DE60121450T2

DE60121450T2 - Mittels gewebetechnologie hergestellte dezellularisierte gegenstände und gewebe

Info

Publication number: DE60121450T2
Application number: DE60121450T
Authority: DE
Inventors: Shannon Oakland MITCHELL; Jennifer Irvin KOH; E. Laura Hillsborough NIKLASON; Vikas Durham PRABHAKAR
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 2000-08-16
Filing date: 2001-08-16
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2021-08-17
Also published as: DE60121450D1; AU2001284968B2; WO2002014480A9; EP1315796A2; US20080248080A1; CA2419817A1; ATE332964T1; CA2419817C; WO2002014480A3; US20060073590A1; US20020115208A1; EP1315796B1; US20120135049A1; WO2002014480A2; US6962814B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein Schaden, eine Funktionsstörung oder der Verlust von Gewebe sind Merkmale von sehr verschiedenen medizinischen Beschwerden. Die Atherosklerose, bei welcher die Bildung von Fettablerungen auf den Wänden der Blutgefäße dazu führt, dass sich die Gefäße verengen, stellt ein gut bekanntes Beispiel dar. Unfälle führen häufig zu einem Schaden an Sehnen, Bändern und Gelenken. Degenerierende Krankheiten wie Arthritis stellen eine andere Verletzungsquelle für solche Gewebe dar. Systemische Krankheiten wie Diabetes, Krebs und Zirrhose sind noch eine weitere Ursache für eine Zerstörung oder Funktionsstörung von Organen.
Bei vielen der oben beschriebenen Situationen stellt ein Ersatz des geschädigten Gewebes oder Organs die beste oder sogar die einzige Möglichkeit dar. Eine Transplantation von menschlichen Spendern (entweder lebenden oder toten) hat sich eines beträchtlichen Erfolges erfreut und Verfahren wie die Transplantation von Leber, Herz und Niere werden zunehmend eingesetzt. Die große Knappheit an Spendern, die Komplexität bei der Entnahme der Organe und deren Übertragung auf die Empfänger sowie die mögliche Übertragung von infektiösen Agenzien stellen jedoch beträchtliche Nachteile dieser Lösungsmöglichkeit dar. Bei einigen Situationen wie dem Ersatz von Blutgefäßen, werden die Gefäße aus einem Teil des Körpers entnommen und an einem anderen Ort transplantiert, um an Stellen mit einer Zerstörung einen Bypass zu bilden. Die Anzahl der zur Verfügung stehenden Gefäße ist jedoch beschränkt und die zur Verfügung stehenden könnten nicht über eine optimale Festigkeit oder andere Parameter verfügen.
Die Verwendung von synthetischen Materialien oder von Tieren stammenden Geweben bieten Alternativen zu der Verwendung von menschlichen Geweben. Beispielsweise finden aus synthetischen Polymeren wie Dacron hergestellte Transplantate beim Ersatz der Gefäße Verwendung. Mechanische Prothesen werden weithin eingesetzt, um geschädigte Herzklappen zu ersetzen. Der Einsatz von synthetischen Materialien weist jedoch eine Anzahl von Nachteilen auf. Das Material ist häufig immunogen und kann als Ausgangspunkt für eine Infektion oder Entzündung dienen. Der Einsatz tierischer Gewebe bringt sowohl Probleme der Immunogenität. mit sich als auch die Möglichkeit, Krankheiten zu übertragen. Darüber hinaus können entnommene tierische Gewebe hinsichtlich ihrer Größe, Form oder anderer Eigenschaften nicht optimal passen, was daher die Nützlichkeit und Flexibilität dieser Lösungsmöglichkeit einschränkt. Es besteht ein Bedarf nach innovativen Lösungsmöglichkeiten für das Problem des Ersatzes von geschädigten oder funktionsgestörten Organen und Geweben.
Tissue Engineering ist ein sich entfaltendes Gebiet, in welchem versucht wird, im Labor Techniken zur Kultivierung von Ersatzgeweben und -organen zu entwickeln (siehe z.B. Niklason, L. und Langer, R., Advances in tissue engineering of blood vessels and other tissues, Transplant Immunology, 5, 303–306, 1997). In der allgemeinen Strategie zur Herstellung von Ersatzgeweben werden Säugerzellen verwendet, die auf ein geeignetes Substrat für eine Zellkultur aufgetragen werden. Die Zellen lassen sich von dem in Frage kommenden Empfänger erhalten (z.B. mittels Biopsie), in welchem Falle sie oft vor der Aussaat auf das Substrat in Kultur vermehrt werden. Die Zellen können auch von anderen Quellen (z.B. von bewährten Zelllinien) erhalten werden. Nach der Aussaat geht das Zellwachstum im Allgemeinen im Labor und/oder nach der Implantation des manipulierten Gewebes im Patienten weiter.
Die mittels Tissue Engineering erhaltenen Konstrukte können für verschiedene Zwecke verwendet werden, auch als Prothesevorrichtungen für die Reparatur oder den Ersatz von geschädigten Organen oder Geweben. Sie können auch in vivo als Liefersysteme für Proteine oder andere Moleküle dienen, welche von den Zellen des Konstrukts ausgeschieden werden oder allgemein als Liefersysteme von Arzneimitteln. Mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukte können in vitro auch als Modelle für die Gewebsfunktion oder als Modelle für das Testen der Wirkungen von verschiedenen Behandlungen oder Arzneimitteln dienen.
In der Tissue Engineering-Technolgie kommt auch häufig die Auswahl einer geeigneten Kultur vor, um das Gewebswachstum aufrecht zu erhalten oder zu fördern. Im Allgemeinen sollten diese Substrate dreidimensional und bearbeitbar sein, um Stützgewebe mit der gewünschten Form für das in Frage kommende Gewebe zu bilden. Es sind einige Stützgewebsklassen bekannt. Diese Stützgewebe lassen sich in fünf allgemeine Kategorien einteilen: (1) nicht abbaubare synthetische Polymere; (2) abbaubare synthetische Polymere; (3) nicht humane Kollagengele, die nicht porös sind; (4) nicht humane Kollagennetzee, die auf die gewünschte Porosität gebracht werden; und (5) dezellularisiertes humanes (totes) Kollagengewebe.
Diese unterschiedlichen Stützgewebstypen werden weiter unten näher beschrieben.
Nicht abbaubare synthetische Polymere, z.B. Dacron und Teflon, lassen sich zu verschiedenen Fasern und Geweben verarbeiten. Diese Materialien sind jedoch im Wesentlichen biologisch nicht abbaubar und sind somit nach der Implantation in den Körper der Ausgangspunkt einer Infektion oder Entzündung. Abbaubare synthetische Polymere, zu denen Substanzen wie Polyglykolsäure. Polymilchsäure, Polyanhydride usw. zählen, lassen sich ebenfalls zu verschiednen Fasern und Geweben verarbeiten und wurden in breitem Umfang als Stützgewebe für Gewebekulturen eingesetzt. Diese Materialien können chemisch modifiziert werden, um ihre Abbaugeschwindigkeit und Oberflächeneigenschaften "anzupassen". Fragmente von abbaubaren Polyestern können jedoch beträchtliche und unerwünschte Entzündungsreaktionen hervorrufen.
Nicht humane Kollagengele, aus Rinderkollagen und Mäuseschwanz-Kollagen hergestellte Gele, sind gewöhnliche Stoffe, mit denen im Laboratorium gearbeitet wird, sie weisen jedoch beträchtliche Nachteile auf, wie z.B. geringe Zugfestigkeit, kein Porenvolumen, damit die Zellen wachsen können und sich das Gewebe entwickeln kann, sowie eine Empfindlichkeit gegenüber Kollagenasen, welche das Gel mit der Zeit schwächen. Nicht humane Kollagennetze bestehen aus porösen Netzwerken, die aus verarbeitetem Rinderkollagen hergestellt werden. Während die Nützlichkeit dieser Netze für Tissue Engineering-Anwendungen nur wenig untersucht worden sind, bergen sie wie bei allen aus Rinderproteinen hergestellten Materialien die Gefahr von immunologischen und/oder entzündlichen Reaktionen, wenn sie in einen menschlichen Patienten implantiert werden, sowie die Gefahr der Kontamination mit auf Prionen basierenden Krankheitserregern.
Insgesamt ist unter allen Gesichtspunkten betrachtet keines der zurzeit verfügbaren Stützgewebe für Gewebskulturen zufrieden stellend. Somit besteht ein Bedarf nach verbesserten Stützgeweben für Gewebskulturen zum Einsatz beim Tissue Engineering.
Im Allgemeinen stellen Stützgewebe für Gewebskulturen ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von mittels Tissue Engineering gewonnen Produkten dar. Der Bedarf nach verbesserten Stützgeweben für Gewebskulturen stellt einen Aspekt des weitergefassten Bedarfs nach verbesserten mittels Tissue Engineering gewonnen Produkten zur Implantation in Mensch oder Tier dar, um kranke, geschädigte oder fehlende Gewebe und/oder Organe zu ersetzen oder zu ergänzen. Wie im Falle von tierischen Geweben können mittels Tissue Engineering gewonnene Gewebe, die durch die Verwendung von Zellen erzeugt wurden, welche nicht von dem in Frage kommenden Empfänger stammen, antigen sein. Andererseits kann bei Verwendung von Zellen, welche von dem in Frage kommenden Empfänger stammen, ein beträchtlicher Zeitraum benötigt werden, um das mittels Tissue Engineering gewonnene Gewebe oder Organ herzustellen, vorausgesetzt, dass nur eine beschränkte Zahl von Zellen entnommen werden kann. Es besteht daher ein Bedarf nach verbesserten Verfahren zur Herstellung von mittels Tissue Engineering gewonnenen Geweben und Organen mit minimaler Antigenizität. Es besteht auch ein Bedarf nach flexibleren Verfahren zur Herstellung von mittels Tissue Engineering gewonnenen Geweben und Organen, z.B. nach Verfahren, in denen man Zellen aus dem in Frage kommenden Empfänger verwenden könnte, während für die Produktion des mittels Tissue Engineering gewonnenen Gewebes oder Organs möglichst wenig Zeit benötigt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung handelt von Verfahren zur Herstellung dezellularisierter Stützgewebe zur Verwendung beim Tissue Engineering und zur Herstellung von dezellularisierten mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukten und Geweben für eine Implantation in den Körper. Auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Verfahren handelt die Erfindung auch von dezellularisierten Stützgeweben zur Verwendung beim Tissue Engineering, von mittels Tissue Engineering gewonnenen dezellularisierten Konstrukten und von manipulierten Geweben, die für eine Implantation in den Körper geeignet sind. Darüber hinaus handelt die Erfindung von Verfahren zur Behandlung eines Individuums, das den Ersatz oder das Wachstums eines Gewebes oder Organs benötigt, indem die erfindungsgemäßen manipulierten Konstrukte oder Gewebe implantiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird ein Substrat mit einer ersten Zellpopulation beimpft (d.h. in Kontakt gebracht), vorzugsweise mit Zellen, von denen bekannt ist, dass sie extrazelluläre Matrixmoleküle wie Kollagen und Elastin ausscheiden. Das Substrat kann flach, röhrenförmig oder im Allgemeinen so gestaltet sein, dass es jede gewünschte dreidimensionale Form annimmt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Substrat röhrenförmig. Das Substrat besteht vorzugsweise aus einem biokompatiblen Material, z.B. aus einem biokompatiblen Polymer mit Eigenschaften oder Einbaumodifikationen, die es für eine Haftung an der Zelle und/oder für Wachstum geeignet machen.
Geeignete Zelltypen für das Beimpfen des Substrats sind Fibroblasten und glatte Muskelzellen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung stammen die Zellen zum Beimpfen des Substrats von einem Individuum der gleichen Art wie das Individuum, in welches das Konstrukt schließlich implantiert wird, um die Immunogenität möglichst klein zu halten. Soll das Konstrukt z.B. in einen Menschen implantiert werden, können menschliche Zellen verwendet werden, um das primäre, mit Zellen beimpfte Konstrukt zu bilden.
Das Konstrukt wird unter Bedingungen in Kultur gehalten, welche für das Wachstum der Zellen über einen Wachstumszeitraum geeignet sind, während welchem die Zellen die extrazellulären Matrixmoleküle ausscheiden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden mehrfache Beimpfungen und Wachstumszeiten angewendet. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden mehr als ein Zelltyp eingesetzt. Beispielsweise können eine oder mehrere Beimpfungen mit einer Mischung von Zellen verschiedener Typen durchgeführt werden. Alternativ können bei einer Beimpfung Zellen von nur einem Typ verwendet werden, aber für alle Beimpfungen wird nicht notwendigerweise der gleiche Typ eingesetzt. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden die Wachstumsbedingungen, z.B. die Medien für die Gewebskultur, ausgesucht, um die Ablagerung der extrazellulären Matrix zu steigern. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden während der Wachstumszeit(en) Reize. z.B. pulsierende Kräfte, eingesetzt. Derartige Reize können ausgesucht werden, um die Entwicklung gewünschter Eigenschaften, wie z.B. mechanische Festigkeit, zu begünstigen.
Nachdem die Zellen ein Gewebe mit gewünschter Dicke gebildet haben, wird das Konstrukt dezellularisiert. Eine Dezellularisierung lässt sich unter Einsatz von jedem der verschiedenen Mittel, wie Detergentien, Emulgatoren, Proteasen und/oder Lösungen von hoher oder geringer Ionenstärke, erzielen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Dezellularisierung unter solchen Bedingungen und ausreichenden Zeiträumen, dass antigene Zellen und Zellkomponenten im Wesentlichen entfernt werden und ein mittels Tissue Engineering gewonnenes dezellularisiertes Konstrukt (Stützgewebe) zurückbleibt, welches primär aus extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagen und Elastin besteht. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das anfangs beimpfte Substrat im Wesentlichen oder ganz aus dem Stützgewebe entfernt.
Nach dem Dezellularisierungsprozess kann das dezellularisierte Konstrukt zur Entfernung der Komponenten der Dezellularisierungslösung gewaschen werden. Wie unten beschrieben, kann das dezellularisierte Konstrukt zusätzlichen Tissue Enuneering-Schritten unterzogen werden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das dezellularisierte Konstrukt zur späteren Verwendung aufbewahrt. Um das dezellularisierte Konstrukt während der Lagerung zu konservieren, können verschiedene Verfahren wie die Kältekonservierung und das Trocknen nach verschiedenen Vorschriften eingesetzt werden. Alternativ kann das dezellularisierte Konstrukt für ein weiteres Tissue Engineering verwendet oder in den Körper eines Subjekts implantiert werden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das Konstrukt vor der Implantation mit einem biologisch aktiven Mittel behandelt.
In einem anderen Aspekt handelt die Erfindung von Verfahren zur Herstellung manipulierter dezellularisierter Konstrukte, die für eine Implantation in den Körper geeignet sind. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird ein dezellularisiertes mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt wie oben beschrieben aus einem mittels Tissue Engineering gewonnenen Gewebe hergestellt. das dezellularisierte mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukt wird in den Körper implantiert und kann in vivo rezellularisieren. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das dezellularisierte Konstrukt vor seiner Implantation mit jeweils einem der verschiedenen Mittel zur Beschleunigung des Rezellularisierungsprozesses behandelt.
In einem alternativen Verfahren der Erfindung wird das dezellularisierte mittels Tisse Engineering gewonnene Konstrukt vor seiner Implantation in den Körper mit einer Zellpopulation beimpft, um ein beimpftes mittels Tissue Engineerng gewonnenes dezellularisiertes Konstrukt zu bilden. Vor dieser Beimpfung kann das Konstrukt zur Beschleunigung der Rezellularisierung auf verschiedene Weise behandelt werden. Das beimpfte Konstrukt kann in den Körper eines Subjekts (z.B. eines Tieres oder vorzugsweise eines Menschen) implantiert werden, welches dessen bedarf, oder es kann vor der Implantation unter Bedingungen gehalten werden, welche für das Wachstum und/oder die Differenzierung der Zellen über einen Wachstumszeitraum hinweg geeignet sind.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung stammen die für die Beimpfung verwendeten Zellen von einem Individuum der gleichen Art wie das Individuum, in welches das manipulierte Konstrukt implantiert werden soll. Die Zellen können von demselben Individuum stammen, in welches das manipulierte Konstrukt implantiert werden soll. Es kann eine Kombinatian unterschiedlicher Zelltypen eingesetzt werden. Beispielsweise kann das mittel Tissue Engineering gewonnene dezellularisierte Konstrukt mit einer Mischung von Zellen beimpft werden. Es können unterschiedliche Zelltypen eingesetzt werden, um unterschiedliche Abschnitte oder Oberflächen des Konstrukts zu beimpfen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird (werden) der (die) Zelltyp(en) entsprechend der letzten Verwendung des manipulierten Konstrukts ausgewählt. Soll beispielsweise das Konstrukt als Arterie Verwendung finden, können die geeigneten Zelltypen Gefäßzellen wie z.B. Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten sein. Soll das Konstrukt zur Reparatur einer knorpeligen Struktur verwendet werden, können Chondrocyten und Fibroblasten die geeigneten Zelltypen sein. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden Vorläuferzellen eingesetzt, um die dezellularisierte Stützgewebekultur zu beimpfen. Die Vorläuferzellen können sich während der zweiten Wachstumsphase und/oder nach der Implantation in ein Individuum differenzieren. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden mehrfache Beimpfungen und Wachstumsphasen ausgeführt. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird mehr als ein Zelltyp eingesetzt. Beispielsweise können eine oder mehrere Beimpfungen mit einer Mischung von Zellen verschiedener Typen durchgeführt werden. Alternativ können bei einer Beimpfung Zellen von nur einem Typ verwendet werden, aber für alle Beimpfungen wird nicht notwendigerweise der gleiche Typ eingesetzt. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden während der Wachstumszeit(en) Reize. z.B. pulsierende Kräfte, verabfolgt. Derartige Reize können ausgesucht werden, um die Ausbildung gewünschter Eigenschaften, wie z.B. mechanische Festigkeit, zu begünstigen.
In einem anderen Aspekt handelt die Erfindung von Verfahren zur Herstellung von dezellularisierten, nativen, manipulierten Geweben und auch von nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten dezellularisierten, nativen, manipulierten Geweben. Das Verfahren umfasst die Schritte, dass natives Gewebe einem Tier oder menschlichen Spender entnommen wird, dass das native Gewebe einem oder mehreren Schritten mit Tissue Engineering unterzogen wird und dass das manipulierte native Gewebe dezellularisiert wird. Der Schritt mit Tissue Engineering kann das Beimpfen des nativen Gewebes mit Zellen umfassen sowie das Halten des beimpften Gewebes über eine Wachstumsphase unter Bedingungen, die für das Wachstum der Zellen geeignet sind. Der Schritt mit Tissue Engineering kann die Verabfolgung eines mechanischen oder elektrischen Reizes, z.B. eines pulsierenden Reizes, an das native Gewebe umfassen.
