開示された脱細胞化された組織マトリクスは、図２に開示された方法を用いて形成されることができる。２０２において、組織は、アニオン性界面活性剤溶液に浸漬される。アニオン性界面活性剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であってよい。ＳＤＳは０．７５％～１．５％のＳＤＳ、又は０．７５％～３％のＳＤＳであってよい。当該組織をアニオン性界面活性剤溶液に４回浸漬し、かつ、各浸漬後に前記組織から前記アニオン性界面活性剤溶液を除去することができる。４回の浸漬のうちの１回は、振動により行うことができる。４回の浸漬のうちの最終回の時間は、１６～２４時間であってよく、約２０時間であってよい。２０４では、アニオン性界面活性剤溶液は、当該組織から除去される。
２０６では、組織を非イオン性界面活性剤溶液に浸漬する。非イオン性界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００であってよい。当該溶液は０．７５％～１．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００であってよい。当該溶液は０．７５％～３％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００であってよい。組織を非イオン性界面活性剤溶液に５回浸漬し、各浸漬ごとに前記組織から非イオン性界面活性剤を除去することができる。５回の浸漬のうち４回は、振動により行うことができる。４回の浸漬のうちの最終回の時間は、１６～２４時間であってよく、約２０時間であってよい。２０８では、非イオン性界面活性剤溶液は当該組織から除去される。
いくつかの界面活性剤及び他の溶液は、当該技術分野で公知であり、これまでに脱細胞化プロセスで報告されている。これらには、限定されるものではないが、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００（非イオン性）、ドデシル硫酸ナトリウム（イオン性）、トリプシン、低張食塩溶液、ヌクレアーゼ溶液、高張塩溶液、エタノール、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ＢＲＩＪ（商標）－３５、ラウレス硫酸ナトリウム、ＴＷＥＥＮ（商標） ２０、ＬＵＢＲＯＬ－ＰＸ、及びポリエチレンラウリルエーテルがあげられる。本発明者らは、これらの部分又は全部が、上記洗剤工程への添加剤として、又は単独で、以前に作用したように、脱細胞化プロトコルにおける洗剤として有効でありうることを予測する。
２１０では、組織を１つ以上のすすぎ液ですすぎ、脱細胞化された組織マトリクスを形成する。１つ以上の洗浄液としては、集合的に、緩衝液、二重蒸留水、塩化ナトリウム、ヌクレアーゼ及び抗生物質があげられうる。ヌクレアーゼはデオキシリボヌクレアーゼであってよい。組織をすすぐこととしては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と二重蒸留水（ｄｄＨ２０）を交互に用いて組織をすすぐこと、塩化ナトリウム溶液で組織を洗浄すること、リン酸緩衝生理食塩水と二重蒸留水で組織をすすぐこと、組織をヌクレアーゼと塩化マグネシウム溶液と接触させること、組織を二重蒸留水ですすぐこと、組織をリン酸緩衝生理食塩水と抗生物質の溶液と接触させること、及び組織を緩衝液と抗生物質溶液中に保存することがあげられる。塩化ナトリウム溶液は、０．５Ｍ～２Ｍ塩化ナトリウム、又は０．５Ｍ～３Ｍ塩化ナトリウムであってよい。ヌクレアーゼ及び塩化マグネシウム溶液は、２．５ｍＭ～５．５ｍＭ塩化マグネシウムであってよく、又は１．５ｍＭ～６．５ｍＭ塩化マグネシウムであってよい。
すすぎ後、脱細胞化された組織マトリクスが容易に再細胞化されるように、実質的に界面活性剤、例えば、陰イオン性及び非イオン性界面活性剤を含まなくてよい。２１２では、脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼと接触させる。α－ガラクトシダーゼとの接触により、脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼを含むＰＢＳ中に浸漬することによって達成されることができる。再細胞化プロセスが完了して免疫適合性である骨格が形成された後、免疫適合性である骨格を固定して、免疫適合性である骨格を保存し、保存安定性が得られうる。免疫適合性である骨格は、光酸化、熱固定、アルデヒドを含む架橋固定剤、及びアルコールを含む沈殿固定剤を含む、公知の技術及び固定剤を用いて固定することができる。例えば、固定剤はグルタルアルデヒドであってよい。
方法２００は、４日未満で完了することができる。工程２０２、２０４、２０６及び２０８は、３日未満で完了することができる。
本明細書で開示された方法は、血管組織、腸下粘膜、血管壁、及び間葉由来組織を含むが、これらに限定されない、細胞外マトリクスを有するいかなる組織と共に用いることができる。高密度の組織の接触時間は、より長い場合がある。
アニオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤は、脱細胞化特性があることが当技術分野で公知であるいかなるアニオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤であってよい。すすぎ液は、細胞の破片及び洗剤を骨格から除去することが公知である、いかなるすすぎ液又はすすぎ液の組み合わせであってよい。
脱細胞化プロセスの後、脱細胞化された組織マトリクスは、例えば図１の実施形態に示されたプロセスを用いて、脱細胞化された組織マトリクスをレシピエントに免疫適合性である真核細胞と接触させることにより、真核細胞が脱細胞化された組織マトリクスに接着し、増殖し、及び／又は、脱細胞化された組織マトリクス内及び／又は上で分化する条件下で再細胞化されて、脱細胞化された組織マトリクスを免疫適合性である細胞で覆って、免疫適合性である骨格を形成することができる。脱細胞化された組織マトリクスは、好ましくは、真核細胞が脱細胞化された組織マトリクスに接着し、これを覆い、外表面に残存する異種抗原又は界面活性剤を十分に覆い、免疫適合性である骨格を生成するのに十分な時間、真核細胞と接触される。覆うこと（カバー）は、脱細胞化された組織マトリクスに接着した免疫適合性である細胞が、脱細胞化された組織マトリクスの外表面を十分に覆い、免疫適合性である骨格を形成することを意味する。マスキングは、脱細胞化された組織マトリクス上の抗原が免疫系によって検出されないように、免疫系の成分による脱細胞化された組織マトリクスへのアクセスを阻害することができる。被覆は、脱細胞化された組織マトリクスの外表面の部分的又は完全に被覆することができる。真核細胞は、脱細胞化された組織マトリクスの外表面の５０％以上を覆うことができる。真核細胞は、好ましくは、脱細胞化された組織マトリクスの外表面の８０％以上を覆う。免疫適合性である骨格はレシピエントの血液に曝露された場合に、レシピエントに自己組織に対して予測される炎症性サイトカイン放出の１０％以内であるのと同じ条件下で、同じ量のレシピエントの血液に対して生体外で最大炎症誘発性サイトカインを放出する比率として表される。
脱細胞化された組織マトリクスを覆う真核細胞は、細胞の単層又は薄層を形成することができる。薄層は、最初の再細胞化用に厚さ１～５の細胞層の範囲内であってよい。接触は、インビトロで行うことができる。接触は、真核細胞と適合性の培養培地及び脱細胞化された組織マトリクスの存在下で行うことで、再細胞化プロセスを助けることができる。培地は、真核細胞の脱細胞化された組織マトリクスへの接着を支持又は増強する因子を含んでよく、真核細胞の成長及び分裂を支持又は促進する因子を含んでよい。因子の例としては、再細胞化前の脱細胞化された組織マトリクスへのトリプシンの添加、培養培地へのＶＥＧＦ又は線維芽細胞誘導因子１４の添加、再細胞化前の脱細胞化された組織マトリクスへの前駆細胞特異的抗体（例えば、ＣＤ３４）の連結、及び酢酸及びアルギニルグリシルアスパラギン酸ポリペプチドによる脱細胞化された組織マトリクスの処理があげられるが、これらに限定されない。
