Die
Kryopräservation
und Lagerung von Organen und Körpergeweben
zur Konservierung und späteren
Verwendung, z.B. im Rahmen einer Transplantation, sind bekannt und
klinisch etabliert. Die verwendeten Techniken unterscheiden sich
dabei nur unwesentlich (Brockbank KGM. Basic Principles of Viable
Tissue Preservation. In: Transplantation Techniques and Use of Cryopreserved
Allograft Cardiac Valves and Vascular Tissue. DR Clarke (ed.), Adams Publishing
Group Ltd., Boston. S 9-23. American Association of Tissue Banks
Standards for Tissue Banking (1995), A.A.T.B., McLean, VA, U.S.A.
European Association of Tissue Banks General Standards for Tissue
Banking (1995), E.A.T.B., Vienna, Austria).
Die
Kryopräservation
findet vor allem bei der Lagerung von menschlichen Herzklappen,
den sogenannten Homografts, und bei der Lagerung menschlicher Venen
oder anderer Gewebe Verwendung.
Der
Einsatz von kryopräservierten
Venenallografts beispielsweise ist ein etabliertes Verfahren in der
Bypasschirurgie (Brockbank KGM et al., Cryopreserved vein transplantation.
J. Cardiac Surg. 7: 170-176, 1992; Gelbfish J. et al., Cryopreserved
homologous saphenous vein: Early and late patency in coronary artery
bypass surgical procedures. Ann. Thorac. Surg. 42:70, 1986; Fujitani
RM et al., Cryoperserved saphenous vein allogenic homografts: An alternative
conduit in lower extremity arterial reconstruction in infected fields.
J. Vasc. Surg. 15: 519-526,
1992) und findet bei Patienten Verwendung, die nicht über genügend körpereigenes
Gefäßmaterial
verfügen,
oder deren Gefäße qualitativ
nicht geeignet sind. Häufig
werden derart kryopräservierte Venen
auch als Bypässe
in infizierten Körperregionen
eingesetzt. Hier verbietet sich der Einsatz prosthetischen Materials
durch die hohe, materialbedingte, Inzidenz des Protheseninfekts.
Allerdings
zeigen kryopräservierte
Venen einen schlechten Langzeitverlauf (Bilfinger TV et al., Cryopreserved
Veins in Myocardial Revascularization: Possible Mechanism for Their
Increased Failure. Ann. Thorac. Surg. 63: 1063-69, 1997 und Kommentar
in Ann. Thorac. Surg. 64: 1524-5, 1997. Marshin RS et al., Cryopreserved
Saphenous Vein Allografts for Below Knee Lower Extremity Revascularization. Ann.
Surg. 219: 664-72, 1994). Ursächlich
hierfür dürfte vor
allem eine immunologisch bedingte Degeneration der Venenwand sein
(Carpenter JP, Tomaszewski JE, Immunosuppression for Human Saphenous
Vein Allograft Bypass Surgery: a Prospective Randomized Trial. J.
Vasc. Surg. 26: 32-42, 1997. Carpenter JP, Tomaszewski JE, Human
Saphenous Vein Allograft Bypass Grafts: Immune Response. J. Vasc.
Surg. 27: 492-9, 1998). Darüber
hinaus werden häufig
thrombotische Frühverschlüsse kryopräservierter
Venen beobachtet. Beide Prozesse wurden bislang in vielen Publikationen
auf die Beschädigung des
Spenderendothels im Rahmen der Kryopräservierung, die bis zum vollständigen Fehlen
desselben führen
kann, oder auf eine eingeschränkte
Funktionalität
des erhaltenen Endothels zurückgeführt (Brockbank
KGM et al., Cryopreserved vein transplantation. J. Cardiac Surg.
7: 170-176, 1992; Brockbank KGM et al., Functional analysis of cyropreserved
veins. J. Vasc. Surg. 11: 94-102, 1990. Laub GW et al., Cryopreserved
allograft veins as alternative coronary conduits: early phase results.
Ann. Thorac. Surg. 54: 826-31, 1992. Louagie YA et al., Viability
of long term cryopreserved human saphenous veins. J. Cardiovasc.
Surg. 31: 92-100, 1990).
Demzufolge
zielen bislang bekannte und bereits patentierte Kryopräservationstechniken
für Allo- und
Xenografts darauf ab, einen möglichst
hohen Erhaltungsgrad des vaskulären
und mikrovaskulären Spenderendothels
nach dem Reinigungsprozess zu gewährleisten. Der Erhaltungsgrad
des Spenderendothels des kryopräservierten
Gewebes wird in der Literatur mit 50%–80% angegeben (Bambang LS
et al., Effects of cryopreservation on the proliferation and anticoagulant
activity of human saphenous vein endothelial cells. J. Thorac Cardiovasc.
Surg. 110: 998-1004).
In
neuerer Zeit wird jedoch gerade dem vaskulären und mikrovaskulären Endothel
im Rahmen der akuten und chronischen Organabstoßung eine Schlüsselposition
beigemessen. Endothel spezifische nicht HLA-Antigene, die zu einer
Aktivierung von CD4 T-Zellen führen,
ermöglichen
es dem Spenderendothel – im
Zusammenwirken mit weiteren akzessorischen Molekülen – fremde Antigene dem Immunsystem
des Empfängers
anzubieten. Die Freisetzung von nicht HLA-Antigenen durch beschädigte Endothelzellen
führt zu
einer chronischen Immunreaktion und möglicherweise zur Graftvaskulopathie und
chronischen Abstoßung
(Rose ML, Role of endothelial cells in allograft rejection. Vasc.
Med. 2(2): 105-14, 1997; Reul RM, Fang JC, Denton MD et al, CD 40
and CD 40 ligand (CD 154) are coexpressed in microvessels in vivo
in human cardiac allograft rejection. Transpalantation 64(12): 1765-74,
1997; Salom RN, Maguire JA, Hancock WW, Endothelial activation and
cytokine expression in human acute cardiac allograft rejection.
Pathology 30(1): 24-29, 1998). Umgekehrt bewirkt die selektive Entfernung
des Spenderendothels das Ausbleiben akuter Abstoßungsreaktionen im Tierexperiment
(Ratte) (Ann. Surg. 206: 757-764, 1987), wo es anschließend zu
einer spontanen Reendothelialisierung kommen kann. Derartig vorbehandelte
Bypässe
zeigten im Tierexperiment verbesserte Standzeiten.
Ausgehend
vom Gedanken, dass die immunologisch bedingte Transplantatabstoßung von
allen zellulären
Bestandteilen des Transplantats ausgeht, wurden verschiedene Methoden
zur Entfernung dieser Zellen entwickelt (U.S. Pat. No. 5,613,982).
Dabei fanden diverse hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Lipasen,
Nukleotidasen, Glykosidasen etc.), aber auch physikalisch-chemische
Maßnahmen
(Gebrauch hypotonischer Medien oder Detergentien, Dampf-Phasen-Frierprozesse,
pH-Extreme etc.) Anwendung (U.S. Pat. No. 5,192,312; U.S. Pat. No. 5,632,778;
U.S. Pat. No. 5,613,982, U.S. Pat. No. 5,843,182, WO 95/24873).
Derartige Maßnahmen haben
aber den prinzipiellen Nachteil, dass nie ausgeschlossen werden
kann, dass diese Behandlungen auch die Festigkeit anderer, für die strukturelle Integrität von Hohlorganwänden ebenfalls
entscheidender Komponenten, wie z.B. der Kollagene, insbesondere
Typ I Kollagen, Proteoglykane oder Glykoproteine, schädigend beeinflussen.
Dies ist um so wichtiger, da schwerste Komplikationen, die auf einer strukturellen
Wandschwäche
der kryopräservierten Venen
beruhen, wie z.B. Einrisse der Venenwand oder Wandaussackungen (Aneurysmen)
der Venen, die zu komplikationsträchtigen Reoperationen führen, die
auch längere
Zeit nach der Implantation in den Menschen auftreten können bestens
bekannt sind (Lehalle B et al., Early rupture and degeneration of
cryopreserved arterial allografts. J. Vasc. Surg. 25: 751-2, 1997.
Couvelard A. et al., Human allograft failure. Hum. Pathol. 26: 1313-20,
1995). Wenn dezellularisiertes Gewebe als Matrix für Rezellularisierungsmaßnahmen
dient, wird es notwendig, das zu transplantierende Gewebe mit hohen
Konzentrationen spezieller Adhäsionsfaktoren
bzw. Wachstumsfaktoren zu inkubieren, um eine erneute Ansiedlung von
Zellen in der Wand zu ermöglichen
(U.S. Pat. No. 5,632,778 und 5,613,982 bzw. U.S. Pat. No. 5,192,312,
U.S. Pat. No. 5,843,182, WO 95/24873). Derartige Präparate sind
teuer, meist nicht für
den klinischen Gebrauch zugelassen und es ist noch weitgehend unbekannt,
in welchem Ausmaß unphysiologisch
hohe Konzentrationen dieser Wirkstoffe die funktionelle Differenzierung
von Geweben beeinflussen. Dies ist um so wichtiger, da, wie oben
bereits erwähnt,
nur vollständig
differenziertes Endothel effektiv ist (Ku D et al., Human coronary
vascular smooth muscle and endothelium-dependent responses after storage
at –75°C. Cryobiology
29: 199-209, 1992).