Nach der Dezellularisierung kann das Gewebe in den Körper eines Subjekts implantiert oder weiteren Schritten mit Tissue Engineering unterzogen werden. Solche Schritte können jeden der oben angegebenen Schritte umfassen, z.B. das Beimpfen mit einer Zellpopulation und das Halten des beimpften Gewebes über einen Zeitraum unter Bedingungen, welche das Wachstum der Zellen begünstigen. Das Gewebe kann auch aufbewahrt und sodann zur Verwendung wieder aufbereitet werden. In den Ausführungsformen der Erfindung, in welchen das dezellularisierte, manipulierte, native Gewebe mit Zellen beimpft wird, können die Zellen von dem Individuum stammen, in welche das Gewebe implantiert werden soll. Das Beimpfen mit Zellen von dem Individuum, in welche das Gewebe implantiert werden soll, kann die Wahrscheinlichkeit einer Abstoßungsreaktion des Immunsystems verringern.
In einem anderen Aspekt handelt die Erfindung von der Behandlung eines Individuums, das den Ersatz oder das Wachstum eines Gewebes oder Organs benötigt. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren die Herstellung eines dezellularisierten mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts oder eines dezellularisierten, manipulierten, nativen Gewebes und die Implantation des Konstrukts oder Gewebes in den Körper des Individuums mit Hilfe standardmäßiger chirurgischer Verfahren. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren die Herstellung eines dezellularisierten mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts oder eines dezellularisierten, manipulierten, nativen Gewebes, das Beimpfen des Konstrukts oder Gewebes mit Zellen und die Implantation des Konstrukts oder Gewebes in den Körper des Individuums mit Hilfe standardmäßiger chirurgischer Verfahren. In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Konstrukt oder Gewebe vor der Implantation in den Körper des Individuums über eine Wachstumsphase in Kultur unter Bedingungen gehalten, die das Wachstum der beimpften Zellen begünstigen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das Konstrukt oder Gewebe mit Zellen beimpft, welche von dem Individuum stammen. Nach der Implantation können die Zellen in vivo von dem Individuum in das Gewebe wandern und die überimpfte Zellpopulation ergänzen. Die Wanderung der Zellen in das Konstrukt kann beschleunigt werden, indem z.B. das Konstrukt vor oder nach der Implantation mit Wachstumsfaktoren, chemotaktischen Mitteln oder anderen Verbindungen behandelt wird. Das Konstrukt kann Zellen umfassen, die gentechnisch bearbeitet wurden, um einen oder mehrere dieser Wachstumsfaktoren, chemotaktischen Stoffe usw. zu produzieren.
DEFINITIONEN
Um den Gegenstand der beanspruchten Erfindung klarer und präziser darzulegen, werden die folgenden Definitionen für spezifische, in der Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen verwendete Ausdrücke angegeben.
Allogen – In Bezug auf einen Empfänger ist eine allogene Zelle oder ein allogenes Gewebe eine Zelle oder ein Gewebe, die von einem Spender der gleichen Art wie der Empfänger stammen oder von ihm herrühren.
Tier – Der hier verwendete Ausdruck Tier umfasst auch Menschen. Wenn daher auf Prozesse wie die Entnahme von Gewebe aus einem Tier Bezug genommen wird, soll das bedeuten, dass das Tier auch ein Mensch sein kann. Obwohl hier manchmal Bezug auf "ein Tier oder einen Menschen" genommen wird, soll das nicht besagen, dass der Ausdruck Tier nicht auch Menschen mit einbezieht.
Künstliches Substrat – Der hier verwendete Ausdruck künstliches Substrat umfasst Stoffe, wie abbaubare oder nicht abbaubare Polymere, die in vitro synthetisiert (d.h. nicht von einem lebenden Tier oder einer Pflanze produziert) wurden. Es sei darauf hingewiesen, dass das Polymer mit einem von einer lebenden Pflanze oder Tier produzierten Polymer identisch sein kann, z.B. kann das Polymer ein Protein sein, das unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt wurde. Das Substrat kann z.B. auch ein langes Rohrmaterial sein, das mit jedem der verschiedenen Kunststoffe oder aus natürlichen Quellen erhaltenen Materialien beschichtet sein kann. Künstliche Substrate können auch bestimmte Materialien umfassen, die erhalten werden, indem von einer lebenden Quelle produzierte Substanzen isoliert und weiterbearbeitet werden. Insbesondere umfasst der Ausdruck Stoffe, die erhalten werden, indem Gewebe aus einem Organismus entnommen wird und eines oder mehrere von einer lebenden Quelle produzierte extrazelluläre Matrixproteine isoliert und/oder weiterbehandelt werden und beinhaltet daher Kollagenschwämme oder Rafts. Ein Gewebe, das im Wesentlichen intakt bleibt und im Wesentlichen die Struktur beibehält, in der es natürlicherweise im Körper eines Organismus angetroffen wird, wird jedoch nicht als künstliches Substrat angesehen, sondern wird stattdessen als natives Gewebe angesehen. Außer dieser Ausnahme soll der Ausdruck "künstliches Substrat" entweder in Bezug auf das Material oder in Bezug auf die Konfiguration keinerlei Einschränkung unterliegen.
Autolog – Für einen Empfänger ist eine autologe Zelle oder ein autologes Gewebe eine Zelle oder ein Gewebe, die vom Empfänger stammen oder herrühren.
Biologisch aktives Mittel – Ein natürlich vorkommendes oder synthetisches chemisches Gebilde, das in der Lage ist, eine Veränderung im Phänotyp oder Genotyp einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs oder eines Organismus hervorzurufen, wenn es mit der Zelle, dem Gewebe, dem Organ oder dem Organismus in Kontakt kommt.
Zellkomponente – Dieser Ausdruck bezieht sich auf Substanzen, welche einen Teil einer Zelle darstellen und umfasst Zellmembranen und Makromoleküle (z.B. Nucleinsäuren oder Polypeptide), die man normalerweise eingeschlossen in einer Zellmembran, eingebettet in eine Zellmembran oder an einer Zellmembran haftend vorfindet. Dieser Ausdruck umfasst keine Moleküle, die von Zellen ausgeschieden worden sind, z.B. extrazelluläre Matrixkomponenten wie Kollagen, Elastin und Proteoglykane, selbst wenn solche Moleküle an die Zelloberfläche gebunden sind.
Für das Wachstum geeignete Bedingungen – Unter Bedingungen, die für das Wachstum eines besonderen Zelltyps geeignet sind, wird eine Umgebung mit Bedingungen von Temperatur, Druck, Feuchtigkeit, Austausch von Nährstoffen und verdauten Stoffen sowie Gasaustausch verstanden, welche das Überleben und die Reproduktion der Zellen erlauben. Für jeden besonderen Zelltyp kann eine für das Wachstum geeignete Umgebung die Gegenwart besonderer Nährstoffe oder Wachstumsfaktoren erfordern, die benötigt werden oder sich günstig auf das Überleben und die Reproduktion der Zellen auswirken.
Natives Gewebe – Der hier verwendete Ausdruck natives Gewebe ist ein Gewebe, das einem Tier oder einem Menschen entnommen wird, das im Wesentlichen intakt bleibt und im Wesentlichen die Struktur beibehält, in welcher es natürlicherweise im Körper des Tieres oder Menschen gefunden wird.
Nicht zelluläre Strukturkomponenten – Der hier verwendete Begriff nicht zelluläre Strukturkomponente bezieht sich auf eine Substanz, welche in einem biologischen Gewebe (entweder ein natives Gewebe oder ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt) vorkommt, wobei die Substanz von einer Zelle stammt, die im Gewebe vorkommt, jedoch nicht in der Plasmamembran einer Zelle enthalten ist. Beispiele sind Kollagen, Elastin, Proteoglykane, Fibronectin und Laminin.
Vorläuferzelle – Der Ausdruck "Vorläuferzelle" betrifft eine Zelle, die nicht vollständig differenziert ist, die jedoch die Fähigkeit hat, entweder selbst weiter auszudifferenzieren oder welche zu einer Zelle (oder Zellen) führt, welche in der Lage ist weiter auszudifferenzieren. Die Vorläuferzelle kann zu einer oder mehreren unterschiedlichen Zelltypen führen. Der Prozess, mit welchem die Vorläuferzelle zu einer Zelle (oder Zellen) führt, die in der Lage ist, weiter auszudifferenzieren, kann sich über einen oder mehrere Zyklen der Zellteilung erstrecken. Eine Stammzelle ist ein Typ einer Progenitor-Zelle. Der Ausdruck "Progenitor-Zelle" umfasst jedoch auch Zellen, die längs eines Differenzierungsweges einen oder mehrere Schritte unternahmen, die z.B. einen oder mehrere Differenzierungsmarker exprimieren.
Primäres Zellaussaat-Konstrukt – Ein Konstrukt mit einem künstlichen Substrat, welches mit einer Zellpopulation ausgesät worden war und über einen Zeitraum unter Bedingungen, die für das Wachstum und/oder die Zellteilung geeignet sind, in Kultur gehalten wurde.
Sekundäres Zellaussaat-Konstrukt – Ein primäres Zellaussaat-Konstrukt, das mit einer zweiten Zellpopulation ausgesät worden war. Die zweite Zellpopulation kann im Wesentlichen die gleiche Zellpopulation sein, die zur Herstellung des primären Zellaussaat-Konstrukts eingesetzt wurde oder sie kann sich davon unterscheiden.
Mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt – Dieser Ausdruck wird hier im Allgemeinen verwendet, um sich auf eine zwei- oder dreidimensionale Masse von lebendem Säugergewebe zu beziehen, welches primär durch in vitro-Wachstum produziert wurde. Das Konstrukt kann einen oder mehrere Gewebstypen umfassen und jedes Gewebe kann einen oder mehrere Zelltypen umfassen. Der Ausdruck umfasst auch eine zwei- oder dreidimensionale Masse von lebendem Säugergewebe, welches mindestens zum Teil durch in vivo-Wachstum auf einem künstlichen Substrat produziert wurde. Ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt unterscheidet sich von einem Explantat einer entsprechenden natürlichen Quelle, z.B. einem nativen Gewebe, dadurch, dass sich das primäre Wachstum des Konstrukts in vitro abspielt.
Xenogen – Für einen Empfänger ist eine xenogene Zelle oder ein xenogenes Gewebe eine Zelle oder ein Gewebe, das von einem Spender einer anderen Art als der Empfänger abstammt oder herrührt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Bioreaktor mit einem röhrenförmigen Substrat, das für das Wachstum eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts geeignet ist.
2A zeigt in 66-facher Vergrößerung eine mikrofotografische Aufnahme einer unbehandelten mittels Tissue Engineering erhaltenen kleinkalibrigen Arterie, welche mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurde.
2B zeigt in 100-facher Vergrößerung eine mikrofotografische Aufnahme einer unbehandelten mittels Tissue Engineering erhaltenen kleinkalibrigen Arterie, welche mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurde.
3A zeigt in 66-facher Vergrößerung eine mikrofotografische Aufnahme einer dezellularisierten mittels Tissue Engineering erhaltenen kleinkalibrigen Arterie, welche mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurde.
3B zeigt in 100-facher Vergrößerung eine mikrofotografische Aufnahme einer dezellularisierten mittels Tissue Engineering erhaltenen kleinkalibrigen Arterie, welche mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurde.
4A zeigt in 66-facher Vergrößerung eine mikrofotografische Aufnahme einer dezellularisierten mittels Tissue Engineering erhaltenen kleinkalibrigen Rinderarterie, welche mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurde.
4B zeigt in 100-facher Vergrößerung eine mikrofotografische Aufnahme einer dezellularisierten mittels Tissue Engineering erhaltenen kleinkalibrigen Rinderarterie, welche mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurde.
5A zeigt eine mikrofotografische Aufnahme einer mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten mittels Tissue Engineering erhaltenen kleinkalibrigen Schweinearterie vor der Dezellularisierung.
5B zeigt eine mikrofotografische Aufnahme einer mit Hämatoxylin und Eosin angefärbten mittels Tissue Engineering erhaltenen kleinkalibrigen Schweinearterie nach der Dezellularisierung.
6A zeigt eine Phasenkontrastansicht eines Querschnitts einer beimpften dezellularisierten Schweinearterie.
6B zeigt einen fluoreszierenden Querschnitt der gleichen Probe wie in 6B.
GENAUE BESCHREIBUNG BESTIMMTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung Handelt von verschiedenen neuen Verfahren und nützlichen Produkten auf dem Gebiet des Tissue Engineering und dem Ersatz von Geweben und Organen. Genauer gesagt werden in einem Aspekt der Erfindung Verfahren zur Produktion von dezellularisierten mittels Tissue Engineering gewonnener Konstrukte zur Verfügung gestellt, welche sich in den Körper implantieren lassen, z.B. als Behandlungen für Zustände, mit denen ein Schaden oder eine Funktionsstörung von Gewebe einhergeht. Die Implantation in den Körper umfasst das Implantieren auf der Körperoberfläche und/oder das Anheften auf dem Körper zusätzlich zum Implantieren im Körper, so dass das implantierte Konstrukt oder Gewebe vollständig im Körper eingeschlossen ist. Somit können die Konstrukte und Gewebe der vorliegenden Erfindung den Ersatz von Haut, Cornea und anderen Geweben umfassen, welche genau genommen sich nicht im Körper befinden.
Die Konstrukte der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen hergestellt, indem zunächst ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt, wie weiter unten beschrieben, nach irgend einem der verschiedenen Verfahren angezüchtet wird. Typischerweise wird in diesen Verfahren ein Substrat mit Zellen beimpft (d.h. in Kontakt gebracht) und das beimpfte Substrat unter Bedingungen kultiviert, die für das Wachstum der Zellen geeignet sind, um ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt zu erhalten. Mit dem Wachstum und der Teilung der Zellen auf und/oder in dem Substrat scheiden diese extrazelluläre Matrixproteine wie Kollagen und Elastin aus. Das Konstrukt wird über einen Zeitraum kultiviert, der ausreicht, um ein Konstrukt mit der gewünschten Dicke und/oder den gewünschten Eigenschaften zu produzieren, das in erster Linie aus ausgeschiedenen Proteinen und Zellen besteht. Es lassen sich verschiedene Wachstumsbedingungen wählen, um diesen Prozess zu beschleunigen und/oder die Ausbildung gewünschter mechanischer, physikalischer oder biochemischer usw. Eigenschaften zu stimulieren. Derartige Wachstumsbedingungen können den Einsatz besonderer Wachstumsmedien, die Verabfolgung mechanischer, elektrischer und/oder chemischer Reize usw. umfassen. Die Zellen können von einem Tier oder einer Zelllinie der gleichen Art wie der jeweilige Empfänger stammen, so dass das erhaltene Konstrukt Proteine enthält, die möglichst wenig antigen sind und im Körper möglichst gut kompatibel sind. Soll das Konstrukt beispielsweise in einen Menschen implantiert werden, können die Zellen menschliche Zellen sein. Obwohl im Allgemeinen bei der Produktion des mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts das sich bildende Gewebe primär in vitro kultiviert wird, liegen mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukte, die zumindest zum Teil durch Kultivieren des Gewebes in vivo produziert wurden, ebenfalls im Geltungsbereich der Erfindung.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung spielen bei der Herstellung des mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts mehrfache Zyklen der Zellbeimpfung und dazwischen liegende Wachstumsphasen eine Rolle. Die bei den verschiedenen Beimpfungen eingesetzten Zellen können vom gleichen oder von unterschiedlichen Zelltypen sein und/oder sie können aus mehrfachen Zelltypen bestehen. Die Wachstumsphasen und Kulturbedingungen können die gleichen sein oder sie können in den verschiedenen Wachstumsphasen variieren. Um ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Blutgefäß herzustellen, wird z.B. in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ein Substrat mit glatten Muskelzellen beimpft und über einen Zeitraum von z.B. 6 Wochen kultiviert. Nach dieser ersten Wachstumsphase wird das Konstrukt mit Endothelzellen beimpft und über eine weiter Wachstumsphase von z.B. 1 bis 2 Wochen kultiviert.
Nach der Herstellung des mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts wird unabhängig von den bei seiner Herstellung eingesetzten besonderen Schritten das Konstrukt dezellularisiert. Mit geeigneten Dezellularisierungstechniken werden Zellkomponenten entfernt, während die ausgeschiedenen Proteine wie z.B. Kollagen und Elastin im Wesentlichen intakt bleiben. Somit umfasst ein Verfahren der vorliegenden Erfindung die Schritte (i) dass ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt hergestellt wird, indem ein Substrat mit Zellen beimpft wird, dass die Zellen in einer Kultur wachsen gelassen werden und dass wahlweise das Konstrukt einem oder mehreren zusätzlichen Zyklen von Beimpfen und Wachstum unterzogen wird; und (ii) dass das mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt dezellularisiert wird, wodurch ein dezellularisiertes Konstrukt hergestellt wird. Im ersten Schritt können verschiedene mittels Tissue Engineering erfolgende Manipulationen durchgeführt werden, wie z.B. das Verabfolgen von mechanischen oder elektrischen Reizen an das wachsende Konstrukt, die Verabreichung von ausgesuchten biologisch aktiven Substanzen an das Konstrukt (z.B. Wachstumsfaktoren). In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung behält das dezellularisierte Konstrukt im Wesentlichen die gleich Form und physikalischen Eigenschaften wie vor der Dezellularisierung. Insbesondere erhalten Bindegewebe wie Blutgefäße, Muskeln, Knochen, Sehnen und Bänder, die alle wesentliche Komponenten von extrazellulären Matrixproteinen enthalten, den größten Teil ihrer mechanischen Festigkeit von ihren extrazellulären Matrixkomponenten. Der Beitrag der Zellen zu den physikalischen Eigenschaften des Bindegewebes ist eher gering. Somit sind Behandlungen, welche die Zellen entfernen aber an der extrazellulären Matrix nur geringen Schaden anrichten bevorzugt.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird das dezellularisierte Konstrukt sorgfältig gewaschen, um restliche Dezellularisierungslösung zu entfernen, welche die Biokompatibilität mindern oder das nachfolgende Wachstum der Zellen auf oder in dem Konstrukt behindern kann. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung führen der Dezellularisierungsprozess und/oder die nachfolgenden Waschschritte zur Entfernung des meisten oder im Wesentlichen allen Substrats (d.h. des Materials, auf welches die Zellen am Anfang ausgesät wurden), welches nach der Wachstumsphase zurückbleibt. Nach der Dezellularisierung kann das Konstrukt in den Körper eines Subjekts implantiert oder für eine weitere Verwendung aufbewahrt werden. In letzterem Falle lässt sich das Konstrukt leicht wieder aufbereiten, wenn ein Patient ein implantiertes Gewebe benötigt. Eine solche Wiederaufbereitung kann die Entfernung von restlicher Lagerungslösung usw. umfassen. Somit umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen oder mehrere der wahlweisen Schritte (i) Waschen des dezellularisierten Konstrukts, (ii) Entfernen von einigem oder allem restlichen Substrat, (iii) Aufbewahrung des dezellularisierten Konstrukts, (iv) Wiederaufbereitung des dezullularisierten Konstrukts und (v) Implantation des dezellularisierten Konstrukts in ein Subjekt.