脱細胞化プロセスの後、再細胞化プロセスの前に、脱細胞化された組織マトリクスを、例えば２４時間培養培地に浸漬することができる。
免疫適合性である骨格は、常温保存できる、滅菌された骨格を形成するように固定することができる、レシピエントに移植又は移植する前に保存又は出荷することができる。常温保存可能な骨格は、分解せず、最長５年又はそれ以上の期間、室温で長期間維持することができる。免疫適合性である骨格を固定することはまた、レシピエントへの移植後に大動脈圧に曝された場合に、真核細胞が、脱細胞化された組織マトリクスから脱落する可能性を低下させうる。
免疫適合性である骨格は、さらに、自己又は同種の血液に曝露されてよい。免疫適合性である骨格は、インビボでの移植又は移植に用いられうる。
ある実施実施形態では、多段階の脱細胞化プロセスは、組織骨格から異種マーカーを除去するのに効果がある。実験により、ヒトモデルにおけるウシ心膜を有する組織骨格、ヒトモデルにおけるブタ細胞外マトリクス、ラットモデルにおけるモルモット大動脈弁から異種マーカーが除去されたことが確認された。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ヒトモデルにおけるブタ大動脈弁尖、ヒトモデルにおけるヒト心膜を用いて同様の結果を確認することができると予測している。
ある実施実施形態では、脱細胞化された組織マトリクスは、炎症性免疫応答の低減に有効である。実験により、ヒトモデルではウシ心膜、ヒトモデルにおけるウシ心膜、ヒトモデルにおけるブタ細胞外マトリクス、及びラットモデルにおけるモルモット大動脈弁で炎症性免疫応答の低下が確認された。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ヒトモデルにおけるブタ大動脈弁尖、ヒトモデルにおけるヒト心膜を用いて同様の結果を確認することができると予測している。
ある実施実施形態では、α－ガラクトースを切断する工程は、α－ガラクトース抗原を除去するのに有効であり、脱細胞化された組織に対する免疫応答をさらに低下させることが予測される。
ある実施実施形態では、胸骨骨髄から間葉系幹細胞を採取して培養することは、脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化するのに十分な幹細胞を産生する効果が証明されている。
ある実施実施形態では、再細胞化は、脱細胞化された組織マトリクスの再細胞化において有効であることが証明されている。実験により、ウシ心膜、ブタ大動脈弁尖、モルモット大動脈弁、未変性のブタ大動脈弁尖及び肺動脈弁において、脱細胞化された組織マトリクスの再細胞化における効果が確認された。
ある実施実施形態では、ある実施実施形態では、異種組織から形成された脱細胞化された組織マトリクスの再細胞化の方法は、さらに、異種組織から形成された脱細胞化された組織マトリクスに対する炎症性免疫応答を、自己の対照組織と同様のレベルまで低下させる効果がある。この効果は、ヒトモデルにおけるウシ心膜、ヒトモデルにおけるブタ細胞外マトリクス、ラットモデルにおけるモルモット大動脈弁で確認されている。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ヒトモデルにおけるブタ大動脈弁尖、ヒトモデルにおけるヒト心膜を用いて同様の結果を確認することができると予測している。
いくつかの実施形態では、脱細胞化及び再細胞化の方法は、心臓弁材料に用いられる免疫適合性である骨格に対する炎症性免疫応答を低減させて、これにより、免疫適合性である骨格から作られた生体弁の生体人工心臓弁の耐久性が高まり、構造弁の劣化速度が低減する。
ある実施形態では、本方法は、ブタ心臓弁置換、ウシ心臓弁置換、及びトランスカテーテル心臓弁置換用に効果があり、適用可能であることが実証されている。
本方法のいくつかの実施形態は、他の組織工学的心臓弁と比較した場合、比較的費用対効果が高く、世界中の医療提供者による実現可能な大量生産及び利用が可能となる。
本発明者らは、開示された組織工学的心臓弁の費用対効果及び利点が、弁の変性による再手術及び抗凝固剤使用による合併症の低減を考慮すると、患者の生活の質及び生存を改善し、医療システムの長期的な費用を削減すると予測する。
ある実施実施形態では、免疫適合性である骨格は、固定が起こるであろう脱細胞化及び再細胞化プロセスの後に、保存安定性がある。
本明細書中に開示されるような免疫適合性である骨格を形成する方法の例示的な実施形態を、以下に記載する。例示的な実施形態における、１時間に設定されたインキュベーション時間は、３０分～２時間の範囲であってよい。インキュベーション時間は、溶液の濃度を変えることにより、３０分～２時間以外であってよい。
実施例
脱細胞化
第１日目－ 組織をペトリ皿に入れ、組織を覆うのに十分なＰＢＳで洗浄し、吸引した。組織を完全に覆うのに十分なＳＤＳを添加し、皿を室温で１時間、少なくとも３０回／分で振動させた。組織を吸引してＳＤＳを除去した。新鮮なＳＤＳを添加し、ＳＤＳ洗浄を２回繰り返し、最後のＳＤＳ洗浄を一晩放置した。
第２日目－ ＳＤＳ溶液を吸引し、組織を覆うのに十分な１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００に交換し、前回と同じ設定で最低１時間振動させた。これを３回繰り返した。Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００を吸引し、再度添加し、一晩放置した。
第３日目－ 組織を２５ｍＬのＰＢＳで２回リンスし、洗剤を洗い流すために各洗浄後に吸引した。組織を２５ｍＬのオートクレーブ済二重蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）で８回すすぎ、残った界面活性剤を洗い流した。８回目の洗浄後に、泡があり、界面活性剤が残留する場合、気泡が消失するまで組織をすすぎ、さらに２回洗浄した。その後、液体を吸引した。組織を覆うのに十分な量のＰＢＳ中の１Ｍ ＮａＣｌ溶液を添加し、組織を、少なくとも１時間、最低３０ＲＰＭで、室温で振動子上に置いた。その後、組織を覆うのに十分な量のＰＢＳで組織をすすぎ、吸引してＰＢＳを除去した。その後、組織を覆うのに十分なｄｄＨ２Ｏで組織を２回リンスし、吸引してｄｄＨ２Ｏを除去した。組織を覆うのに十分な量のデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）＋ＭｇＣｌ２溶液を加え、組織を少なくとも１時間、少なくとも２５ＲＰＭで３６～３９℃の加熱震盪器に入れた。その後、ＤＮａｓｅ溶液を吸引した。その後、組織を覆うのに十分なＤＤＨ２Ｏで組織を２回リンスし、各洗浄後に吸引した。次に、組織を覆うのに十分な量のＰＢＳ及び抗生物質溶液で組織をすすぎ、細菌を除去した。組織を室温、３０ＲＰＭで３０～６０分間振動子上に置き、ＰＢＳ及び抗生物質溶液を吸引した。ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）及び抗生物質溶液を調製した。組織をプラスチックチューブに入れ、十分な量のＨＢＳＳ及び抗生物質溶液を添加した。その後、再細胞化工程まで組織を４℃で保存した。
この段階以降のいかなる時点で、αガラクトースは、脱細胞化した組織をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに１００ユニット／Ｌ（７５～２００ユニット／Ｌ）で溶解したインゲン豆αガラクトシダーゼに、回転子上で２～６℃で２４時間浸漬することにより、場合によっては、切断することができる。２４時間後、組織をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳと抗生物質に移して保存する。
再細胞化