Es
ist heute bekannt, dass nach herkömmlicher Kryopräservation
immer noch ein gewisser Prozentsatz an viablen Spenderzellen verbleibt,
was als Ansatzpunkt für
immunologische Reaktionen diskutiert worden ist (Yankah AC et al.,
Antigenicity and fate of cellular components of heart valve allografts. In:
Yankah AC, Hetzer R, Yacoub MH, eds. Cardiac valve allografts 1962-1987.
Current concepts on the use of aortic and pulmonary allografts for
heart valve substitutes. Darmstadt: Steinkopff Verlag 1988). Andere
Autoren hingegen halten die Viabilität des Transplantates für immunologisch
unbedeutend und belegen sogar eine bessere Standzeit viabler Transplantate
(O'Brian MF et al.,
A comparison of aortic valve replacement with viable cryopreserved
and valves, with note on chromosomal studies. J. Thorac. Cardiovasc.
Surg. 94: 812-23, 1987. Angell WW et al., Long term function of
viable frozen aortic homografts: a viable homograft valve bank.
J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 93: 815-22, 1987). Generell wird heute jedoch
der viable Homograft bei der Kryopräservation bevorzugt. Beim Herzklappenersatz
mit kryopräservierten
Homografts wurde bei ABO kompatiblen Transplantaten eine milde Abstoßungsreaktion
nachgewiesen, bei ABO inkompatiblen eine moderate akute Abstoßung. Bei
beiden Formen der Abstoßung war
eine T-Zell Aktivierung für
4–10 Tage
nachweisbar. Eine klinische Relevanz bestand nicht (Fischlein T
et al., Immunologic reaction and viability of cryopreserved homografts.
Ann. Thorac. Surg. 60: 122-6, 1995).
Außer diesen
Nachteilen werden in der betreffenden Literatur bisher kaum die
Erkenntnisse zur Verteilung antithrombogener bzw. prothrombogener Aktivitäten bzw.
Wirkstrukturen in der Wand von Hohlorganen berücksichtigt. Während sich
vaskuläres
Endothel (als Deckge webe der Innen- bzw. luminalen Seite von allen
Blutgefäßen und
Blutgefäßklappen)
z.B. durch eine Vielzahl antiaggregatorischer, antikoagulatorischer
und profibrinolytischer Aktivitäten
auszeichnet (Z. Kardiol. 82: Suppl. 5, 13-21, 1993; FASEB J. 2:
116-123, 1988), sind zelluläre Komponenten
der tieferen Gefäßwand vor
allem durch die Expression von Gewebefaktor charakterisiert, der
im Kontakt mit Plasmafaktoren eine sofortige Gerinnungsreaktion
einleitet (Thrombosis Res. 81: 1-41, 1996; J. Clin. Invest. 100:
2276-2285, 1997; FASEB J. 8: 385-390, 1994; Arterioscler. Thromb.
Vasc. Biol. 17: 1-9, 1997). Eine Abschirmung gerade der prothrombogenen
Wandaktivitäten
von Hohlorganen ist nicht nur bei Blutgefäßen und Blutgefäßklappen, sondern
auch bei allen anderen kryopräservierten und
nicht kryopräservierten
natürlichen
oder künstlichen
Hohlorganen bzw. Gefäßen von
größter physiologischer
Bedeutung.
Es
ist beispielsweise bekannt, dass die Thrombomodulinaktivität des verbliebenen
Spenderendothels nach der Kryopräservation
reduziert ist. Dies führt
zu Einschränkung
der antikoagulatorischen Funktion des Spenderendothels (Bilfinger
TV et al., Cryopreserved veins in myocardial revascularization:
possible mechanism for their increased failure. Ann. Thorac. Surg.
63: 1063-9, 1997).
Zur
Vermeidung der oben beschriebenen Nachteile wurde schon frühzeitig
vorgeschlagen durch Methoden der Gewebekonstruktion ("Tissue-Engineerings") neue oder veränderte Organe
mit verbesserten antithrombogenen Eigenschaften zu entwickeln (Weinberg
CB, Bell E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured
vascular cells. Science. 1986; 231: 397-400.). Hierbei konnte auf
Erfahrungen zurückgegriffen
werden, die bei der Ansiedelung einer stabilen Endothelzellschicht
an der Innenseite von Kunststoffprothesen gewonnen worden waren
(Zilla P, Fasol R, Deutsch M, Fischlein T, Minar E, Hammerle A,
Krupicka O, Kadletz M. Endothelial cell seeding of polytetrafluoroethylene
vascular grafts in humans: a preliminary report. J Vasc Surg. 1987;
6: 535-41.). Zilla et al. konnten überzeugend belegen, dass eine
stabile Endothelzellschicht in der Tat die antithombogenen Eigenschaften
solcher Prothesen verbessert. Eine Auskleidung von zu implantierenden
Blutgefäßen mit
vaskulärem
Endothel ist heute ein erklärtes
Ziel der Biotechnologie und des "Tissue-Engineerings".
Beim
Versuch natürliche
Hohlorgane mit Zellen zu besiedeln hat sich herausgestellt, dass
die Vorbeschichtung der betroffenen Organe mit Serum, das dem Empfänger der
derart veränder ten
Organe entnommen worden war, eine ideale Matrix zur Ansiedelung
von Zellen darstellt (Lamm P et al. New autologous coronary bypass
graft: First clinical experience with an autologous endothelialized
cryopreserved allograft. J Thorac Cardiovasc Surg 117: 1217-9, 1999).
Diese Vorbeschichtung zeichnet sich gegenüber einer Vorbeschichtung mit
Fibronectin mit und ohne ein Proteoglycan (z.B. Heparinsulfat) (U.S.
Pat. No. 5,192,312; U.S. Pat. No. 5,632,778; U.S. Pat. No. 5,613,982,
U.S. Pat. No. 5,843,182, WO 95/24873, Zilla P. et al., Endothelial
cell seeding of polytetrafluoroethylene grafts in humans. J. Vasc.
Surg. 6: 535-541,
1987) durch die Verkürzung
des Beschichtungsverfahrens und den Verzicht auf eine Reihe – bei anderen
Verfahren üblichen – klinisch
bislang nicht zugelassener Substanzen (u.a. Fibronectin) aus.
Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine allgemein
anwendbare Methode zur Konservierung und Lagerung von Organen und
Geweben, insbesondere jedoch von Hohlorganen bereitzustellen. Eine
weitere Aufgabe bestand in der Bereitstellung von Organen und Geweben,
die gegenüber
den mit herkömmlichen
Verfahren hergestellten Organen und Geweben eine höhere mechanische
Stabilität
und eine verbesserte immunologische Verträglichkeit aufweisen.
Die
Lösung
dieser Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen, der nachfolgenden Beschreibung
und den Abbildungen.
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Devitalisierung und
Konservierung von Organen und/oder Geweben zur Verfügung, bei
dem die Organe und Gewebe steril entnommen und für mindestens 2 Wochen in Dunkelheit
in einer Flüssigkeit gelagert
werden, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: sterilem Wasser, einer kristalloiden
Flüssigkeit,
einer kolloidalen Flüssigkeit,
einer lipidhaltigen Flüssigkeit
und einer Kombination der genannten Flüssigkeiten. Anschließend werden
Zelltrümmer, zelluläre Abbauprodukte
sowie lösliche
Stoffe unter Druck (abhängig
vom zu perfundierenden Gewebe oder Organ) vorzugsweise jedoch mit
physiologischen, d.h. den natürlichen
organ- und gewebespezifischen Perfusionsdrucken, mit einer Flüssigkeit, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus den vorstehend genannten Flüssigkeit,
ausgewaschen.
Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von
Matrices für
den Teil- und Neuaufbau von Organen und/oder Geweben zur Verfügung. Dieses
Verfahren umfasst die Schritte der Devitalisierung und Konservierung
von Organen und/oder Geweben nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren
und die Zellrepopulation der Organe und Gewebe, z.B. die Reendothelialisierung.
Zusätzlich
wird ein Kultivationsgerät
zur Verwendung in einem der erfindungsgemäßen Verfahren bereit gestellt.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist zur Herstellung veränderter
körpereigener
Organe und Gewebe zur sofortigen klinischen Verwendung dieser Organe
und Gewebe, wie z.B. im Falle von Arterien und Venen, deren sofortige
Implantation nach durchlaufen des Herstellprozesses ohne eine zusätzliche Weiterbehandlung
(z.B. Kryopräservation)
der Gefäße, geeignet.
Die erfindungsgemäß hergestellten
Organe und Gewebe verfügen über deutlich
höhere
biomechanische Stabilitäten,
als die selben Organe und Gewebe nach herkömmlichen Lagerungs- und Konservierungsmethoden
(z.B. Kryopräservation). Zusätzlich stellt
die Erfindung Verfahren zur Verfügung,
die geeignet sind, um die erfindungsgemäßen Organe und Gewebe durch
die Methoden des "Tissue
Engineerings" in
klinisch absolut unbedenklicher Weise weiterbehandeln zu können. Insbesondere stellt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Auskleidung von Hohlorganen
mit vaskulärem
Endothel zur Verfügung,
die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Devitalisierung und Konservierung erhalten werden.