Im Gegensatz zu Geweben, die aus tierischen oder menschlichen Spendern entnommen wurden, kann das Substrat (und damit das dezellularisierte Konstrukt selbst) konfiguriert werden, um eine besonders gewünschte Gestalt und Größe anzunehmen, ohne die Beschränkungen, die durch die Form oder Größe von entnommenem Gewebe auferlegt werden. Manipulierte Blutgefäße lassen sich z.B. bis zu einer bestimmten gewünschten Länge oder einem Durchmesser ohne unerwünschte Strukturen wie Verzweigungen oder Ventile heranzüchten. Auch im Gegensatz zu dezellularisierten tierischen Geweben können die von Zellen stammenden Proteine in dem dezellularisierten Konstrukt aus Zellen der gleichen Art wie die des ins Auge gefassten Empfängers stammen. Ohne an irgend eine Theorie gebunden zu sein wird angenommen, dass extrazelluläre Matrixproteine des Menschen im Wesentlichen nicht immunogen sind, wenn sie in einen anderen Menschen implantiert werden, was ihnen gegenüber von tierischen Quellen stammenden Proteinen und auch gegenüber abbaubaren oder nicht abbaubaren synthetischen Polymeren einen Vorzug verschafft. Dies ist so, weil die extrazellulären Matrixkomponenten, welche die nicht zellulären Strukturkomponenten eines dezellularisierten Konstrukts bilden, innerhalb einer Art äußerst konserviert sind. Beispielsweise sind genetische Varianten in Kollagenen und Elastinen äußerst selten. Darüber hinaus lassen sich Zellen (z.B. Fibroblasten oder glatte Muskelzellen) von einem einzelnen Spender erhalten und verwenden, um große Mengen (z.B. hunderte) an Konstrukten herzustellen. Diese Zellen können peinlich genau auf übertragbare Krankheiten (z.B. HIV oder Hepatitis) hin gescreent werden, wodurch das mit den Produkten einhergehende Infektionsrisiko verkleinert wird. Manipulierte Gewebe lassen sich unter Verwendung von Zellen produzieren, welche gewünschte Eigenschaften wie die Fähigkeit zu gutem Wachstum in einer Kultur aufweisen und, welche genetisch modifiziert wurden, um z.B. ihre Ausscheidung von extrazellulären Matrixkomponenten zu verändern usw.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das dezellularisierte Konstrukt für weiteres Tissue Engineering als Stützgewebe eingesetzt. In dem Falle, dass das Stützgewebe nach dem Dezellularisierungsprozess aufbewahrt wurde, lässt sich je nach der bei der Lagerung eingesetzten Technik das Stützgewebe in geeigneter Weise wieder aufbereiten. Das dezellularisierte Konstrukt, das hier auch als Stützgewebe bezeichnet wird, wird mit einer Zellpopulation beimpft, welche im Wesentlichen gleich der Zellpopulation ist, welche zur Beimpfung des Substrats verwendet wurde oder sie kann sich in einem oder mehreren Merkmalen davon unterscheiden. Die zur Beimpfung des Stützgewebes eingesetzten Zellen können z.B. aus einem unterschiedlichen Zelltyp oder einer unterschiedlichen Art bestehen als die Zellen, welche zur Herstellung des dezellularisierten Konstrukts verwendet wurden. Im Allgemeinen sind die Zellen von der gleichen Art wie der ins Auge gefasste Empfänger und sind von einem Zelltyp, der charakteristisch für das Gewebe oder Organ ist, welches das Konstrukt ersetzen oder vermehren soll. Ist das Konstrukt z.B. ein Blutgefäß, enthalten die Zellen vorzugsweise Endothelzellen und Zellen der glatten Muskulatur. Wie im Falle der am Anfang erfolgenden Herstellung des mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts können mehrfache Zyklen der Beimpfung mit Zellen und dazwischen liegende Wachtumsphasen eingesetzt werden. Die bei den verschiedenen Beimpfungen eingesetzten Zellen können vom gleichen oder von unterschiedlichen Typen sein und/oder sie können aus multiplen Zelltypen bestehen. Die Wachstumsphasen und die Kulturbedingungen können die gleichen sein oder sie können unter verschiedenen Wachstumsphasen variieren. Es lassen sich verschiedene Wachstumsbedingen auswählen, um diesen Prozess zu beschleunigen und/oder das Auftreten von erwünschten mechanischen, physikalischen oder biochemischen Eigenschaften zu stimulieren, um die Wanderung der Zellen in die Wand des Konstrukts zu stimulieren usw. Solche Wachstumsbedingungen können die Verwendung von besonderen Wachstumsmedien, das Verabfolgen von mechanischen, elektrischen und/oder chemischen Reizen usw. umfassen. Somit kann im Allgemeinen das dezellularisierte Konstrukt (Stützgewebe) jedem der Schritte beim Tissue Engineering unterzogen werden, die bei der Herstellung eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts eine Rolle spielen.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das dezellularisierte Konstrukt mit Zellen beimpft, die von dem Individuum stammen, welches der ins Auge gefasste Empfänger des Konstrukts ist. Dieser Ansatz hält die Wahrscheinlichkeit möglichst klein, dass das Konstrukt eine immunologische oder entzündliche Reaktion auslöst, wenn es in den Empfänger implantiert wird. Diese Ausführungsform der Erfindung stellt eine besonders vorteilhafte Strategie für die Herstellung eines auf Zellen basierenden implantierbaren Gewebes dar. Bei Einsatz der derzeitigen Techniken benötigt man z.B. eine Kulturzeit von annähernd 6 bis 10 Wochen, um eine mittels Tissue Engineering gewonnene implantierbare Arterie aus Zellen herzustellen, die auf abbaubares polymeres Stützgewebe ausgesät und angezüchtet wurden (Niklason, et al, Functional arteries grown in vitro, Science, 284: 489–493, 1999). Die Verfügbarkeit von mechanisch robusten dezellularisierten Stützgeweben aus Kollagen, wie sie von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden, verkürzt diese Produktionszeit dramatisch. Ist ein Patient, dem ein implantierbares Gefäß von Nutzen wäre, identifiziert, wird gemäß einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bei dem Patienten eine Biopsie vorgenommen und die Zellen isoliert. Die Zellen werden sodann auf ein dezellularisiertes Stützgewebe ausgesät und über einen Zeitraum von einigen Tagen bis zu einer oder zwei Wochen angezüchtet. Sodann wird das vollständige, im Wesentlichen autologe Gefäß implantiert. Dieser Ansatz verkürzt die gesamte Kulturzeit für die Herstellung eines autologen Gefäßes von 6 bis 10 Wochen auf 1 bis 2 Wochen, unter dem Gesichtspunkt der klinischen Anwendbarkeit eine Verkürzung mit weitreichenden Folgen. Natürlich weisen die Verfahren bei anderen implantierbaren Geweben wie z.B. Herzklappen, Harnblasen usw. ähnliche Vorteile auf.
Das Stützgewebe lässt sich mit jeder der verschiedenen Möglichkeiten entweder vor oder nach dem Aussäen behandeln. Beispielsweise können Stoffe, die ausgewählt wurden, die Haftung oder das Wachstum der Zellen zu verbessern, auf das Stützgewebe aufgetragen werden. Nach dem Aussäen kann das beimpfte Stützgewebe in ein Subjekt implantiert werden oder es kann für eine oder mehrere zusätzliche Wachstumsphasen (d.h. zusätzlich zu der (den) Wachstumsphase(n) vor der Dezellularisierung) kultiviert werden. In letzterem Falle lassen sich verschiedene Wachstumsbedingen auswählen, um das Zellwachstum und die Zellteilung zu beschleunigen und/oder das Auftreten von erwünschten mechanischen, physikalischen oder biochemischen Eigenschaften zu stimulieren, um die Wanderung der Zellen in die Wand des Konstrukts zu stimulieren usw. Solche Wachstumsbedingungen können die Verwendung von besonderen Wachstumsmedien, das Verabfolgen von mechanischen, elektrischen und/oder chemischen Reizen usw. umfassen.
Zusammenfassend weisen somit die die erfindungsgemäßen Verfahren wahlweise die zusätzlichen Schritte auf: (i) Beimpfen des Stützgewebes (d.h. des dezellularisierten Konstrukts) mit einer Zellpopulation, wodurch ein mit Zellen beimpftes dezellularisiertes Konstrukt erhalten wird; und (ii) Implantieren des mit Zellen beimpften dezellularisierten Konstrukts in ein Subjekt. Vor dem zweiten dieser Schritte kann das Konstrukt über einen Zeitraum unter Bedingungen in Kultur gehalten werden, die für das Wachstum und/oder die Teilung der Zellen geeignet sind, wodurch ein mittels Tissue Engineering gewonnenes dezellularisiertes Konstrukt hergestellt wird. Wie im Falle der Herstellung des anfänglichen mittels Tissue Engineering gewonnen Konstrukts kann das rezellularisierte, dezellularisierte mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukt mehrfachen Zyklen der Beimpfung mit Zellen sowie des Wachstums unterzogen werden, bei jedem von denen (ein) unterschiedliche(r) (Zelltyp) Zelltypen vorkommen (kann) und/oder unterschiedliche Wachstumsbedingungen vorliegen können. Während einer oder mehrerer Wachstumsphasen kann das mittels Tissue Engineering gewonnene dezellularisierte Konstrukt verschiedenen Tissue-Engineering-Manipulationen unterzogen werden, wie z.B. dem Verabfolgen von mechanischen oder elektrischen Reizen.
Vor der Implantation in ein Subjekt lassen sich die Konstrukte der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen mit jedem der verschiedenen biologisch wirksamen Stoffe behandeln. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden diese Stoffe ausgesucht, um die Eigenschaften des Konstrukts nach der Implantation zu verbessern, z.B. um die Fähigkeit der endogenen Zellen (d.h. Zellen, die sich in dem Subjekt befinden), das Konstrukt zu besiedeln, zu erleichtern, um das Wachstum der ausgesäten Zellen zu beschleunigen, um die Gefäßbildung des Konstrukts zu erleichtern, um die Wahrscheinlichkeit einer Thrombusbildung herabzusetzen usw. Geeignete biologische Mittel sind, jedoch nicht ausschließlich, Thrombomodulatoren, Mittel, welche die Hämokompatibilität erhöhen sowie Antibiotika. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung umfasst das biologisch aktive Mittel eine pharmazeutische Zusammensetzung. In diesem Falle kann das Konstrukt als Liefervehikel für Arzneimittel dienen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für die Behandlung desselben Leidens bestimmt sein wie das, welches durch die Implantation des Konstrukts behandelt wird oder aber für die Behandlung eines anderen Leidens.
Zusätzlich zu der Dezellularisierung des durch Tissue-Engineering-Techniken erhaltenen Konstrukts (z.B. des durch Beimpfen eines künstlichen Substrats erhaltenen Konstrukts) umfasst die vorliegende Erfindung auch die Dezellularisierung von nativem Gewebe, das vor der Dezellularisierung (einem) bestimmten Tissue-Engineering-Schritt(en) unterzogen worden war. Beispielsweise kann über einen Zeitraum unter Bedingungen, die für das Wachstum und die Teilung der in dem nativen Gewebe enthaltenen Zellen geeignet sind, das native Gewebe nach der Entnahme kultiviert werden. Das native Gewebe kann mit zusätzlichen Zellen beimpft werden. Die Wachstumsbedingungen (z.B. das Wachstumsmedium) lassen sich auswählen, um das Zellwachstum und die Zellteilung zu beschleunigen und/oder um die Ausbildung erwünschter mechanischer, physikalischer oder biochemischer Eigenschaften zu stimulieren. Beispielsweise können an das native Gewebe mechanische oder elektrische Kräfte verabfolgt werden. Nach den Tissue-Engineering-Schritten wird das native Gewebe dezellularisiert und kann dann aufbewahrt, in den Körper eines Subjekts implantiert oder als Stützgewebe für weiteres Tissue Engineering verwendet werden. Im letzteren Falle wird das dezellularisierte native Gewebe mit einer Zellpopulation beimpft und kann sodann auf die im Wesentlichen gleiche Weise wie die oben beschriebenen dezellularisierten Konstrukte verwendet oder weiter bearbeitet werden.
In den folgenden Abschnitten werden die Techniken und Bedingungen für die Herstellung eines mit Primärzellen beimpften Konstrukts, Techniken zur Dezellularisierung des mit Primärzellen beimpften Konstrukts zur Herstellung eines dezellularisierten Konstrukts (Stützgewebes), Verfahren zur Lagerung des Stützgewebes und Verfahren zur Wiederaufbereitung des Stützgewebes nach der Lagerung genauer beschrieben. Weiter unten werden auch Verfahren zur Verwendung des Stützgewebes zur Herstellung eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts zur Implantation in den Körper genauer beschrieben. Darüber hinaus werden die Tissue-Engineering-Schritte beschrieben, die vor der Dezellularisierung bei entnommenem nativem Gewebe zum Ensatz kommen können.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Konstrukt, das dezellularisiert werden soll, ein mittels Tissue-Engineering gewonnenes Konstrukt, das wie in der am 07.02.98 eingereichten anhängigen Patentabmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs" beschrieben hergestellt wurde.
Herstellung eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts
Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren und Techniken zur Herstellung von mittels Tissue-Engineering gewonnenen Konstrukten bekannt und sind für eine Verwendung zusammen mit den vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Beispiele für geeignete Aussaat- und Kulturverfahren für das Wachstum von dreidimensionalen Zellkulturen werden in der anhängigen Patentanmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs", dem US-Patent 5,266,480 und dem US-Patent 5,770,417 beschrieben. Diese Referenzen beschreiben Techniken zur Erstellung einer dreidimensionalen Matrix, zum Inokulieren der Matrix mit den gewünschten Zellen sowie zum Halten der Kultur. Im Allgemeinen wird ein mittels Tissue-Engineering gewonnenes Konstrukt hergestellt, indem man Zellen auf ein geeignetes Substrat aussät und die Zellen unter für das Wachstum geeigneten Bedingungen kultiviert. Das Substrat kann flach, röhrenförmig oder allgemein so konfiguriert sein, dass es jede gewünschte dreidimensionale Form annimmt. Das Substrat kann z.B. zu Formen geformt sein wie, jedoch nicht ausschließlich, Kugeln, Ellipsoide, Scheiben, Blätter oder Folien sowie zu Hohlkugeln, Hohlellipsoiden und an den Enden offenen Röhren. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist das Substrat röhrenförmig.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Substrat ein biokompatibles Material, z.B. ein biokompatibles Polymer mit Eigenschaften oder Modifikationen, welche die Haftung der Zellen und/oder ihr Wachstum begünstigen. Geeignete Materialien sind Materialien, die biologisch abbaubar oder biologisch erodierbar sind, wie z.B. Materialien, die unter physiologischen Bedingungen langsam hydrolysieren. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung sind poröse Materialien bevorzugt. Unter den verschiedenen geeigneten Materialien finden sich synthetische Polymere wie Polyester, Polyorthoester oder Polyanhydride mit Polymeren oder Copolymeren der Glykolsäure, Milchsäure oder Sebacinsäure. Substrate mit proteinartigen Polymeren sind ebenfalls zur Herstellung von mittels Tissue-Engineering gewonnener Konstrukte geeignet. Es können Kollagengele, Kollagenschwämme und -netze sowie auf Elastin basierende Substrate, Fibronectin, Laminin oder andere extrazelluläre Matrixproteine oder fibrilläre Proteine eingesetzt werden. Die synthetischen Polymere oder die proteinartigen Polymere können entweder modifiziert sein oder sie können auf jede der unterschiedlichen Weisen derivatisiert sein, um z.B. ihre hydrophilen Eigenschaften zu steigern und/oder um für verbesserte Zelladhäsionseigenschaften zu sorgen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das Substrat vor der Aussaat mit einem, Material beschichtet, z.B. mit denaturiertem Kollagen, um die Haftung der Zellen daran zu verbessern. Materialien, die als Substrate für das Wachstum der Zellen zur Herstellung von mittels Tissue-Engineering gewonnener Substrate brauchbar sind sowie Verfahren zur Herstellung solcher Substrate sind im Stand der Technik bekannt und werden auch in der anhängigen Anmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs" und in dem US-Patent 5,770,417 beschrieben.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird vor der Implantation des Konstrukts in ein Subjekt einiges oder alles Substrat während der Wachstumsphase abgebaut und/oder entfernt. Die Entfernung kann durch Verwendung eines Fluidstromes erfolgen und lässt sich durch Dezellularisierung verbessern. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird ein mittels Tissue-Engineerung gewonnenes Konstrukt auf einer Struktur angezüchtet, von der es nach der Wachstumsphase wieder vollständig entfernt wird. Ein Gefäßkonstrukt lässt sich z.B. auf einer Länge eines Silikonschlauchs anzüchten, der mit einer dünnen Schicht von verdünntem denaturiertem menschlichem Kollagen beschichtet wurde, an welche sich die Zellen anheften können. Nach der Wachstumsphase wird der Silikonschlauch aus dem Gefäßkonstrukt entfernt, was zu einem mittels Tissue-Engineering erhaltenen Konstrukt führt, das völlig frei von Substrat ist.
