JP2002507907A

JP2002507907A - 生合成移植片及びその製造方法

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Publication number: JP2002507907A
Application number: JP50521599A
Authority: JP
Inventors: バーダー、アウグスチヌス; シュタインホフ、グスタフ; ハーベリッヒ、アクセル
Original assignee: バーダー、アウグスチヌス; シュタインホフ、グスタフ; ハーベリッヒ、アクセル
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2002-03-12
Also published as: ES2175753T3; WO1999000152A3; DE59803925D1; WO1999000152A2; DE19828726A1; EP0989867A2; EP0989867B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、様々に分化した自己由来又は遺伝工学的に製造かつ修飾された偽自己コロニー形成細胞を含む間質組織のレシピエント特異的移植片に関する。前記移植片を作り出すためには、適切に望ましい細胞とともに十分かつ直接的に再コロニー形成することのできる弛緩構造を有する非変性の実際的に無細胞のコラーゲン基質を入手するために、同種若しくは異種組織若しくは材料に酵素的若しくは化学的処理を実施する。

Description

【発明の詳細な説明】生合成移植片及びその製造方法本発明は、無細胞化された結合組織基質に移植片レシピエントの自己細胞又は遺伝子工学的に修飾された同種若しくは異種細胞とともにコロニー形成させることによる生合成移植片の製造方法に関する。さらに本発明は、上記の方法により入手可能であり、領域ごとに様々に分化した自己細胞とともにコロニー形成させた結合組織から構成されるレシピエント特異的な生合成移植片に関する。今日では、移植技術において皮膚、血管及び臓器の外科的移植が既に意のままに行われて良好な成果が得られており、広範囲に普及している。だが適切な移植片を準備することに関してはまだまだ困難が伴う。移植片は、その技術によって大きく３つのグループに分けることができる。まず第１に、各々の使用及びそれによって発生する負荷に従って、例えば合成樹脂、金属、セラミック、繊維材料等のような合成材料から作られる移植片ないしはインプラントがある。現代では合成インプラントには高度の堅牢性という長所があり、例えば人工関節では材料に対して高度の負荷能力が要求されるので、特に整形外科領域においてその価値が認められている。だが人工インプラントには、特にいかなる場合においても共増殖することができない、さらに実際的に内方成長することができないという欠点がある。後者の欠点を原因として、人工インプラントからその天然周囲への移行部では頻回に問題が発生する。第２には、例えばドナー器官のような同種材料、又は場合によっては異種材料（動物起源）も使用できる可能性がある。化学的に処理された動物由来移植片は、例えばヒトにおける心臓弁置換術に使用される。この場合に化学的処理がなされた動物由来の移植片は、構造タンパク質を安定化させて抗原反応を防止するために一般にはグルタルアルデヒドを用いて処理される。だがグルタルアルデヒド処理された組織は、移植後には恒常的な硬化及び進行性石灰化から逃れられない。そこでこれらの移植片は全て２、３年で置換されなければならない。例えばドナー器官のような同種材料を使用した場合は、レシピエントの生体に対して常に負担がかかる免疫抑制が不可欠になる。そのために身体内での様々なプロセスに基づいて拒絶反応が発生することがある。多くの場合に、結局は他の部位での移植に身体固有の組織を使用することが試みられる。この方法は例えばバイパス移植術において使用されるが、その場合には血液還流の欠陥を補整するために他の身体部位から静脈が採取されて心臓領域に使用される。皮膚移植の場合にも、頻回に他の部位から採取された皮膚が使用される。皮膚の移植においては、１：１の皮膚面積で移植した場合には実際的には何の成果も得られない、そこでそのためにより小さな皮膚領域を採取し、これを引き続いて広げなければならないという極めて大きな問題が生じる。だがこの採取した皮膚を拡張することは新たに移植された皮膚の安定性及び機能性にとっては有害である。そこで可能な限り拒絶反応（宿主対移植片反応）を発生しないために良好に内方成長し、それによって長期間に渡って堅牢であり、宿主から身体固有材料であると認識されて天然細胞交換によって再構成され、その結果できる限りレシピエントの身体内での移植片の共増殖が可能になるように、天然材料に近似して形成されている移植片材料又は直ちに使用可能な移植片にえオする大きな必要がある。そこで本発明の課題は、そうした移植片及びそうした移植片の製造方法を利用することにある。