Definitionen
Der
Begriff "Organe" bedeutet, aus Zellen und
Geweben zusammengesetzte Teile des Körpers, die eine Einheit mit
bestimmten Geweben bilden.
Der
hier verwendete Begriff "Gewebe" bedeutet, einzelne
Arten von Zellverbänden,
die gemeinsame Funktionen besitzen und die den Körper aufbauen.
"Erfindungsgemäße Organe" sind Organe der
vorstehenden Definition, die den erfindungsgemäßen Herstellprozess durchlaufen
haben und nur durch zusätzliche
Weiterbehandlung in Form der Zellrepopulation der Organe, vorzugsweise
durch Reendothelialisierung ihre Funktionen ganz oder teilweise
ausüben
können.
Die Zellrepopulation erfolgt vorzugsweise durch Methoden des "Tissue-Engineerings".
"Erfindungsgemäße Gewebe" sind Gewebe der
vorstehenden Definition, die den erfindungsgemäßen Herstellprozess durchlaufen
haben und sowohl mit, als auch ohne Weiterbehandlung in Form der
Zellrepopulation der Organe, vorzugsweise der Reendothelialisierung,
insbesondere durch die Methoden des "Tissue Engineerings" klinisch verwendbar sind.
Als
Gewebe, wie vorstehend definiert, werden auch Hohlorgane verstanden.
Hohlorgane sind beispielsweise Blutgefäße, Blutgefäßklappen, Lymphgefäße, Lymphgefäßklappen,
Herzklappen, Harnleiter, Samenleiter und Bronchien.
Der
Begriff "kristalloide
Flüssigkeit" bedeutet jede Form
von gepufferten oder ungepufferten Salzlösungen.
Der
hier verwendete Begriff der "kolloidalen Flüssigkeit" bedeutet protein-
und/oder zuckerhaltige Lösungen.
Der
Begriff "lipidhaltige
Flüssigkeit" bedeutet jede Form
von fetthaltigen Lösungen.
Der
hier verwendete Begriff "dunkel" bedeutet ohne Einfluss
einer natürlichen
oder künstlichen Lichtquelle.
Der
Begriff "unter Druck" bedeutet Perfusion von
Geweben und Organen mit erfindungsgemäßen Flüssigkeiten unter Applikation
von Druck, abhängig vom
zu perfundierenden Gewebe oder Organ, vorzugsweise jedoch unter
Applikation organ- und gewebespezifischer Druckwerte (d.h. den allgemein
bekannten und für
die betroffenen Gewebe und Organe typischen Blutdruckwerten (= den
physiologischen Druck)). Im Falle von erfindungsgemäßen Hohlgefäßen wird
ein transmuraler Druckgradient über
die Wand von ca. 20–100
mmHg bevorzugt. Im Falle komplexer Organe, wie z.B. der Leber erfolgt
die Applikation eines Druckgradienten via dem natürlichen Blutzufluss
und der Organumgebung. "Steril" bedeutet keinen
Keimen ausgesetzt.
Der
Begriff "variabler
Flow" bedeutet dass über den
im Patent beschriebenen Bioreaktoren verschiedene Flussraten in
den Hohlorganen erzeugt werden können.
Dadurch kann beispielsweise in der Frühphase der erfindungsgemäßen Beschichtung von
Hohlorganen mit Endothelzellen durch Anhebung des Flusses die Expression
von Adhäsionsfaktoren
aus den Endothelzellen gesteigert werden. Dies erleichtert wiederum
die feste Verankerung der aufgebrachten Endothelzellen.
Der
Begriff „Lyophilisation" beschreibt ein bekanntes
Verfahren, das zur Konservierung labiler, alterierender biologischer
Substanzen dient. Die zu trocknenden Substanzen werden in einer
Kältemischung
(z.B. Kohlensäureschnee
in Methylalkohol) schnell und schonend eingefroren und anschließend unter
Hochvakuum (obere Grenze des Vakuums: 0.05–0,1 Torr) gebracht. Das Eis
sublimiert und der entweichende Wasserdampf wird durch die Pumpe, unterstützt durch
geeignete hygroskopische Mittel (z.B. Tiefkühlkondensator) so schnell entfernt
dass in Folge der Verdunstungskälte
die zu trocknende Substanz im gefrorenen Zustande bleibt.
Der
Begriff „Kritisch-Punkt
Trocknung" beschreibt
ein bekanntes Verfahren zum Trocknen biologischer Proben bei dem
Wassers gegen ein Zwischenmedium (z.B. Ethanol) ausgetauscht wird
und dieses Zwischenmedium dann erneut gegen CO2 ausgetauscht
wird. Hierbei macht man sich den Effekt zunutze, dass bei bestimmten
Bedingungen (nämlich
oberhalb des sogenannten kritischen Punkts) nicht mehr zwischen
flüssiger
und gasförmiger
Phase unterschieden werden kann und es so möglich ist, den direkten Phasenübergang
flüssig
=> gasförmig zu
umgehen.
Der
hier verwendete Begriff "Antibiotika" bedeutet pilzliche
oder bakterielle Stoffwechselprodukte und deren Abwandlungsprodukte
mit hemmender oder abtötender
Wirkung gegen Viren, Bakterien und Pilze. Zu den erfindungsgemäß bevorzugten
Antibiotika gehört
unter anderem Gentamicin.
Der
Begriff "Devitalisation" (= Devitalisierung)
bedeutet Abtötung
aller Zellen und die Reduktion der entsprechenden Organe und Gewebe
auf das Niveau des Bindgewebes. Der Begriff der "Devitalisation" bedeutet zusätzlich Lagerung der Zielorgane
entweder bis zum Zeitpunkt ihrer klinischen Verwendung oder bis
zu ihrem Neuaufbau und/oder bis zu ihrer Modifikation.
Der
hier verwendete Begriff "devitaler
steady state" bedeutet
Zustand der Organe und Gewebe nach Devitalisation.
Der
Begriff "Tissue-Engineering" bedeutet Techniken,
die es ermöglichen,
verschiedene, teilweise organspezifische Zellen zu isolieren, zu
kultivieren und zu vermehren (z.B. Reendothelialisation von Hohlorganen
wie Arterien oder Venen). Letztendlich entstehen durch diese Techniken
neue Organe und Gewebe.
Der
hier verwendete Begriff "Matrix" bedeutet Grundgerüst für den Neuaufbau
oder die Veränderung
von Organen und Geweben durch Methoden des "Tissue-Engineerings". Zellen in der Gewebekultur werden
auf diesen "Matrices" propagiert.
Der
Begriff "Repopularisation" bedeutet die Rebesiedelung
mit organ- oder gewebespezifischen Zellen, sog. "Repopulationszellen".
Unter "Apoptose" (griechisch: das
Fallen der Blätter
im Wind) wird ein Vorgang verstanden, der auch programmierter Zelltod
genannt wird und dazu benutzt wird, Gewebe und Organe zu devitalisieren. Apoptose
ist die häufigste
Form von Zelltod im Organismus. Apoptose spielt eine fundamentale
Rolle zur Aufrechterhaltung der Homöostase von Geweben und Organen.
Das Absterben einzelner Zellen ist eine essentielle Voraussetzung
für das Überleben des
gesamten Organismus, denn die Entstehung, Gestaltung und Erhaltung
von Geweben wird nicht nur durch Zellvermehrung und Differenzierung
gesteuert, sondern erfordert auch ein geordnetes Entfernen von überflüssig gewordenen
oder geschädigten
Zellen. Die Apoptose ist durch eine Vielzahl von morphologischen
und biochemischen Veränderungen
definiert. Diese Veränderungen
umfassen das Schrumpfen der Zelle und die Kondensation des Chromatins,
das sich an die Innenseite der Kernhülle anlagert und spezifisch
in hochmolekulare Fragmente von 50 und 300 kbp (Kilobasenpaare)
und in vielen Fällen
in kleinere Fragmente von etwa 200 bp (Basenpaare) und einem Vielfachen
davon gespalten. Zum gezielten Abbau von essentiellen Proteinen
z.B. des Zytoskeletts werden spezifische Eiweiß-spaltende Enzyme wie Proteanen
(Caspasen) aktiviert. Die Komposition der Plasmamembran verändert sich
und die Zelle, insbesondere der Zellkern schrumpft, während die
Zellorganellen relativ lange funktionsfähig bleiben. Schließlich zerfällt die
Zelle in membranumschlossene Abschnürungen ("apoptotic bodies"), die von Phagocyten oder Nachbarzellen
abgebaut werden. Wichtig ist, dass bei der Apoptose die Plasmamembran
intakt bleibt, damit keine Entzündungsreaktion
ausgelöst
wird.
Der
Begriff "synthetisches
Material", wie hier verwendet,
bedeutet jedes organische und/oder anorganische Produkt, das für solche
Zwecke geeignet ist. Insbesondere soll das synthetische Material
die mechanische Stabilität
der erfindungsgemäßen Organe
und Gewebe erhöhen.
