ES2372116T3

ES2372116T3 - Preparación de tejido para implantación meniscal.

Info

Publication number: ES2372116T3
Application number: ES07824573T
Authority: ES
Inventors: Eileen Ingham; John Fisher; Thomas Stapleton; Joanne Ingram
Original assignee: University of Leeds
Current assignee: University of Leeds
Priority date: 2006-11-16
Filing date: 2007-11-13
Publication date: 2012-01-16
Anticipated expiration: 2027-11-13
Also published as: WO2008059244A2; JP2010509965A; ATE522233T1; GB2443938A; AU2007321018B2; EP2094325A2; EP2094325B1; JP5732197B2; CA2701175A1; AU2007321018A1; GB0722232D0; JP2014223331A; PL2094325T3; CA2701175C; WO2008059244A3; DK2094325T3; US20100152852A1; US8956411B2; GB2443938B

Abstract

Un procedimiento para preparar tejido meniscal donante para posterior implantación en un hospedador que comprende las etapas de: (i) congelar y descongelar el tejido; (ii) incubar el tejido en una disolución hipotónica; (iii) incubar el tejido en una disolución hipotónica que comprende un detergente aniónico; (iv) repetir las etapas (ii) y (iii); (v) incubar el tejido en una disolución que comprende al menos una enzima nucleasa; y (vi) lavar el tejido con un agente oxidante.

Description

Preparación de tejido para implantación meniscal.

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar una matriz de tejido, preferiblemente una matriz de tejido blando, para la sustitución y/o reparación de menisco dañado o defectuoso. La invención también proporciona un tejido de menisco que está sustancialmente descelularizado para posterior trasplante/implantación.

ANTECEDENTES

La rodilla humana es una articulación importante y compleja que comprende tres huesos espacialmente interrelacionados (fémur, tibia y rótula), ligamentos y estructuras cartilaginosas, que interactúan todas ellas para crear diversos movimientos. Las superficies de los huesos de la rodilla dentro de la articulación están cubiertas con cartílago articular. Esta importante superficie permite que los huesos se deslicen suavemente unos contra otros sin que se produzca daño al hueso. El menisco, una almohadilla de cartílago con forma de C se asienta entre las superficies articulares de cartílago del hueso y actúa como absorbente de impactos distribuyendo el peso y mejora con ello la estabilidad general de la rodilla. Cada articulación de rodilla tiene menisco medial y lateral que se compone de fibrocondrocitos, proteoglicanos y una matriz extracelular de fibras de colágeno y elastina. Cuando los meniscos se dañan por lesión, enfermedad o inflamación artrítica se pueden desarrollar cambios en la articulación de la rodilla con el consiguiente hinchamiento, dolor y/o pérdida de la función de articulación de la rodilla en el individuo afectado. Aun cuando es posible reparar un menisco desgarrado, puede que haya de ser retirado un menisco que esté gravemente dañado o tenga un desgarro extenso.

Dado que el cartílago articular en adultos no se regenera naturalmente en un grado significativo una vez que se destruye, los meniscos adultos dañados se han tratado históricamente mediante diversas intervenciones quirúrgicas que incluyen la retirada y sustitución con dispositivos protésicos. En pacientes de más edad, la sustitución de articulación de rodilla es a menudo la opción preferida. Sin embargo, para individuos más jóvenes (aquellos por debajo de 50 o 55 años de edad) la alternativa a sustituir la articulación entera es un trasplante meniscal que usa o bien meniscos protésicos o bien tejido donante para sustituir el menisco dañado.

Un problema asociado con el uso de tejido donante para sustitución meniscal es que el menisco es un tejido fibrocartilaginoso denso totalmente impregnado con fibrocondrocitos que son las células responsables de la síntesis, mantenimiento y reparación de la matriz extracelular. El menisco medial humano es de aproximadamente 4,5 cm de longitud y el menisco lateral es de aproximadamente 3,5 cm de longitud, el grosor de cada uno oscila desde 25 hasta 35 mm (los valores porcinos son similares a los de meniscos humanos). Como el menisco humano es un tejido grueso y denso con células situadas en toda su extensión y especialmente alrededor de la microvasculatura es extremadamente difícil descelularizarlo, especialmente en las regiones centrales, lo que a su vez significa que es difícil preparar un tejido inmunológicamente inerte o descelularizado para trasplante y por tanto hay riesgo de rechazo. En otras palabras hay poca biocompatibilidad y alto riesgo de que el hospedador tenga una reacción inmunológica tanto del heteroinjerto como del xenoinjerto.

A fin de proporcionar un implante meniscal biocompatible acelular, se han desarrollado prótesis meniscales artificiales. Sin embargo, un problema asociado con la prótesis meniscal artificial es que no es tan robusta como el tejido meniscal natural y también es deficiente en las propiedades elásticas de los meniscos naturales y por consiguiente las prótesis de este tipo no son tan eficaces en la absorción de impacto como el material natural.