本発明に従ってこの課題を解決するには、選択されたレシピエントのための生合成移植片を製造するために下記のステップを含む方法を使用する：ａ）天然のコラーゲン基質を含有する同種若しくは異種組織ないしは材料を準備するステップ、ｂ）コラーゲン基質から慎重に細胞を除去し、引き続いて無菌生理食塩液により洗浄することにより広範に全ての抗原反応性細胞を除去し、それによって化学的に修飾されていない実際的に無細胞化された弛緩したコラーゲン基質を入手するステップ、ｃ）無細胞化され、ステップｂ）の処理によって弛緩した材料をその度望ましいレシピエントの同種細胞又はレシピエントに適合するように遺伝工学的に修飾された細胞とともにできる限り完全にコロニー形成させる引き続いての直接的加工によって直ちに使用可能な移植片を入手するステップ。米国特許第５，３３６，６１６号から、既に下記のステップを用いて移植のためにコラーゲンの基礎上で組織を調製するための方法は知られている：下記の特性を有する生合成移植片の化学的前処理及び細胞除去、低温処理、乾燥安定化、乾燥、再水和及び細胞再構成：ａ）もしかすると宿主によってリモデリング及び修復され得る細胞外タンパク質及びコラーゲン基質を含有する、ｂ）生育能力のある内皮細胞若しくは上皮細胞との良好な再コロニー形成のための無傷の膜基盤である、ｃ）主として宿主における免疫応答を惹起しない、ｄ）石灰化しない、及びｅ）室温で容易に保管及び輸送することができる。この周知の方法は、後になって移植片レシピエントによって身体内で再構成及びリモデリングされ得るように移植片としてできる限り「免疫中性」である支持組織基質が形成されなければならないという概念に基づいている。この過程を容易にするために、この方法に従って製造された移植片の引き続いてのコロニー形成の可能性も見込まれている。基質が移植片レシピエントの身体から異質と認識されることを回避するために、一定のステップによる調製が予定されている。第１に、採取された生物学的基礎材料は構造的損傷を回避するためにを安定化液中に浸漬される。この安定化液には、酸化防止剤、膨潤剤、抗生物質、プロテアーゼ阻害剤及びさらに平滑筋弛緩薬を含めることができる。その後に前処理された組織は、一般に適切な緩衝剤、塩、抗生物質、１種以上の界面活性剤、１種以上のプロテアーゼ阻害剤及び１種以上の酵素を含有する無細胞化液中に浸漬される。こうして入手された無細胞基質は、例えばグルタルアルデヒドのような架橋結合剤を用いて固定され、移植時まで保管することができる。又別の場合には、通例の低温処理を受けさせられる。この低温処理の過程において、生成物を既に無菌包装することができる。この組織はその後、真空条件下の低温においてできる限り慎重な凍結乾燥処理を受ける。凍結乾燥材料は新鮮若しくは低温保存材料に比較して拒絶反応を引き起こす可能性が少ないので、この凍結乾燥は明らかに拒絶を回避するための追加措置として行われる。この材料は、好ましくはその後この状態で保管及び輸送すべきである。移植前に、組織は再水和させられる。再水和は生理食塩液若しくはリンゲル液中で行われるが、場合によってはプロテアーゼ阻害剤を含有することができる。例えばアルカリホスファターゼを阻害してさらに石灰化を抑制するためのジホスホネート、さらに移植後の血管新生及び宿主細胞浸潤を刺激するための物質のようなその他の添加剤を含有することができるが、或いは再水和をグルタルアルデヒドのような架橋結合在中で実施することもできる。追加の措置として、最終的にはイン・ビトロ又はイン・ビボにおいて生育力のある免疫耐性細胞とともにコロニー形成させることが予定されている。この周知の方法の中心的概念は、良好に組み込まれて拒絶反応を惹起しない無細胞の偽「中性」基質を入手することにある。この概念における重点は、場合によっては酵素、界面活性剤、抗生物質、プロテアーゼ阻害剤等を用いる多数の化学的処理ステップによて基質を「中性化」することに置かれている。さらにもう１つの重点は、低温保存及び乾燥によって達成され、同時に基質のさらなる「中性化」が行われる、優れた保管及び輸送能力に置かれている。だが既知の方法及びそれに従って入手される移植片には重大な短所がある。Ｉｎｖｉｔｒｏ試験において細胞を以前に乾燥又は低温処理されたコラーゲン基質上で再形成させるとその内方成長が実質的により不良になることが証明されているので、冷凍及び乾燥が細心の注意を払って実施された場合においても、ポリマーのコラーゲン基質は機械的安定性及び弾性の低下による構造的変化を起こさざるを得ないことが判明している。それによってレシピエントの身体内での移植片が再中性化される可能性は極めて妨害される、又は場合によっては打ち砕かれる。さらに、露出している「中性化」コラーゲン基質を作り出す方法は危険性があると思われる。コラーゲン基質はイン・ビトロにおいては多数の化学薬品を用いて処理することができるが、だがこれをレシピエントの身体内で継続して実施することはできない。グルタルアルデヒドによる処理は、上記で既に異種材料について述べたますます増加する硬化の問題及び場合によってはさらに石灰化にも通じるであろう。さらに又、露出しているコラーゲン基質は最終的には内因性コラゲナーゼ類により攻撃され、その結果拒絶反応が発生する危険が存在する。