Je nach der beabsichtigten Funktion für das hergestellte mittels Tissue-Engineering gewonnene Konstrukt lässt sich eine Anzahl unterschiedlicher Zelltypen oder Kombinationen derselben verwenden. Diese Zelltypen sind, jedoch nicht ausschließlich: glatte Muskelzellen, Herzmuskelzellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Urothelzellen, Fibroblasten, Myoblasten, Chondrocyten, Osteoblasten, Keratinocyten, Hepatocyten, Gallengangszellen, Pankreasinselzellen, Nebenschilddrüsenzellen, Nebennierenzellen, Hypothalamuszellen, Hypophysenzellen, Eierstockzellen, Hodenzellen, Speicheldrüsenzellen, Adipocyten und Vorläuferzellen. Beispielsweise können glatte Muskelzellen und Endothelzellen für muskuläre röhrenförmige Konstrukte verwendet werden, z.B. Konstrukte, die zu Gefäß-, Ösophagus-, Darm-, Rectum- oder Harnleiterkonstrukten werden sollen; Chondrocyten können in Knorpelkonstrukten verwendet werden; Herzmuskelzellen können in Herzkonstrukten verwendet werden; Hepatocyten und Gallengangszellen können in Leberkonstrukten verwendet werden, Epithel-, Endothel-, Fibroblast- und Nervenzellen können in Konstrukten verwendet werden, die als Ersatz oder Verbesserung für jede der vielen unterschiedlichen Gewebstypen gedacht sind, welche diese Zellen enthalten. Im Allgemeinen lassen sich alle Zellen verwenden, welche in dem natürlichen Gewebe gefunden werden, dem das Konstrukt entsprechen soll. In einigen Fällen kann es jedoch von Vorteil sein, Zellen eines Typs zu verwenden, der sich natürlicherweise in dem natürlichen Gewebe befindet, dem das Konstrukt entsprechen soll. Darüber hinaus können Progenitor-Zellen wie Myoblasten oder Stammzellen verwendet werden, um ihre entsprechenden differenzierten Zelltypen zu produzieren. In einigen Fällen kann es ein Vorzug sein, Zellen von Neugeborenen oder Tumorzellen zu verwenden.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung sind die Zellen für den in Frage kommenden Empfänger eher allogen als xenogen. Zellen können von einem Spender (entweder lebendig oder tot) erhalten werden oder sie können aus einer bewährten Zelllinie stammen. Um Zellen von einem Spender zu erhalten (z.B. ein möglicher Empfänger eines mittels Tissue Engineering erhaltenen Konstrukts), können im Stand der Technik bekannte standardisierte Biopsietechniken eingesetzt werden. Repräsentative Techniken werden z.B. in der anhängigen Anmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs" und in Oberpenning, F., et al., De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering, Nature Biotechnology, 17, 149–155, 1999 beschrieben. In diesem Artikel werden auch geeignete Materialien und Techniken für die Erzeugung dreidimensionaler Substrate, Zellkulturtechniken und Aussaattechniken für Zellen sowie Verfahren zur Bewertung von mittels Tissue Engineering gewonnener Organe beschrieben. So erhaltene Zellen lassen sich in Kultur expandieren, obwohl vorzugsweise Zellen mit niedriger Passagezahl (z.B. weniger als 5 oder, mehr bevorzugt, weniger als 3) zur Herstellung des Konstrukts verwendet werden, um den Verlust des differenzierten Phänotyps möglichst gering zu halten. Die von einem Spender isolierten Zellen werden vorzugsweise gescreent, um die Möglichkeit für eine Übertragung von Infektionskrankheiten auszuschließen. Von bewährten Zelllinien stammende Zellen (z.B. solche, die von der ATCC, Rockville, MD bezogen werden können) können ebenfalls verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden Zellen (entweder von einem Spender oder aus einer bewährten Zelllinie) verwendet, welche durch Einführung von exogenen genetischen Sequenzen oder durch die Inaktivierung oder Modifikation von endogenen Sequenzen genetisch manipuliert worden waren. Es können z.B. Gene eingeführt werden, um die Zellen zu veranlassen, Proteine zu produzieren, die sonst in dem Wirt fehlen. Die Produktion von seltenen aber erwünschten Proteinen (im Kontext bestimmter Gewebe) wie z.B. Elastin kann angekurbelt werden.
Um in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung die Antigenität möglichst klein zu halten, werden, wie oben angeführt, Zellen von der gleichen Art wie der beabsichtigte Empfänger des Endkonstrukts verwendet, um das anfängliche mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukt (d.h. das Konstrukt, das dezellularisiert werden soll) zu erzeugen.
Wenn daher das Konstrukt in einen Menschen implantiert werden soll, werden vorzugsweise von einem Menschen stammende Zelle verwendet, um das Anfangskonstrukt zu erzeugen. In solchen Ausführungsformen der Erfindung, in welchen das dezellularisierte Konstrukt als Stützgewebe für weiteres Tissue Engineering dient (d.h. solche Ausführungsformen, in denen das dezellularisierte Konstrukt mit Zellen beimpft wird), werden vorzugsweise Zellen derselben Art wie der ins Auge gefasste Empfänger des Endkonstrukts verwendet, um das dezellularisierte Konstrukt zu beimpfen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das dezellularisierte Konstrukt mit Zellen beimpft, die dem beabsichtigten Empfänger des Konstrukts entnommen wurden. Allgemeine Säugerzellkulturtechniken, Zelllinien und Zellkultursysteme, die zusammen mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden in Doylc, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G., (Hrg.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley, 1998 beschrieben.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden aus einer Suspension Säugerzellen auf und/oder in einem Substrat ausgesät, so dass sie vorzugsweise gleichmäßig mit einer relativ großen Oberflächen- und/oder Volumendichte verteilt werden. Das Substrat kann, muss aber nicht, ein poröses Substrat sein. Die Zellen können annähernd 1 × 10⁴ bis 5 × 10⁷ Zellen/ml Kulturmedium umfassen, mehr bevorzugt annähernd 2 × 10⁶ Zellen/ml bis 2 × 10⁷ Zellen/ml und noch mehr bevorzugt annähernd 5 × 10⁶ Zellen/ml. Die optimale Konzentration und die absolute Zahl an Zellen können mit dem Zelltyp, der Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen, dem Substratmaterial und mit verschiedenen anderen Parametern variieren. Die Suspension kann in jeder physiologisch verträglichen Flüssigkeit gebildet werden, vorzugsweise in einer, welche die Zellen nicht schädigt oder ihre Fähigkeit, sich an das Substrat anzuheften, beeinträchtigt. Geeignete Flüssigkeiten sind Medien für das Zellwachstum (z.B. DMEM mit 10% fötalem Rinderserum).
Die Zellen können mit jedem Standardverfahren auf und/oder in einem Substrat ausgesät werden. Beispielsweise lässt sich das Substrat durch Eintauchen in eine Zellsuspension übereine Zeitspanne, während welcher sich die Zellen an das Substrat anheften und anschließendes Auswaschen der nicht adhärenten Zellen beimpfen. Das Substrat kann mit Zellen unter Verwendung einer Spritze, einer Pipette oder einer anderen sterilen Abgabevorrichtung beimpft werden. Nach einem bevorzugten Verfahren wird die Suspension auf das Substrat getropft und das Substrat danach in Rotation versetzt, z.B. in einem Rotationsgefäß, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erzielen.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden nach der Aussaat der Zellen und vor dem Einbringen des beimpften Substrats in ein Zellkulturmedium eine Zeit lang (Beimpfungszeit) an das Substrat anheften gelassen. Die optimale Beimpfungszeit variiert mit dem Zelltyp und dem Substrat. Werden. z.B. die in der anhängigen Anmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs" beschriebenen synthetischen hydrophilen Polymersubstrate eingesetzt, können Beimpfungszeiten von etwa 20 Minuten gewählt werden. Für anderen Substrate können Beimpfungszeiten von einer Stunde oder mehr geeignet sein und sind auch im Stand der Technik benutzt worden.
Es können verschiedene Behandlungen zum Einsatz kommen, um die Haftung der Zellen am Substrat oder aneinander zu erhöhen. Geeignete Behandlungsverfahren werden z.B. in der obigen anhängigen Anmeldung 09/109,427 beschrieben. Solche Behandlungsverfahren umfassen das Auftragen von verschiedenen Proteinen wie z.B. Wachstumsfaktoren oser extrazellulären Matrixproteinen auf das Substrat or das anwachsende Konstrukt. Es können z.B. Kollagen, Elastin, Fibronectin, Laminin oder Proteglykane auf das Substrat aufgetragen werden. Die Substrate können mit Wachstumsfaktoren wie aFGF, bFGF, PDGF, TGFβ usw. durchtränkt werden oder diese Stoffe können im Kulturmedium angeboten werden.
Geeignete Wachstumsbedingungen für Säugerzellen in Kultur sind im Stand der Technik gut bekannt. Zellkulturmedien umfassen im Allgemeinen essentielle Nährstoffe und wahlweise Inhaltsstoffe wie Wachstumsfaktoren, Salze, Mineralstoffe, Vitamine usw., welche nach den zu kultivierenden Zelltyp(en) ausgesucht werden. Es können besondere Inhaltsstoffe ausgesucht werden, um das Zellwachstum, die Differenzierung, die Ausscheidung spezifischer Proteine usw. zu verbessern. Im Allgemeinen umfassen Standardmedien für das Wachstum Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium mit niedrigem Glucosegehalt (DMEM) mit 110 mg/l Pyruvat und Glutamin, das mit 10 bis 20% fötalen Rinderserum (FBS) supplementiert ist oder Kalbsserum und 100 E/ml Penicillin sind so geeignet wie verschiedene andere im Stand der Technik gut bekannte Standardmedien. Ein besonders bevorzugtes Kulturmedium zur Herstellung eines mittels Tissue Engineering gewonnenen muskulären röhrenförmigen Konstrukts, wie z.B. ein kleinkalibriges Blutgefäß, wird unten in Beispiel 2 beschrieben. Zellen werden vorzugsweise unter sterilen Bedingungen in einer Atmosphäre von 5 bis 15% CO₂, vorzugsweise 10% CO₂, bei einer Temperatur bei oder nahe bei der Körpertemperatur des Tieres, von dem die Zellen stammen kultiviert. Menschliche Zellen werden z.B. vorzugsweise bei etwa 37°C kultiviert.
Im Allgemeinen hängt die Länge der Wachstumsphase von dem besonderen mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts ab, das hergestellt werden soll. Die Wachstumsphase kann so lange verlängert werden, bis das Konstrukt die gewünschten Eigenschaften erlangt hat, z.B. bis das Konstrukt eine besondere Dicke, Größe, Festigkeit, Zusammensetzung der Proteinkomponenten und/oder eine besondere Zelldichte erreicht hat. Verfahren zur Bewertung dieser Parameter werden in der anhängigen Anmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs" und in dem US-Patent 5,613,982 beschrieben.
Nach einer ersten Wachstumsphase kann das Konstrukt mit einer zweiten Zellpopulation beimpft werden, welche Zellen des gleichen Typs umfassen kann wie sie in der ersten Aussaat der Zellen eingesetzt wurden oder Zellen von einem anderen Typ. Das Konstrukt kann dann in einer zweiten Wachstumsphase gehalten werden, welche sich in der Länge von der ersten Wachstumsphase unterscheidet und es können andere Wachstumsbedingungen gewählt werden. Für die Aussaat mit Zellen können Mehrfachzyklen mit dazwischen liegenden Wachstumsphasen eingesetzt werden.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann ein mittels Tissue Engineering gewonnenes muskuläres röhrenförmiges Gewebe in einem biomimetischen System wie das in der anhängigen Anmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs" und in Niklason, et al., Functional arteries grown in vitro, Science, 284: 489–493, 1999 beschriebene angezüchtet werden. Wie darin beschrieben wird ein semi-disposabler Bioreaktor aus Glas ähnlich dem in 1 gezeigten und in Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung besprochenen an einem Pumpensystem angebracht. Wie in 1 gezeigt, verfügt die Kammer 22 des Bioreaktors über Seitenarme 12, durch welche ein Stück des Schlauches 14 eingeführt wird. Der Schlauch dient als Träger für ein Substrat 16, das ausgesät wird, um das Konstrukt zu produzieren. Der Schlauch selbst kann wechselweise als Substrat dienen, entweder mit oder ohne eine Schicht oder Schichte aus Beschichtungsmaterial. Durch den Schlauch kann Flüssigkeit gepumpt werden, um wie weiter unten beschrieben auf das Lumen des sich bildenden Konstrukts eine pulsierende Kraft auszuüben. Der Bioreaktor umfasst einen Stopfen 18, der entfernt werden kann, um das Substrat in den Rektor zu geben und das Substrat mit Zellen zu beimpfen. Über eine Füllöffnung 20 wird das Kulturmedium und andere Flüssigkeiten der Kammer zugesetzt und aus ihr entfernt. Das Bioreaktorsystem kann aus Glas oder einem anderen geeigneten Material wie z.B. verschiedenen Kunststoffen bestehen. In den Ausführungsformen der Erfindung, in welchen das dezellularisierte Konstrukt cryokonserviert wird, besteht der Bioreaktor vorzugsweise aus einem Material wie Kunststoff, der extrem niedrige Temperaturen (z.B. von flüssigem Stickstoff) aushalten kann.
Die Verabfolgung von Reizen während der Wachstumsphase
Gewebe im Körper werden verschiedenen physikalischen Reizen ausgesetzt. Arterien, Herzklappen und Herzkammern sind z.B. pulsierenden Streck- und Fließkräften ausgesetzt wenn das Blut durch das Herz-Kreislauf-System gepumpt wird. Komponenten des Muskel-Skelett-Systems unterliegen während des Gehens und anderer physikalischer Aktivitäten mechanischen Kräften. Es ist gut bekannt, dass physikalische Reize tief greifende Wirkungen auf die Eigenschaften und die Entwicklung von Geweben und die Zellen, die diese produzieren, ausüben. Ohne an irgend eine Theorie gebunden zu sein, schlagen wir vor, dass wenn wachsende mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukte bestimmten Reizen ausgesetzt werden (z.B. mechanischen Kräften, die denen gleichen, welchen entsprechende Gewebe normalerweise in vivo ausgesetzt wären), das erhaltene Konstrukt dazu bringen, Eigenschaften und Strukturen auszubilden, welche stärker denen des entsprechenden natürlich vorkommenden Gewebes gleichen. In einigen Fällen kann das Anlegen von geeigneten Reizen zu gewünschten Eigenschaften führen, z.B. zu einer größeren Festigkeit, welche die in natürlichem Gewebe gefundene übertrifft. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird daher ein physikalischer Reiz (z.B. ein mechanischer oder elektrischer Reiz) während der Wachstumsphasen an das mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukt angelegt. Die Stärke und Art des Reizes lässt sich während der Wachstumsphase variieren und der reiz braucht nicht dauernd über die gesamte Wachstumsphase hinweg angelegt werden sondern kann während eines oder mehrerer Abschnitte der Wachstumsphase angelegt werden. Im Falle eines Konstrukts, das hergestellt wird, indem Mehrfachzyklen der Zellaussaat mit dazwischen liegenden Wachstumsphasen ausgeführt werden, können während der unterschiedlichen Wachstumsphasen unterschiedliche Reize eingesetzt werden.
Wie genau in der anhängigen Anmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs" beschrieben, wird in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Muskelkonstrukt hergestellt, in welchem in dem Lumen eines Substrats ein dehnbarer Körper eingeführt ist, um den ausgesäten Muskelzellen eine pulsierende Streckung aufzuerlegen. Während das Muskelgewebe auf und/oder in dem Substrat wächst, liefert eine mit dem Innern dehnbaren Körpers verbundene Pumpe einen zyklisch anwachsenden Druck, um den dehnbaren Körper zu veranlassen, sich in dem Lumen des Substrats auszudehnen und dem Substrat und dem sich entwickelnden Gewebe eine pulsierende Streckkraft mitzugeben. Das Anlegen pulsierender Streckkräfte kann bei der Herstellung von sowohl mittels Tissue Engineering gewonnener Gefäßkonstrukte als auch von nicht als Gefäß konzipierter Konstrukte wie z.B. Ösophagus-, Darm-, Rectum-Harnleiter- oder Harnblasenkonstrukten Verwendung finden. Die an das Konstrukt angelegten Kräfte können ausgewählt werden, um beim Pulsieren und dem Grad der dem Konstrukt übermittelten Streckung entsprechende natürliche Kräfte nachzuahmen.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden Kräfte an ein röhrenförmiges mittels Tissue Engineering gewonnenes Muskelkonstrukt ohne die Verwendung eines dehnbaren Rohrs angelegt. Beispielsweise lässt sich eine Flüssigkeit wie das Gewebskulturmedium direkt durch das Lumen des Konstrukts pumpen und so der bei Arterien im Körper anzutreffende Fluss im Innern des Lumens nachahmen. Mit zunehmender Entwicklung des Konstrukts kann der Fluss variiert werden und der Druck im Innern des Lumens und die Scherkräfte können selbst bis über die im Körper herrschenden Bedingungen angehoben werden.
Das Anlegen physikalischer Kräfte ist natürlich nicht auf mittels Tissue Engineering gewonnene Muskel- und/oder Gefäßkonstrukte beschränkt, sondern kann auch vorteilhafterweise bei der Herstellung von verschiednen anderen mittels Tissue Engineering gewonnener Konstrukttypen eingesetzt werden. Ein pulsierender Fluss kann z.B., wie im US-Patent 5,899,937 beschrieben, bei der Herstellung von Herzklappen eingesetzt werden. Das Beaufschlagen mit Reizen ist nicht an das Beaufschlagen mit pulsierenden Reizen, Streckkräften oder mit einem Flüssigkeitsstrom in Zusammenhang stehenden Reizen beschränkt. Beispielsweise lassen sich entweder konstante oder zyklische Streckreize anbringen. Darüber hinaus kann mit nicht mechanischen Reizen wie elektrischen Reizen beaufschlagt werden.
Dezellularisierung
Die in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahren können bei einem mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukt zur Anwendung kommen, das nach jedem der oben beschriebenen Verfahren hergestellt wird oder bei einem nativen Gewebe, das einem Subjekt entnommen worden ist. In ersterem Falle besteht das Ergebnis der Dezellularisierung darin, ein mittels Tissue Engineering gewonnenes dezellularisiertes Konstrukt herzustellen. Das mittels Tissue Engineering gewonnene dezellularisierte Konstrukt kann in ein Subjekt implantiert werden, weiteren Tissue-Engineering-Schritten unterzogen werden, in denen eine Beimpfung mit Zellen vorkommen kann, oder es kann für andere Zwecke benutzt werden. Ein natives Gewebe kann vor seiner Dezellularisierung Tissue-Engineering-Schritten unterzogen werden, um ein manipuliertes dezellularisiertes natives Gewebe herzustellen. Das manipulierte dezellularisierte native Gewebe kann natürlich nach seiner Dezellularisierung zusätzlichen Tissue-Engineering-Schritten unterzogen werden.
Eine Dezellularisierung weist ein Anzahl von Wirkungen auf. Insbesondere im Falle eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts, das für einen ins Auge gefassten Empfänger allogen ist (d.h. Zellen, die von der gleichen Art wie der Empfänger stammen) sind die extrazellulären Matrixproteine wie Kollagen und Elastin, welche einen großen Teil des Konstrukts bilden, im Wesentlichen nicht immunogen, wenn sie in den Empfänger implantiert werden. Die Zellen selbst sind im Allgemeinen immunogen, wenn sie in ein anderes Subjekt als das Individuum implantiert werden, von dem die Zellen stammten (oder einem genetisch identischen Individuum). Beispielsweise ist reines menschliches Kollagen (entweder aus menschlichem Gewebe stammend oder unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt) im Allgemeinen nicht immunogen, wenn es in einen Menschen implantiert wird. Menschliche Zellen, die Kollagen produzieren, sind jedoch im Allgemeinen immunogen, wenn sie in einen anderen Menschen als das Individuum implantiert werden, von dem sie stammen. Mit anderen Worten, in einem typischen mittels Tissue Engineering gewonnen Konstruktstellen die Zellen die Mehrheit des antigenen Materials im Konstrukt. Wenn man die Zellen entfernt, ist es daher möglich, die Wahrscheinlichkeit, dass nach dem Implantieren des Konstrukts in ein Subjekt eine immunologische oder entzündliche Reaktion induziert wird, wesentlich zu verringern oder auszuschalten.