Un procedimiento que pudiera descelularizar eficazmente el tejido meniscal donante ofrecería beneficio inmediato al tratamiento de individuos que necesitaran implante/trasplante meniscal.

BREVE RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN

Según un primer aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para preparar tejido meniscal donante para posterior implantación en un hospedador que comprende las etapas de:

(i): aplicar ultrasonidos al tejido en una disolución tamponada;

(ii): congelar y descongelar el tejido;

(iii) incubar el tejido en una disolución hipotónica;

(iv): incubar el tejido en una disolución hipotónica que comprende un detergente aniónico;

(v): repetir las etapas (iii) y (iv);

(vi): incubar el tejido en una disolución que comprende al menos una enzima nucleasa; y

(vii) lavar el tejido con un agente oxidante;

Preferiblemente, la etapa (ii) se puede realizar con anterioridad a la etapa (i), es decir, que el tejido meniscal donante se puede someter al procedimiento de congelación/descongelación con anterioridad al procedimiento de aplicación de ultrasonidos, y no se pretende que el orden de estas dos etapas limite el alcance de la invención.

A lo largo de la descripción y reivindicaciones de esta memoria de patente, las palabras "comprenden" y "contienen" y las variaciones de dichas palabras, por ejemplo "que comprende" y "comprende" quieren dar a entender "que incluyen pero no se limitan a", y no se pretende (ni se pone en práctica) excluir otros restos, aditivos, componentes, unidades o etapas.

A lo largo de la descripción y reivindicaciones de esta memoria de patente, el singular engloba el plural a menos que el contexto exija otra cosa. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, se ha de entender que la memoria de patente considera la pluralidad así como la singularidad, a menos que el contexto exija otra cosa.

Rasgos, unidades, características, compuestos, restos o grupos químicos descritos en conjunción con un aspecto, realización o ejemplo particular de la invención se ha de entender que son aplicables a cualquier otro aspecto, realización o ejemplo descrito en este documento a menos que sean incompatibles con ellos.

En una realización de la invención, el procedimiento comprende preparar un tejido meniscal donante para posterior implantación en un hospedador que comprende las etapas de:

(i): congelar y descongelar el tejido;

(ii): incubar el tejido en una disolución hipotónica;

(iii) incubar el tejido en una disolución hipotónica que comprende un detergente aniónico;

(iv): repetir las etapas (ii) y (iii);

(v): incubar el tejido en una disolución que comprende al menos una enzima nucleasa; y

(vi): lavar el tejido con un agente oxidante;

En esta realización de la invención se omite la etapa de aplicar ultrasonidos al tejido en una disolución tamponada. Se ha encontrado que el procedimiento de la presente invención se puede realizar con éxito sin la etapa de aplicación de ultrasonidos, pero se piensa que dicha etapa permite una mejor recelularización sobre la implantación una vez que se descelulariza el tejido meniscal. Por lo tanto, es una etapa opcional y preferida en la invención pero una etapa que se puede necesitar para mejorar la posterior recelularización y por lo tanto en alguna ocasión se llevará a cabo como parte del procedimiento de la presente invención.

Se apreciará que el menisco se puede obtener extrayendo la totalidad o una porción de un menisco medial o lateral de una articulación de rodilla de un donante alogénico o xenogénico.

Preferiblemente el receptor del menisco preparado es un ser humano, como alternativa el receptor puede ser de cualquier otra especie que requiera un implante meniscal como resultado de un daño o una degeneración de dicho tejido.

Un xenoinjerto o xenotrasplante es un trasplante de tejido desde un donante de una especie a un receptor de otra especie. A veces también se usan los términos heteroinjerto o heterotrasplante, mientras los términos homoinjerto o aloinjerto se refieren a trasplante en la misma especie.

En la presente invención, cuando el receptor es un ser humano, el donante es preferiblemente un ser humano o cualquier otro mamífero que tenga menisco de propiedades fisiológicas parecidas aproximadamente.

Preferiblemente el tejido meniscal donante es de origen indistintamente humano o porcino.

Como se ha indicado anteriormente en este documento, se puede conseguir la descelularización en ausencia de aplicación de ultrasonidos pero cuando se incluye en el procedimiento de la presente invención, la etapa de aplicación de ultrasonidos se lleva a cabo en disolución salina tamponada de fosfato (PBS) o cualquier otra disolución tampón fisiológicamente aceptable.

Preferiblemente, la energía ultrasónica es de impulsos, un régimen típico es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 segundos de conexión y 0,5, 1 o 2 segundos de desconexión, aunque se apreciará que los tiempos exactos de los impulsos no tienen intención de limitar el alcance de la invención.

Preferiblemente, la potencia ultrasónica está entre 100-700 vatios, y más preferiblemente es aproximadamente 400 vatios.