露出している不完全又は偽コロニー形成コラーゲン基質においてはますます多くの顆粒球遊走並びに血小板粘着及び白血球遊走が発生することがあり、それによって最終的には炎症反応が発生し、移植片が構造的及び機能的に変化する。これに対して本発明は新規の概念を追求する。この場合においても完全な無細胞化、つまり細胞基質から抗原反応性細胞及びその他の抗原性組織成分を完全に除去することがより重要視される。だがコラーゲン基質はその後に、別の処理ステップにおいて免疫学的に「中性化」されることも構造を変化させられることもない。本発明における原料としては、望ましい組織、血管若しくは器官のための基礎構造として利用することのできる同種若しくは異種材料が役立つ。個々の例では、この場合にも後の移植片レシピエントから前もって採取された自己材料も又使用できよう。本発明に従うと、この原料の無細胞化はもっぱら細心の注意を払っての細胞除去及び引き続いての場合によっては無菌水溶液による十分な洗浄によって行われる。細心の注意を払っての細胞除去は、例えばトリプシン液中に組織ないしは材料を浸漬することによる慎重な酵素による細胞消化か、或いは又化学的細胞溶解剤を用いて、好ましくはイオン特異的錯化剤を用いてのどちらかで行うことができる。酵素による細胞溶解の場合は、細胞がその周囲と固定されている消化酵素結合部位がそれによって解かれる。これは、好ましくはトリプシン液中へ組織ないしは材料を浸漬することによって行われる。このトリプシン液には、必要がある場合にＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、トリトン若しくはＴＮＮを添加することができる。酵素が組織に作用する時間を調整することによって、消化の度合いが制御され、コラーゲン基質自体に対する攻撃が回避される。トリプシン処理は無細胞にされた基質の良好な弛緩を生じさせるので、その結果新たなコロニー形成が容易になる。或いは又、コラーゲン基質に固定されている細胞を任意の他の化学的方法で溶解する化学的細胞溶解剤が使用される。好ましくは、細胞から必須イオンを取り去って溶解を惹起するイオン特異的錯化剤を使用することが予定されている。例えばカルシウムイオンによる錯形成によって細胞相互の結合及びインテグリンを通しての細胞−基質結合が解消される。イオン特異的錯化剤としては、例えばカルシウムイオン特異的ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチル−エーテル）−四酢酸）を使用できる。ＥＧＴＡは、好ましくは短時間に高濃度で使用する。さらに例えばＥＤＴＡ (エチレンジアミン四酢酸)、クエン酸塩若しくはエチレンジアミンのような他の錯化剤ないしはキレート化剤、又はコラーゲン−タンパク質構造を攻撃しないその他の化学的細胞死滅剤及び溶解剤を使用することもできる。さらに又、下記の物質も考えられる：ＢＡＰＴＡ／ＡＭ(細胞透過性カルシウム−キレート化剤)、ＤＭＳＯ、ガドリニウム、デスフェリオキサミン、デスフェリチオシン、ヘキサデンタート又はアミノカルボキシラート。上記の化学薬品は単独若しくは混合物で使用することができるが、それらにはうな他の添加剤を補充することができる。好ましくは、化学的細胞死滅剤には例えばトリプシンのような長時間作用させるとコラーゲンを攻撃する可能性のある酵素類を含めない。上記の化学薬品によって、細胞は同時に死滅及び溶解させられる。細胞溶解は、集中的洗浄若しくは細胞を機械的に剪断する適切な処理によって補助することができる。化学的機械的処理の長所は、コラーゲン基質を無細胞化する処理ステップの所要時間がトリプシンによる処理の所要時間と比較して明らかに短い点にある。これによって、第１にコラーゲン基質自体が攻撃される危険性が低下し、さらに第２に基質が長時間に渡って溶液中に膨潤させられないために三次構造がより良好に保持される。さらにもう１つの長所は、「硬質化学薬品」を使用することによって動物起源の場合によっては汚染した酵素による問題を回避できることにある。又もう１つの長所は最終的に、基底膜が無傷のまま保侍される点にある。基底膜は内皮細胞にとっての直接的かつ組織特異的接着基質である。基質タンパク質のグリコシル化度は、細胞移動及び後になってからの細胞の遊走にも影響を及ぼす。従って本発明によると他の基質コンポーネント及びインテグリン類と三次元結合しているコラーゲン基質の天然形を入手することができる。上記の方法を使用すると、弛緩しているが、それらの二次構造及び三次構造は天然重合化コラーゲンにまだ広範に相応しており、新規の細胞、つまりレシピエントの自己細胞又は個々の場合に可能であれば他の免疫耐性細胞を内方成長させるために極めて良好に準備されているコラーゲン構造が入手される。無細胞化された弛緩構造の基質は、おそらく短期間に渡って中継保管若しくは滅菌（例えばＵＶ若しくは陽子による放射線照射、又はエチレンオキサイドガスによって）されるが、それ以上の化学的処理は行われずに、原則的には直ちに、そのつど望ましい、つまりレシピエントにとっての自己細胞とともにイン・ビトロでできる限り完全にコロニー形成させられる。このコロニー形成は通常の培地中で行うことができ、培地には抗生物質を添加することができる。