Es lässt sich jedes der zahlreichen Dezellularisierungsverfahren einsetzen. Im Allgemeinen werden in den Verfahren verschiedene chemische, biochemische und/oder physikalische Mittel eingesetzt, um zelluläre Komponenten aufzubrechen, abzubauen und/oder zu zerstören und/oder die Matrix modifiziert, in welche die Zellen eingebettet sind, damit die Entfernung der Zellen und Zellkomponenten erleichtert wird. Solche Verfahren werden z.B. in den US-Patenten 4,776,853; 5,192,312; 5,336,616; 5,595,571; 5,613,982; 5,855,620; 5,899,936 und 5,916,265 beschrieben. Weitere Dezellularisierungsverfahren werden in Bader, A., et al., Tissue engineering of heart valves-human endothelial cell seeding of detergent acellularized porcine valves, Eur. J. Cardio-thoracic Surg. 14, 279–284, 1998 und in Courtman, D. W., et al., Biomechanical and ultrastructural comparison of cryopreservation and a novel cellular extraction of porcine aortic valve leaflets, J. Biomed. Mat. Res., 29, 1507–1516, 1996 beschrieben.
Das Dezellularisierungsverfahren verursacht vorzugsweise keine schwerwiegende Veränderung in der Struktur des mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts oder nativen Gewebes oder eine beträchtliche Veränderung in den biomechanischen Eigenschaften. Die Auswirkungen der Dezellularisierung auf die Struktur lassen sich im Lichtmikroskop, mit einer Prüfung der Ultrastruktur usw. begutachten Biomechanische Tests, die im Stand der Technik gut bekannte sind, können eingesetzt werden, um die Auswirkungen von verschiedenen Vorschriften für die Dezellularisierung auf die Gewebeeigenschaften zu bestimmen. Die Auswahl und Interpretation solcher Tests hängt im Allgemeinen von der Beschaffenheit des Konstrukts und dem Zweck ab, für das es gemacht ist. Darüber hinaus führt die Behandlung vorzugsweise zu keiner cytotoxischen Umgebung, welche die nachfolgenden Schritte wie das erneute Aussäen in vitro oder das Besiedeln des Konstrukts oder Gewebes mit Zellen eines Empfängers in vivo signifikant hemmt.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das Konstrukt oder Gewebe, das dezellularisiert werden soll, in einer oder mehreren Dezellularisierungslösungen über einen Zeitraum inkubiert, der ausreicht, einen beträchtlichen Anteil der Zellen und/oder Zellkomponenten zu entfernen. Im Allgemeinen beschleunigen die Dezellularisierungslösungen die Lyse der Zellen und die Zerstörung der Zellkomponenten, d.h. sie enthalten Mittel, welche Zellbestandteile wie Zellmembranen, Proteine, Nucleinsäuren usw. aufbrechen und/oder abbauen. Wässrige hypotone Lösungen oder Lösungen mit niedriger Ionenstärke erleichtern durch ihre osmotischen Wirkungen die Lyse der Zellen. Solche Lösungen können entionisiertes Wasser enthalten oder einen wässrigen hypotonen Puffer (z.B. bei einem pH von etwa 5,5 bis 8, vorzugsweise etwa 7 bis 7,5). Die Dezellularisierung kann unter Verwendung einer einzelnen Dezellularisierungslösung erfolgen oder das Konstrukt kann nacheinander in zwei oder mehr Lösungen inkubiert werden. Ein anderer Lösungsansatz besteht in dem abwechselnden Eintauchen in hypertone und hypotone Lösungen.
Geeignete Dezellularisierungsmittel sind Salze, Detergenzien/Emulgatoren und Enzyme wie Proteasen und/oder Nucleasen. Es lassen sich Kombinationen unterschiedlicher Klassen von Detergenzien, z.B. ein nicht ionisches Detergens wie Triton X-100^® (tert.-Octylphenylpolyoxyethylen) und ein ionisches Detergens wie SDS (Natriumdodecylsulfat) einsetzen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden, wie in den Beispielen weiter unten beschrieben, eine oder mehrere Dezellularisierungslösungen, die Triton X-100^®, CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonium]-1-propansulfonat) oder SDS in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) enthalten eingesetzt. Andere geeignete Detergenzien sind Polyoxyethylen (20)-sorbitanmonooleat und Polyoxyethylen (80)-sorbitanmonooleat (Tween 20 und 80), Natriumdeoxycholat und Octylglukosid.
Im Allgemeinen ist es bevorzugt, eine Dezellularisierungstechnik einzusetzen, bei der ein Schaden an oder eine Veränderung der Proteinmatrix möglichst klein gehalten wird. Ein solcher Schaden kann von Proteasen (z.B. Kollagenase) herrühren, welche nach der Lyse der zellen freigesetzt werden können oder sie können extrazellulär in der Matrix vorliegen. Daher sind in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung verschiede Additive wie Metallionen-Chelatbildner, z.B. EDTA (Ethylendiamintetraacetat), und/oder Protease-Inhibitoren in der Dezellularisierungslösung enthalten. Geeignete Protease-Inhibitoren zur Verwendung in Dezellularisierungslösungen sind z.B. ein oder mehrere der folgenden Vertreter: Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Aprotinin, Leupeptin und N-Ethylmaleimid (NEM).
In der Dezellularisierungslösung können verschiedene Enzyme zum Einsatz kommen, welche Zellkomponenten abbauen. Solche Enzyme sind Nucleasen (z.B. DNAsen wie DNAse I, RNAsen wie RNAse A) und Phospholipasen (z.B. Phospholipase A oder C). Bestimmte Proteasen wie Dispase II, Trypsin und Thermolysin können bei der Dezellularisierung von Nutzen sein, insbesondere bei der Dezellularisierung von nativen Geweben wie der Haut.
Werden proteolytische Enzyme eingesetzt, kann es erwünscht sein, dafür Sorge zu tragen, dass die Entfernung der Zellen ohne signifikanten Schaden an der extrazellulären Matrix vor sich geht. Die Aktivität der Proteasen ist eine Funktion der Zeit, der Temperatur und der Konzentration und diese Variablen lassen sich auf geeignete weise einstellen, um eine vernünftige Dezellularisierung ohne eine unannehmbare Zerstörung der extrazellulären Matrix zu erzielen. Die Nucleasen werden typischerweise in einer Konzentration zwischen 0,1 μg/ml und 50 μg/ml eingesetzt, vorzugsweise etwa 10 μg/ml für DNAse I und etwa 1,0 μg/ml für RNAse A. Die Nucleasen werden vorzugsweise in einer physiologisch gepufferten Lösung bei einer Temperatur zwischen etwa 20°C und 39°C, vorzugsweise 37°C, über einen Zeitraum zwischen etwa 30 Minuten und 6 Stunden eingesetzt.
Wie oben beschrieben enthält die Dezellularisierungslösung typischerweise einen Puffer. Geeignete Puffer sind organische Puffer wie Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), [4-(2-Hydroxyethyl]piperazin]-ethansulfonsäure] (HEPES) usw. Puffer wie Natriumphosphat, Citrat, Bicarbonat, Acetat oder Glutamat können ebenfalls eingesetzt werden. Im Allgemeinen kann ein pH zwischen etwa 5,5 und 8,0, zwischen etwa 6,0 und 7,7 oder zwischen etwa 7,0 und 7,5 verwendet werden.
Physikalische Kräfte wie die Bildung von intrazellulärem Eis können als ein Primärmittel zum Erreichen einer Dezellularisierung oder zur Steigerung der Aktivität von Dezellularisierungslösungen herangezogen werden. Bei einem solchen Lösungsweg, der als Einfrieren aus der Dampfphase bezeichnet wird, wird das Konstrukt oder Gewebe in eine geeignete Lösung gegeben, z.B. eine Standardcryokonservierungslösung wie Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM), 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), 10% fötale Rinderserum (FBS), und langsam abgekühlt, z.B. 1–2°/Minute. Es können mehrfache Gefrier- und Auftauzyklen durchgeführt werden. Zu der Lösung können Kolloidbildner gegeben werden, um die extrazelluläre Bildung von Eis zu vermindern, während man intrazelluläres Eis sich bilden lässt. Geeignete Stoffe sind Polyvinylpyrrolidon (10% w/v) und dialysierte Hydroxyethylstärke (10% w/v).
Die oben angegebenen Beispiele für Dezellularisierungstechniken sollen die Erfindung nicht einschränken und die Erfindung umfasst den Einsatz von im Wesentlichen jeder Dezellularisierungstechnik, die einen beträchtlichen Anteil der Zellen zu entfernen vermag, während die Matrix im Wesentlichen intakt bleibt. Natürlich ist zu beachten, das für besondere mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukte oder native Gewebe, je nach den Eigenschaften dieser Konstrukte oder Gewebe, bestimmte Techniken bevorzugt sind. Ein Fachmann ist in der Lage, eine geeignete Dezellularisierungstechnik auszuwählen und Parameter wie die Temperatur und die Zeit zu variieren, um den gewünschten Grad an Dezellularisierung zu erzielen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden im Dezellularisierungsprozess mindestens 50% der Zellen entfernt. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden im Dezellularisierungsprozess mindestens 60%, mindestens 70% oder mindestens 80% der Zellen entfernt. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden im Dezellularisierungsprozess mindestens 90%, mindestens 95% oder im Wesentlichen alle Zellen entfernt. Wie oben beschrieben kann es zwischen den zwei Zielen, einen hohen Grad an Dezellularisierung zu erzielen und die Struktur und die Eigenschaften der extrazellulären Matrix beizubehalten einen Kompromiss geben. Somit ist nicht notwendigerweise bevorzugt, dass eine höchstmögliche Dezellularisierung erreicht wird, wenn dabei bei der extrazellulären Matrix ein unannehmbarer Schaden auftritt. Der optimale Grad an Dezellularisierung kann von den Eigenschaften des Konstrukts abhängen und davon, wofür es verwendet werden soll.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird ungeachtet des eingesetzten Dezellularisierungsverfahrens das dezellularisierte Konstrukt oder Gewebe nach seiner Entfernung aus der Lösung, in welcher die Dezellularisierung stattgefunden hat, in einer physiologisch geeigneten Lösung wie PBS, Gewebskulturmedium usw. gewaschen. Beim Waschen wird restliche Dezellularisierungslösung entfernt, welche sonst die Zerstörung des dezellularisierten Konstrukts oder Gewebes verursachen, das Wachstum der nachfolgend ausgesäten Zellen verhindern und/oder deren Biokompatibilität verringern könnte.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Dezellularisierung, indem sich das Konstrukt in (einer) Dezellularisierungslösung(en) über einen Zeitraum voll saugt. Während dieses Zeitraums kann die Lösung gerührt oder bewegt werden. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, das Fließmuster der Dezellularisierungslösung zu ändern, wenn man z.B. in dem Behälter, in welchem die Dezellularisierung durchgeführt wird, für Konvektionsströme sorgt, indem man in dem Behälter rotierende Arme mit Schaufeln an den geeigneten Stellen einsetzt usw. Die Veränderung des Fließmusters kann den Transport von wichtigen Dezellularisierungsmitteln in der Lösung verbessern und deren Transfer erhöhen, was zu einer Verbesserung des Prozentsatzes der Dezellularisierung führt. Darüber hinaus kann die Veränderung des Flusses die Entfernung von Zellen und Zellkomponenten aus dem Gewebe beschleunigen.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung, in welchen das Konstrukt ein in einem Bioreaktor angezüchtetes manipuliertes Gefäß ist, kann die Dezellularisierungslösung durch das innere Lumen des Gefäßes gepumpt werden, um den Innenabschnitt des Gefäßes zu dezellularisieren. Darüber hinaus kann das Gewebskulturmedium aus dem Bioreaktor entfernt und durch Dezellularisierungslösung ersetzt werden, um den Außenabschnitt des Gefäßes Dezellularisierungsbedingungen auszusetzen. Eine Beaufschlagung mit (oben beschriebenen) pulsierenden Kräften während der Dezellularisierungsphase kann herangezogen werden, um die Dezellularisierung zu beschleunigen.
Nach der Dezellularisierung und dem Waschen können das mittels Tissue Engineering gewonnene dezellularisierte Konstrukt oder das manipulierte dezellularisierte Gewebe in ein Subjekt implantiert werden, das dieser bedarf, z.B. als Ersatz für ein Blutgefäß, eine Herzklappe, ein Organ usw. oder sie können weiteren Tissue-Engineering-Schritten mit Zellaussaat unterzogen werden. Alternativ kann wie oben beschrieben, das dezellularisierte Konstrukt für seine weiter Verwendung aufbewahrt werden.
Bestimmung der Auswirkungen der Dezellularisierung
Es können verschiedene Verfahren eingesetzt werden, um die Wirkungen einer besonderen Dezellularisierungsvorschrift in Bezug auf das Ausmaß der erzielten Dezellularisierung und/oder in Bezug auf die Veränderungen bei den nicht zellulären Strukturkomponenten (z.B. die extrazelluläre Matrix) zu ermitteln. Es können Gewebeproben angefärbt werden, z.B. mit Hämatoxylin und Eosin und mit Hilfe des Lichtmikroskops untersucht werden. Wird eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung benutzt, erscheinen extrazelluläre Matrixkomponenten rosa und die Kerne erscheinen, wie in den 2, 3 und 4 gezeigt, als purpurrote Flecken. Färbeverfahren und Färbungen, welche zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix unterscheiden sowie Färbungen, die zwischen verschiedenen extrazellulären Matrixkomponenten (z.B. Kollagen und Elastin) unterscheiden sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Anzahl der in dem Gewebe enthaltenen Zellen kann durch visuelle Inaugenscheinnahme bei 20- bis 100facher Vergrößerung ermittelt werden. Um den erzielten Prozentsatz der Dezellularisierung zu ermitteln, wird die in einem gegebenen Bereich des dezellularisierten Gewebes vorhandene Anzahl der Zellen mit der Anzahl der Zellen verglichen, die in einem äquivalenten Bereich von Kontrollgewebe anzutreffen sind, das keiner Dezellularisierung unterzogen worden war. Die Integrität der nicht zellulären Strukturkomponenten kann ebenfalls durch visuelle Inaugenscheinnahme ermittelt werden. Eine Zerstörung bei diesen Komponenten lässt sich durch Fragmentierung oder Abtrennung der Fibrillen von extrazellulärem Matrixmaterial nachweisen.
Andere Techniken zur Beurteilung des Ausmaßes der Dezellularisierung sind die Immunohistochemie und die Elektronenmikroskopie. Die Immunohistochemie kann eingesetzt werden, um bestimmte Zellkomponenten nachzuweisen, die Komponenten enthalten, welche besonders immunogen sein können wie z.B. die Histokompatibilitäts-Antigene. Genaue Einzelheiten zur Behandlung von Geweben für die Licht- und Elektronenmikroskopie sowie für die Immunohistochemie und den am Anfang dieses Abschnitts wiedergegebenen Referenzen nachgelesen werden, insbesondere bei Bader et al. Dem Fachmann sind andere geeignete Techniken bekannt. Eine Einschätzung der Dichte der Zellen, die nach der Dezellularisierung zurückblieben, kann auch erhalten werden, indem, wie in der anhängigen Anmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs" beschrieben, der DNA-Gehalt im Gewebe ermittelt wird, z.B. durch Messen der Intensität der Fluoreszenz eines Farbstoffes wie Hoechst 33258 nach seiner Bindung an die DNA.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung führt die Entfernung der Zellen und Zellkomponenten im Vergleich mit dem Konstrukt vor seiner Dezellularisierung zu einer verminderten Immunogenität des dezellularisierten Konstrukts. Es kann z.B. die humorale Immunantwort auf aus dezellularisierten Konstrukten gewonnenen Extrakten mit der humoralen Immunantwort von Extrakten verglichen werden, die aus Kontrollkonstrukten gewonnen wurden, welche nicht dezellularisiert worden waren (siehe Beispiel 4 im US-Patent 5,613,982). Kurz gesagt werden Kaninchen mit NaCl-Extrakten entweder von dezellularisierten Konstrukten oder von Kontrollkonstrukten immunisiert und daraus Immunseren gewonnen. Die Immunseren werden auf die Gegenwart von IgG- und IgM-Antikörpern gegen Antigene gescreent, welche in Extrakten vorkommen, die aus nicht dezullarisierten (Kontroll)-Konstrukten hergestellt wurden. In einem anderen Lösungsansatz zur Bewertung der Verminderung der Immun- und Entzündungsantworten gegen dezullularisierte Konstrukte im Vergleich mit Kontrollkonstrukten werden Proben des Konstrukts in Kaninchen implantiert, nach einem Zeitraum wie z.B. zwei Wochen die Implantate und das umgebende Gewebe entnommen und die entnommen Implantate und das Gewebe einer histopathologischen Analyse unterzogen (siehe Beispiel 5 im US-Patent 5,613,982). Die Gegenwart von entzündlichen Zellen und Zellen des Immunsystems in den Proben dient als Indikator für den Grad der von den Implantaten hervorgerufenen Entzündungs- und Immunantwort. Es können verschiedene andere dem Fachmann bekannte Verfahren eingesetzt werden, um die Verminderung in der Immunogenität und Entzündungsantwort zu bestimmen, die auf die Dezellularisierung der mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukte zurückzuführen sind.
Aufbewahrung eines dezellularisierten Konstrukts
Ein dezellularisiertes Konstrukt oder ein dezellularisiertes natives Gewebe können durch Einsatz jeder der zahlreichen Aufbewahrungstechniken nach ihrer Dezellularisierung aufbewahrt werden. Die Lagerung dezellularisierter Konstrukte oder Gewebe würde für einen leichten Zugang zu diesen Materialien sorgen, wenn sie gebraucht werden. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden viele mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukte hergestellt, indem von einer einzigen bevorzugten Quelle erhaltene menschliche Zellen verwendet werden (z.B. von einem einzigen menschlicher Spender, dessen Zellen gescreent worden sind, um die Wahrscheinlichkeit der Übertragung von Infektionskrankheiten zu reduzieren oder von einer Zelllinie, die besonders bevorzugte Eigenschaften aufweist oder genetisch modifiziert worden ist, um ihre Fähigkeit zur Ausscheidung von extrazellulären Matrixkomponenten zu verbessern). Die mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukte werden dezellularisiert und aufbewahrt. Ist ein Patient, bei dem eine Implantation eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts von Nutzen wäre, identifiziert, wird ein aufbewahrtes Konstrukt wiederaufbereitet und entweder direkt in den Patienten implantiert oder einem weiteren Tissue Engineering unterzogen, z.B. mit vom Patienten erhaltenen Zellen beimpft.