Die
Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Devitalisierung und Konservierung
von Organen und/oder Geweben, umfassend die sterile Entnahme und
Lagerung des Organs oder Gewebes für mindestens 2 Wochen im Dunklen
bei einer Temperatur von 0 bis 37 °C in einer Flüssigkeit,
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: sterilem Wasser, kristalloider Flüssigkeit,
kolloidaler Flüssigkeit,
lipidhaltiger Flüssigkeit
oder einer Kombination der genannten Flüssigkeiten und die anschließende Auswaschung
von Zelltrümmern,
zellulären
Abbauprodukten sowie löslichen
Stoffen unter Druck, vorzugsweise unter physiologischem Druck, mit
einer Flüssigkeit,
ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus: sterilem Wasser, kristalloider Flüssigkeit,
kolloidaler Flüssigkeit,
lipidhaltiger Flüssigkeit
oder einer Kombination der genannten Flüssigkeiten, wobei bevorzugte
kristalloide Flüssigkeiten
Bretschneiderscher Kardioplegischer Lösung oder Medium 199 (Seromed)
sind. Weiterhin bevorzugt ist eine kristalloide Flüssigkeit,
die einen Antibiotikazusatz enthält.
Die
Entnahme des Organs oder Gewebes von Toten (Multiorganspendern)
ist besonders bevorzugt.
In
einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt zusätzlich vor
der Lagerung ein mehrfaches Spülen
in der gleichen Flüssigkeit,
in der auch die Lagerung erfolgt. Die Lagerung und Auswaschung von
Zelltrümmern,
zellulären
Abbauprodukten und löslichen
Stoffen kann in der gleichen Flüssigkeit
erfolgen. Es ist hierbei erforderlich, dass im Falle von Geweben
ein Druckgradient über
das Gewebe (z.B. bei Hohlorganen ein transmuraler Druckgradient,
d.h. Druckgradient über
die Wand des Hohlorgans) erzeugt wird. Im Falle von Organen wird ein
Druckgradient zwischen den natürlichen,
organeigenen Blut, und/oder Lymphgefäßen und dem Restorgan erzeugt.
In
einer weiteren Ausführungsform
erfolgt die Auswaschung von Zelltrümmern, zellulären Abbauprodukten
sowie löslichen
Stoffen mehrfach, bevorzugt jedoch mindestens 2-mal, besonders bevorzugt ist
jedoch die 2-malige Auswaschung im Abstand von 6 Wochen. Vorzugsweise
erfolgt die Lagerung und Auswaschung der Organe und Gewebe in einer
sterilen Flüssigkeit.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Auswaschverfahren
für Hohlorgane
in dem erfindungsgemäßen Kultivationsgerät (1).
In
einer weiteren Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die Lagerung der Organe und Gewebe für mindestens 6 Wochen, um einen "devitalen steady
state" zu ermöglichen.
Die Lagerung erfolgt besonders bevorzugt unter sterilen Bedingungen.
In
einer weiteren Ausführungsform
erfolgt die Lagerung der Organe und/oder Gewebe bei einem pH-Wert
zwischen 3 und 9, bevorzugt zwischen 6.9 und 7.8, besonders bevorzugt
zwischen 7,0 und 7,5 und bei einer Temperatur von 0 bis 37°C, besonders bevorzugt
jedoch bei 4°C.
In
einer weiteren Ausführungsform
erfolgt die Lagerung der Organe und Gewebe unter reduziertem Sauerstoffdruck,
besonders bevorzugt unter anaeroben Bedingungen.
In
einer weiteren Ausführungsform
erfolgt die erfindungsgemäße Devitalisierung
und/oder Lagerung mit Gasen, die in der flüssigen Form (wie z.B. flüssiges CO2), oder in der gasförmigen Form vorliegen können. Bevorzugt
handelt es sich bei dem Gas um eine Edelgas.
Die
erfindungsgemäßen Organe
und/oder Gewebe können
nach abgeschlossener erfindungsgemäßer Devitalisierung und Konservierung
getrocknet werden. Diese Trocknung kann durch Lyophilisierung oder
Kritisch-Punkt Trocknung nach Entwässerung erfolgen.
Organe
und Gewebe, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Devitalisierung
und Konservierung hergestellt wurden, weisen im Vergleich zu den
nativen, frisch entnommenen Organen ein nahezu unverändertes
Grundgerüst
(extrazelluläre
Matrix) auf. Diese Organe und Gewebe bieten in idealer Weise – auch ohne
eine spezielle Vorbeschichtung – die
Voraussetzung für
einen Teil- oder Neuaufbau der betroffenen Organe durch Methoden des "Tissue- Engineerings". Darüber hinaus
können die
Organe und Gewebe, wie im Fall der vorbehandelten Blutgefäße, auch
direkt, ohne jede weitere Maßnahme,
klinisch implantiert werden.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
die Devitalisierung und Konservierung von Hohlorganen, beispielsweise
von Blutgefäßen, Blutgefäßklappen,
Lymphgefäßen, Lymphgefäßklappen,
Herzklappen, Harnleitern, Samenleitern, Bronchien und Organen wie
Harnblasen, Lebern, Nieren und Herzen.
Durch
das erfindungsgemäße Verfahren werden
entscheidende Vorteile gegenüber
bislang üblichen
Verfahren erreicht. Die so hergestellten Organe und Gewebe verfügen über deutlich
höhere
biomechanische Stabilitäten,
als die selben Organe und Gewebe nach herkömmlichen Lagerungs- und Konservierungsmethoden
(z.B. Kryopräservation). Bei
erfindungsgemäß hergestellten
Blutgefäßen zeigt
sich ein, im Vergleich zu den selben Hohlorganen nach Kryopräservation,
in signifikant erhöhter Platzdruckwert
(5). Von außergewöhnlicher
Bedeutung ist weiterhin, dass die so vorbehandelten Organe und Gewebe
nicht oder nur wenig antigen sind.
Bevorzugte
erfindungsgemäße Hohlorgane sind,
wenn sie als Arterien und Venen sofort wieder reimplantiert werden,
vollkommen deendothelialisiert und weisen eine die Zellgrenzen überschreitende
Anfärbung
für Keratansulfat
auf, bei ansonsten weitgehender Erhaltung der extrazellulären Matrix
der betroffenen Hohlorgane. Dies betrifft insbesondere die dreidimensionale
Erhaltung der konservierten Kollagenstrukturen. Durch den langsamen
Zerfall der viablen Strukturen während
der Lager- und Konservierungszeit kommt es zu einem Absterben auch
solcher Zellen, die normalerweise die Kryopräservation überleben (z.B. Perizyten, "Pericyte like cells"). Die von diesen
Zellen gebildeten Antigene, die nach einer Kryopräservation
noch nachweisbar sind (im Falle der Perizyten, "Pericyte like cells" beispielsweise der die Gerinnung initiierende
Gewebefaktor ("Tissue Factor")), sind nach Vorbehandlung
mit dem neuen Verfahren nicht mehr nachweisbar.
In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird im erfindungsgemäßen Verfahren
die Devitalisierung von Organen und Geweben, beispielsweise mit
Hilfe niedermolekularer Substanzen, die die Apoptose direkt oder
indirekt induzieren, verstärkt
bzw. beschleunigt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Chemotherapeutikum
(z.B. Methotrexat) zur Induzierung der Apoptose und damit zur Verstärkung und Beschleunigung
der Devitalisierung eingesetzt. Die Verstärkung der Devitalisierung beispielsweise
mittels niedermolekularer Substanzen kann während der erfindungsgemäßen Lagerung
des Organ oder Gewebes oder in einem vorgeschalteten Schritt erfolgen.
Substanzen im Sinne der Erfindung bedeuten jede Substanz, die die
Apoptose direkt induziert oder aber die Interaktion von Signalmolekülen abschwächt oder
verstärkt,
die an der Apoptoseinduktion beteiligt sind. Insbesondere seien
hier die bereits oben erwähnten
Chemotherapeutika genannt.
Weiterhin
betrifft die Erfindung Organe und Gewebe, insbesondere Hohlorgane,
die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt werden. Die Hohlorgane und insbesondere die Gefäße, die
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
devitalisiert und konserviert werden, bieten ideale Voraussetzungen für ihre Verwendung
als Organmatrices beim "Tissue-Engineering" und weisen im Falle
von Blutgefäßen, die
auf der Innenoberfläche
mit Patienten-autologen Endothelzellen ausgekleidet sind, bessere Langzeitoffenheitsraten
auf als nicht beschichtete Hohlorgane bzw. Gefäße. Die Organe und Gewebe zur
Herstellung der erfindungsgemäßen Matrices
für den
Teil- und Neuaufbau von Organen und/oder Geweben sind ubiquitär verfügbar. Die
erfindungsgemäßen Matrices
können
ohne jeden Aufwand hergestellt werden, sie sind – im Vergleich zu künstlichen
Oberflächen – deutlich
weniger thrombogen und weitaus weniger anfällig für Infektionen. Die Herstellung
kann darüber
hinaus von angelernten, nicht speziell ausgebildetem Personal in
höchster
Qualität
vollzogen werden. Im Falle von Blutgefäßen zeigen die so erzeugten
erfindungsgemäßen Blutgefäße die gleichen Operationseigenschaften
(wie z.B. Näh-
und Stechbarkeit) wie unbehandelte körpereigene Blutgefäße. Es können ebenso
erstmalig auch xenogene Blutgefäße ohne
jede weitere Behandlung nach der erfindungsgemäßen Herstellung in den Menschen
implantiert werden. Es besteht die Möglichkeit zur industriellen
Umsetzung der erfindungsgemäßen Herstellung
im größten Stil
ohne jeden größeren Aufwand.