La etapa de aplicación de ultrasonidos se lleva a cabo preferiblemente durante 10-40 minutos, idealmente durante 20 minutos aproximadamente y preferiblemente se lleva a cabo por debajo de la temperatura ambiente. Idealmente la aplicación de ultrasonidos se lleva a cabo sobre hielo a aproximadamente 4ºC.

El procedimiento de congelación/descongelación preferiblemente comprende congelar el tejido, por ejemplo entre los -10 y -80ºC, y típicamente a -20ºC durante 2-24 horas y deshelar posteriormente el tejido durante aproximadamente 2, 3 ó 4 horas hasta que alcanza la temperatura ambiente. Este procedimiento se lleva a cabo por lo menos una vez y preferiblemente dos veces en ausencia de tampón hipotónico y se repite de nuevo al menos una vez y preferiblemente dos veces mientras el tejido está sumergido en el tampón hipotónico. Se apreciará que la congelación/descongelación en presencia y ausencia de tampón hipotónico se puede invertir y opcionalmente alternar. Una disolución hipotónica es aquella en la cual la concentración de electrolito está por debajo de la de las células. En esta situación la presión osmótica conduce la migración de agua a las células, en un intento de igualar la concentración de electrolito por el lado de dentro y el de fuera de las paredes celulares.

Preferiblemente, el tampón hipotónico es disolución de Tris 10 mM a un pH de 8,0 aproximadamente e incluye aproximadamente 0,1% (peso/volumen) de EDTA y aprotinina (a una concentración de aproximadamente 10 KIU.ml-1).

Preferiblemente, la etapa de incubación con disolución hipotónica comprende un lavado hipotónico en dos fases a temperaturas que se elevan gradualmente. La primera etapa es incubación durante aproximadamente 12-48 horas y típicamente 24 horas aproximadamente por debajo de la temperatura ambiente pero por encima de la de congelación por ejemplo alrededor de 4ºC y la segunda fase incubación durante aproximadamente el mismo período a una temperatura por encima de la temperatura ambiente por ejemplo aproximadamente a 37ºC, se realiza una tercera fase (etapa (iv) en la realización en la que se realiza aplicación de ultrasonidos y etapa (iii) cuando se omite) incubando el tejido en una disolución hipotónica que comprende adicionalmente un detergente aniónico. La tercera etapa de lavado con el detergente aniónico comprende incubación durante 1-3 días, y preferiblemente durante aproximadamente 48 horas a una temperatura por encima de la del segundo lavado pero por debajo de la temperatura de ebullición por ejemplo a 55ºC aproximadamente.

Las temperaturas y períodos de incubación anteriormente especificadas en las etapas de incubación que se acaban de describir en este documento ejemplifican un protocolo apropiado para los procedimientos de la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Preferiblemente, el detergente aniónico es docedil sulfato sódico (SDS). Preferiblemente este está presente en la disolución hipotónica de lavado a una concentración en el intervalo de 0,03-0,3% (v/v) y más preferiblemente todavía está presente a aproximadamente 0,15% (v/v).

Preferiblemente la etapa de incubación en tres fases de las etapas (iii) y (iv), cuando se realiza aplicación de ultrasonidos y las etapas (ii) y (iii) cuando se omite la aplicación de ultrasonidos se repiten durante un mínimo de tres ciclos.

Preferiblemente, en una realización de la invención después de la etapa (v) cuando se realiza aplicación de ultrasonidos y la etapa (iv) cuando se omite aplicación de ultrasonidos del lavado hipotónico repetido con y sin detergente aniónico, el procedimiento incluye adicionalmente la etapa de lavar el tejido en una disolución tampón.

Preferiblemente, el tampón es PBS. El procedimiento de lavado puede comprender incubaciones repetidas entre 1, 2 ó 3 horas a una temperatura de 40-60ºC e idealmente a aproximadamente 55ºC. Esta etapa se repite preferiblemente 1, 2 ó 3 veces más.

Preferiblemente, el procedimiento incluye una incubación (etapa (v) o etapa (vi) cuando se emplea etapa de aplicación de ultrasonidos) con una disolución que comprende una o más enzimas nucleasa.

Las enzimas nucleasa se usan para digerir cualquier materia nucleica restante que se ha mostrado que actúa como sitios para calcificación.

Una disolución incubadora de nucleasa típica, pero no limitante, es disolución de Tris 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, albúmina de suero bovino (50 !g/ml) con RNasa (1 U.I ml-1) y DNasa (50 U.ml-1).

El tejido se incuba preferiblemente durante aproximadamente 2, 3 ó 4 horas típicamente a 37ºC aproximadamente con la disolución de nucleasa al tiempo que se agita suavemente.

Después de la incubación con la disolución de nucleasa, preferiblemente el tejido se incuba a continuación adicionalmente durante aproximadamente 12-48 horas y típicamente 24 horas a 30-50ºC y típicamente aproximadamente a 37ºC en una disolución hipertónica.

Preferiblemente la disolución hipertónica es Tris en disolución (0,05 M) pH 7,6 más NaCl 1,5 M y EDTA (0,1% peso/volumen).