Die Cryokonservierung (d.h. Konservierung durch Halten bei einer extrem niedrigen Temperatur) ist ein Verfahren zur Aufbewahrung des dezellularisierten Konstrukts oder dezellularisierten nativen Gewebes. Das Gefrieren und die Vitrifikation stellen zwei unterschiedliche Lösungsansätze dar, die derzeit durchgeführt werden. In beiden Fällen ist es ein Hauptziel, eine zerstörerische Bildung von Eiskristallen zu verhindern. Beim Gefrieren wird das Gewebe oder Organ, das cryokonserviert werden soll, mit einer Lösung perfundiert, welche eine ausreichende Konzentration (im Allgemeinen ca. 10 Vol.-%) eines Kälteschutzmittels (CPA) enthält, so dass während der folgenden Abkühlung eine Eisbildung eingeschränkt ist. Typische Kälteschutzmittel umfassen Glycerin, Dimethylsulfoxid (DMSO), Glykole, Propandiol, Polyvinylpyrrolidon, Dextran und Hydroxyethylstärke. Die Vitrifikation ist eine Cryokonservierungstechnik, bei der eine Verfestigung zu einem amorphen glasigen Zustand stattfindet, der die Bildung von Eiskristallen und das Wachstum möglichst klein hält oder eliminiert. In beiden Fällen müssen die Gewebe für eine Langzeitstabilität typischerweise auf Temperaturen unter –100°C abgekühlt werden (z.B. in flüssigem Stickstoff). Für die Vitrifikation wird das Gewebe mit noch höheren Konzentrationen an CPA perfundiert als beim Gefrieren. Nach der Inkubation in der Cryokonservierungslösung kann das Gewebe in einem sterilen Behälter verpackt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in welcher ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt in einem Bioreaktor angezüchtet und dezellularisiert wird, wird die Cryokonservierungslösung in den Bioreaktor eingeführt, welcher als Behälter für die Aufbewahrung verwendet wird.
Die Wahl und Konzentration des Kälteschutzmittels, der zeitliche Verlauf für die Zugabe des Kälteschutzmittels, die Temperatur, mit welcher das Kälteschutzmittel eingeführt wird sowie die Geschwindigkeit der Abkühlung uns das anschließende Wiedererwärmen spielen alle eine wichtige Rolle für den Erfolg des Konservierungsprozesses. Es sind verschiedene spezifische Verfahren und Methoden für die Konservierung und Aufbereitung nach der Lagerung entwickelt worden und an verschiedenen Geweben und Zellen angewendet worden. Es werden Techniken zur Konservierung von Geweben und Organen wie z.B. von Blutgefäßen, Herzklappen, Geweben von Skelettmuskeln, sowie Geweben aus Kollagen durch Cryokonservierung beschrieben, z.B. in den US-Patenten 4,890,4575; 5,131,850; 5, 158,867 und 5,336,616, in welcher ein Verfahren zur Konservierung einer zellfreien auf Kollagen basierenden Gewebsmatrix beschrieben wird. Das Verfahren umfasst die Inkubation eines dezellularisierten eine proteinartige Matrix aufweisenden Gewebes mit einer Lösung eines Kälteschutzmittels, gefolgt vom Einfrieren bei solchen Abkühltemperaturen, dass an der proteinartigen Matrix ein minimaler funktionelle Schaden auftritt, Trocknen des kältebehandelten Gewebes unter solchen Temperatur- und Druckbesingungen, dass das Wasser ohne nennenswerte Rekristallisation von Eis oder einem Schaden an der Ultrastruktur entfernt werden kann, Aufbewahren des Gewebes und nachfolgende Rehydratisierung.
Techniken und Reagenzien zur Vitrifikation werden in den US-Patenten 4,559,298; 5,217,860; 5,952,168 und 5,962,214 beschrieben. Die in diesen Referenzen beschriebenen Verfahren lassen sich leicht auf die hier offenbarten, mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukte und manipulierten dezellularisierten nativen Gewebe übertragen.
Obwohl die Cryokonservierung einen verlässlichen Ansatz für die Aufbewahrung eine mittels Tissue Engineering gewonnenen dezellularisierten Konstrukts der vorliegenden Erfindung darstellt, liegen alternative Verfahren ebenfalls im Geltungsbereich der Erfindung. Es können z.B. auch Trocknungsverfahren eingesetzt werden, bei denen stabilisierende Komponenten wie z.B. Sucrose zugesetzt werden. Eine Kombination von Dextran und Glucose sorgt für gewünschte physikalische Eigenschaften und einen Schutz der Proteine gegen Stresssituationen beim Gefriertrocknen und beim Lufttrocknen. Das Gefriertrocknen kann unter Einsatz eines Lyophilisators erfolgen. Das Lufttrocknen kann unter einem Strom von trockenem Stickstoff stattfinden und das Konstrukt kann dann im Vakuum bei Raumtemperatur lyophilisiert werden.
Wiederaufbereitung eines dezellularisierten Konstrukts
Je nach der gewählten Lagerungstechnik wird das Konstrukt vor seiner Implantation in ein Subjekt auf geeignete Weise wiederaufbereitet oder für ein weiteres Tissue Engineering verwendet. Bei der Wiederaufbereitung werden vorzugsweise die Cryokonservierungsmittel entfernt, welche möglicherweise gegen Zellen toxisch und reitend sind, wenn sie in den Körper eingeführt werden. Darüber hinaus verursachen bevorzugte Wiederaufbereitungstechniken nur minimale Veränderungen bei den Strukturkomponenten des Konstrukts. Im Falle einer Cryokonservierung umfasst die Wiederaufbereitung das (vorzugsweise schnelle) Aufwärmen und die Entfernung der Cryokonservierungslösung, wie dies in den oben angegebenen Patenten beschrieben wird. Die Entfernung der Cryokonservierungslösung kann durch sorgfältiges Waschen erfolgen, z.B. in normaler Saline oder in einem standardisierten Zellkulturmedium. Falls ein Trocknungsschritt eingesetzt wird, schließt die Wiederaufbereitung, wie im US-Patent 5,336,616 beschrieben, eine Rehydratisierung ein (z.B. in normaler Saline oder in einem standardisierten Zellkulturmedium). Antibiotica und/oder Antipilzmittel können sich in der für das Auswaschen und/oder die Rehydratisierung verwendeten Lösung befinden, um die Chance für eine Kontamination möglichst klein zu halten. Getrocknetes Gewebe kann direkt einer Zellsuspension ausgesetzt werden, wodurch die Wiederaufbereitung und Beimpfung in einem Schritt erfolgt. Das getrocknete Gewebe kann ausgewaschen werden, z.B. mit Medien zur Entfernung aller Trocknungsmittel und dann, falls nötig, in Medien getränkt werden, bevor das Gewebe einer Zellsuspension ausgesetzt wird.
Verwendung und weiteres Engineering eines mittels Tissue Engineering gewonnenen dezellularisierten Konstrukts
Wie oben beschrieben kann ein mittels Tissue Engineering gewonnenes dezellularisiertes Konstrukt in den Körper eines Subjekts implantiert werden, um ein Gewebe oder Organ, welches einen Bedarf danach hat, zu reparieren, zu ersetzen oder zu vermehren. Die Implantation kann erfolgen, indem jede der verschiedenen Techniken, wie z.B. dem Fachmann bekannte chirurgische Techniken eingesetzt werden und in Abhängigkeit von der besonderen Funktion, die das Konstrukt erfüllen soll. Ein dezellularisiertes vaskuläres Konstrukt kann z.B. bei einer Bypass-Operation eingesetzt werden, um ein erkranktes Blutgefäß zu ersetzen. Ein dezellularisiertes Herzklappen-Konstrukt kann bei einer Operation zum Ersatz einer Herzklappe eingesetzt werden, um z.B. eine stenotische oder mangelhaft arbeitende Klappe zu ersetzen. In dem Falle, dass das dezellularisierte Konstrukt direkt in einen Empfänger transplantiert wird, kann das Konstrukt mit den eigenen Zellen des Empfängers erneut besiedelt werden. Dem Konstrukt können verschiedene Agenzien wie z.B. Wachstumsfaktoren zugesetzt werden, um diesen Prozess zu beschleunigen. Solche Mittel können z.B. vor oder nach der Implantation zugesetzt werden z.B. mittels Injektion in das Konstrukt oder nahe bei dem Konstrukt, durch systemische Verabreichung an den Empfänger des Konstrukts usw.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das dezellularisierte Konstrukt vor der Implantation in einen Empfänger weiteren Tissue-Engineering-Schritten unterzogen. Solche Schritte können das beimpfen des Konstrukts mit einer oder mehreren Zellpopulationen sein, vorzugsweise mit von dem ins Auge gefassten Patienten erhaltenen Zellen. Ein dezellularisiertes Gefäßkonstrukt kann z.B. mit glatten Muskel- und/oder Endothelzellen beimpft werden, die aus einer dem ins Auge gefassten Patienten entnommenen Biopsieprobe erhalten wurde. Nach einem Zeitraum, in welchem sich die Zellen an das Konstrukt anheften können, kann das beimpfte Konstrukt in den Patienten implantiert werden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden die Zellen genetisch transformiert, so dass sie die gewünschten Eigenschaften zeigen, z.B. die Produktion eines Proteins oder eines anderen Moleküls, welches im Empfänger nicht vorkommt oder die Produktion eines Wachstumsfaktors, der im Konstrukt die Zellbildung oder Angiogenese anregt. In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird das Konstrukt vor der Implantation in den Empfänger mit einem bioaktiven Mittel wie z.B. einer pharmazeutischen Zusammensetzung getränkt und dient damit als ein Vehikel zur Arzneimittelausschüttung.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das dezellularisierte Konstrukt vor seiner Implantation in den Empfänger beimpft und über einen Zeitraum kultiviert. Diese Wachstumsphase kann im Vergleich mit der Zeit, die für die Anzucht des Konstrukts vor seiner Dezullularisierung benötigt wird, relativ kurz sein (z.B. 1 bis 2 Wochen). In dieser Phase können sich die beimpften Zellen an ihre Umgebung gewöhnen und mit der Teilung beginnen. Da jedoch das Konstrukt bereits über eine beachtliche Masse und Festigkeit verfügt, brauchen die Zellen nicht so lange kultiviert zu werden, das sie eine ausgedehnte extrazelluläre Matrix bilden. Das dezellularisierte Konstrukt kann natürlich mehrfachen Beimpfungen und Wachstumsphasen unterzogen werden. Im Allgemeinen kann in jeder auf die Dezellularisierung folgenden Wachstumsphase jede oder alle der beim Wachstum des Konstrukts vor der Dezellularisierung eingesetzten Techniken verwendet werden. Die oben beschriebenen Substanzen können z.B. dem Konstrukt zugesetzt werden, um die Anheftung der Zellen zu begünstigen. Wachstumsfaktoren können dem Konstrukt zugesetzt werden und/oder im Medium enthalten sein, um das Wachstum der Zellen und/oder die Entwicklung oder Haltung eines differenzierten Phänotyps zu unterstützen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden während der Wachstumsphase(n) nach der Dezellularisierung an das beimpfte dezellularisierte Konstrukt Reize wie die oben beschriebenen verabfolgt (z.B. pulsierende Kräfte und/oder ein Flüssigkeitsstrom).
Somit wird in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Blutgefäß hergestellt, in dem ein Bioreaktorsystem verwendet wird, in welchem pulsierende Reize und durch einen Flüssigkeitsstrom hervorgerufene Reize einem Substrat verabfolgt werden, das mit glatten Muskelzellen und Endothelzellen beimpft ist, die für einen ins Auge gefassten Empfänger allogen sind. Das Substrat wird mit Verabfolgung einer pulsierenden Streckung etwa 6 bis 8 Wochen lang kultiviert, während denen eine im Wesentlichen proteinartige extrazelluläre Matrix ausgeschieden wird und das Produkt die gewünschten physikalischen Eigenschaften und die gewünschte Dicke annimmt. Das Konstrukt wird sodann in der Bioreaktorkammer dezellularisiert, wobei während der Dezellularisierungsphase pulsierende Kräfte und ein pulsierender Flüssigkeitsstrom verabfolgt werden, um den Dezellularisierungsprozess zu beschleunigen und um zur Entfernung des Substrats beizutragen. Das dezellularisierte Konstrukt wird bis es benötigt aufbewahrt. Nach der Identifizierung eines Individuums, das eines Gefäßtransplantats bedarf, wird das Konstrukt aus dem Lager entnommen und mit glatten Muskel- und Endothelzellen beimpft, die von dem ins Auge gefassten Empfänger erhalten wurden. Nach relativ kurzer Kultivierungszeit (z.B. 1 bis 2 Wochen), während welcher dem Konstrukt pulsierende Reize und/oder ein pulsierender Flüssigkeitsstrom verabfolgt werden können, wird das rezellularisierte Konstrukt unter Einsatz eines geeigneten chirurgischen Verfahrens in den Empfänger implantiert.
Bewertung der biochemischen Eigenschaften und der Lebensfähigkeit der Zellen von Konstrukten und Geweben
Es kann erwünscht sein, ein dezellularisiertes Konstrukt zu verwenden, das biochemische Eigenschaften aufweist, die denen des Gewebes oder Organs ähnlich oder überlegen sind, dem sie entsprechen, insbesondere wenn das dezellularisierte Konstrukt in den Körper implantiert werden soll, ohne dass es zusätzlichen Tissue-Engineering-Schritten unterzogen wurde. Es können verschiedene Verfahren zur Anwendung kommen, um die biochemischen Eigenschaften von mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukten oder von dezellularisierten Konstrukten, die danach mit Zellen beimpft und kultiviert wurden, zu untersuchen. Die ausgewählte besondere Technik hängt im Allgemeinen von dem Konstrukt ab und die gewünschten biochemischen Eigenschaften richten sich nach der beabsichtigten Funktion des Konstrukts nach seiner Implantation in einen Empfänger. Geeignete Verfahren zum Testen der biochemischen Eigenschaften eines Gefäßkonstrukts werden in der anhängigen Anmeldung 09/109,427 mit dem Titel "Tissue-Engineered Constructs" beschrieben (siehe die darin enthaltenen Beispiele) und umfassen die Messung der Burststärken und der Compliances und die Messung der Sutura-Retentionsstärke. Spannungs-Dehnungs-Analysen wie z.B. der Single-Load-versus-Elongation-Test, der Spannungrelaxationstest sowie der Tensile-Failure-Test werden in dem US-Patent 5,613,982 (siehe Beispiel 7) beschrieben und sind auch geeignet und lassen sich im Allgemeinen für jeden Typ eines mittels Tissue Engineerung gewonnenen Konstrukts verwenden. Es können auch dem Fachmann bekannte zusätzliche Tests zur Anwendung kommen.
In den Ausführungsformen der Erfindung, in welchen das dezellularisierte Konstrukt vor seiner Implantation in einen Empfänger beimpft und kultiviert wird, kann es erwünscht sein, dass das Konstrukt vor seiner Implantation funktions- und lebensfähig ist. Es lassen sich verschiedene Verfahren anwenden, um die Funktions- und Lebensfähigkeit des Konstrukts zu ermitteln. Die Lebensfähigkeit von Zellen lässt sich z.B. mit dem Trypanblau-Ausschluss-Assay ermitteln, indem die gesamte Proteinsynthese (z.B. durch Messen des Einbaus von [³H]-Prolin) oder DNA-Synthese (z.B. durch Messen des Einbaus von [³H]-Thymidin) gemessen werden. Spezifischere Assays für die Zellaktivität wie die Messung der Kollagenproduktion sind im Stand der Technik wie z.B. dem US-Patent 5,613,982 ebenfalls bekannt.
Produktion eines dezellularisierten, manipulierten, nativen Gewebes
In den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren wird ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt dezellularisiert. Die Verfahren lassen sich jedoch erweitern so dass sie die Dezellularisierung von nativem Gewebe umfassen, das einem Spender entnommen und vor der Dezullularisierung Tissue-Engineering-Schritten unterzogen wurde. Verfahren zur Entnahme von Geweben aus Spendern (z.B. aus lebenden oder toten tierischen oder menschlichen Spendern) sind im Stand der Technik bekannt. Es sind verschiedene Verfahren eingesetzt worden, um Gefäßgewebe, Herzklappen, Haut, Organe wie Nieren, Lebern, Lungen, Herzen usw. zu entnehmen. In einigen Fällen werden Gewebe oder Organe für den Zweck einer direkten Transplantation in einen Empfänger entnommen, in welchem Falle es das Ziel ist, das Gewebe oder Organ im Allgemeinen direkt in einem Zustand zu konservieren, der dem Zustand so nahe wie möglich kommt, in welchem es dem Spender entnommen wurde und das entnommene Gewebe oder Organ einer minimalen Bearbeitung unterzogen. In anderen Fällen wie z.B. der Entnahme von Herzklappen des Schweins, die als Ersatz für Herzklappen des Menschen verwendet werden, kann das entnommene Gewebe einer extensiven chemischen Weiterbehandlung wie einer Fixierung, Dezellularisierung, Quervernetzung usw. unterzogen werden, um die Immunogenität zu vermindern und/oder die physikalischen Eigenschaften zu verbessern. Verfahren zur Dezellularisierung von entnommenem nativem Gewebe und dessen Wiederbesiedelung mit neuen Zellen sind beschrieben worden (z.B. in den US-Patenten 5,192,312 und 5,613,982). Die Behandlung von entnommenen Geweben vor deren Dezellularisierung ist jedoch allgemein auf die Aufbewahrung und/oder Konservierung des Gewebes beschränkt geblieben.
Nach der vorliegenden Erfindung wird aus einem Tier oder einem Menschen entnommenes natives Gewebe in Kultur gezüchtet. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das native Gewebe vor oder nach einer Kultivierungsphase mit Zellen beimpft, obwohl dies nicht erforderlich ist. Die Zellen können von jedem der oben beschriebenen Typen sein, vorzugsweise stammen die Zellen jedoch von der gleichen Art wie der für das manipulierte Gewebe ins Auge gefasste Empfänger. Im Allgemeinen lässt sich jedes der im Zusammenhang mit der Herstellung eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Gewebes beschriebene Kulturverfahren bei der Kultivierung von entnommenem nativem Gewebe einsetzen. Es können z.B. Wachstumsfaktoren zum Einsatz kommen, um das Zellwachstum zu beschleunigen oder einen differenzierten Phänotyp zu halten. Agenzien, die zur Verbesserung der Haftung der Zellen ausgewählt wurden, können dem nativen Gewebe zugesetzt werden. Das entnommene native Gewebe kann, wie oben für mittels Tissue Engineering gewonnene Konstrukte beschrieben, während der Kultivierungsphase physikalischen Reizen ausgesetzt werden, wie z.B. pulsierenden Streckungen oder einem Flüssigkeitsstrom. Nach einer oder mehreren Kultivierungsphasen, während denen eine oder mehrere Beimpfungen mit Zellen stattfinden können, wird das native Gewebe dezellularisiert. Das dezellularisierte manipulierte native Gewebe kann für jede der oben für mittels Tissue Engineering gewonnene dezellularisierte Konstrukte beschrieben Zwecke verwendet werden.