特に錯化剤によって慎重かつ迅速に推移させる細胞溶解の場合は、特別な理由から必要と思われるときには追加の化学的若しくは低温処理を行うことができる。本発明は、個々の場合に広範に無細胞化された基質と免疫耐性細胞、つまり一般にはレシピエントの自己細胞との完全な多層でのコロニー形成が行われることによって既に後になってからの拒絶反応を回避できるという認識を基礎としている。自己細胞の代わりに、移植片レシピエントにとって「適合性」である、即ちレシピエントの身体によってもはや「異質」と認識されないように遺伝子工学的に変化させられた他の起源の細胞も使用することができる。この方法では、レシピエントは全ての接近可能な部位が自己細胞で被覆されている、従ってレシピエントの身体から異質と認識されない移植片を利用できる。この移植片は身体内で通常の再構成機序を受け、その結果として移植片は自然な方法でリモデリングされ、更新され、細胞分化を経てさらに適応させられる。従って移植片は、特に良好に内方成長し、再構成され、場合によってはさらに共増殖するように極めて良好に準備されている。無細胞化基質によって多数の形の移植片を提供することができる。移植片は、各々使用目的に従って様々な自己細胞を用いて、さらに場合によっては領域ごとに相違する自己細胞とともにコロニー形成させることができる。本発明をさらに発展させた場合には、基質内に成長因子類を持ち込むことが予定されている。この場合には、好ましくはそのつどの細胞にとって特異的である例えばＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＣＧＦ又はＰＤＧＦのような因子類を使用できる。同様に、さらに例えばフィブロネクチンのような基質因子類若しくは化学走性因子類も又使用できる。ある好ましい実施形態では、適切な成長因子に対する遺伝子を用いて形質転換されている遺伝的に修飾された細胞を使用することによって成長因子類が細胞コロニー形成に持ち込まれ、その結果移植後の時期に少なくとも一過性の成長因子（類）が発現する。成長因子（類）の一時的発現は、毛細管形成プロセスを増強若しくは誘発することによって移植片に対する受容能の上昇を支援することができる。細胞の形質転換ないしはトランスフェクション（移入）を行うには、適切な方法を選択しなければならない。この場合には、エレクトロポレーション、リポソームによる遺伝子伝達、レセプター媒介性エンドサイトーシス、タンパク質コーティング又はその他の周知で文献中に十分に記載されている方法の中から最も適切な方法を使用することができる。或いは又、成長因子を細胞外基質中に直接持ち込むこともできる。これは例えば微小莢膜被包化形で若しくは適切な被覆によって行うことができよう。これによって成長因子は短期間、又は移植後の一定の期間に渡って遅延して移植片へ遊離させられ、その結果一時的に成長因子の局所的高濃度が発生し、そこから毛細管形成プロセスを誘発するためのシグナル作用が生み出される。この方法に従って入手された移植片は直ちに使用することができる。保管及び輸送は、無菌及び非脱水条件下で最大の注意を払って慎重に行わなければならない。完成した移植片に特別な脱水及び再水和又はその他の構造を変化させる措置を行うことは推奨されない。特に実質性器官においては、その組織が異質と認識されないようにどの細胞をどこで増殖させるかという制御が特に重要である。管状血管及び心臓弁移植片においては、目的にに合うように外側では自己（筋−）線維芽細胞及び内側では内皮細胞が使用される。線維芽細胞は重層で増殖し、この方法で自己細胞との外見上無傷のコロニー形成を確保するが、それによって顆粒球組織による浸潤は回避される、若しくは少なくとも強度に妨害される。管状血管の外側への細胞の塗布は、例えば粘性液体を用いて行うことができる。細胞はそれによって外面上でより良好に止まるので、内方成長が容易になる。粘性又はさらに例えばコラーゲン、血漿若しくはフィブリノーゲンを含有できるゲル化能力のある溶液を使用することができる。本発明はそれに応じて特に、領域ごとに様々に分化した自己細胞とともにコロニー形成させられた間質性結合組織から構成されるレシピエント特異的な生合成移植片を含む。移植片レシピエントから前もって入手されていた自己細胞の代わりに、レシピエントを考慮して遺伝工学的に変化させられた他の起源の偽自己細胞も又使用することができる。間質性結合組織のコラーゲン基質は、可能な限りどこでも露出していてはならない。本発明に従った移植片が皮膚移植片である場合は、好ましくは外側（身体の反対側）ではケラチノサイト及び内側（身体側）では中胚葉起源の細胞とともにコロニー形成させられる。この場合にも表面はそのつど完全にコロニー形成されるので、そこでは主として結局は硬化する、又は身体から異質と認識され、そのために撲滅されてしまう可能性のあるコラーゲン基質が露出していない。皮膚移植片とともに、生合成心臓弁、大動脈、その他の血管、腱、角膜、軟骨、骨、喉頭、心臓、気管、神経半月板、椎間板又は尿管、尿道及び膀胱を入手することができる。後者３つは手術後の患者又は先天性形成異常（例、尿道下裂）における欠損補填に使用することができる。重合化された実際的に自然な状態に放置されている移植片基質のコラーゲンは、天然の状態に広範に相応する高度の機械的安定性及び弾性を有する。