Preferiblemente, el tejido se lava a continuación en una disolución tampón que comprende PBS y un agente quelante durante entre 12-24 horas.

Preferiblemente, el agente quelante es EDTA a una concentración de 0,1% (peso/volumen).

Preferiblemente, el agente oxidante de la etapa final de los procedimientos de la presente invención es ácido peroxiacético (C2H4O3) también conocido como ácido peracético y abreviado comúnmente como PAA.

Preferiblemente, la concentración de PAA está en el intervalo de 0,01 - 0,5% v/v y más preferiblemente todavía es aproximadamente 0,1% PAA (v/v).

Preferiblemente, el procedimiento incluye además un lavado de incubación multifase en PBS a temperaturas decrecientes. Un protocolo típico para este lavado de la fase final es un primer lavado con PBS durante 12-48 horas y típicamente 24 horas entre 35-50ºC e idealmente a 45ºC, un segundo lavado de incubación durante un período similar entre 30-40ºC e idealmente a 37ºC y un lavado de incubación final durante un período similar entre 0-10ºC e idealmente a 4ºC.

Preferiblemente, el lavado de incubación multifase se repite adicionalmente una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho veces adicionales.

Se apreciará a lo largo de la descripción de los procedimientos de la presente invención que los tiempos, temperaturas y concentraciones citadas se dan solamente como ejemplos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Preferiblemente, el procedimiento incluye adicionalmente la etapa de conservar el tejido preparado para uso posterior.

Una etapa de este tipo se ilustra, por ejemplo, por la crioconservación o la ultracongelación.

Según un aspecto adicional de la invención se proporciona un producto de trasplante producido por los procedimientos de la presente invención.

Según un aspecto todavía adicional de la invención se proporciona tejido meniscal que se puede obtener por el procedimiento de la presente invención para uso como tejido de trasplante.

Según un aspecto todavía adicional de la invención se proporciona el uso de tejido meniscal que se puede obtener por el procedimiento de la presente invención como tejido de trasplante.

Preferiblemente, el producto producido por la presente invención se puede caracterizar por la ausencia (100%) o sustancial ausencia (90%) de células en el área central del tejido meniscal.

El procedimiento de la presente invención proporciona un medio por el que se puede preparar tejido meniscal que está sustancialmente desprovisto de células tales como fibrocondrocitos.

Preferiblemente, el producto producido por la presente invención se puede caracterizar por un contenido de ADN genómico (ADNg) entre 0 y 20 ng/mg, más preferiblemente por un contenido de ADNg de 0-10 ng/mg y todavía más preferiblemente es un contenido de ADNg de 0-5 ng/mg.

El producto de la presente invención está por lo tanto prácticamente desprovisto de células tales como fibrocondrocitos y tiene un contenido despreciable si es que tiene alguno en ADNg y como tal es el material más apropiado para posterior trasplante.

Se piensa que los procedimientos y productos de la presente invención proporcionan ventajosamente tejido meniscal natural que es verdaderamente biocompatible con un hospedador con mínimo riesgo de rechazo por el hospedador en virtud del procedimiento mejorado de descelularización.

Los procedimientos de la presente invención se han empleado con éxito para descelularizar tejido meniscal de áreas problemáticas para descelularización en las áreas exterior y central del menisco y especialmente alrededor de áreas de microvascularización y profundas dentro del tejido situado centralmente.

Según un aspecto todavía adicional de la invención se proporciona un kit que comprende las disoluciones según se han descrito anteriormente en este documento y que incluye opcionalmente un juego de instrucciones escritas para su uso.

Según un aspecto todavía adicional de la invención se proporciona un procedimiento de tratamiento de un individuo que requiere un trasplante meniscal que comprende las etapas de preparar un tejido meniscal donante descelularizado según el procedimiento del primer aspecto de la invención y sustituir el menisco dañado o defectuoso con el menisco descelularizado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La invención se describirá ahora por vía solamente de ejemplo con referencia a las siguientes figuras en las que:

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo de un procedimiento típico etapa por etapa según el procedimiento de la presente invención.

La Figura 2 muestra el contenido en ADN y la histología del menisco porcino medial después de descelularización usando diversos protocolos. La Figura 2A muestra menisco fresco; La Figura 2B muestra el menisco después de un procedimiento de descelularización básica; La Figura 2C muestra el menisco después de descelularización y aplicación de ultrasonidos; La Figura 2D muestra el menisco después de descelularización a 55ºC y aplicación de ultrasonidos; La Figura 2E muestra el menisco después de descelularización a 55ºC, aplicación de ultrasonidos y congelación descongelación; La Figura 2F muestra el menisco después de descelularización a 55ºC (x 2), aplicación de ultrasonidos y congelación descongelación; La Figura 2G muestra el menisco después de descelularización a 55ºC (x 3-4), aplicación de ultrasonidos, congelación descongelación y tratamiento con PAA.