Durch
das erfindungsgemäße Verfahren werden
im Falle komplexer Organe, wie z.B. Leber und Niere, aber auch im
Falle von Hohlorganen, ideale Matrices für den Neuaufbau oder die Veränderung
dieser Organe und Gewebe durch Methoden des "Tissue-Engineerings" bereitgestellt.
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung neue Kulturmedien, die dadurch gekennzeichnet
sind, dass übliche
Kulturmedien wie Basalmedien oder Vollmedien mit autologen (also
körper-/patienteneigenen)
Wachstumsfaktoren und/oder mit autologen (also körper-/patienteneigenen Adhäsionsmolekülen supplementiert
werden wobei die autologen Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmoleküle aus Blutplättchen hergestellt
werden. Geeignete Basalmedien sind MEM Eagle, DMEM, Medium I99, MCDB
131, Ham's Medium,
Iscore, RPMI (erhältlich z.B.
bei Life Technology, Germany oder Geromed, Germany).
Die
Kultivierung und Vermehrung verschiedener, teilweise organspezifischer
Zellen wird durch das erfindungsgemäße Verfahren und insbesondere durch
die erfindungsgemäßen Kulturmedien
ermöglicht.
Durch die erfindungsgemäßen Kulturmedien wird
die organspezifische Differenzierung der eingesetzten Zellen erhalten
bzw. erst hergestellt. Beispielsweise sind die bei der Propagierung
von Leberzellen (Hepatozyten) unter Verwendung der erfindungsgemäßen Kulturmedien
und Verfahren die bei herkömmlichen
Techniken bekannten Probleme der Vermehrung und Differenzierung
dieser Zellen bedeutungslos. Das heißt, es gelingt problemlos,
die Zellen der Leber (Hepatozyten) zu kultivieren, wenn erfindungsgemäße mit autologen
Wachstumsfaktoren supplementierte Kulturmedien Verwendung finden.
Das gleiche trifft für
die Zellen der Niere zu. Die so gewonnen Zellen dienen zur Modifikation
oder auch dem Neuaufbau von Organen und Geweben, wobei die Organe
und Gewebe auch ihrerseits vorbehandelt (z.B. kryopräserviert)
sein können.
Generell dienen diese Organe und Gewebe als Grundgerüste für deren
Modifikation durch die Behandlung mit den oben erwähnten, durch
die Methoden des "Tissue Engineerings", gewonnen Zellen.
In idealer Weise werden dadurch dreidimensionale Konstrukte erzeugt,
die die jeweiligen Funktionen des nachzuahmenden Organs oder Gewebes
ganz oder teilweise übernehmen
können.
Beispiele
für erfindungsgemäße Hohlorgane, die
sofort nach dem Verfahren zur Devitalisierung und Konservierung
ohne jede weitere Vorbehandlung in den Menschen reimplantiert werden
können,
sind menschliche Blutgefäße, also
Arterien und Venen. Beispiele für
erfindungsgemäße Organe,
die nach dem Verfahren zur Devitalisierung und Konservierung als
Matrices für
den Neuaufbau von Organen verwendet werden können, sind u.a. menschliche Blutleiter,
Lebern, Nieren, Harnleiter und Harnblasen.
Als
besonders bevorzugte erfindungsgemäße Gefäße kommen allo- oder xenogene
Gefäße (Arterien,
Venen, Lymphgefäße) mit
und ohne Auskleidung mit autologen Endothelzellen auf der Innenoberfläche in Betracht.
Weiterhin
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Matrices
für den
Teil- und Neuaufbau von Organen, umfassend die Schritte der Devitalisierung
und Konservierung von Organen und/oder Geweben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
und die Repopularisation dieser Organe und/oder Gewebe, beispielsweise
durch Reendothelialisierung. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von
autologen Zellen, z.B. autologen Endothelzellen für die Repopulation.
Insbesondere bevorzugt ist dabei der Einsatz der neuen Kulturmedien,
enthaltend autologe Wachstumsfaktoren und/oder Adhäsionsmoleküle.
Im
Falle von Hohlorganen, zu denen u.a. allogene Gefäße, xenogene
Gefäße und Harnleiter zählen, erfolgt
nach der Devitalisierung und Konservierung dieser Organe und Gewebe
die Reendothelialisierung. So ist es beispielsweise möglich, Matrices xenogenen
Ursprungs für
den Aufbau eines neuen Gefäßes und
dessen Endothelialisierung (z.B. bovine Brustwandarterien, die dem
erfindungsgemäßen Verfahren
unterzogen wurden) zu verwenden.
Die
Erfindung betrifft daher auch solche Organe und Gewebe, die durch
das erfindungsgemäße Verfahren,
umfassend die Devitalisierung und Konservierung sowie die Reendothelialisierung
hergestellt wurden.
Die
erfindungsgemäßen Hohlorgane,
die vor ihrer Implantation reendothelialisiert wurden, weisen an
der Innenoberfläche
bzw. der luminalen Oberfläche
vorzugsweise eine Auskleidung mit Patienten-autologen Endothelzellen
auf. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung umfasst Gefäße und ihre
Klappen, die mit Empfänger-autologen
Endothelzellen auf der Innenoberfläche bzw. der luminalen Oberfläche ausgekleidet sind.
Perfusionsversuche
von endothelialisierten erfindungsgemäßen Spendergefäßen zeigten
keine Unterschiede in der Endothelmorphologie und Scherkraftstabilität zu vollkommen
intakten, frisch gewonnenen Venen oder Arterien.
Das
Endothel aller Blutgefäße, vaskulären Klappen
und Herzhöhlen
ist nicht nur durch die oben genannten antithrombogenen Merkmale
gekennzeichnet. Es stellt im gesunden, intakten Zustand eine immunologisch
wichtige Barriere gegenüber
der Masse der im Blut befindlichen Abwehrzellen (Granulozyten, Monozyten,
Lymphozyten) dar, die ohne direkte Kontaktmöglichkeit mit der Endothelschicht
vorbeigleiten.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
auf der luminalen Oberfläche
eines Blutgefäßes bzw.
seiner Klappen eine absolut konfluente, gegen die Scherkräfte des
vorbeiströmenden
Blutes dauerhaft verankerte Endothelschicht zu etablieren. Diese wirkt
als komplexer antithrombogener und antiinflammatorischer Katalysator,
um die Thromboembolisierung der Hohlorgane zu verhindern. Organe,
die mit Patienten-autologen Zellen ausgekleidet, verändert oder
gänzlich
neuaufgebaut wurden, lösen
nicht nur keine Immunantwort an deren luminaler Oberfläche aus,
sondern schränken
eine mögliche
immunologische Abwehr auch im Bereich tieferer Wandschichten erfahrungsgemäß so ein,
dass es nicht zu einer klinisch relevanten Abstoßung der Gefäße kommt.
Im Gegensatz beispielsweise zu kryopräservierten und autolog endothelialisierten
Blutgefässen verhindert
das neue Verfahren erstmalig die bei diesen Gefäßen noch vorhandene leichte
Restabstoßungsreaktion
vollständig
und ermöglicht
erstmalig bei gleichzeitiger Verwendung des ebenfalls erfindungsgemäßen Einsatzes
der neuen Kulturmedien mit autologen Wachstumsfaktoren eine klinikrelevante
Rebesiedelung komplexer Organe wie beispielsweise der Leber oder
der Niere, die bislang an der Antigenität der Grundsubstanz dieser
komplexen Organe gescheitert sind.
Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung den klinischen Einsatz komplexer
Organe, die dem erfindungsgemäßen Verfahren
entsprechend hergestellt wurden.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird die Zellrepopulation, insbesondere die Reendothelialisierung
ohne jede Vorbeschichtung der Spendergefäße mit Adhäsionsfaktoren oder Serum allein
durch die direkte Aussaat und Ansiedelung der Zellen, die unter
Einsatz der neuen Kulturmedien mit autologen Wachstumsfaktoren hergestellt wurden,
auf die Gefäßinnenoberfläche vorgenommen.
Dies ist mit keinem bislang bekannten Beschichtungsverfahren möglich.
Die
Erfindung betrifft daher ebenfalls Verfahren zur Erzeugung und Verwendung
der neuen Kulturmedien. Autologe Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmoleküle, wobei
die autologen Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmoleküle aus Blutplättchen hergestellt
werden, werden erfindungsgemäß erstmalig als
Zusatz zu Kulturmedien und zur Initialbehandlung der zu repopularisiereden
Organe und Gewebe verwendet. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von
mit autologen Wachstumsfaktoren und/oder Adhäsionsmolekülen angereicherten erfindungsgemäßen Kulturmedien,
um vor der Aussaat der Zellen eine Vorbeschichtung der Hohlorgane
mit autologen Adhäsionsmolekülen oder
mit Wachstums- und Adhäsionsfaktoren
zu erreichen. Diese erfindungsgemäßen Kulturmedien eignen sich
bevorzugt zur Züchtung
von Zellen aus dem Gefäßsystem
des Menschen, insbesondere vaskulärer Endothelzellen. In der
Biotechnologie, insbesondere für
den Einsatz am Menschen, ist die Verwendung von nicht-autologen
oder gentechnisch hergestellten Wachstumsfaktoren klinisch und forensisch
oftmals problematisch. Dies drückt
sich in eindrucksvoller Weise dadurch aus, dass nahezu jedes sich
zur Zeit auf dem Markt befindliche Kulturmedium vom jeweiligen Hersteller trotz
nachgewiesener Eignung für
die Zellkultur, nicht für
den Einsatz am Menschen freigegeben ist. Hierfür ursächlich sind die in der Regel
diesen Medien zugefügten
Bestandteile humanen oder tierischen Ursprungs, insbesondere bei
den serumfreien Medien. Die sich daraus möglicherweise ergebenden Haftungsansprüche an die
jeweiligen Hersteller verhindern einen klinischen Einsatz komplexer
Wachstumsmedien am Menschen. Die erfindungsgemäßen Kulturmedien ermöglichen,
dass die Züchtung
humaner Zellen problemlos ist.