これによって、生合成移植片が新たな手術による置換を必要とせずに長期間に渡って、もしかすると永続的にレシピエントの身体内に存在し続けることが可能になる。さらにその上、このコラーゲンは身体固有の再構成における細胞分化にプラスの影響を及ぼす。移植された人工器官は、「内側の再構成」によってより身体固有にさせられる、つまり自己細胞が生体内部に異種基質を吸収して新しい自己基質と交換するのである。下記では、本発明を自己細胞を分離するための分離プロトコールの例及び本方法を実施するための例を含む実施例に基づいて説明する。実施例生合成移植片の製造（一般）トリプシンによる組織の準備(細胞除去)：組織を採取した後に、好ましくは０．０５%トリプシン液中に浸漬し、各々材料の壁厚に従って液中に例えば２４、４８、７２若しくは９６時間放置する。或いは又その時間の代わりにトリプシン液の濃度を変化させてもよい。組織はトリプシン液で完全に被覆されなければならない。この液体は、好ましくは常に攪拌することによって運動させておく。温度は２５〜３７℃の間でなければならない。特に極めて堅い組織の場合は、細胞溶解を補助するために追加してｐＨ値の変化又は慎重な超音波処理を行うことができる。錯化剤ないしはキレート化剤による組織の準備(細胞除去)：典型的には、組織の処理は４℃で約３時間に渡って１％ＥＤＴＡ等張食塩液中に浸漬することによって行う。処理時間は錯化剤の濃度に依存する。この場合にも、必要に応じて例えば超音波処理によって溶解を補助することができる。酵素若しくは錯化剤による細胞及び抗原性組織部分の溶解終了後には、組織を洗浄する、つまり洗浄液中に何度も浸漬する又は長時間に渡って洗浄液を環流させて清浄化する。洗浄には、生理食塩液、ＰＢＳ等のような無菌水溶液を使用できる。洗浄は何日間も継続して行うことができ、それまでに洗い流されていない細胞体をさらに追加して除去する。錯化剤による処理を４℃で行った場合には、洗浄も又この温度で行うのが有益である。この場合、少なくとも約２時間は洗浄すべきであろう。必要な場合は、抗生物質を添加した上で等張液中の組織を約４℃へ冷却し、その後のコロニー形成を行うまで無菌で保管する。この代わりに、例えばガンマ線滅菌、ＵＶ若しくは陽子照射のような放射線照射及びエチレンオキサイド滅菌を行うこともできる。コロニー形成のために使用できる細胞（例、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞）を分離する場合は、従来からの分離プロトコールを使用できる。コロニー形成は、無菌条件下の３７℃において培地中で行うが、培地には場合によって成長因子を添加することができる。完全なコロニー形成のためには、培地を常に動かし、動いている材料を頻回に酸素に接触させることが有益である。種類の異なる細胞ないしは細胞集団とのコロニー形成は様々な方法で行うことができる。本発明の長所は、細胞が広範に天然組成に相応する形状及び三次元ジオメトリーの細胞外基質を見出すことにある。つまり、細胞コロニー形成のために例えば脱水及び再水和のような構造傷害性プロセスを回避しながら生理的状態に近い細胞外基質を使用できる点である。この基質は時間に応じて段階的にコロニー形成させることができる。移植片が皮膚移植片である限りにおいて、組織はその間に担体上に固定されるか、又はある範囲内にはめ込まれ、その後は片側だけが細胞に接触させられる。この方法は上側及び下側についても使用できる。さらに他の材料も一定の領域の適切なはめ込み及び／又は充填によって適切にコロニー形成させることができる。例えば、上からはケラチノサイトと並びに下からは結合組織細胞及び場合によっては皮膚付属形成物の細胞とともにコロニー形成させることができる。或いは又、時間的に皮膚付属形成物のケラチノサイト細胞とのコロニー形成の前に上から送り込むこともできる。管状移植片は、例えば最初は環流中に内側ではコロニー形成させ、その後に結紮若しくははめ込んで外側ではコロニー形成させることができる。生合成血管を製造する場合は、例えば外側から筋線維芽細胞及び内腔の内側からヒト内皮細胞を送り込むことが可能である。目的は、血管の壁内への細胞の内方成長及び細胞外基質の三次元微小周囲内での移動目的についての細胞の分化を達成することである。基質内へのこの細胞遊走は、本発明の本質的な特徴であると同時に重要な長所である。外側からの血管コロニー形成は、最初は平滑筋細胞及びその後は（筋−）線維芽細胞とともに行うことができる。或いは又、内腔の内側では最初は筋線維芽細胞を供給し、その後は時間の経過とともにコンフルエントな筋線維芽細胞−細胞層が形成されるように、同様に内腔内に内皮細胞（培地中に懸濁している）を供給することもできる。内皮細胞及び平滑筋細胞の入手は最新技術に相応して行う。組織の入手患者の下肢から長さ約１ｃｍの伏在静脈を採取してヘパリン加全血中に入れ、この方法で研究室へ輸送する。研究室ではその後イン・ビトロで拡張させるために内皮細胞及び筋線維芽細胞を分離する。内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞の分離及び培養１．