La Figura 3A muestra un intervalo de histología de menisco porcino fresco y la Figura 3B muestra la histología de áreas comparables después de descelularización según el procedimiento de la presente invención.

La Figura 4 muestra datos biomecánicos para tejido meniscal fresco y descelularizado.

La Figura 5 muestra tinción con inmunoperoxidasa para alfa-gal en tejido meniscal fresco y descelularizado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Materiales y Métodos

Preparación de tejido meniscal

Se obtuvieron meniscos porcinos de un matadero local dentro de las 24 horas del sacrificio del animal. Se diseccionaron los meniscos de la articulación de la rodilla extirpando cuidadosamente la cápsula de la rodilla antes de cortar ambos ligamentos cruzados anterior y posterior para exponer el menisco. A continuación se hicieron incisiones perpendiculares a las uniones de los cuernos meniscales para liberar los meniscos. A continuación se retiraron el tejido sobrante de la cápsula y las uniones meniscales usando tijeras. A continuación se retiró el menisco y se lavó en PBS (Oxoid) para retirar la sangre sobrante. A continuación se almacenaron las muestras a -40ºC sobre papel de filtro humedecido con PBS para uso futuro.

Preparación de tejido/histología

Se fijaron especímenes de tejido (n=3) en formalina tamponada neutra al 10% (v/v) durante 48 horas y a continuación se deshidrataron y se empotraron en cera de parafina. Se tomaron secciones seriadas de 6!m de grosor y se usó 1 de 10 secciones. Se uso tinción estándar de hematoxilina y eosina (H&E) (Bios Europe Ltd, Skelmersdale, UK) para evaluar la histoarquitectura del tejido. Se tiñeron los ácidos nucleicos usando colorante de Hoechst (bis-benzimida H33258 pentahidrato; Sondas Moleculares, Eugene, OR). Anticuerpos monoclonales para (-Gal obtenidos de Alexis biochemicals, San Diego, EE.UU.

Aplicación de ultrasonidos

Se suturaron muestras de tejido (2 cm de ancho) a un bastidor de aluminio usando suturas de proleno 4-0 compradas a Southern Syringes Ltd. Esto se colocó dentro de un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml con PBS enfriado en hielo y se mantuvo sobre hielo. Diversos regímenes de aplicación de ultrasonidos (procesador de aplicación de ultrasonidos de alta intensidad, 600 vatios, modelo 601, Progen Scientific, Mexborough, South Yorkshire), se aplicaron a las muestras de tejido por la vía de poner la muestra de tejido directamente bajo la sonda cambiándose el PBS después de cada tratamiento. A la terminación, se retiró el tejido y se sometió al procedimiento de descelularización restante. El régimen de impulsos fue 1 segundo de conexión, 1 segundo de desconexión durante 10 minutos antes de cambiar la PBS y repetir.

Penetración meniscal

Se usó un aparato de penetración para analizar la deformación bajo carga de meniscos porcinos frescos y descelularizados. El dispositivo consistía en un vástago con una punta de penetración plana, desmontable de 3 mm, cilíndrica, rígida en un extremo y con el otro extremo conectado a un transformador diferencial de variación lineal (LVDT) para vigilar el desplazamiento del vástago. Se colocaron pesos bajo el LVDT y se inició el movimiento del vástago mediante un mecanismo manual de liberación. Se calibró el LVDT usando alturas de escalones y se obtuvo el factor de calibración. El LVDT tenía una resolución de 0,0254 mm. La velocidad del vástago se controló mediante un amortiguador lleno de aceite. Las muestras (n=3) se cortaron en primer lugar usando un cortador de 6 mm de diámetro para retirar discos de forma cilíndrica. Se retiró del centro de los discos originales una sección que medía 3 mm. Se fijaron las muestras sobre la base del portamuestras usando cinta adhesiva de doble cara (3M; Loughborough, UK) y una gota de pegamento de cianoacrilato. Se aplicó una carga de aproximadamente 2 N mediante un amortiguador viscoso. Se sumergieron las muestras en una PBS. Se desarrollaron ensayos a lo largo de períodos de tiempo de 1 hora. El LVDT permitió la generación de resultados en el formato de tiempo frente a voltaje. Se obtuvieron datos usando Lab View 8 (National Instruments, Austin EE.UU.) y tras aplicación del factor de calibración, los resultados se convirtieron en tiempo frente a deformación (mm).

Ensayo de hidroxiprolina.