幹細胞培養：患者から幹細胞を採取する際に、２つの方法を用いた。１つ目は、心臓手術のために胸骨切開を行った患者から胸骨血を採取する手法である。胸骨切開を行った後、０．１～０．５ｍＬの胸骨血を吸引し、直ちに採取して処理に供する。７５ｍＬ Ｔ２５プラスチック製細胞培養平板に１５ｍＬの細胞培養用培地を入れ、３７℃で培養する。その後、血液を培地に直接注入する。その後、フラスコを５．０％ ＣＯ２で３７℃のインキュベーターに入れる。翌日、培地を吸引し、平板を１５ｍＬのＰＢＳ で洗浄する。その後、ＰＢＳを吸引し、１５ｍＬの培地をフラスコに添加する。その後、３日ごとに培地を交換し、最適な増殖条件を得る。フラスコが１００％コンフルエンスに達したら、細胞をフラスコから取り出し、複数のフラスコに分割して、より多くの細胞を増殖させることができる。
２つ目の方法は腸骨稜から血液を採取する方法である。腸骨穿刺を行い（外科的処置は必要ない）、骨髄を吸引する。その後、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）溶液を用いて血液をその成分に分離する。血液を等量のダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ）培地で希釈する。その後、血液及び培養培地混合物２０ｍＬをＦｉｃｏｌｌ（登録商標）１５ｍＬの上に混合しないように重ねる。その後、試料を遠心分離機に入れ、４０分間遠心する。完了後、バフィーコートを除去し、上記の胸骨全血と同様に直接平板培養する。培地交換の間隔とプロトコルは、上記と同様である。
十分な数の細胞が培養されると、培養平板から取り出す。再細胞化する前に、脱細胞化された弁又は弁材料を２４時間培養液に移す。コンフルエントになった平板をインキュベーターから取り出し、平板を覆うのに十分な量のＰＢＳで洗浄する。その後、ＰＢＳを除去する。各平板にＴｒｙｐＬＥ（登録商標）１０ｘを１～３ｍｍずつ平板全体を覆うように加え、付着した間葉系幹細胞を平板から浮き上がらせる。本発明者らは、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）１ｘ～１０ｘを用いうると予測する。その後、平板をインキュベーターに戻し、光学顕微鏡で細胞が平板から浮き上がったことが確認されるまで維持する。細胞が浮き上がったら、同量のＤＭＥＭ培養液を平板に加える。細胞を含む溶液を回収し、５０ｍＬコニカルチューブに入れる。その後、試験管を３００～５００ｇで１０～２０分間、２～８℃で遠心分離する。遠心分離が完了すると、チューブの底に細胞が目に見えるペレット状になっているはずである。その後、細胞を乱すことなく、できるだけペレットの近くまで溶液を吸引する。その後、細胞を１０～２５ｍＬのＰＢＳで洗浄して、残存するＴｒｐｙＬＥ（登録商標）及びＤＭＥＭをすべて除去し、反転して混合し、ペレットをほぐした後、上記と同じ設定で再度遠心分離する。遠心分離終了後、溶液を再度ペレットまで吸引する。その後、（細胞の数及び再細胞化される組織のサイズに応じて異なる公知の方法により）細胞をＤＭＥＭ培地に再懸濁する。その後、組織を培地及び細胞と共に回転子上で、３７℃８～１６時間インキュベートする。再細胞化後の組織は、直ちに用いるか、グルタルアルデヒド溶液を用いて固定することができる。
再細胞化の間、本発明者らは、ＤＭＥＭ Ｆ１２の４０ｍＬ（約５００，０００細胞／ｍＬ）中で約２０００万個の細胞中で脱細胞化組織骨格を１２時間インキュベートした。本発明者らは、８～１６時間、すなわち１０～１４時間の間のインキュベーション時間は、免疫適合性を提供するのに十分な脱細胞化された組織骨格の被覆が提供されることを予測する。インキュベーション時間は、脱細胞化組織骨格の被覆率を最適化するように選択される。培地を変化させず、１２時間後に、本発明者らは、細胞の死滅が始まることを見出した。本発明者らは、より長いインキュベーション、かつより短いインキュベーションには、細胞濃度を高める必要があると予測する。本発明者らは、８時間のインキュベーションのために、４０ｍＬのＤＭＥＭ Ｆ１２に、２，５００万～３，０００万個の細胞、又は６２５，０００～７５０，０００個／ｍＬの細胞濃度が必要とされうることを予測する。本発明者らは、１６時間のインキュベーションでは、細胞の死滅が始まる可能性があり、従って、細胞死を考慮すると、２，０～２，５００万個の細胞、又は５０，０００～６２５，０００個／ｍＬ細胞濃度が必要とされうることを予測する。本発明者らは、適用範囲を最大限に提供するため、１２時間が好ましいインキュベーションの長さであることを見出した。
本発明者らによって、いくつかの概念実証実験が発明者によって実施されており、さらに多くの実証実験が現在実施されている。未変性の脱細胞化、再細胞化された組織を、ヒトの生体外モデル及びラットの生体モデルで血液に曝露させた。これらの実験の結果、脱細胞化された組織マトリクスによる炎症誘発性サイトカイン（免疫系エフェクター）が有意に減少し、かつ、再細胞化された骨格ではさらに有意に減少することが示された。本発明者らは、先行研究及び文献で利用可能な研究に基づいて、ヒト心膜及びブタ大動脈弁尖が同様の結果を示すことを予測する。
ウシ心膜
ウシ心膜は脱細胞化および再細胞化の工程を経た。各患者から採取した２０ｍＬの全血をＤＭＥＭ Ｆ１２培地と等量で混合し、その１０ｍＬを用いて３×３ｍｍの未変性のウシ心膜（ＮＢＰ）（ｎ＝６）、脱細胞化されたウシ心膜（ＤＢＰ）（ｎ＝６）、再細胞化されたウシ心膜（ＲＢＰ）（ｎ＝６）、ヒト心膜（ＨＰ）（ｎ＝５）を露出させた。その後、１５ｍＬチューブ中の全ての曝露群を、３７℃インキュベーター内の回転子上に置いた。１日後及び３日後、チューブから全血２ｍＬを取り出し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）勾配遠心分離（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）を行い、上部血漿層をエッペンドルフ（登録商標）チューブに保存した。液体窒素で瞬間凍結し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）分析まで－８０℃フリーザーで保存した。
増殖アッセイ：全血１０ｍＬから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）勾配遠心法（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）により分離した。単核細胞を、トリパンブルー排除染料を用いて計数し、１０％ヒト血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、５０ＩＵのペニシリン／ｍＬ、及び５０ｍＬのストレプトマイシン／ｍＬ（カリフォルニア州サーモフィッシャー科学）含有ＲＰＭＩ １６４０培地からなる適当量の「完全培地」に再懸濁し、１×１０６細胞／ｍＬＡ ０．５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）バイオレット（カリフォルニア州サーモフィッシャー）染色液を含有する溶液を作製した。その後、１×１０６細胞／ｍＬの濃度の末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を、０．５μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）バイオレット染色溶液中で２０分間インキュベートした。結合しなかった色素を、５倍量のＲＰＭＩ １６４０を添加し、５分間インキュベートして吸収した。その後、細胞を遠心分離し、完全培地中に再懸濁した。その後、染色された細胞のアリコートを、未変性の、脱細胞化され、再細胞化された、ヒト心膜組織がある、４つの１５ｍＬチューブに分配した。培養５日後、細胞をＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ３に対する蛍光抗体で染色した。増殖の分析は、４０５ｎｍ励起及び４５０／４０バンドパス発光フィルター付きフローサイトメトリーを用いて行った。増殖は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）Ｖｉｏｌｅｔのシグナル強度の低下によって同定され、各ピークは細胞数の重複を示した。