材料・ＨＢＳＳ（Ｃｌｉｎｔｅｃ、Ｓａｌｖｉａ、ホンブルク）・Ｃａ²⁺及びＭｇ²⁺を含有するＰＢＳ(Ｓｉｇｍａ)、・コラゲナーゼＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、マンハイム）・１０％（２０％）ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を含有する、Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）を含むＭ−１９９・ヒトプール血清・１００Ｕ／ｍｌペニシリン(Ｓｉｇｍａ)、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）・５，０００Ｕ／ｍｌヘパリン（ＨｅｐａｒｉｎＮｏｖｏ，Ｎｏｒｄｉｓｋ、マインツ、保存料非含有）・６−ウエル培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、フリッケンハウゼン、ドイツ）・フィブロネクチン被膜２．内皮細胞２．１細胞入手方法の例細胞の入手は、その中にＣａ²⁺及びＭｇ²⁺を含有するＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）及び０．２％コラゲナーゼＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、マンハイム）(或いは０．２％コラゲナーゼＡとともにＨＢＳＳ若しくはＭ−１９９を含有するＨＢＳＳ) を含有するＰＢＳによるセグメントの充填、ＨＢＳＳ（５％ＣＯ₂／９５％空気／３７℃）中での３０分間のインキュベーション、場合によっては１時間へのインキュベーション時間の延長、その中に２０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍｌのＭ−１９９による融解(或いは又：血管の切開及び培地が満たされたペトリ皿内への細胞の掻爬)、細胞の捕捉及び遠心分離（３００×ｇ、１０分間）、その中に２０％ＦＫＳ、１０Ｕ／ｍｌペニシリン(Ｓｉｇｍａ)、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン(Ｓｉｇｍａ)、５０μｇ／ｍｌＥＧＦ（内皮細胞成長因子）(Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、マンハイム)、５，０００Ｕ／ｍｌヘパリンを含有する５ｍｌのＭ−１９９内での再懸濁及び１％ゼラチンを用いて前被覆された６ウエル培養プレート上での培養によって行う。或いは又ヒト血清の代わりにＰＢＳ若しくはＮＣＳを使用することもできる。２．２内皮細胞の培養培養は次のことによって行うことができる：３７℃の５％ＣＯ₂、９５％空気において培地を交換しながらの全３日間のインキュベーション。コンフルエントな状態に達した後、細胞を溶解させるためにＣａ²⁺及びＭｇ²⁺を含有しないＰＢＳ中に０．０５トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液を使用する(室温での２〜３分間のインキュベーション)。或いは又、「掻爬」による機械的分離を行うこともできる。引き続いてその中に２０％ＦＢＳを含有するＭ−１９９を用いて洗浄する(トリプシン不活化のため)。３００×ｇで１０分間に渡って遠心分離し、引き続いて再建濁させる。最後に７５ｃｍ²培養ビン中で継代培養する(第１継代、１７５ｃｍ³培養ビン中での約２週間に渡る第２継代)。これらの細胞は移植片上に供与するために使用する。３．筋線維芽細胞３．１ＳＭＣ（“ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ”＝平滑筋細胞）及びＦＢ（“ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”線維芽細胞）の入手これらの入手は次のステップで行う：・脱内皮細胞血管からの外膜（ＦＢ）の機械的分離・１ｍｍ細片への破砕・これらの細片を培養ビン中に少量の培地と一緒に入れる・２〜３日後には、組織部分が培養ビンの底面上に付着する・培養ビンは毎日８時間は垂直に立てておく。３．２ＳＭＣ及びＦＢの培養培養は、３７℃、９５％空気、５％ＣＯ₂において１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細胞密度で２〜３日ごとに培地を交換しながら広範囲にコンフルエントな状態が達成されるまで行う；その後に類別化及び継代培養する。図の説明図１：処理後の豚の大動脈(本発明のステップ（ａ）及び（ｂ）に相応する実験)。基質は弛緩しており、細胞を含有していない。この場合の細胞除去はトリプシンにより行われた。図２：本発明に相応してトリプシンにより無細胞化された大動脈壁表面の走査電子顕微鏡写真。基質原線維が示されている。図３：表面内腔側で単層を形成している内皮細胞とのコロニー形成後の豚の大動脈。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年９月２７日（１９９９．９．２７）【補正内容】請求の範囲１．