Antes de realizar el ensayo de hidroxiprolina, las muestras (n=3) fueron liofilizadas hasta peso constante antes de ser hidrolizadas para incubación con ácido clorhídrico (HCl) 6M durante 4 h a 120ºC y neutralizadas usando hidróxido de sodio (NaOH). El procedimiento adoptado se basaba en el método descrito por Edwards y O´Brien [29]. Se constituyeron disoluciones patrón de calibrador usando trans-4-hidroxi-L-prolina (Sigma). Se añadió disolución de prueba (50 !l) a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo plano a los que se añadieron 100 !l de disolución oxidante (cloramina T hidrato; Sigma) y se dejaron durante 5 minutos con agitación suave. A continuación se añadió a cada pocillo reactivo de Earlich (100 !l). A continuación se cubrió la placa y se incubó a 60ºC en baño de agua durante 45 minutos antes de que se leyera la absorbancia a 570 nm. A continuación se determinó la concentración de hidroxiprolina mediante interpolación con una curva patrón de hidroxiprolina.

Ensayo de azúcar sulfatado.

Antes de realizar el ensayo de azúcar sulfatado, las muestras (n=3) fueron liofilizadas hasta peso constante antes de digerir enzimáticamente el tejido en tampón de papaína (1 mg.ml-1 de papaína, Sigma, en PBS a pH 6,0 con cisteína-HCl 5mM, Sigma y Na2EDTA 5 mM, VWR) durante 48 h a 60ºC. El procedimiento se adaptó de Famdale y col., [30]. Brevemente, se constituyeron disoluciones patrón del calibrador usando sulfato de condroitina (Sigma). Se añadieron disoluciones patrón o de prueba (40 !l) a 250 !l de disolución de azul de 1,9-dimetileno en pocillos de placas de 96 pocillos de fondo plano. A continuación se leyó la absorbancia a 525 nm después de 1 minuto. A continuación se determinó la concentración resultante de azúcares sulfatados, representativa de glicosaminoglicanos (GAG), mediante interpolación con la curva patrón.

Extracción y análisis de presencia de ADNg

Se extrajo ADN genómico (ADNg) usando un kit de aislamiento de ADN para tejidos (Roche Applied Sciences, Indianápolis, EE.UU). Brevemente, se sometieron a digestión 200 ml de tejido meniscal porcino fresco y descelularizado usando una disolución de Proteinasa K (n=3). Después de esto, se aplicó una disolución de RNasa para digerir el ARN presente dentro de las muestras. A continuación se añadió disolución de precipitación de proteína y se centrifugaron las muestras (15.000 g, 20 min a 20ºC). A continuación se añadió isopropanol (0,7 volúmenes, VWR) al precipitado para recuperar cualquier ADN presente. El precipitado de ADN aislado se lavó a continuación con etanol al 70% (v/v) enfriado en hielo y se dejó secar al aire antes de resuspensión en tampón tris-EDTA (Sigma).

Se analizó cualitativamente la presencia de ADNg usando un sistema E-gel PowerBase (Invitrogen, Paisley, UK). Se insertó un E-gel de agarosa del 2% (peso/volumen) seco (Invitrogen) en la base antes de la adición de muestras. Se prepararon muestras resuspendidas (4!l) añadiendo tampón de carga (2!l, Invitrogen) para facilitar la carga de muestra. El volumen total se cargó a continuación en canales individuales del E-gel y a continuación se sometió a electroforesis. Se desarrolló en paralelo una escalera de ADN de 1 kb (Fermentas Inc, Sheriff Hutton, UK) para estimar el tamaño del ADN aislado. La tinción con bromuro de etidio permitió la inspección visual sobre un sistema Kodak Gel Logic 1500 (Eastman Kodak Company, Harrow, UK). Se cuantificó ADN midiendo absorbancia a 260-280 nm en un espectrofotómetro Nanodrop (Labtech Int, Ringmer, UK).

Ejemplo 1

Con referencia a la Figura 1 se muestra un diagrama de flujo típico de una realización del procedimiento de la presente invención. Con respecto al protocolo de la Figura 1 el orden de aplicación de ultrasonidos y congelación/descongelación se puede invertir pero, según se demostrará más adelante, las etapas de aplicación de ultrasonidos, congelación/descongelación y tratamiento con PAA son esenciales para efectuar la descelularización total de tejido meniscal.

Ejemplo 2

Con referencia a la Figura 2A-G, se muestra una representación esquemática del menisco como un triángulo rectángulo para aproximar la forma general de la sección trasversal del menisco y una tinción de Hoechst que muestra el contenido en ADN de células que es una indicación de la densidad celular. Además se proporcionan a la derecha diapositivas de histología. Las Figuras 2A-G muestran el contenido de ADN y la histología del menisco porcino medial después de descelularización usando diversos protocolos.

La Figura 2A muestra menisco porcino medial fresco y la presencia de células en todo el tejido con una distribución uniforme del contenido en ADN de las células o densidad celular desde las regiones exteriores a las interiores del menisco.