定性分析：未変性、脱細胞化、ヒト心膜組織の組成及び免疫細胞浸潤を、組織学、免疫組織化学、透過型及び走査型電子顕微鏡を用いて定性的に分析した。まず、１×１ｍｍの未変性及び脱細胞化した心膜組織片をＤＡＰＩで染色し、全血曝露前にウシ細胞の有無を確認した。全血曝露の５日後に、全群の心膜組織を５×５ｍｍに切り出し、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。２４時間後、試料を７０％エタノールに移した。組織標本を切り出し、Ｈ＆Ｅ染色、抗ビメンチン（間質細胞）による免疫組織化学染色、抗ＣＤ３（Ｔ細胞）及び抗ＣＤ６８（マクロファージ）による免疫蛍光染色を行った。最後に、未変性及び脱細胞化した組織の非曝露試料代表試料を、組織に対して平行及び垂直配向の両方で切断し、ＴＥＭ及びＳＥＭを用いて分析した。
サイトカインの測定：－８０℃の冷凍庫で保存したサイトカイン含有上清を解凍し、ヒトＴＮＦ－α ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（カテゴリー番号ＤＹ２１０－０５）及びヒトＩＦＮ－γ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（カテゴリー番号ＤＹ２８５Ｂ－０５）（Ｒ＆Ｄシステムス、ミネアポリス）の製造業者の推奨プロトコルに従って、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）分析を行った。Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）Ｈ４ハイブリッドリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、Ｖｅｒｍｏｎｔ）を用いて、４５０ｎｍ及び５４０ｎｍでの吸光度を読み込んだ。
組織学及び顕微鏡検査：４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色で染色したＮＢＰは広範な可視核物質を示した。一方、ＤＢＰはバックグラウンドの細胞外マトリクスの領域内に核物質が完全に存在しなかった。再細胞化後、ＤＡＰＩ染色は再び間葉系細胞による細胞外マトリクスの広範な被覆を示した。未変性、脱細胞化及び再細胞化組織のＳＥＭ画像は、脱細胞化プロセス後に、有意なコラーゲン破壊、フィブリン沈着、及び赤血球捕捉がない、同等のコラーゲン形態及び分布を示した。細胞構造は、ネイティブ組織と再細胞化組織に認められたが、脱細胞化組織画像には細胞は認められなかった。未変性組織、脱細胞化組織及び再細胞化組織の細胞外マトリクスをＴＥＭで可視化したところ、脱細胞化した組織ではウシ細胞が除去され、再細胞化した組織では間葉系細胞の構造が観察された。ＴＥＭ上のコラーゲン・バンディングで示される細胞外マトリクスは、組織工学プロセスを通じて継続的に維持されており、このプロセスが超細胞構造を乱さないことを示す証拠となっている。
抗ビメンチン染色したＮＢＰは、組織の端にあるすべての動物細胞に見られる間質細胞の染色を示したが、ＤＢＰは比較部位に間質細胞の染色がなく、脱細胞化プロセスの効果が確認された。再細胞化された組織は、顕著なビメンチン染色が示されたが、これは間葉系細胞によって発現されるタンパク質によるもので、間葉系細胞が脱細胞化された異種移植片によく着座するという証拠をさらに増強するものであった。
５日間の曝露後の未変性、脱細胞化、及び再細胞化組織のヘマトキシリンエオジン染色は、組織工学的処置後も層状構造が維持されていることを強調する、細胞外マトリクスの同等の全体的形態を示した。同様の細胞外マトリクス保存パターンは、組織の弾性フォンゲゾン及びゴモリのトリクローム染色でも認められ、組織工学プロセスを経た組織ではコラーゲンが存在することが示されたた。まとめると、組織の組織学的検査及び顕微鏡検査により、界面活性剤系の脱細胞化プロセスの効果が確認された。
免疫細胞浸潤：未変性組織のヘマトキシリンエオジン染色切片は、好中球及び形質細胞の存在を伴う自然免疫細胞浸潤を示したが、脱細胞化組織及び再細胞化組織は、免疫細胞浸潤を示さなかった。免疫細胞浸潤は、ヒト全血への曝露の５日後に切片化された未変性組織の免疫蛍光によってさらに特徴付けられた。Ｔ細胞浸潤（ＣＤ３）及びマクロファージ（ＣＤ６８）は未変性組織にみられた。これにより、未変性組織の初期の異種性先天性免疫応答及び細胞介在免疫応答が実証された。
炎症性サイトカイン：図３に示すように、曝露１日目のＴＮＦ－αの炎症性サイトカイン発現のＥＬＩＳＡ解析では、ＤＢＰ曝露群ではＮＢＰ群に比べて有意なサイトカイン産生の減少（５８９．３ｐｇ／ｍＬ ｖｓ １３８８．５ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０２）がみられた。再細胞化ではＤＢＰ群に比べて有意なサイトカイン発現の減少（１５９．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ５８９．３ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０２）がみられた。ＲＢＰ曝露群ではＨＰ群と比較して有意な差は認められなかった（１５９ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ９．４ｐｇ／ｍＬ、ｐ＞０．０５）。図４に示すように、曝露３日目のサイトカイン産生量は、ＤＢＰ曝露群ではＮＢＰ群に比して有意に減少し（３８１．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ８０７．８ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０１）た。再細胞化により、ＤＢＰ群と比較して再びサイトカイン発現が有意に減少した（２４．３ ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ３８１．０ ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０５）。再度、ＨＰとの比較ではＲＢＰ曝露群のサイトカイン産生量は有意差が認められなかった（２４．３ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ３６．１ｐｇ／ｍＬ、ｐ＞０．０５）。注目すべきは、１日目と３日目のサイトカインレベルを比較した場合、すべての曝露群で全体的にサイトカイン産生量が減少したが、ＮＢＰ→ＤＢＰ→ＲＢＰとサイトカインレベルが有意に減少する傾向は、いずれの時点でも依然として存在していた。曝露１日目におけるＩＦＮ－γの炎症性サイトカイン発現は、サイトカイン産生がないことを示した。しかし、図５に示すように、曝露３日目には、ＮＢＰ群と比較してＲＢＰ曝露群のサイトカイン産生量は有意な減少を示した（０ｐｇ／ｍＬ対２６．５ｐｇ／ｍＬ Ｐ＜０．０５）。
フローサイトメトリー図６～１１は、ＮＢＰ（図６及び７）、ＤＢＰ（図８）、ＨＰ（図９）及びＲＢＰ（図１０及び１１）のフローサイトメトリーの結果を示す。ＲＢＰについてのフローサイトメトリーによるＣＤ ４＋ Ｔ細胞増殖アッセイでは、ＮＢＰ群と比較してＴ細胞増殖が有意に減少し（４９．１％対２１．６％）、Ｔ細胞の各増殖に対応する分数減少のピークで示されるＴ細胞の増殖が増加することが示された。ＨＰと比較した場合、ＲＢＰ群は依然としてＴ細胞増殖を示した（２１．６％対２．１％）。
ブタ細胞外マトリクス
患者の集団：待機的心臓手術を受ける患者から、術前に同意を得た。術中に、心膜、２０ｍＬのヘパリン化全血、及び胸骨骨髄の試料を採取した。