Somit weist zusammenfassend das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte auf, dass (i) natives Gewebe entnommen wird; (ii) das native Gewebe einem oder mehreren Tissue-Engineering-Schritten unterzogen wird, um ein manipuliertes natives Gewebe zu gewinnen und (iii) das manipulierte native Gewebe dezellularisiert wird, um ein manipuliertes natives dezellularisiertes Gewebe zu gewinnen. Der (die) Tissue-Engineering-Schritt(e) umfasst (umfassen) die Kultivierung des nativen Gewebes unter für das Wachstum geeigneten Bedingungen und kann (können) wahlweise die Schritte aufweisen, dass das native Gewebe einer oder mehreren Beimpfungen mit Zellen mit wahlweise dazwischen liegenden Wachstumsphasen unterzogen wird und dass das Gewebe mechanischen, elektrischen und/oder chemischen Reizen ausgesetzt wird. Solche Reize können die Verabfolgung von Kräften aus pulsierenden Streckungen oder Flüssigkeitsströmen, die Behandlung des nativen Gewebes mit Wachstumsfaktoren usw. umfassen. Das dezellularisierte manipulierte native Gewebe kann auf alle der oben für ein dezellularisiertes mittels Tissue Engineering gewonnenes Konstrukt beschriebenen Weisen verwendet werden. Somit kann das dezellularisierte, manipulierte, native Gewebe in den Körper eines Subjekts implantiert oder für weiteres Tissue Engineering verwendet werden. Das dezellularisierte, manipulierte, native Gewebe kann aufbewahrt und wie oben beschrieben wiederaufbereitet werden. Das dezellularisierte, manipulierte, native Gewebe kann mit Zellen beimpft werden, z.B. mit Zellen, die von dem ins Auge gefassten Empfänger stammen, und können vor der Implantation in den Empfänger in Kultur gehalten werden. Während der Kultivierungsphase(n) können nach der Dezellularisierung mechanische, elektrische und/oder chemische Reize verabfolgt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Bereitung eines mit Zellen beimpften Primärkonstrukts
In diesem Beispiel wird die Bereitung eines für die Dezellularisierung geeigneten mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts beschrieben, in diesem Falle eine kleinkalibrige Arterie, wobei Bioreaktorsystem eingesetzt wird. Eine genauere Beschreibung vieler Aspekte dieses Prozesses findet sich in der oben bezeichneten anhängigen Anmeldung. Als Anfangsschritt wurde ein aus Polyglykolsäure (PGA)-Fasern (Albany International Research Co., Mansfield, MA) hergestelltes Non-Wowen-Netze hergestellt und weiter bearbeitet, um ein poröses Substrat mit einer hydrophilen Oberfläche zu erhalten. Die Weiterbearbeitung verbessert die Benetzbarkeit und erhöht die Anzahl der Zellen, die sich während des Beimpfens auf der Oberfläche ablagern. Kurz gesagt begann die Behandlung mit drei aufeinander folgenden 30-minütigen Waschvorgängen in Hexan, Dichlormethan und Diethylether, gefolgt von einer Lyophilisation über Nacht. Das Netz aus PGA wurde sodann kurz in Ethanol getaucht, dann mit destilliertem Wasser behandelt und für 1 Minute in eine 1,0 normale Lösung von NaOH gegeben, wobei die Lösung gerührt wurde. Das Netz wurde dann nacheinander in destilliertem Wasser gewaschen, wobei die Lösung geändert wurde bis das pH der Waschlösung bei etwa 7,0 blieb. Das wurde dann über Nacht lyophilisiert. das Netz wurde zu Röhren mit Innendurchmessern von etwa 3–6 mm und Längen von etwa 1 bis 10 cm zusammengerollt, welche dann mit einem unbeschichteten Faden aus PGA zusammengenäht wurden (Davis & Geck, Inc., Manati, P. R.), um ein röhrenförmiges Substrat zu bilden.
1 zeigt das für eine Beimpfung mit Zellen passend zusammengesetzte Bioreaktorsystem (10).
Der Bioreaktor umfasst eine Kammer (32) aus Glas mit einem Volumen von ca. 200 ml und hohlen Seitenarmen (12) mit einem Innendurchmesser von 4 mm. Die Seitenarme werden im Gefäß an röhrenförmigen Verbindungsstücken (24) aus Plastik angebracht. Eine kurze röhrenförmige Manschette (26) aus dem nicht abbaubaren Gefäßimplantat-Material Dacron (Sherwood-Davis & Geck, St Louis, MO) mit einem Innendurchmesser von ca. 5 mm wird an jeder Seite des Bioreaktors an das Verbindungsstück aus Plastik angenäht. Die Dacron-Manschette fungiert als Anker zum Anheften des sich entwickelnden Gewebes an den Huststoff und das Glas des Bioreaktorsystems. In die Poren wachsen leicht glatte Muskelzellen und Fibroblasten hinein, wodurch sich die Bildung einer kontinuierlichen Verbindung zwischen dem Zellgewebe und den nicht abbaubaren Elementen des Systems erreichen lässt.
Für die Produktion eines Gefäß-Stützgewebes werden bei der Bereitung die Enden des röhrenförmigen PGA-Substrats unter Verwendung eines unbeschichteten Fadens aus Dacron (Sherwood-Davis & Geck, St Louis, MO) an die Dacron Manschetten genäht. Ein Stück eines hochdehnbaren Siliconschlauchs (14) für medizinische Zwecke mit bekannter Compliance (Patter Products, Beaverton, MI) wurde durch die Seitenarme, die Verbindungsstücke aus Plastik und die Manschetten aus Dacron eingeführt. Das Bioreaktorsystem mit dem röhrenförmigen Substrat wurde sterilisiert, indem es Ethylenoxid ausgesetzt wurde, und etwa drei Tage lang entgasen gelassen.
Glatte Muskelzellen aus der Aorta von Rindern wurden wie folgt erhalten. Von einem Schlachthof vor Ort wurden Explantate der Thoraxaorta von Rindern auf Eis erhalten. Die Aorten wurden in PBS gelegt, die mit Standardkonzentrationen an Penicillin (100 E/ml) supplementiert worden war. Die Innenschicht der Aorta wurde mit einer Pinzette abgezogen und die äußere Adventitia wurde zusammen mit der äußeren Media entfernt. Der restliche Mitelabschnitt der Media wurde mit der zuvor endothelialen Seite nach unten in eine Petrischale gelegt und das Gewebe in Abständen von 1 cm eingeschnitten. Es wurde ausreichen DMEM mit Pen-Strep und 15% FBS zugegeben, um den Boden der Schale zu bedecken, ohne dass die Gewebe dazu gebracht wurden, über die Oberfläche zu fließen. Die Gewebe wurden 7 bis 10 Tage lang kultiviert während welcher die glatten Muskelzellen aus den Geweben herauswanderten, um am Ende der Kultivierungsphase in der Schale einen Monolayer zu bilden. Die Gewebe wurden dann entfernt und die Zellen für insgesamt 2 bis 3 Passagen kultiviert. Die Identität von glatten Muskelzellen und die Reinheit wurden durch das visuelle Erscheinungsbild bestätigt und durch die Immunofärbung des α-Actins in glatten Muskeln. Die Zellen wurden mittels Trypsinisierung (0,05% Trypsin, 0,02% EDTA) aus der Kultur entfernt, zu einem Pellet zentrifugiert und sacht resuspendiert, um eine einzelne Zellsuspension in frischem DMEM zu bilden.
Das Substrat wurde beimpft, indem 1 bis 2 ml einer Suspension von glatten Muskelzellen aus der Rinderaorta mit einer Konzentration von etwa 5 × 10⁶/ml gleichmäßig auf das Substrat pipettiert wurden. Man ließ die Zellen 30 Minuten lang dich anheften und dann wurde in das Gefäß des Bioreaktors frisches Medium gegeben. Das manipulierte Gefäß wurde in dem Bioreaktor unter ständigem Rühren kultiviert, in einer Atmosphäre von 10% CO, bei einer Temperatur von 37°C in DMEM, der mit 20% FBS, Penicillin G (100 E/ml), 5 mM HEPES, Ascorbinsäure (0,05 mg/ml), CuSO₄ (3 ng/ml), Prolin (0,05 mg/ml), Alanin (0,03 mg/ml) und Glycin (0,05 mg/ml) supplementiert worden war. Die Ascorbinsäure wurde täglich nachgefüllt. Ungefähr die Hälfte des Mediums wurde zweimal pro Woche durch frisches Medium ersetzt. Somit wurde jede Woche ein Volumen an frischem Medium zugegeben, das gleich dem Volumen des Bioreaktors war.
Beispiel 2
Dezellularisierung eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts einer Rinderarterie unter Einsatz von ionischen Detergenslösungen
Material und Methoden
Kleinkalibrige Arterien wurden wie in Beispiel 1 beschrieben unter Einsatz von glatten Muskelzellen aus der Rinderaorta manipuliert. Nach einer Kulturphase von 8 Wochen wurde ein Gefäß aus dem Bioreaktor entnommen, mit PBS gewaschen und zu Segmenten von 2 mm Dicke zerschnitten. Die Schnitte wurden in 50 ml einer Dezellularisierungslösung getaucht, welche 1 M NaCl, 25 mM EDTA, 8 mM CHAPS in steriler PBS bei pH 7,2 enthielt. Die Proben wurden unter kontinuierlichem Rühren 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und sodann dreimal in PBS gewaschen. Dann wurden die Proben in 50 ml einer zweiten Dezellularisierungslösung gelegt, die 1 M NaCl, 25 mM EDTA, 1,8 mM SDS in sterilem PBS bei pH 7,2 enthielt und 1 Stunde lang unter kontinuierlichem Rühren bei Raumtemperatur inkubiert. Nach ihrer Entnahme aus der Dezellularisierungslösung wurden die Segmente zweimal 5 Minuten lang mit PBS gewaschen, um die restliche Lösung zu entfernen.
Die dezellularisierte Arterie und eine Kontrollarterie, die identischen Bedingungen produziert aber keiner Dezellularisierung unterzogen worden war, wurden in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardtechniken angefärbt.
Ergebnisse
In 2 wird eine schwach vergrößerte (66×, Bild A) und eine stark vergrößerte (100×, Bild B) Mikrofotografie von unbehandelten Kontrollgefäßen gezeigt. In Bild A ist die äußere Oberfläche des Gefäßes rechts und die innere Oberfläche (Lumen) links. Wie in der Figur gezeigt, setzt sich der äußerste Abschnitt des Gefäßes fast ganz aus Zellen (sichtbar als kleine, dunkle, purpurrote Flecken) un extrazellulärer Matrix zusammen. Das drittinnerste Gefäß enthält auch ringförmige Polymerfragmente, welche in das manipulierte Gefäß in nicht organisierter Form eingebaut sind. In Bild B mit der stärkeren Vergrößerung ist die äußere Oberfläche des Gefäßes unten.
In 3 wird eine schwach vergrößerte (66×, Bild C) und eine stark vergrößerte (100×, Bild D) Mikrofotografie des dezellularisierten Gefäßes gezeigt. Die innere Oberfläche des Gefäßes liegt in Bild C rechts. Wie in der Figur gezeigt, sind die Polymerfragmente in die Gefäßarchitektur loser eingebaut als bei der Kontrollarterie. In Bild D wird der Gewebeabschnitt des Gefäßes mit der äußeren Oberfläche auf der rechten Seite gezeigt. Es sind einige Zellfragmente sichtbar, besonders in der äußersten Abschnitten der Gefäßwand, aber die Gesamtzahl der Zellen und Zellüberreste ist im Vergleich mit der Kontrollarterie deutlich kleiner.
Beispiel 3
Dezellularisierung eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Arterienkonstrukts des Rindes unter Einsatz von nicht-ionischen Detergenslösungen
Material und Methoden
Kleinkalibrige Arterien wurden wie in Beispiel 1 beschrieben unter Einsatz von glatten Muskelzellen aus der Rinderaorta manipuliert. Nach einer Kulturphase von 8 Wochen wurde ein Gefäß aus dem Bioreaktor entnommen, mit PBS gewaschen und zu Segmenten von 2 mm Dicke zerschnitten. Die Schnitte wurden in 50 ml einer Dezellularisierungslösung getaucht, welche 1% Triton X-100^® (Sigma), 20 μg/ml RNAse A (Sigma) und 0,2 mg/ml DNAse (Sigma) in steriler PBS ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺ enthielt, und 24 Stunden lang unter 10% CO₂-Atmosphäre bei 37°C unter ständigem Rühren inkubiert. Nach ihrer Entnahme aus der Dezellularisierungslösung wurden die Segmente mehrmals mit PBS gewaschen, um restliche Lösung zu entfernen.
Die dezellularisierte Arterie und eine Kontrollarterie, die identischen Bedingungen produziert aber keiner Dezellularisierung unterzogen worden war, wurden in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardtechniken angefärbt.
Ergebgnisse
In 4 wird eine schwach vergrößerte (66×, Bild E) und eine stark vergrößerte (100×, Bild F) Mikrofotografie des dezellularisierten Gefäßes gezeigt. Die innere Oberfläche des Gefäßes liegt in Bild E rechts. Wie in der Figur gezeigt, sind die Polymerfragmente (34) an der restlichen Kollagenmatrix sehr schwach adhärent. In Bild F wird der Gewebsabschnitt gezeigt, wobei sehr wenig Zellreste oder Kernmaterial zwischen den Kollagensträngen verblieb. Im Vergleich mit der in 3 gezeigten Kontrollarterie wird die Zahl der Zellen und Zellreste signifikant vermindert.
Beispiel 4
Dezellularisierung eines mittels Tissue Engineering gewonnenen Arterienkonstrukts des Schweins unter Einsatz von ionischen Detergenslösungen
Material und Methoden
Glatte Muskelzellen aus der Halsschlagader von Schweinen wurden wie folgt erhalten. Von einem Schlachthof vor Ort wurden Explantate der Thoraxaorta von Rindern auf Eis erhalten. Die Aorten wurden in PBS gelegt, die mit Standardkonzentrationen an Penicillin (100 E/ml) supplementiert worden war. Die Innenschicht der Aorten wurde mit einer Pinzette abgezogen und die äußere Adventitia wurde zusammen mit der äußeren Media entfernt. Der restliche Mitelabschnitt der Media wurde mit der zuvor endothelialen Seite nach unten in eine Petrischale gelegt und das Gewebe in Abständen von 1 cm eingeschnitten. Es wurde ausreichend DMEM mit Pen-Strep und 101% FBS zugegeben, um den Boden der Schale zu bedecken, ohne dass die Gewebe dazu gebracht wurden, über die Oberfläche zu fließen. Die Gewebe wurden 7 bis 10 Tage lang kultiviert während welcher die glatten Muskelzellen aus den Geweben herauswanderten, um am Ende der Kultivierungsphase in der Schale einen Monolayer zu bilden. Die Gewebe wurden dann entfernt und die Zellen für insgesamt 2 bis 3 Passagen kultiviert. Die Identität von glatten Muskelzellen und die Reinheit wurden durch das visuelle Erscheinungsbild und durch die Immunofärbung des α-Actins in glatten Muskeln bestätigt. Die Zellen wurden mittels Trypsinisierung (0,05% Trypsin, 0,02% EDTA) aus der Kultur entfernt, zu einem Pellet zentrifugiert und sacht resuspendiert, um eine einzelne Zellsuspension in frischem DMEM zu bilden.
Eine kleinkalibrige Arterie wurde wie im Wesentlichen in Beispiel 1 beschrieben unter Einsatz von glatten Muskelzellen aus der Halsschlagader des Schweins manipuliert, mit der Ausnahme, dass das verwendete Medium eher mit 10% als mit 20% FBS supplementiert wurde. Nach einer Kulturphase von 8 Wochen wurde ein Gefäß aus dem Bioreaktor entnommen, mit PBS gewaschen und zu Segmenten von 2 mm Dicke zerschnitten. Die Schnitte wurden in 50 ml einer Dezellularisierungslösung getaucht, welche 1 M NaCl, 25 mM EDTA, 8 mM CHAPS in steriler PBS bei pH 7,2 enthielt. Die Proben wurden unter ständigem Rühren 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und sodann dreimal in PBS gewaschen. Dann wurden die Proben in 50 ml einer zweiten Dezellularisierungslösung gelegt, die 1 M NaCl, 25 mM EDTA, 1,8 mM SDS in steriler PBS bei pH 7,2 enthielt und 4 Stunden lang unter kontinuierlichem Rühren bei Raumtemperatur inkubiert. Nach ihrer Entnahme aus der Dezellularisierungslösung wurden die Segmente zweimal 5 Minuten lang mit PBS gewaschen, um die restliche Lösung zu entfernen.
Die dezellularisierte Arterie und eine Kontrollarterie wurde in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardtechniken angefärbt.
Ergebnisse
In 5A wird eine Mikrofotografie eines Abschnitts eines manipulierten Gefäßes vor der Dezellularisierung gezeigt. Auf dem Bild ist ein krapfenförmiger Querschnitt des Gefäßes zu erkennen. Die purpurroten Zellkerne sind klar zu erkennen und die extrazelluläre Matrix ist rosa gefärbt. 5B zeigt eine Mikrophotographie eines Abschnitts des gleichen Gefäßes nach der Dezellularisierung. Das fast vollständige Fehlen von Kernmaterial legt nahe, das mit der Vorschrift für die Dezellularisierung die große Mehrheit der Zellen wirksam entfernt werden konnte, während die extrazelluläre Matrix im Wesentlichen intakt blieb. Es ist wahrscheinlich, dass kürzere Zeiträume für das Eintauchen in die Dezellularisierungslösung (z.B. 30 Minuten bis 4 Stunden) auch zu annehmbaren Ergebnissen führen würde.
Wird nach dieser Vorschrift gearbeitet, gibt es kein Anzeichen für zurückbleibendes Polymersubstrat nach der Dezellularisierung. Dieser Befund legt nahe, dass die bei dem Gefäß des Schweins benutzten Dezellularisierungsphasen das Substrat wirksamer entfernen können als die oben beschriebenen kürzeren Phasen zur Dezellularisierung des Rindergefäßes.
Beispiel 5
Dezellularisierung und Neubeimpfung eines kultivierten nativen Gewebekonstrukts
Material und Methoden
Glatte Muskelzellen aus der Halsschlagader von Schweinen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben erhalten. Um die Sichtbarmachung nach der Aussaat zu erleichtern, wurden die Zellen nach den Angaben des Herstellers mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff PKH26-GL (Sigma) fluoreszenzmarkiert.