El protocolo que se sigue para descelularización de menisco porcino medial en la Figura 2B se describe en Booth, C y col., "Tissue engineering of cardiac valve prostheses I: Development and histological characterisation of an accellular porcine scaffold" The Journal of Heart Valve Disease 11, págs. 457-462, (2002). Este procedimiento no implica aplicación de ultrasonidos ni congelación/descongelación pero sí que emplea una etapa de incubación con SDS a temperatura ambiente. Los resultados de contenido en ADN después de este procedimiento muestran que solamente se han retirado células del área periférica del menisco y que aun hay células presentes en el área interior. El protocolo que se emplea en la Figura 2C es el protocolo que se describe en Booth y col, más una etapa adicional de aplicación de ultrasonidos. Los resultados muestran que aunque se han retirado células periféricas junto con algunas del área interior, todavía persisten células en la mayor parte de la extensión del menisco. Siguiendo el mismo protocolo que para la Figura 2C pero con el detergente aniónico de descelularización (SDS) a temperatura elevada (55ºC) los resultados (Figura 2D) muestran que aunque se han retirado totalmente células de una proporción significativa del menisco, todavía están presentes en el centro del menisco aun cuando a una densidad reducida. Con respecto al protocolo que se sigue en la Figura 2E, esta muestra el menisco después de descelularización a 55ºC, aplicación de ultrasonidos y congelación/descongelación. Los resultados muestran que se encuentran células a una densidad baja en toda el área central con predominancia de números de células situadas alrededor de la microvascularización. En el protocolo que se sigue para la Figura 2F, descelularización a 55ºC (x2), aplicación de ultrasonidos y congelación/descongelación los resultados son todavía mejores, en cuanto que hay muy pocas células que quedan y que las células se han lisado y están situadas aleatoriamente dentro del centro del menisco. Volviendo a los resultados de la Figura 2G que emplea el procedimiento de la presente invención según se representa gráficamente en la Figura 1 de descelularización a 55ºC (x 3), aplicación de ultrasonidos, congelación/descongelación y tratamiento con PAA, se observa una retirada completa de células. La tinción de Hoechst muestra ausencia total de ADN debida a la retirada completa de células.

Los resultados que se obtienen en los diversos protocolos de descelularización muestran que usando el procedimiento de la presente invención se puede conseguir una descelularización completa que no es posible con ninguno de los protocolos incompletos que se han probado ni con otros procedimientos de la técnica anterior.

Ejemplo 3

Con referencia a la Figura 3A se muestra la distribución celular dentro de menisco porcino medial fresco. Un área de la sección trasversal del menisco se aproxima a un triángulo rectángulo (véanse Figuras 2A-G) y muestra que las áreas problemáticas para la descelularización incluyen las áreas exterior y central del menisco, especialmente alrededor de la microvascularización profunda dentro del tejido situado centralmente. Como se muestra en el Ejemplo 2A-E las áreas que se podrían descelularizar usando un procedimiento incompleto según la presente invención eran las del menisco periférico superior e inferior y las del menisco interior. Con referencia a la Figura 3B se muestra una sección comparable de un menisco porcino medial descelularizado según el procedimiento de la presente invención en la que el menisco, incluyendo las áreas problemáticas exterior y central, está completamente desprovisto de células, en otras palabras el menisco está completamente descelularizado y proporciona un tejido que es adecuado para trasplante a un hospedador.

Ejemplo 4

La Figura 4 muestra un gráfico de la deformación frente al tiempo para ambos meniscos fresco y descelularizado que se han descelularizado según los procedimientos de la presente invención. Los datos proporcionan una ilustración de una prueba biomecánica que usa penetración. Los resultados muestran que el menisco descelularizado tiene propiedades biomédicas de compresión parecidas al compararlas con las de tejido fresco y por lo tanto tiene propiedades físicas parecidas y es adecuado para implantación a un hospedador.

Ejemplo 5

Se sabe que el epítopo xenogénico Gal ( 1-3 Gal 1 1-4 Glc NAc-R o alfa-Gal es responsable de rechazo hiperagudo en xenotrasplante. En la ingeniería de tejidos epítopo alfa-Gal residual puede inducir inflamación grave en seres humanos y puede conducir al fallo del injerto. La Figura 5A muestra la tinción positiva de inmunoperoxidasa respecto a la presencia del epítopo alfa-Gal usando un anticuerpo monoclonal anti-alfa-Gal en menisco porcino medial fresco. Cuando se compara con un menisco descelularizado según los procedimientos de la presente invención, la Figura 5B muestra ausencia del epítopo por la vía de tinción negativa. Estos resultados muestran que el menisco preparado por los procedimientos de la presente invención es deficiente en epítopo alfa-Gal y por lo tanto es adecuado para implantación en un hospedador humano.

Ejemplo 6

La concentración de hidroxiprolina por mg de peso seco del tejido porcino meniscal fresco fue 143,3 (± 23,29) !g.mg-1. Después de la descelularización se encontró que la concentración de hidroxiprolina fue 123,96 (± 36,3) !g.mg-1. No hubo diferencia significativa en el contenido de hidroxiprolina del tejido fresco en comparación con el tejido descelularizado (ANOVA, p>0,05).