選択されたレシピエントのための生合成移植片を製造するための下記のステップを含む方法：ａ）天然のコラーゲン基質を含有する同種若しくは異種組織ないしは材料を準備するステップ、ｂ）コラーゲン基質から慎重に細胞を除去し、引き続いて無菌生理食塩液により洗浄することにより広範に全ての抗原反応性細胞を除去し、それによって化学的に修飾されていない実際的に無細胞化された弛緩したコラーゲン基質を入手するステップ、ｃ）無細胞化され、ステップｂ）の処理によって弛緩した材料をそのつどの望ましいレシピエントの同種細胞又はレシピエントに適合するように遺伝工学的に修飾された細胞とともにできる限り完全にコロニー形成させる引き続いての直接的加工によって直ちに使用可能な移植片を入手するステップ。２．コロニー形成させなければならない材料が外側では筋線維芽細胞及び内側では内皮細胞とともにコロニー形成される管状血管であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．管状血管が外側ではまず最初に平滑筋細胞その後に筋線維芽細胞及び内側ではまず最初に筋線維芽細胞その後に内皮細胞とともにコロニー形成されることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．コロニー形成させなければならない材料が外側ではケラチノサイト及び内側では中胚葉細胞とともにコロニー形成される平たく拡張された皮膚移植片として予定されているコラーゲン基質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。５．基質が内側では追加して皮膚附属形生物及び外側ではケラチノサイトとのコロニー形成の前に皮膚附属形成物とともにコロニー形成されることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．細心の注意を払っての細胞除去が酵素による細胞消化、好ましくはトリプシン液中に組織ないしは材料を浸漬することによって行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．細心の注意を払っての細胞除去が化学的細胞溶解剤を用いて、好ましくは特にＥＤＴＡまたはＥＧＴＡのようなイオン特異的錯化剤を用いて行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．材料がステップ（ａ）及び（ｂ）の間及び／又はステップ（ｂ）及び（ｃ）の間に好ましくは４℃へ冷却した等張液中で抗生物質を添加して無菌で中継保管及び／又は、好ましくは例えばＵＶ若しくは陽子による放射線照射、又はエチレンオキサイドガスによって慎重に滅菌されることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。９．管状血管の外側への細胞の塗布が粘性液体を用いて行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。１０．好ましくはコロニー形成において又はコロニー形成の前に成長因子類を適切な形で細胞基質内に持ち込むことによって、又はコロニー形成後に成長因子類をコロニー形成した基質内に持ち込むことによって、基質内に追加して少なくとも１種の成長因子、基質因子又は化学走性因子が持ち込まれることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。１１．コロニー形成のために、成長因子（類）に対してコーディングされた遺伝子を用いて形質転換ないしはトランスフェクションされている遺伝子工学により修飾された細胞が使用されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．入手された移植片が保管及び輸送のために非脱水条件下で無菌で保管されることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。１３．コラーゲン含有同種若しくは異種組織ないしは材料が心臓弁、皮膚、血管、大動脈、腱、角膜、軟骨、骨、気管、神経、半月板、椎間板、尿道、尿管及び膀胱を含むことを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。１４．領域ごとに様々に分化した自己細胞又は遺伝子工学的に変化させられた偽自己細胞とともにコロニー形成された間質性結合組織から構成される、特に請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって入手可能なレシピエント特異的な生合成移植片。１５．実質性器官であることを特徴とする請求項１４に記載の移植片。１６．外側では（筋−）線維芽細胞で重層に及び内側では内皮細胞とともにコロニー形成されており、このとき表面がそのつど完全にコロニー形成されているのでそこでは広範にコラーゲン基質が露出していない生合成心臓弁であることを特徴とする請求項１４に記載の移植片。１７．外側（身体の反対側）ではケラチノサイト及び内側（身体側）では中胚葉起源の細胞とともにコロニー形成させられており、このとき表面がそのつど完全にコロニー形成されているのでそこでは主としてコラーゲン基質が露出していない皮膚移植片であることを特徴とする請求項１４に記載の移植片。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者バーダー、アウグスチヌスドイツ連邦共和国、デー―31275 インメンゼン、ヒンター・デン・ランゲン・ヘーフェン 16 (72)発明者シュタインホフ、グスタフドイツ連邦共和国、デー―31303 ブルクドルフヘッケンダン 12 (72)発明者ハーベリッヒ、アクセルドイツ連邦共和国、デー―30916 アイゼルンハーゲン、ドルフシュトラーセ８