脱細胞化：市販のブタ細胞外マトリクス（Ｃｏｒｍａｔｒｉｘ（登録商標）、米国ジョージア州）を骨格として用いた。最初に、２インチ×２インチのマトリクス片を脱細胞化した。まず、組織を２５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次に、室温で４０ｒｐｍで振動させながら、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（バイオラッドラボラトリーズ、米国カリフォルニア州）で洗浄した。ＳＤＳは１時間おきに交換し、合計４回交換した。４回目のＳＤＳの添加後は２０時間放置した。翌日、ＳＤＳを除去し、室温で４０ｒｐｍで振動させながら、２５ｍＬのＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（サーモフィッシャー科学、米国マサチューセッツ州）を添加した。１時間後、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００を除去し、交換した。これを計４回繰り返し、左の交換後は２０時間放置した。翌朝、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００を除去し、組織をＰＢＳ及び二重蒸留水（ＤＤＨ２Ｏ）で、泡がなくなるまですすいだ。その後、室温で４０ｒｐｍで振動させながら、組織を１％塩化ナトリウムで１時間洗浄した。塩化ナトリウムを除去し、組織を再度ＰＢＳ及びＤＤＨ２Ｏですすいだ。２５ｍＬのＤＮａｓｅ及びＭｇＣｌ２を加えて、３７℃で４０ｒｐｍで組織を振動させた。吸引後、組織をＤＤＨ２Ｏで２回すすぎ、２５ｍＬの１％ ＰＢＳペニシリン－ストレプトマイシン混合物を加え、組織を３７℃、４０ｒｐｍで３０分間振動させた。脱細胞化が完了したら、組織をプリモシン含有１％ Ｈａｎｋの平衡塩溶液（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国カリフォルニア州）で、使用するまで４℃の冷蔵庫で保存した。
細胞培養：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、アルバータ大学のＭａｚａｎｋｏｗｓｋｉ Ａｌｂｅｒｔａ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで待機的心臓手術を受けた患者から採取した。胸骨切開部から血液試料を採取し、Ｔ７５プラスチック細胞培養フラスコ（サーモフィッシャー科学，米国マサチューセッツ州）に直接播種した。プラスチック接着性ＭＳＣのみを培養するために、細胞を、２０％ウシ胎児血清、０．２％アスコルビン酸、及び０．２％プリモシンを添加したＤＭＥＭ Ｆ１２（サーモフィッシャー科学，米国マサチューセッツ州）培地中で３７℃で５％ ＣＯ２でインキュベートした。最初の平板培養の１日後に細胞をＰＢＳで洗浄して培地を交換した。その後、３日毎に培地交換し、フラスコが１００％のコンフルエンスに達するまで定期的にモニターし、その時点で約１００万個の細胞が含まれていた。１５ｍＬのフェノールレッド非含有のＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ １０ｘ、（サーモフィッシャー科学，米国マサチューセッツ州）を添加し、３０分間インキュベートして細胞をトリプシン化した。その後、１５ｍＬの完全ＤＭＥＭ Ｆ１２を添加し、細胞及び溶液を５０ｍＬの円錐管に移し、４００ｇ、１８℃で１５分間遠心分離した。溶液を吸引し、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、さらに１サイクルの遠心分離を行った。その後、細胞ペレットをＤＭＥＭ Ｆ１２培地に再懸濁し、９５％コンフルエンスに達するまで複数のフラスコ上に平板培養するか、又は再細胞化のために直ちに用いた。
再細胞化：再細胞化は、３ｍｍ×３ｍｍの組織片をＤＭＥＭ Ｆ１２培養培地１０ｍＬ中で３７℃で２４時間回転子上でインキュベートすることによって開始した。翌日、上記のように分離された約１００万のＭＳＣを、４ｍＬのＤＭＥＭ Ｆ１２培養培地に再懸濁する。その後、組織を幹細胞を含む５ｍＬ遠心チューブ（ＭＴＣ Ｂｉｏ、米国ニュージャージー州）中に培地に入れ、３７℃で１２時間回転子上に置いた。
曝露：採取した血液２０ｍＬをＤＭＥＭ Ｆ１２培養培地２０ｍＬと混合する。次に、全血１０ｍＬを個々の１５ｍＬポリプロピレン遠心分離管（サーモフィッシャー科学、米国マサチューセッツ州）に移し、未変性ブタマトリクス（ｎ＝９）、脱細胞化ブタマトリクス（ｎ＝９）、再細胞化ブタマトリクス（ｎ＝６）、及び自己ヒト心膜（ｎ＝９）を個々の管内に入れた。その後、チューブを回転子上に載せ、３７℃でインキュベートした。曝露後１、３、及び５日目に、各試験管から全血２ｍＬを採取し、２ｍＬ エッペンドルフ（登録商標）試験管（サーモフィッシャー科学、米国マサチューセッツ州）に入れた。その後、試料を４００ｇ、１８℃で１５分間遠心分離した。血清を回収して新しいチューブに移し、ペレットは廃棄した。血清を含む試験管を液体窒素中で速やかに凍結し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）分析まで－８０℃で保存した。
定性分析：脱細胞化及び再細胞化が成功したことの確認は、４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色により行った。未変性、脱細胞化及び再細胞化後の試料を含む処理の各段階における組織試料をＤＡＰＩで染色し、未変性の細胞の存在、脱細胞化後のそれらの細胞の不在、及び再細胞化後のＭＳＣの存在を同定した。
定量分析：－８０℃で保存したサイトカイン含有血清を解凍し、ヒトＴＮＦ－α ＤｕｏＳｅｔ（登録商標） ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＹ２１０－０５）及びヒトＩＬ１β ＤｕｏＳｅｔ（登録商標） ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＹ２０１－０５）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス）の製造業者推奨プロトコルに従ってＥＬＩＳＡ分析を行った。Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）Ｈ４ハイブリッドリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、バーモント州ウィヌースキー）を用いて、４５０ｎｍ及び５４０ｎｍでの吸光度測定を実施した。
統計解析：群間のデータの比較は未対化Ｔ検定を用いて分析し、統計的有意性はｐ＜０．０５とした。群間のばらつきの比較は一元配置分散分析を用いて行い、統計的有意性はｐ＜０．０５とした。
定性分析：ＤＡＰＩで染色した未変性マトリクス（ＮＣＭ）は、核物質の存在を示す。対照的に、ＤＣＭはＤＡＰＩ染色で核物質の完全な非存在を示した。再細胞化後、ＤＡＰＩ染色は、再細胞化マトリクス（ＲＣＭ）を形成する脱細胞化マトリクス（ＤＣＭ）の再細胞化に用いたＭＳＣからの核物質の広範な存在を示した。