Ejemplo 7

La concentración de azúcares sulfatados por mg de peso seco del tejido porcino meniscal fresco fue 30,3 (± 3,9) !g.mg-1. Después de la descelularización se encontró que la concentración de azúcares sulfatados fue 12,3 (± 1,6) !g.mg-1, lo que indica una pérdida de 59,4%. Hubo diferencia significativa en el contenido de azúcares sulfatados del tejido fresco en comparación con el tejido descelularizado (ANOVA, p<0,05), lo que indica pérdida de GAG.

5 Ejemplo 8

Muestras de tejido meniscal descelularizado tratadas para extraer ADN genómico (ADNg), cargadas y sometidas a electroforesis en gel de agarosa confirmaron la ausencia de ADNg en comparación con el tejido meniscal fresco que desplegó una banda clara alrededor de 10.000 pares de bases (que no se muestra). Los resultados se verificaron cuantitativamente usando espectrofotometría, en la que se vio un pico de absorbancia entre 260-280 nm para

10 muestra de tejido fresco que indica la presencia de ADNg. Este pico correspondió a 40 (± 9,7) ng.mg-1. También se registró un pico pequeño para tejido descelularizado correspondiente a 2 (± 0,5) ng.mg-1.

En conclusión, los procedimientos de la presente invención muestran que es posible proporcionar un tejido meniscal donante porcino o humano inmunológicamente inerte que conserva sus propiedades físicas. Los meniscos de este tipo se pueden usar para posterior implantación en un hospedador evitando o minimizando por lo tanto la

15 probabilidad de rechazo de trasplante al tiempo que se proporciona la misma resistencia y capacidades funcionales que las del menisco sano.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para preparar tejido meniscal donante para posterior implantación en un hospedador que comprende las etapas de:

(i)

congelar y descongelar el tejido;

(ii)

incubar el tejido en una disolución hipotónica;

(iii) incubar el tejido en una disolución hipotónica que comprende un detergente aniónico;

(iv)

repetir las etapas (ii) y (iii);

(v)

incubar el tejido en una disolución que comprende al menos una enzima nucleasa; y

(vi)

lavar el tejido con un agente oxidante.
2.

Un procedimiento según la reivindicación 1 que comprende además la etapa de aplicar ultrasonidos al tejido en una disolución tamponada ya sea antes o después de la etapa (i).
3.

Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que el menisco se puede obtener retirando la totalidad o una porción de un menisco medial o lateral de una articulación de rodilla de un donante alogénico o xenogénico y en el que opcionalmente el donante es humano o porcino.
4.

Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que la etapa de congelación y descongelación comprende congelar el tejido entre -10 y -80ºC y en el que opcionalmente la etapa de congelación dura entre 2-24 horas y la etapa posterior de descongelación dura 2, 3, o 4 horas hasta que el tejido se deshiela.
5.

Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que el procedimiento de la etapa de congelación y descongelación se lleva a cabo al menos una o más veces en ausencia de un tampón hipotónico y se repite una o más veces mientras el tejido está sumergido en una disolución tampón hipotónica, y en el que opcionalmente la disolución tampón hipotónica es disolución de Tris 10 mM a un pH de 8,0 e incluye EDTA y aprotinina.
6.

Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que la etapa de incubación con una disolución hipotónica de la etapa (ii) comprende un lavado hipotónico en dos fases a temperaturas que se elevan gradualmente y que además incluyen opcionalmente una etapa de incubación con tercera fase que comprende incubar el tejido en una disolución hipotónica que comprende adicionalmente un detergente aniónico y en la que opcionalmente la incubación dura entre 1-3 días y la temperatura de incubación está por encima de la de la etapa de incubación en la segunda fase.
7.

Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente que incluye además la etapa de lavar el tejido en una disolución tampón que comprende un agente quelante después de la etapa de incubación y en el que opcionalmente la disolución tampón es PBS y el agente quelante es EDTA.
8.

Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que la etapa de incubar el tejido con una disolución que comprende una o más enzimas nucleasa está después de las etapas de incubación repetida.
9.

Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que el agente oxidante en la etapa de lavar el tejido con un agente oxidante es ácido peroxiacético (C2H4O3) o ácido peracético (PAA) y en el que opcionalmente la concentración de PAA está en el intervalo de 0,01 - 0,5% v/v.
10.

Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente que comprende además la etapa de un lavado de incubación multi-fase en PBS a temperaturas decrecientes después del lavado del tejido en presencia de un agente oxidante.
11.

Un producto que comprende tejido meniscal que se puede obtener por el procedimiento de cualquier reivindicación precedente para uso en un tejido de trasplante.
12.

Un tejido meniscal que se puede obtener por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso como un tejido de trasplante.
13.

Un producto meniscal según una u otra de las reivindicaciones 12 o 13 caracterizado por la ausencia (100%) o sustancial ausencia (90%) de células en el área central del tejido meniscal.
14.

Un producto meniscal según una u otra de las reivindicaciones 12 o 13 caracterizado por un contenido en ADN genómico (ADNg) entre 0 y 20 ng/mg.