Claims

【特許請求の範囲】１．選択されたレシピエントのための生合成移植片を製造するための下記のステップを含む方法：ａ）天然のコラーゲン基質を含有する同種若しくは異種組織ないしは材料を準備するステップ、ｂ）コラーゲン基質から慎重に細胞を除去し、引き続いて無菌生理食塩液により洗浄することにより広範に全ての抗原反応性細胞を除去するステップ、ｃ）無細胞化され、ステップｂ）の処理によって弛緩した材料をそのつどの望ましいレシピエントの同種細胞又はレシピエントに適合するように遺伝工学的に修飾された細胞とともにできる限り完全にコロニー形成させる引き続いての直接的加工によって直ちに使用可能な移植片を入手するステップ。２．細心の注意を払っての細胞除去が酵素による細胞消化、好ましくはトリプシン液中に組織ないしは材料を浸漬することによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．細心の注意を払っての細胞除去が化学的細胞溶解剤を用いて、好ましくは例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡのようなイオン特異的錯化剤を用いて行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．材料がステップ（ａ）及び（ｂ）の間及び／又はステップ（ｂ）及び（ｃ）の間に好ましくは４℃へ冷却した等張液中で抗生物質を添加して無菌で中継保管及び／又は、好ましくは例えばＵＶ若しくは陽子による放射線照射、又はエチレンオキサイドガスによって慎重に滅菌されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。５．材料のコロニー形成が例えば管状血管では外側では（筋−）線維芽細胞及び内側では内皮細胞とともに様々に分化した自己細胞を用いて局所的に行われることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。６．管状血管の外側への細胞の塗布が粘性液体を用いて行われることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．好ましくはコロニー形成において又はコロニー形成の前に成長因子類を適切な形で細胞基質内に持ち込むことによって、又はコロニー形成後に成長因子類をコロニー形成した基質内に持ち込むことによって、基質内に追加して少なくとも１種の成長因子、基質因子又は化学走性因子が持ち込まれることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。８．コロニー形成のために、成長因子（類）に対してコーディングされた遺伝子を用いて形質転換ないしはトランスフェクションされている遺伝子工学により修飾された細胞が使用されることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．入手された移植片が保管及び輸送のために非脱水条件下で無菌で保管されることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。１０．コラーゲン含有同種若しくは異種組織ないしは材科が心臓弁、皮膚、血管、大動脈、腱、角膜、軟骨、骨、気管、神経、半月板、椎間板、尿道、尿管及び膀胱を含むことを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。１１．領域ごとに様々に分化した自己細胞又は遺伝子工学的に変化させられた偽自己細胞とともにコロニー形成された間質性結合組織から構成される、特に請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって入手可能なレシピエント特異的な生合成移植片。１２．実質性器官であることを特徴とする請求項１１に記載の移植片。１３．外側では（筋−）線維芽細胞で重層に及び内側では内皮細胞とともにコロニー形成されており、このとき表面がそのつど完全にコロニー形成されているのでそこでは広範にコラーゲン基質が露出していない生合成心臓弁であることを特徴とする請求項１１に記載の移植片。１４．外側（身体の反対側）ではケラチノサイト及び内側（身体側）では中胚葉起源の細胞とともにコロニー形成させられており、このとき表面がそのつど完全にコロニー形成されているのでそこでは主としてコラーゲン基質が露出していない皮膚移植片であることを特徴とする請求項１１に記載の移植片。