Ein Segment einer Halsschlagader eines erwachsenen Schweins wurde mittels einer Behandlung mit Lösungen in zwei Phasen dezellularisiert. Die Arterie wurde nach einer Vorschrift ähnlich der in Swindle, M. M., Moody, D. C, Phillips, L. D., Swine as Models in Biomedical Research, Ames, Iowa, Iowa State University Press, 1992. beschriebenen wie folgt entnommen: Die Narkose wurde mit 2,0 mg/kg Tiletamin + 8,8 mg/kg Zolazepam, die nach Bedarf mit alle 1 bis 2 Stunden stattfindenden stoßweisen Boli ergänzt wurden eingeleitet. Die Narkose wurde während der Länge des Eingriffs mit 2% Foran aufrechterhalten. Der linke seitliche Hals wurde vorbereitet und mit einem Tuch abgedeckt. Die linke Halsschlagader wurde freigelegt, ligiert und über eine Länge von 2 bis 3 cm herausgeschnitten. Die Schnittwunde wurde schichtweise geschlossen. Die entnommene Arterie wurde zum Transport (ca. 10 Minuten) in DMEM gelegt und dann unmittelbar in die Dezellularisierungslösung gegeben. Über die ersten 24 Stunden wurde die Arterie in auf PBS basierendes 8 mM NaCl und 25 mM EDTA getaucht. Die Lösung wurde sodann durch 1,8 mM SDS, 1 M NaCl und 25 mM EDTA ersetzt und weitere 24 Stunden inkubiert. Beide Behandlungen erfolgten unter Rühren unter sterilen Bedingungen bei 37°C und 10% CO₂. Nach der Dezellularisierung wurde das Gefäß sorgfältig in PBS ausgewaschen.
Ein Segment des Gefäßes wurde in einem sterilen Bioreaktor suspendiert und mit fluoreszenzmarkierten glatten Muskelzellen aus der Halsschlagader des Schweins beimpft, indem 1 bis 2 ml Zellsuspension mit einer Konzentration von ca. 7 × 10⁶/ml gleichmäßig auf die äußere Oberfläche des dezellularisierten Gefäßes pipettiert wurden. Die Zellen ließ man 29 Minuten lang sich anheften und das zweite Gefäß wurde, wie oben beschrieben, in einen Bioreaktor gelegt. Der Bioreaktor wurde mit 250 ml DMEM-Kulturmedium gefüllt, das mit 10% FBS, Penicillin G (100 E/ml), 5 mM HEPES, Ascorbinsäure (0,05 mg/ml), CuSO₄ (3 ng/ml), Prolin (0,05 mg/ml), Alanin (0,03 mg/ml) und Glycin (0,05 mg/ml) supplementiert worden war. Die Ascorbinsäure wurde täglich nachgefüllt.
Das Gefäß wurde drei Tage lang in einer 10% CO₂-Atmosphäre bei einer Temperatur von 37°C unter Rühren kultiviert. Das Gefäß wurde sodann dem Bioreaktor entnommen und die Segmente für die Histologie eingefroren, indem sie zunächst in eine OCT (orptimum cutting temperature)-Verbindung, eine in weitem Umfang zur Verfügung stehende Formulierung von wasserlöslichen Glykolen und Harzen, eingetaucht werden und dann in flüssigen Stickstoff gelegt werden. Die Segmente werden in gefrorenem Zustand geschnitten und auf Objektträger gelegt, die bis zur Untersuchung mit dem Mikroskop gefroren eingehalten werden.
Ergebnisse
In 6 wird (a) eine Phasenkontrastaufnahme eines Gefäßquerschnitts und (b) die entsprechende Aufnahme des fluoreszierenden Querschnitts gezeigt. Da die Zellen vor ihrer Aussaat fluoreszenzmarkiert wurden, können die ausgesäten Zellen von den restlichen Zellen unterschieden werden, die nach dem Dezellularisierungsvorgang zurückbleiben. Das Vorkommen von fluoreszierenden Zellen auf der Oberfläche des Gefäßes wies, wie aus 6B zu ersehen ist, darauf hin, dass sich ausgesäte Zellen an das dezellularisierte native Gefäß anhefteten, es fand jedoch keine Migration nach innen statt.
Beispiel 6
Bereitung eines dezellularisiserten mittels Tissue Engineering gewonnenen Rinderkonstrukts unter Verwendung einer nicht ionischen Detergenslösung.
Es wird eine kleinkalibrige Arterie manipuliert, indem glatte Muskelzellen Rinderaorten wie in Niklason, et al., Functional arteries grown in vitro, Science, 284, 489–493, 1999. beschrieben verwendet werden. Kurz gesagt werden 1 bis 2 ml einer Suspension von glatten Muskelzellen (5 × 10⁶ Zellen/ml), die aus der Media-Schicht der Rinderaorta isoliert wurden (wie dies in Ross, R., et al., J. Cell Biol. 50, 172, 1999 beschrieben wird, deren Inhalte hiermit als Referenz eingeführt werden) auf ein röhrenförmiges Substrat aus Polyglykolsäure pipettiert, welches in der Kammer des Bioreaktors über einem Stück eines dehnbaren Siliconschlauchs befestigt ist. Die Oberfläche des Substrats wird wie in Gao. J, et al., J Biomed. Mater. Res. 42, 417, 1998, beschrieben modifiziert, um die Hydrophilizität der Oberfläche zu erhöhen. Nach einer anfänglichen Aussaatphase von 30 Minuten wird der Bioreaktor mit einem Medium gefüllt (mit wie in Beispiel 1 modifiziertem DMEM). Das Konstrukt wird 8 Wochen lang kultiviert, während denen pulsierende radiale Belastungen bei 165 Schlägen pro Minute und 5% radialer Aufblähung (Verformung) an das sich entwickelnde Konstrukt verabfolgt werden, indem Medium in pulsierender Weise durch den dehnbaren Siliconschlauch gepumpt wird. Nach der achtwöchigen Kultivierungsphase wird der Siliconschlauch entfernt und der Fluss des Mediums direkt durch das kultivierte Gefäß verabfolgt. Zur Produktion einer Endothelschicht wird eine Suspension von Endothelzellen (3 × 10⁶ Zellen/ml) aus der Rinderaorta in das Lumen injiziert und es wird ermöglicht, dass sich die Zellen binnen 90 Minuten anheften. Die Fließgeschwindigkeit durch das Lumen wird über 3 Tage der Kultur hinweg nach und nach von 0,0333 bis auf 0,1 ml/sec erhöht, wobei die entsprechenden Scherkräfte an der Gefäßwand von 1 × 10^–2 N/m2 auf 3 × 10^–2 N/M2 ansteigen. Das Konstrukt wird über zusätzliche zwei Wochen kultiviert, während welchen es einem Fluss durch das Lumen unterzogen wird.
Nach den Kultivierungsphasen wird das Medium aus dem Bioreaktor entfernt und das Konstrukt mit steriler PBS ausgewaschen. Der Bioreaktor wird mit einer Dezellularisierungslösung gefüllt, die 1% Triton X-100^® (Sigma), 20 μg/ml RNAse A (Sigma) und 0,2 mg/ml DNAse (Sigma) in steriler PBS ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺ enthält. Die Dezellularisierungslösung wird auch in ein am Bioreaktor angebrachtes Fließsystem gegen und durch das innere Lumen des Gefäßes mit einer Fließgeschwindigkeit von ca. 0,1 ml/sec. gepumpt. Nachdem der Ansatz 24 Stunden lang bei 37°C in einer 10%-CO₂-Atmosphäre unter ständigem Rühren der Dezellulariasierungslösung ausgesetzt worden war, wird die Dezellulariasierungslösung aus dem Bioreaktor und aus dem Fließsystem entfernt und das System mit PBS ausgewaschen. Die Verabfolgung eines intraluminalen Flusses durch das Innere des manipulierten Gefäßes führt zur Entfernung von im Wesentlichen allen restlichen Fragmenten des polymeren Substrats.
Für die Cryokonservierung wird das dezellularisierte Konstrukt zuerst 20 Minuten lang in nes DMEM getaucht, der 1 M DMSO, 2,5% Chondroitinsulfat und 10% fötales Rinderserum bei 4°C enthält und dann mit einer kontrollierten Geschwindigkeit von ca. 1,0°/Minute bis auf –80°C heruntergekühlt und dann zur Aufbewahrung in flüssigen Stickstoff überführt. Das Auftauen erfolgt, indem der der Lagerbehälter bei 37°C in ein Wasserbad getaucht wird, bis alles Eis verschwunden ist, worauf der Behälter dann in 5-minütigen Zeitabständen in DMEM überführt wird, das 0,5 M, 0,25 M und am Ende 0 M Mannit als osmotischen Puffer enthält. Das dezellularisierte Gefäß wird, wie bei Niklason, et al., Functional arteries grown in vitro, Science, 284: 489–493, 1999 beschrieben, in die rechte Arteria saphena eines Yucatan Zwergschweins implantiert.
Beispiel 7
Bereitung und nachfolgende Manipulation eines dezellularisierten mittels Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts
Ein mittels Tissue Engineering gewonnenes Gefäßkonstrukt wird in einem ähnlichen wie in Beispiel 1 beschriebenen Bioreaktorsystem aus Kunststoff aber ohne Einsatz eines Polymersubstrats wie folgt hergestellt: Glatte Muskelzellen des Menschen und menschliche Endothelzellen werden unter Einsatz von Standardbiopsie- und -kulturtechniken erhalten und in vitro gehalten. Das Stück Siliconschlauch, das sich bis zu den Dacronmanschetten im Bioreaktor erstreckt, wird steril mit einer dünnen Schicht aus Gelatinematerial beschichtet, d.h. es wurde aus verdünntem menschlichen Kollagen hergestellt. Das menschliche Kollagen (im Handel erhältlich) wird denaturiert und mit einer Spritze auf die Außenseite des Siliconschlauchs pipettiert oder aufgetragen, um eine ungefähr 50 μm dicke Schicht zu erzeugen. Während des Auftragens der Kollagenlösung kann der Schlauch in Rotation versetzt werden, so dass eine Schicht mit gleichmäßiger Dicke hergestellt wird. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung dient der mit Kollagen beschichtete Schlauch somit als Substrat.
Nachdem man die Kollagenschicht hat trocknen lassen wird mit einer Pipette eine Suspension von 1 bis 2 ml Kulturmedium mit glatten menschlichen Muskelzellen in einer Konzentration von ca. 5 Millionen Zellen/ml Kulturmedium auf den beschichteten Schlauch und die Dacronmanschetten an jedem Ende aufgetragen. Während der Auftragung der Zellen wird der Schlauch vorzugsweise in Rotation versetzt, um für eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu sorgen. Die dünne Beschichtung sorgt dafür, dass sich eine anfängliche Schicht von Zellen auf der Außenseite des Schlauchs anhängen kann. Der Stopfen des Bioreaktor wird wieder eingesetzt und die Zellen 30 bis 60 Minuten sich anheften gelassen, wonach der Bioreaktor und der Flüssigkeitsbehälter mit Kulturmedium gefüllt werden (wie in Beispiel 1 supplementiertes DMEM). Der Biorektor wird in einen Inkubator für Gewebskulturen gesetzt und bei 37°C in einer 10% CO₂-Atmosphäre über eine Zeitspanne von etwa 1 bis 7 Tagen gehalten, während welcher eine pulsierende radiale Belastung mit 165 Schlägen pro Minute und 5% radialer Aufblähung (Verformung) an das sich entwickelnde Konstrukt verabfolgt werden, indem Medium in pulsierender Weise durch den dehnbaren Siliconschlauch gepumpt wird.
Nach der Wachstumsphase am Anfang wird der Stopfen entfernt und das Medium aus dem Bioreaktor entlassen. Die Oberfläche des sich auf dem Schlauch entwickelnden Gewebes wird sodann erneut mit einer Suspension von menschlichen glatten Muskelzellen beimpft, die im Wesentlichen denen gleichen, die bei der Aussaat am Anfang eingesetzt wurden und diese Zellen ließ man an das sich entwickelnde Gewebe sich anheften. Der Bioreaktor wird dann mit Medium gefüllt und der Kultivierungsprozess mit wie in der ersten Wachstumsphase verabfolgten physikalischen Reizen wiederholt. Diese Sequenz (d.h. erneute Aussaat gefolgt von einer Wachstumsphase) wird weiter ausgeführt bis ein Gewebe der gewünschten Dicke (z.B. etwa 0,038 cm) auf dem Schlauch entstanden ist (nach etwa 2 Wochen).
Nachdem das Gefäß die gewünschte Dicke erreicht hat, wird der Siliconschlauch entfernt und der Fluss der Mediums erfolgt direkt durch das kultivierte Gefäß. Zur Herstellung einer Endothelschicht wird eine Suspension mit menschlichen Endothelzellen mit 3 × 10⁶ Zellen/ml in DMEM in das Lumen des Konstrukts injiziert und die Zellen über einen Zeitraum von 90 Minuten sich anheften gelassen. Die Fließgeschwindigkeit durch das Lumen wird über 3 Kultivierungstage hin allmählich von 0,033 ml/sec auf 0,1 ml/sec gesteigert, wobei an der Wand des Gefäßes entsprechende Scherkräfte von 1 × 10^–2 bis 3 × 10^–2 N/m² auftreten. Das Konstrukt wird für weiter zwei Wochen kultiviert, während denen es einem intraluminalen Fluss unterzogen wird.
Nach dieser zweiten Wachstumsphase wird das Medium aus der Kammer des Bioreaktors entfernt und das Konstrukt mit PBS ausgewaschen. Die Kammer wird sodann mit einer Dezellularisierungslösung gefüllt, die 1 M NaCl, 25 mM EDTA, 1,8 mM SDS in steriler PBS bei pH 7,2 enthält.
Dezellularisierungslösung wird auch in ein Fließsystem gegeben, das am Bioreaktor angebracht ist und pulsweise durch das innere Lumen des Gefäßes mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,1 ml/sec gepumpt wird. Nachdem das Konstrukt bei Raumtemperatur 30 Minuten lang der Dezellularisierungslösung ausgesetzt worden ist, wird die Dezellularisierungslösung aus dem Bioreaktor und dem Fließsystem entfernt und das System mit PBS gewaschen.
Für die Cryokonservierung wird die Kammer des Bioreaktors zunächst mit HEPES-gepuffertem DMEM gefüllt, der 1 M DMSO, 2,5% Chondroitinsulfat und 10% fötales Rinderserum bei 4°C enthält. Nach einem Zeitraum von 20 Minuten bei 4°C wird die Kammer mit einer kontrollierten Geschwindigkeit von ca. 1,0°/Minute bis auf –80°C heruntergekühlt und dann zur Aufbewahrung in flüssigen Stickstoff überführt. Nach der Identifizierung eines Subjekts mit Bedarf nach einer Gefäßtransplantation wird das dezellularisierte Gefäß aufgetaut, indem die Kammer des Bioreaktors bei 37°C in ein Wasserbad getaucht wird, bis alles Eis verschwunden ist, worauf die Cryokonservierungslösung aus der Kammer entfernt wird. Zur Elution der Cryokonservierungslösung wird die Kammer dann nacheinander in Zeiträumen von 5 Minuten mit DMEM gefüllt, der 0,5 M, 0,25 M und schließlich 0 M Mannit als osmotischen Puffer enthält. Die Kammer wird sodann mit wie in Beispiel 1 supplementiertem DMEM gefüllt.
Glatte Muskelzellen und Endothelzellen werden aus Biopsieproben erhalten, die dem für das Konstrukt ins Auge gefassten Empfänger entnommen wurden. Diese Zellen werden in Gewebekultur gehalten und expandiert. Nach dem Auftauen des dezellularisierten Konstrukts wird die äußere Oberfläche des Konstrukts mit glatten Muskelzellen beimpft (1 bis 2 ml einer Suspension mit 5 × 10⁶ Zellen/ml), die man über einen Zeitraum von 30 Minuten sich anheften lässt. Die Kammer des Bioreaktors wird mit Kulturmedium gefüllt und das Konstrukt über einen Zeitraum von 1 Woche in Kultur gehalten. Um eine Endothelschicht herzustellen, wird eine Suspension von Endothelzellen aus der Rinderaorta (3 × 10⁶ Zellen/ml) in das Lumen injiziert und die Zellen werden über einen Zeitraum von 90 Minuten sich anheften gelassen. Das Konstrukt wird drei weitere Tage kultiviert, wobei wie während der Wachszumsphasen vor der Dezellularisierung pulsierende Reize verabfolgt werden, und wird dann in den Empfänger implantiert.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines durch Tissue Engineering erhaltenen dezellularisierten Konstrukts auf einem synthetisches Polymermaterial aufweisenden künstlichen Substrat in den Schritten: Anzucht einer dreidimensionalen Ansammlung lebender Zellen zur Bildung einer diese Zellen umgebenden extrazellulären Proteinmatrix; und Dezellularisierung der extrazellulären Proteinmatrix, wodurch ein durch Tissue Engineering erhaltenes dezellularisiertes Konstrukt mit einer dreidimensionalen extrazellulären Proteinmatrix gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die dreidimensionale Ansammlung lebender Zellen auf einem Substrat über einen Zeitraum von etwa 6 bis 8 Wochen gezüchtet wird, um das Konstrukt durch Tissue Engineering zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem durch den Schritt der Dezellularisierung über 90% der lebenden Zellen entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem durch den Schritt der Dezellularisierung über 95% der lebenden Zellen entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem durch den Schritt der Dezellularisierung im Wesentlichen alle lebenden Zellen entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem in dem Schritt der Dezellularisierung eines oder mehrere Detergenzien verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem in dem Schritt der Dezellularisierung ein Protease-Inhibitor verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem in dem Schritt der Dezellularisierung eine Nuclease verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem in dem Schritt der Dezellularisierung ein Metallionen-Chelatbildner verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner den Schritt des Beimpfens des dezullularisierten Konstrukts mit einer Zellpopulation umfasst.
Konstrukt zur Verwendung als Medikament zum Implantieren in einen Patienten, wobei das Konstrukt ein künstliches Substrat mit einem Substrat aus synthetischem Polymermaterial umfasst, das eine dezellularisierte extrazelluläre Proteinmatrix trägt, wobei die extrazelluläre Proteinmatrix eine Dicke von über 50 μm aufweist und wobei die Matrix so geformt wird, indem sie um eine Vielzahl von Einzelzellen eines ersten Typs gebildet wird, welche in einer dreidimensionalen Anhäufung von lebendem Gewebe gezüchtet werden.
Konstrukt nach Anspruch 11, wobei im Konstrukt mindestens 50% der Zellen des ersten Typs fehlen.
Konstrukt nach Anspruch 11, wobei im Konstrukt mindestens 90% der Zellen des ersten Typs fehlen.
Konstrukt nach Anspruch 11, wobei im Konstrukt mindestens 95% der Zellen des ersten Typs fehlen.
Konstrukt nach Anspruch 11, wobei im Konstrukt mindestens 99% der Zellen des ersten Typs fehlen.
Konstrukt nach Anspruch 11, wobei im Konstrukt höchstens 10% der Zellen des ersten Typs vorkommen.
Konstrukt nach Anspruch 11, wobei im Konstrukt höchstens 5% der Zellen des ersten Typs vorkommen.
Konstrukt nach Anspruch 11, wobei im Konstrukt höchstens 1% der Zellen des ersten Typs vorkommen.
Konstrukt nach Anspruch 11, welches ferner lebende Zellen eines auf der extrazellulären Proteinmatrix gezüchteten zweiten Typs aufweist.
Konstrukt nach Anspruch 11, bei welchem die zweiten Zelltypen von einem ins Auge gefassten Empfänger des Konstrukts stammen.
Verwendung des Konstrukts nach jedem der Ansprüche 11 bis 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Gewebeschäden oder Gewebeverlusten.