Beispiele
für Basalmedien,
d.h. basale chemisch definierte Kulturmedien für verschiedene Zelltypen sind:
Minimal Essential Medium (MEM) zur Züchtung von adhärenten Säugetierzellen
(Dulbecco R, G. F. Plaque production by the Polyoma virus. Virology.
1959; 8: 396-397),
Medium 199 für
die Züchtung
von Maus-Fibroblasten oder RPMI Medium zur Züchtung von Tumorzellen. Diese
Medien unterscheiden sich in der Zusammensetzung u.a. von Aminosäuren, Vitaminen,
Spurenelementen, organischen Salzen und anderer organischer Stoffe
die das Wachstum der kultivierten Zellen ermöglichen.
Der
Begriff Basalmedien wird hier gleichbedeutend mit "basale chemisch definierte
Medien" verwendet.
Der Begriff "basale
chemisch definierte Medien" wird
in der Gewebekultur für
Kulturmedien von bekannter qualitativer und quantitativer chemischer Zusammensetzung
benutzt. Im Gegensatz dazu enthalten andere Medien, hier genannt
Vollmedien Naturprodukte wie z.B. Tierserum.
Für die optimale
Züchtung
von Säugetierzellen
werden basale chemisch definierte Medien mit verschiedenen Seren
supplementiert. Vorzugsweise mit fetalem Kälberserum (FCS) oder Neugeborenem Kälberserum
(NCS) und/oder mit anderen nicht genau definierten Wachstumsfaktoren
(z.B. endothelial cell growth supplement: ECGS).
Ein
weiterer Teilaspekt der Erfindung betrifft daher Verfahren, bei
dem autologe, auf verschiedene Weise gewonnene Wachstumsfaktoren
entweder alleine oder in Kombination mit autologem Serum oder in
Kombination mit anderen nicht-autologen Wachstumsfaktoren den entsprechenden
Kulturmedien zugesetzt werden. Hierbei spielt es keine Rolle, ob
bevorzugt basale chemisch definierte Medien (z.B. MCDB 131) oder
sogenannte Vollmedien (z.B. Gibco HE-SFM) verwendet werden. In jedem
Fall wird 1. das Wachstum der Zellen, insbesondere der Endothelzellen,
deutlich beschleunigt (Wachstumskurven, siehe 2),
2. die Differenziertheit der Zellen signifikant erhöht und 3.
die Lebensdauer der Zellen vervielfacht. Als weiterer, besonders
hervorzuhebender Vorteil ist die absolute klinische Unbedenklichkeit
der so aus chemisch definierten Medien entstehenden neuen Kulturmedien
zu betonen, die erstmals die Voraussetzung für eine wirtschaftliche Verwertung
fast aller bisher nach den Methoden des "Tissue Engineering" produzierten Produkte schafft. Dies
dürfte
ein neuer Meilenstein für
die Umsetzung in vitro hergestellter Gewebe- und Organe für die sichere
Anwendung am Menschen sein.
Detaillierte Beschreibung
der erfindungsgemäßen Kulturmedien
Die
neuen Kulturmedien dienen zur Steigerung von Wachstum, Remodellierungsvorgängen und
Reduktion von Entdifferenzierungsvorgängen von vaskulären Zellen
in der Zellkultur und sind dadurch gekennzeichnet, dass einem basalen
chemisch definierten Medium oder einem Vollmedium autologe (also
körper-/patienteneigenen)
Wachstumsfaktoren und/oder autologe Adhäsionsmoleküle zugesetzt werden, wobei
die Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmoleküle aus Blutplättchen hergestellt werden.
Das erfindungsgemäße Kulturmedium
umfasst neben dem Basalmedium (= basales chemisch definiertes Medium)
oder Vollmedium 5–30%,
vorzugsweise 5–20%,
insbesondere bevorzugt 10–15% autologes
Serum. Autologes Serum meint patienteneigenes (von dem Patienten
gewonnenes) Serum, das die autologen Wachstumsfaktoren und/oder
die autologen Adhäsionsmoleküle enthält und vorzugsweise
nicht hitzeinaktiviert ist.
Zusätzlich können dem
erfindungsgemäßen Kulturmedium
rekombinante Wachstumsfaktoren zugesetzt werden. Beispiele für geeignete
rekombinante Wachstumsfaktoren sind bFGF, VEGF, EGF, TGF, "Scatter-factor", PDGF oder eine
Kombination dieser Wachstumsfaktoren.
Die
autologen Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmoleküle werden aus Blutplättchen und/oder weißen Blutkörperchen
hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die autologen Wachstumsfaktoren
und Adhäsionsmoleküle aus angereicherten
Blutplättchen
gewonnen. Weiterhin können
die autologen Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmoleküle aus geronnenem autologem
Vollblut durch Zentrifugation hergestellt werden. Vorzugsweise wird
das gewonnene autologe Vollblut für mindestens für 1 Stunde
bei 37°C
oder für
6 Stunden bei 4°C gelagert.
In
einer weiteren Ausführungsform
kann dem erfindungsgemäßen Kulturmedium
zusätzlich
Glycosaminoglycan zugegeben werden. Besonders bevorzugte Glycosaminoglycane
sind Heparin, Heparinsulfat, Chondroitin, Chondroitinsulfat, Dermatin
oder Dermatinsulfat.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
kann das erfindungsgemäße Kulturmedium
zusätzlich
mit Transferrin, Hydrocortison, Insulin oder Albumin supplementiert
werden.
Das
erfindungsgemäße Kulturmedium
ist zur Anzucht von vaskulären
Zellen, insbesondere Endothelzellen, Perizyten, "Pericyte-like-cells" und glatten Muskelzellen geeignet.
Weiterhin ist das Kulturmedium auch zur Anzucht von nicht vaskulärer Zellen,
insbesondere von Hepatozyten geeignet.
Darüber hinaus
kann das Kulturmedium als Kultivationsmedium im Rahmen des "Tiss Engineerings" verwendet werden.
Insbesondere ist es als Medium zur Vorbeschichtung ("Precoating") vaskulärer Prothesen,
Herzklappen und Bypässen
beim "Tissue-Engineering" geeignet. In einer
bevorzugten Ausführungsform
kann das erfindungsgemäße Kulturmedium
als Präservationslösung bei
der Gewebe-Lagerung (dem "Tissue-Banking") eingesetzt werden.
In
einer weiteren Ausführungsform
können die
autologen Wachstumsfaktoren durch mechanische Zerstörung körpereigener
Gewebe gewonnen werden. Bevorzugt können die autologen Wachstumsfaktoren
durch chemische und/oder biochemische Zerstörung körper eigener Gewebe gewonnen werden.
Besonders bevorzugt können
die autologen Wachstumsfaktoren durch Apoptose körpereigener Gewebe gewonnen
werden. Weiterhin kann die Gewebezerstörung durch Ultraschall erfolgen.
Nachfolgend
sind bevorzugte Verfahren zur Gewinnung von autologem Serum beschrieben:
Gewinnung von autologem
Serum:
Entnahme
von Vollblut ohne gerinnungshemmende Substanzen (wie z.B. Citrat)
vom Empfänger
des zu produzierenden Gewebes. Einleitung der physiologischen Gerinnung
durch künstliche Oberflächen (z.B.
Serumröhrchen)
oder gerinnungsaktivierender Substanzen (z.B. Thrombin). Gewinnung
des Serums durch Zentrifugation des entstehenden Blutkuchens bei
400 g für
10 Minuten. Anschließendes
Abpipettieren des Überstandes
(= Serum).
Gewinnung von autologem
Serum angereichert mit aus Blutzellen freigesetzten autologen Wachstumsfaktoren:
Die
Gewinnung von Vollblut ohne gerinnungshemmende Substanzen nach dem
Fachmann bekannten Methoden. Durch Einleitung der Gerinnung (siehe
oben) kommt es auch zur Aktivation von Blutzellen, insbesondere
von Blutplättchen
und weißen
Blutkörperchen.
Eine Initiierung der Gerinnung und gleichzeitige Aktivation der
Blutzellen kann auch durch Zugabe von „Aktivatoren" (z.B. 1IE/ml Thrombin)
erfolgen. Dabei kommt es zur progredienten Ausschüttung von
Wachstumsfaktoren (z.B. VEGF, PDGF, FGF). Es ist beispielsweise
bekannt, dass die Freisetzung von VEGF aus den aktivierten Blutplättchen nach
1 h bei 37°C
ein Maximum erreicht. Um möglichst
viele der Wachstumsfaktoren zu gewinnen, wird das geronnene Blut
deshalb für
mindestens eine 1 h bei 37 °C
oder mindestens 6 Stunden bei 4 °C
gelagert. Anschließend
erfolgt zur Gewinnung des Serums mit den darin enthaltenen Wachstumsfaktoren die
oben genannte Zentrifugation und das Abpipettieren des Überstandes,
der einen Großteil
der Wachstumsfaktoren enthält.