ＥＬＩＳＡ： ＩＬ１βのＥＬＩＳＡは、図１４に示すように、図１２の３日目（１４２．４ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ３７９．０ｐｇ／ｍＬ， ｐ＝０．００６）及び図１３の５日目（１３８．３ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ３０２．３ｐｇ／ｍＬ， ｐ＝０．０２）に示すように、１日目のＮＣＭ群と比較して、ＤＣＭ群でサイトカイン産生の有意な減少を示した（１６７．４ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ３７９．０ｐｇ／ｍＬ， ｐ＝０．００６）。図１２では、ＮＣＭ：未変性マトリクス、ＤＣＭ：脱細胞化マトリクス、ＲＣＭ：再細胞化マトリクス、ＨＰ：自己ヒト心膜。未対化Ｔ検定 ＮＣＭ：ＤＣＭ Ｐ＝０．００６＊、ＮＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＜０．００１＊、ＤＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＝０．００１＊。図１３では、未対化Ｔ検定ＮＣＭ：ＤＣＭ Ｐ＝０．００７＊、ＮＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＜０．００１＊、ＤＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＝０．００３＊。図１４において、未対化Ｔ検定ＮＣＭ：ＤＣＭ Ｐ＝０．００２＊、ＮＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＜０．００１＊、ＤＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＜０．００１＊。
同様に、１日目（０．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ３７９．０ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．００１）、３日目（０．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ３６９．０ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．００１）及び５日目（０．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ８３．０ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０３）では、未変性組織への再細胞化から有意な低下が示された。また、図１２に示すように１日目（０．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ １６７．４ｐｇ／ｍＬ， ｐ＝０．００１）、図１３に示すように３日目（０．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ １４２．４ｐｇ／ｍＬ， ｐ＝０．００３）、図１４に示すように５日目（０．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ １３８．３ｐｇ／ｍＬ， ｐ＜０．００１）、ＤＣＭと比べＲＣＭではＩＬ１β生成量が著しく減少したことが確認された。ＡＮＯＶＡは、１日目のＦ（２，２１）＝１４．６、ｐ＜０．００１、３日目のＦ（２，２１）＝１２．１、ｐ＜０．００１及び５日目のＦ（２，２１）＝１０．０、ｐ＜０．００１で群間に有意な変動を示した。
ＴＮＦαのＥＬＩＳＡは、未変性マトリクスから脱細胞化マトリクスへの有意な減少はなかったものの、以前のＥＬＩＳＡと同様の結果を示した。図１５に示すように１日目（０．０ｐｇ／ｍＬ対１５２０．５ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．００１）、図１６に示すように３日目（０．０ｐｇ／ｍＬ対３２６．５ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．００４）及び図１７に示すように５日目（０．０ｐｇ／ｍＬ対８３．０ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．００１）では、未変性マトリクス（０．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ １５２０．５ｐｇ／ｍＬ、ｐ＜０．００１）と比較すると、再細胞化マトリクスから有意な減少が見られた（０．０ｐｇ／ｍＬ ｖｓ ３２６．５ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．００４）。図１５では、未対化Ｔ検定ＮＣＭ：ＤＣＭ Ｐ＝０．０７９、ＮＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＜０．００１＊、ＤＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＝０．００３＊。図１６では、未対化Ｔ検定ＮＣＭ：ＤＣＭ Ｐ＝０．１２、ＮＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＝０．００４＊、ＤＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＝０．００２＊。図１７では、未対化Ｔ検定ＮＣＭ：ＤＣＭ Ｐ＝０．１８、ＮＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＝０．０４６＊、ＤＣＭ：ＲＣＭ Ｐ＝０．０３＊であった。
最後に、ＴＮＦα産生の有意な減少は、図１５に示すように１日目（０．０ｐｇ／ｍＬ対１０１８．９ｐｇ／ｍＬ、ｐ＝０．００３）、図１６に示すように３日目（０．０ｐｇ／ｍＬ対１８３．６ｐｇ／ｍＬ、ｐ０．００２）、図１７に示すように５日目（０．０ｐｇ／ｍＬ対３８．２ｐｇ／ｍＬ）でＲＣＭからＤＣＭへ顕著であることが認められた。ＡＮＯＶＡは、１日目のＦ（２，２１）＝１０．８、ｐ＜０．００１、及び３日目のＦ（２，２１）＝３．９４， ｐ＝ ０．０４で群間で有意な変動が確認された。５日目の群間の変動は有意でなかった。
モルモット弁
脱細胞化：雌Ｈａｒｔｌｅｙモルモットから摘出した大動脈弁構築物を、実施例４に記載したのと同じ方法を用いて脱細胞化した。
細胞培養：同系のＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を再細胞化に用いた。ラットＭＳＣを播種し、培養し、実施例４に記載したのと同じ方法を用いて再細胞化を行った。
再細胞化：再細胞化は、個々の大動脈弁構築物１０ｍＬのＤＭＥＭ Ｆ１２培養培地を回転子上で３７℃で２４時間インキュベートすることによって開始した。翌日、上記のように分離された約１００万個のラットＭＳＣを、４ｍＬのＤＭＥＭ Ｆ１２培養培地に再懸濁する。その後、５ｍＬ遠心チューブ（ＭＴＣ Ｂｉｏ、米国ニュージャージー州）の幹細胞を含む培地に組織を入れ、３７℃で１２時間回転子上に置いた。その後、定性的及び定量的分析用の再細胞化された組織の準備が整った。
曝露：雌Ｈａｒｔｌｅｙモルモットから摘出した大動脈弁構築物を入手し、脱細胞化した後、同系のＳｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットＭＳＣを用いて再細胞化した。その後、再細胞化した大動脈弁異種移植片を、レシピエントである雌のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの腎動脈下大動脈に移植した。移植片を、同系移植片、非脱細胞化（新鮮）、脱細胞化、及び再細胞化異種移植片のいずれかとして移植した。移植片を１０－０ナイロン連続縫合糸で端から端まで縫合した。ラットを７日後に安楽死させ、放血した後、移植片を摘出した。総血清免疫グロブリンを定量し、組織学的分析を行い、免疫応答を分析した。
定性分析：脱細胞化及び再細胞化が成功したことの確認は、４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色により行った。未変性、脱細胞化及び再細胞化後の試料を含む処理の各段階における組織試料をＤＡＰＩで染色し、未変性の細胞の存在、脱細胞化後のそれらの細胞の不在、及び再細胞化後のＭＳＣの存在を同定した。ヘマトキシリンエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色及びビメンチン染色を用いて肉眼組織学的検査を実施し、未変性異種移植片における細胞物質の存在を確認した。図１８では、脱細胞化異種移植片のＨ＆Ｅ及びビメンチン染色は、脱細胞化手順では、全ての細胞材料が除去されても、弁の全体構造に悪影響が及ぼされないことを確認した。図１９では、再細胞化異種移植片のＨ＆Ｅ及びビメンチン染色により、コンフルエントな細胞層が弁表面に付着していることが確認された。