In
einer weiteren Verfahrensvariante zur Herstellung von autologem
Serum mit einem höherem Anteil
von autologen Wachstumsfaktoren aus Blutzellen wird Citratblut gewonnen
und die festen Bestandteile (Blutzellen) abzentrifugiert. Entsprechend dem
gewünschten
Anreicherungsfaktor wird ein Teil des Überstandes (Plasma) abpipettiert.
Nach Resuspension der Blutzellen und Rekalzifikation wird die Gerinnung
durch künstliche
Oberflächen
oder durch phy siologische Aktivatoren (z.B. Vollblut oder Thrombin)
eingeleitet. Die Gewinnung des wachstumsfaktorenreichen Serums erfolgt
wie oben beschrieben.
Nachstehend
ist die Gewinnung von autologen Wachstumsfaktoren aus Blutzellen
beschrieben:
Gewinnung thrombozytärer autologer
Wachstumsfaktoren:
Abnahme
von Citratblut. Gewinnung von plättchenreichem
Plasma durch vorsichtige Zentrifugation (315 g für 10 Minuten) und Abpipettieren
des Überstandes.
Freisetzung der autologen Wachstumsfaktoren durch Degranulation
der Plättchen nach
Rekalzifikation und Aktivierung mit bevorzugt Vollblut (1 ml auf
10 ml Plättchen-reiches
Plasma). Angereicherte Wachstumsfaktoren können durch vorheriges Ankonzentrieren
der Plättchen
z.B. auf 2 Million/ml und anschließender Aktivation wie vorstehend
beschrieben gewonnen werden.
Die
Gewinnung von weißen
Blutkörperchen erfolgt
beispielsweise durch Zentrifugation von Citratblut, Abpipettieren
des "Buffy coat" und anschließender Aktivation
(z.B. mit FMLP).
In
einer weiteren Verfahrensform können
ankonzentrierte weiße
Blutkörperchen
und Blutplättchen
gemeinsam aktiviert werden. Die Gewinnung des Wachstumsfaktoren
reichen Serums erfolgt wie oben durch Zentrifugation.
Gewinnung von autologen
Wachstumsfaktoren aus Blutzellen und anderen Geweben durch mechanischen
Aufschluss der Zellen:
In
einer bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Lyse der Zellen durch Komplementaktivierung oder Apoptose.
Gewinnung von konzentriertem
autologem Serum oder konzentriertem wachstumsfaktorenreichen Serums:
Entzug
von Wasser aus den Seren durch einen Konzentrator (z.B. Dextranomer,
Polyacrylamid). Dextranomer und Polyacrylamid Konzentratoren sind kommerziell
erhältlich
(Sephadex von Pharmacia, Bio-Gel P von Bio-Rad Laboratories). Alternativ
können
andere Kon zentratoren wie Silika-Gel, Zeolites, Dextramines, Alginate
Gel, crosslinked Agarose verwendet werden.
Gegebenfalls
kann das gewonnene Gemisch gegen physiologische Lösungen (Hanks
Salze, Earle's Salze,
Basalmedien) dialysiert werden.
Neben
der Zugabe von autologem Serum und autologen Wachstumsfaktoren in
basale chemisch definierte Medien erwies sich der zusätzliche Zusatz
von Heparin, Insulin, Hydrocortison, ggf. Transferrin und Selen
als wachstumssteigernd. Insbesondere Heparin erwies sich als wichtiger
Co-Faktor.
Nachfolgend
sind Verwendungsmöglichkeiten
des erfindungsgemäßen Kultivationsgeräts beschrieben:
Die
Beschichtung erfindungsgemäßer Hohlorgane kann
mit allen für
derartige Maßnahmen üblichen
Apparaturen vorgenommen werden, besonders geeignet ist jedoch das
erfindungsgemäße Kultivationsgerät (Bioreaktor)
(1). Es ergaben sich folgende Vorteile durch die
Verwendung dieses Kultivationsgerätes:
Es wird ein konstanter,
beliebiger Druckgradient über die
Venenwand erzeugt. Zusätzlich
kommt es zum Transport von Medium über die Venenwand, das zur Ernährung der
aufgebrachten Endothelzellen und ggf. anderer in die Venenwand eingebrachter
Zellen dient. Außerdem
werden möglicherweise
noch vorhandene gefäßwandinhärente Antigene
in das Außenmedium
ausgewaschen. Zusätzlich
kann mit dem erfindungsgemäßen Bioreaktor
eine Dauerperfusion besonders von endothelialisierten Hohlorganen
vorgenommen werden, falls es erforderlich erscheint, bestimmte Differenzierungszustände von
Zellen besonders zu unterstützen.
Hierbei kommt es zu einer deutlich gesteigerten Synthese der extrazellulären Matrix,
die die Scherkraftstabilität
der aufgebrachten Endothelschicht der betroffenen Hohlorgane besonders
fordert. Bei diesem Gerät
handelt es sich um ein einfaches, leicht zu handhabendes, kostengünstiges und
sicheres Hilfsmittel zur Endothelialisierung von Hohlorganen jeder
Art.
Weiterhin
ist das erfindungsgemäße Kultivationsgerät auch für folgende
Prozesse geeignet:
- • Zur Rezellularisierung von
prosthetischem und organischem Material, insbesondere zur Reendothelialisierung
mit und ohne Perfusion des Hohlorgans.
- • In
Modifikation (3), zur Ausschwemmung ungewünschter
löslicher
und nichtlösli
cher Stoffe aus prosthetischem und organischem Material, insbesondere
von Hohlorganen.
Die
Ausschwemmung erfolgt durch Applikation eines transmuralen Druckgradienten
(Druckgradient über
die Wand des Hohlorgans), der der Aufrechterhaltung eines für die Ausschwemmung
dieser Stoffe zusätzlich
erwünschten
osmotischen und onkotischen Gradienten zwischen dem zu behandelten
Gewebe und dem Außenmedium
dient und durch einen zusätzlichen
Austausch des Außenmediums.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung von Matrices für
den Teil- und Neuaufbau von Organen und Geweben kann bei allen natürlichen
und künstlichen
Hohlorganen und deren Bestandteilen angewendet werden, beispielsweise
bei natürlichen
Blutgefäßen, Blutgefäßklappen,
bei Lymphgefäßen, Lymphgefäßklappen,
bei Harnleitern und Harnblase, Samenleitern, Bronchien, beim Herzen
und insbesondere bei Herzklappen.
Bei
der Herstellung sogenannter biologischer Herzklappen aus xenogenen
Materialien (beispielsweise aus bovinem Perikard) werden die betroffenen
Ausgangsmaterialien oft mit sogenannten Quervernetzern (z.B. Glutaraldehyd)
fixiert. Hierdurch verlängert
sich die mögliche
Dauer der Lagerung der betroffenen Ausgangsmaterialien. Anschließend werden
die Ausgangsmaterialien auf sogenannte "Stents" zur Erreichung einer biologischen Form
und biomechanischen Stabilität
aufgezogen. Diese "Stents" dienen auch als
Widerlager für
das Verankern der chirurgischen Nähte bei der Implantation. Es
ist bekannt, dass es nach Implantation derartiger Herzklappen zu
chronisch ablaufenden immunologischen Vorgängen kommt, die letztendlich
in einer Degeneration der betroffenen Herzklappe führen. In
der Regel beträgt
die Haltbarkeit solcher Herzklappen nach ihrer Implantation in den
Menschen maximal 15 Jahre, danach muss ein Austausch der Herzklappe
in einem Zweiteingriff mit deutlich erhöhtem Operationsrisiko für den betroffenen
Patienten durchgeführt
werden. Ursächlich
für diese
immunologischen Vorgänge
sind antigene Strukturen des zur Herzklappenherstellung verwendeten
Ausgangsgewebes. Bei Verwendung der erfindungemäßen Ausgangssubstanzen werden
solche antigenen Strukturen vollständig beseitigt und die Standzeiten
biologischer Herzklappen verbessert. Derartige erfindungsgemäße Herzklappen
können
nun ohne jede Weiterbehandlung implantiert werden. Sie können aber auch
mit jeder bislang bei der Her stellung von biologischen Herzklappen
verwendeten Präservationssubstanz
oder Technik weiterbehandelt werden.
Es
konnte festgestellt werden, dass sich, im Falle von Hohlorganen,
insbesondere von Venen, die mechanische Stabilität der beschichteten und unbeschichteten
erfindungsgemäßen Hohlorgane
nach 12-monatiger Lagerung nicht von der frisch entnommener Spendervenen
(Platzdrucktest und histologische Untersuchungen der extrazellulären Matrix)
unterschied. Allerdings zeigten die erfindungsgemäßen Gefäße eine,
im Vergleich zu kryopräservierten
Gefäßen, deutlich
erhöhte
mechanische Stabilität (5).