図２０－２３に示すように，Ｈ＆Ｅ染色により、再細胞化モルモット異種移植片では、新鮮及び脱細胞化移植片と比較して、細胞浸潤が低下したことが示された。
定量分析：－８０℃で保存したサイトカイン含有血清を解凍し、ラットＩｇＧ（カタログ番号Ｅ１１１－１２８） （Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．米国テキサス州モントゴメリ）の製造業者推奨プロトコルに従ってＥＬＩＳＡ分析を行った。Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）Ｈ４ハイブリッドリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、バーモント州ウィヌースキー）を用いて、４５０ｎｍ及び５４０ｎｍでの吸光度測定を実施した。
図２４は、移植後７日目における総血清免疫グロブリンＧを示す。図２５は、移植後７日目における移植片の生存及び血栓症を示す。
本発明者らは、脱細胞化移植片が移植片血栓症の発生率がはるかに高かったが、様々な移植片タイプの間で生存率が同様であることを見出した。
α－ガラクトース切断の有無によるブタ大動脈弁尖
本発明者らは、ブタ大動脈弁尖由来のα－ガラクトースの切断に有効な方法を実証した。α－ガラクトースは、霊長類では見られないが、ほとんどの哺乳類組織で見られる炭水化物である。この炭水化物は、ヒトへの異種インプラントに対する強力な免疫応答に寄与すると仮定されている。
α－ガラクトース開裂：組織の脱細胞化後、組織を、１５ｍＬの１００Ｕ／Ｌα－ガラクトシダーゼを含むＰＢＳの新しいチューブに移した。組織を回転子上に４℃で２４時間放置する。
本発明者らは、これまでの実験および文献の結果に基づき、α－ガラクトースの切断により、免疫応答がさらに低下し、生体外モデルにおける炎症誘発性サイトカイン産生が低下することを予測する。
ヒト心膜
患者の集団：待機的心臓手術を受ける患者から、術前に同意を得た。術中に、心膜、２０ｍＬのヘパリン化全血、及び胸骨骨髄の試料を採取した。
脱細胞化：骨格にはヒト心膜を用いた。最初に、２インチ×２インチのヒト心膜片を、実施例４で記載したように脱細胞化した。
細胞培養：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を収集し、実施例４に記載のように培養した。
再細胞化：再細胞化は、実施例４に記載のように行った。
曝露：曝露プロトコルは、実施例４に記載のように行った。ある患者から採取したヒト心膜は、脱細胞化され、別の患者のＭＳＣで再細胞化される。その後、再細胞化されたマトリクスを、ＭＳＣが自己移植モデルの作製で採取されたのと同じ患者から採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に曝露する。
定量分析：－８０℃で保存したサイトカイン含有血清を解凍し、ヒトＴＮＦ－α ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（カテゴリー番号ＤＹ２１０－０５） （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス）の製造業者推奨プロトコルに従ってＥＬＩＳＡ分析を行った。Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４ハイブリッドリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ， Ｗｉｎｏｏｓｋｉ， Ｖｅｒｍｏｎｔ）を用いて、４５０ｎｍ及び５４０ｎｍでの吸光度測定を実施した。
統計解析：群間のデータの比較は未対化Ｔ検定を用いて分析し、統計的有意性はｐ＜０．０５で得られた。
ＴＮＦαのＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡ法では、未変性心膜から脱細胞化又は再細胞化したヒト心膜への有意な低下は認められなかった。１日目及び３日目には、脱細胞化したヒト心膜のＴＮＦ－α濃度は、未変性の心膜よりも高く、自己細胞再細胞化したヒト心膜のＴＮＦ－α濃度は、未変性の心膜と同様のレベルまで低下した。
図２６は、ＰＢＭＣを１日間曝露した１日後のＴＮＦ－αサイトカイン濃度を示す。図２７は、ＰＢＭＣを３日間曝露した１日後のＴＮＦ－αサイトカイン濃度を示す。
本明細書に記載した実施形態に対して、特許請求の範囲の記載から逸脱することなく、重要でない改変を行うことができる。
特許請求の範囲の記載における、用語「含む」は包括的な意味で用いられ、存在する他の要素を除外しない。不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」（原文）は、存在する特徴の２以上を除外することはない。本明細書に記載された個々の特徴は各々、１つ以上の実施形態では用いることができ、単に本明細書に記載されているからという理由だけで、特許請求の範囲によって定義されるすべての実施形態に必須であると解釈されるべきではない。
Claims (49)
- レシピエントに免疫適合性である骨格を形成する方法であって、脱細胞化された組織マトリクスを、インビトロで、レシピエントに免疫適合性である真核細胞と接触させ、前記脱細胞化された組織マトリクスの外表面を覆い、免疫適合性である骨格を形成することを含み、ここで、前記脱細胞化された組織はレシピエントに対して異種である組織から形成される、方法。
- 真核細胞は、さらに、多能性細胞を含む、請求項１記載の方法。
- 多能性細胞は、さらに、間葉系幹細胞を含む、請求項２記載の方法。
- 脱細胞化された組織マトリクスは、さらに、脱細胞化された細胞外マトリクスを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- レシピエントに免疫適合性である真核細胞は、さらに、レシピエントに対して同種又は自己の細胞を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化する前に、さらに、前記脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼと接触させることを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- さらに、異種の細胞培養骨格を固定剤で固定することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 固定剤は、グルタルアルデヒドである、請求項７に記載の方法。
- 脱細胞化された組織マトリクスは、さらに、心臓弁組織を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- レシピエントはヒトであり、かつ、組織は哺乳類組織である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
- 組織は、ブタ又はウシの組織である、請求項１０に記載の方法。
- 脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化する前に、さらに、以下の：
レシピエントに対して異種である組織を、脱細胞化剤を含む１つ以上の溶液で脱細胞化し、前記脱細胞化された組織マトリクスを生成すること、及び
前記脱細胞化された組織マトリクスを洗浄し、前記脱細胞化剤を除去すること、
により、前記脱細胞化された組織マトリクスを得ることを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。 - 脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化する前に、さらに、以下の：
レシピエントに対して異種である組織をアニオン性界面活性剤溶液に浸すこと、
前記組織からアニオン性界面活性剤溶液を除去すること、
前記組織を非イオン性界面活性剤溶液に浸すこと、
前記組織から非イオン性界面活性剤溶液を除去すること、
前記組織を１つ以上の洗浄液ですすぎ、脱細胞化された組織マトリクスを形成すること、かつ
前記脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼと接触させること、
により、脱細胞化された組織マトリクスを得ることを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。 - レシピエントに対して異種である組織を脱細胞化する方法であって、以下の：
組織をアニオン性界面活性剤溶液に浸すこと、
前記組織からアニオン性界面活性剤溶液を除去すること、
前記組織を非イオン性界面活性剤溶液に浸すこと、
前記組織から非イオン性界面活性剤溶液を除去すること、
前記組織を１つ以上の洗浄液ですすぎ、脱細胞化された組織マトリクスを形成すること、かつ
前記脱細胞化された組織マトリクスをα－ガラクトシダーゼと接触させること、
を含む、方法。 - １つ以上のすすぎ液は、緩衝液、二重蒸留水、塩化ナトリウム、ヌクレアーゼ及び抗生物質を集合的に含む、請求項１４記載の方法。
- さらに、脱細胞化された組織をレシピエントに免疫適合性である真核細胞と接触させることによって前記脱細胞化された組織マトリクスを再細胞化して、前記脱細胞化された組織マトリクスを覆う免疫適合性である細胞の層を形成し、免疫適合性の骨格を形成することを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
- 真核細胞は、さらに、多能性細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
- 多能性細胞は、さらに、間葉系幹細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
- 真核細胞は、さらに、レシピエントと同種又は自己の細胞を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、免疫適合性である骨格を固定剤で固定することを含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 固定剤はグルタルアルデヒドである、請求項２０に記載の方法。
- 組織は、さらに、心臓弁組織を含む、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
- レシピエントはヒトであり、組織は哺乳動物の組織である、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 組織はブタ又はウシの組織である、請求項２３に記載の方法。
- アニオン性界面活性剤溶液に浸す工程は、組織をアニオン性界面活性剤溶液に４回浸漬し、かつ、各浸漬後に前記組織から前記アニオン性界面活性剤溶液を除去することを含む、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。
- ４回の浸漬のうちの１回は、振動により行われる、請求項２５に記載の方法。
- ４回の浸漬のうちの最終回の時間は、１６～２４時間である、請求項２６に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤溶液に浸す工程において、組織を非イオン性界面活性剤溶液に５回浸漬し、かつ、各浸漬後に、前記組織から前記非イオン性界面活性剤を除去することを含む、請求項１４～２７のいずれか一項に記載の方法。
- ５回の浸漬のうちの４回は、振動により行われる、請求項２８に記載の方法。
- ５回の浸漬のうちの最終回の時間は、１６～２４時間である、請求項２９に記載の方法。
- 方法は４日未満で完了する、請求項１４～３０のいずれか一項に記載の方法。
- アニオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムである、請求項１４～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００である、請求項１４～３２のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレアーゼはデオキシリボヌクレアーゼである、請求項１５に記載の方法。
- 組織は、新鮮な組織、死体の組織、固定された組織又は固定されていない組織を含む、請求項１４～３４のいずれか一項に記載の方法。
- すすぐ工程の後に、脱細胞化された組織マトリクスは、前記脱細胞化された組織マトリクスが容易に再細胞化されうるように、アニオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤を実質的に含まない、請求項１４～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 組織を１つ以上の溶液ですすぐ工程は、以下の：
組織をリン酸緩衝生理食塩水と二重蒸留水を交互に用いてすすぐこと、
前記組織を塩化ナトリウム溶液で洗浄すること、
前記組織をリン酸緩衝生理食塩水と二重蒸留水を交互に用いてすすぐこと、
前記組織をヌクレアーゼと塩化マグネシウムの溶液と接触させること、
前記組織を二重蒸留水ですすぐこと、
前記組織をリン酸緩衝生理食塩水と抗生物質の溶液に接触させること、かつ
前記組織を緩衝液及び抗生物質溶液に保存すること、
を含む、請求項１４～２７のいずれか一項に記載の方法。 - レシピエントに免疫適合性である、固定された真核細胞で覆われ、かつ、常温保存可能な生成物を形成する脱細胞化された異種細胞組織
を含む、免疫適合性である骨格。 - 真核細胞は、脱細胞化された組織マトリクスの外表面の少なくとも５０％を覆う、請求項３８に記載の免疫適合性である骨格。
- 真核細胞は、脱細胞化された組織マトリクスの外表面の少なくとも８０％を覆う、請求項３８に記載の免疫適合性である骨格。
- 真核細胞はさらに多能性細胞を含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の免疫適合性である骨格。
- 多能性細胞は、さらに間葉系幹細胞を含む、請求項４１に記載の免疫適合性である骨格。
- 真核細胞は、さらに、レシピエントと同種又は自己の細胞を含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の免疫適合性である骨格。
- 脱細胞化された異種組織は、さらに、脱細胞化された組織マトリクスを含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記載の免疫適合性である骨格。
- 脱細胞化された組織マトリクスは、未変性の細胞外マトリクスである、請求項４４に記載の免疫適合性である骨格。
- 脱細胞化された異種組織は、さらに、異種心臓弁組織を含む、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の免疫適合性である骨格。
- レシピエントはヒトであり、かつ、脱細胞化された異種組織は脱細胞化された哺乳動物組織である、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の免疫適合性である骨格。
- 脱細胞化された異種組織は、脱細胞化されたブタ又はウシの組織である、請求項４７に記載の免疫適合性である骨格。
- 真核細胞は、脱細胞化された異種組織上に単層を形成する、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の免疫適合性である骨格。
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