Vorzugsweise
kann das erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung von Matrices für
den Teil- und Neuaufbau von Organen und Geweben bei Spendergefäßen (Venen
oder Arterien), sowie bei Xenografts angewendet werden. Ein besonderer
Vorteil besteht hier in der Möglichkeit
diese Gefäße vor ihrer
Beschichtung antiviral zu behandeln. Dies ist möglich, da die Gefäßwand der
erfindungsgemäß hergestellten
Gefäße eine
deutlich höhere
mechanische Stabilität
aufweist, als beispielsweise die Wand eines kryopräservierten
Gefäßes.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
erfolgt nach erfindungsgemäßer Auswaschung
komplexer Organe die Repopularisierung dieser Organe mit Zellen
in organspezifischen dreidimensionalen Rotationsapparaturen. Derartige
Rotationsapparaturen sind kommerziell erhältlich (Rotary Cell Culture SystemTM der Firma Synthecon, Inc, USA).
Es
ist weiterhin möglich
Gefäße, die
mit Patienten-autologen Endothelzellen auf der Innenoberfläche ausgekleidet
sind, wobei die Endothelzellen aus anderen Quellen (z.B. peripheres
Blut, Knochenmark, Fettgewebe, gentechnisch verändertes oder hergestelltes
Endothel, xenogenes und gegebenenfalls gentechnisch verändertes
xenogenes Endothel) gewonnen worden sind, erfindungsgemäß zu verwenden.
Darüber hinaus
kann Patienten-autologes Epithel gentechnologisch hergestellt werden,
so dass Epithel erhalten wird, das das Patienten-autologe Epithel
in seinen Oberflächeneigenschaften
bzw. immunologischen Eigenschaften imitiert.
In
einer weiteren Ausführungsform
ist das erfindungsgemäße Hohlorgan
zusätzlich
auf der Außenoberfläche von
einem Mantel aus einem synthetischen Material umschlossen. Dieses
synthetische Mantel kann aus einem resorbierbaren Material bestehen,
beispielsweise aus synthetischer Polyglyconsäure. Hohlorgane, die von einem
Mantel aus synthetischem Material umgeben sind, weisen den Vorteil auf,
dass sie für
mehrere Monate stabilisiert sind.
Im
Vergleich zu bislang veröffentlichten
Ergebnissen zur Antithrombogenität
von Bindegewebe zeigen die erfindungsgemäßen Organe und Gewebe eine
deutliche geringere Thrombogenität. 4a und b zeigen eine erfindungsgemäße Vene,
die 16 Stunden nach ihrer Implantation in einen Patienten wieder
entnommen wurde. Sie zeigt eine vollkommen glatte Oberfläche ohne
jedwede Anheftung von Fibrin, Thrombo-, und Leukozyten. Die bei
dieser Operation ebenfalls verwendeten körpereignen Arterien und Venen
waren allesamt von Thrombo- und Leukozyten Anlagerungen (4c) überzogen
und vollständig
thrombosiert.
Die
erfindungsgemäß hergestellten
Organe können
im gesamten Bereich der Medizin und Veterinärmedizin, der Chirurgie, insbesondere
in der Herz- und Gefäßchirurgie
verwendet werden. Besondere Verwendung finden unbeschichtete oder
beschichtete erfindungsgemäße Gefäße als aortokoronare
Bypässe
bei koronarer Herzkrankheit und als Gefäßtransplantate bei Gefäßrekonstruktionen
jeglicher Art. Dies betrifft z.B. die periphere arterielle Verschlusskrankheit,
aneurysmatische Veränderungen an
Gefäßen, die
einen Ersatz dieser Gefäße notwendig
machen, sowie sämtliche
Wiederholungsoperationen am Herzen und an den Gefäßen. Insbesondere sind
diese Gefäße das ideale
Conduit für
den Einsatz in infizierten Körpergebieten.
Weitere Indikationen für den
Einsatz derartiger Gefäße stellen
eine Vielzahl angeborener Missbildungen dar (beispielhaft seien jegliche
Formen von Shuntoperationen erwähnt).
Zusätzlich
eignen sich derartige Gefäße zu grundlagenwissenschaftlichen
Untersuchungen wie z.B. Arterioskleroseforschung oder Permeationstestung
von Pharmaka. Von besonderem Vorteil ist die Möglichkeit, unbeschichtete Gefäße jederzeit,
ohne jede Vorbehandlung, implantieren zu können. Hierdurch wird auch eine
klinische Vorratshaltung derartiger Gefäße, wie beispielsweise bei
künstlichen
Prothesen bekannt, ermöglicht.
Der erfindungsgemäße Herstellprozess
stellt somit erstmalig in der Geschichte der Medizin einen jederzeit
verfügbaren
organischen Alternativbypass zur Verwendung am Herzen zur Verfügung.
Die
Figuren dienen der Erläuterung
der Erfindung.
1 zeigt
ein Kultivationsgerät
(Bioreaktor) zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Es besteht durchgängig
aus biologisch inerten, autoklavierbaren Teilen und durch dieses
Gerät kann
ein beliebiger Druckgradient über
die Venenwand aufgebaut werden. Des weiteren kann die Vene mit beliebigem
Druck und Fluss mit Hilfe einer Pumpe perfundiert werden.
Das
Kultivationsgerät
umfasst ein mit Medium gefülltes
Kulturgefäß (1),
in dem sich das Hohlorgan befindet (z.B. eine Vene (2)).
Das Lumen der beiden Venenenden ist mittels zweier Adapter (3)
mit den beiden Auslässen
des Kulturgefäßes verbunden. Ein
Adapter ist mit einer Computer-kontrollierten peristaltischen Pumpe
verbunden (7). Der andere Adapter endet an einem Vorrats-
oder Abwurfgefäß (5) mit
einem Steigrohr (4). Stellt das Gefäß (5) ein Abwurfgefäß dar, muss
die Leitung (6) an ein Vorratsgefäß angeschlossen werden. Der
Druckgradient Δp (abhängig vom
Steigrohr (4) und Druckgeber (8)) wird nach gewünschtem
Druckgradienten über
die Gefäßwand eingestellt.
Ist der durch das Steigrohr (4) gebildete Druck ausreichend,
kann die Apparatur auch ohne Druckgeber (8) benutzt werden.
Durch die peristaltische Pumpe (7) kann computergestützt ein Mediumwechsel
im Innenlumen der Vene durchgeführt
werden oder eine kontinuierliche/diskontinuierliche Perfusion des
Gefäßes (2).
Druckleitung (9), Zugangsports (10).
In 2 ist
das Wachstumsverhalten von kultivierten humanen makrovaskulären Endothelzellen
aus der Vena Saphena magna unter verschiedenen Kultivationsbedingungen
und täglichem
50% Mediumwechsel dargestellt.
- a) Kultivation
der Zellen in Medium MCDB131 mit 20% Pool Serum.
- b) Kultivation der Zellen in Medium MCDB131 mit 20% autologen
Serum.
- c) Kultivation der Zellen in Medium MCDB131 mit 20 % Poolserum
+ 10 ng/ml rbFGF.
- d) Kultivation der Zellen in Medium MCDB131 mit 20% erfindungsgemäßen Wachstumsfaktorenreichen
autologen Serum (aus Plättchenreichem Plasma:
2 Millionen Plättchen/ml).
Es
ist ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Medium (d) die weitaus besten
Kulturbedingungen für
menschliche Endothelzellen bietet.
3 zeigt
eine Modifikation des Kultivationsgerätes in 1 zur erfindungsgemäßen druckabhängigen Spülung eines
Hohlorganes. Hierbei findet keine Mediumrezirkulation statt (vgl. 1).
Das Vorratsgefäß I (11)
beinhaltet die Flüssigkeit,
die in das Innenlumen des Hohlorgans (2) unter Druck (abhängig vom
Steigrohr (4) und Druckgeber (9)) über die
Pumpe (7) appliziert wird und im Abwurfgefäß I (5)
aufgefangen wird. Das Vorratsgefäß II (12)
beinhaltet die Flüssigkeit,
die der Umspülung
des Hohlorgans (2) mit Hilfe der Pumpe (8) dient
und im Abwurfgefäß II (6)
mit der über
die Wand des Hohlorgans filtrierte Flüssigkeit gesammelt wird. Druckleitung
(10), Zugangsports (13), Sterilfilter (14).
4 zeigt
eine erfindungsgemäße Vene nach
Implantation im Vergleich zu einer körpereigenen Vene. Die 4a und 4b zeigen
eine erfindungsgemäße Vene,
die 16 Stunden nach ihrer Implantation in einen Patienten wieder
entnommen wurde. Sie zeigt bei histologischer Evaluierung eine vollkommen
glatte Oberfläche
ohne jedwede Anheftung von Fibrin, Thrombo- und Leukozyten. Im Vergleich dazu
zeigt 4c die Innenoberfläche einer
bei dieser Operation ebenfalls verwendeten körpereigenen Vene. Sie war vollständig thrombosiert
und zeigte bei histologischer Evaluierung Fibrin, Thrombo- und Leukozytenauflagerungen.
In 5 sind
die Platzdruckwerte von a) frisch entnommenen Venen, b) kryopräservierten
Venen unmittelbar nach dem Auftauen und c) erfindungsgemäßen Venen
nach 12 monatiger erfindungsgemäßer Lagerung
dargestellt.
Die
nachfolgenden Beispiele erläutern
die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen.