ES2821763T3

ES2821763T3 - Implante y procedimiento de producción de un implante descelularizando un tejido mediante perfusión bajo presión negativa

Info

Publication number: ES2821763T3
Application number: ES14737308T
Authority: ES
Inventors: Tahera Iqbal Ansari; Paul David Sibbons
Original assignee: Videregen Ltd
Current assignee: Videregen Ltd
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2014-06-16
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2034-06-16
Also published as: AU2014283031B2; CA2911567C; KR20180105274A; US20160095956A1; GB201310773D0; KR102128863B1; CA2911567A1; JP2016521611A; WO2014202958A1; AU2014283031A1; CN105392506B; KR20170142211A; CN105392506A; JP6505088B2; US9950095B2; KR20160021256A; EP3010558A1; EP3010558B1; HK1219239A1

Abstract

Procedimiento para producir un implante a partir de tejido intersticial, conectivo o de soporte, el procedimiento comprende al menos una etapa de perfusión del tejido con al menos un medio de descelularización a presión negativa, y que comprende además al menos una etapa de lavado después de la etapa de perfusión o en cada etapa de perfusión, en el que todo el proceso de descelularización se realiza bajo una presión negativa de no más de 0,5 kPa.

Description

DESCRIPCIÓN

Implante y procedimiento de producción de un implante descelularizando un tejido mediante perfusión bajo presión negativa

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un implante y a un procedimiento para producir un implante. La invención es particularmente útil en la producción de implantes derivados de tejidos cartilaginosos o calcificados, tales como los tendones y los huesos de la tráquea.

Antecedentes de la invención

Los implantes que comprenden andamios de origen biológico se han convertido en opciones importantes para la reparación y regeneración de tejidos o de órganos en el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones. Un obstáculo importante y continuo es la necesidad de eliminar del tejido el material celular que presenta antígenos, que luego se convierte en el andamio. En particular, cuando se descelulariza tejido intersticial, conectivo o de soporte relativamente denso, incluyendo tejido cartilaginoso, como el tejido traqueal, es muy difícil, si no imposible, eliminar sustancialmente del tejido todas las células que presentan antígenos.

El daño intersticial, conectivo y de los tejidos de soporte, incluidas las lesiones traqueales largas, sigue representando un desafío para el cirujano. Por ejemplo, el daño resultante de defectos congénitos, traumatismos o tumores que comprometen más de 4,5 a 6 cm o más del 30% de la longitud total de la tráquea en niños no se puede tratar mediante el cierre primario. Por tanto, estos pacientes rara vez se consideran curables quirúrgicamente por lo que el uso de implantes derivados de tejido traqueal es una alternativa deseada. La reconstrucción con un conducto traqueal ampliaría las indicaciones quirúrgicas y mejoraría la calidad de vida.

Los avances recientes en el campo de la medicina regenerativa son muy prometedores, especialmente en lo que respecta a los andamios traqueales de reemplazo obtenidos mediante ingeniería tisular [o ingeniería de tejidos]. El reemplazo ideal debe estar lo más cerca posible de la estructura natural proporcionando estabilidad y características no inmunogénicas. Para cumplir con estos criterios, se están dirigiendo importantes recursos de investigación hacia el uso de material biológico como punto de partida. La preparación de un andamio para fines regenerativos utilizando material alogénico o xenogénico requiere la eliminación completa de toda la antigenicidad a la vez que se conserva la matriz extracelular hasta el punto que sea capaz de soportar la unión celular y proporcionar suficiente rigidez para la ventilación de aire.

Las técnicas de descelularización conocidas utilizan diferentes reactivos químicos y biológicos para eliminar las células que presentan antígenos y las partículas celulares. Un protocolo establecido para descelularizar el tejido traqueal se basa en un procedimiento detergente enzimático, en el que las células se extraen del tejido traqueal mediante perfusión con varios detergentes, enzimas y otros reactivos. Si bien [este protocolo] proporcionó un andamio adecuado que se había trasplantado con éxito en un puñado de casos por motivos compasivos, aún no ha alcanzado la práctica clínica estándar. Una de las razones es la larga preparación del andamio que lleva aproximadamente 3 semanas, y el riesgo que conlleva para el paciente causado por la demora.

El documento WO2011/062621 describe técnicas de descelularización en las que se descelulariza un implante utilizando un medio de perfusión aplicado bajo presión positiva o negativa.

Un andamio estandarizado "listo para usar" para uso clínico requiere no solo las características anatómicas, funcionales y biomecánicas correctas, sino también la viabilidad de que sea preparado en un marco de tiempo adecuado. Para mejorar la descelularización de los tejidos, se encuentran disponibles diferentes procedimientos, que abarcan diferentes combinaciones de enzimas y detergentes.

Dado que se sabe que la mayoría de estos reactivos alteran la matriz extracelular, se desea aún un enfoque diferente a las técnicas conocidas para mitigar o prevenir la alteración de la matriz extracelular.

Dado que el tejido intersticial, conectivo y de soporte, como el cartílago, es un tejido específicamente denso, se requiere un procedimiento para administrar los agentes descelularizantes profundamente en el tejido durante un tiempo relativamente corto y sin impacto en la ultraestructura tisular de la matriz extracelular, especialmente al preparar implantes traqueales.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para producir un implante para la reparación de tejidos o de órganos, especialmente basado en tejido intersticial, conectivo o de soporte, incluido el tejido cartilaginoso como el de la tráquea, en el que el implante se puede preparar en un período de tiempo relativamente corto, a la vez que se mantiene una matriz extracelular sustancialmente intacta con la eliminación sustancialmente de todas las células que presentan antígenos.

Sumario de la invención

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para producir un implante a partir de tejido intersticial, conjuntivo o de soporte, comprendiendo el procedimiento al menos una etapa de perfusión del tejido con al menos un medio de descelularización a presión negativa, y que comprende además al menos una etapa de lavado después de la etapa o de cada etapa de perfusión, en la que todo el proceso de descelularización se realiza bajo una presión negativa de no más de 0,5 kPa.

Los tejidos intersticiales, conectivos o de soporte adecuados incluyen tejido cartilaginoso, fibrocartilaginoso y cartilaginoso calcificado, como la tráquea, la laringe y el cartílago per se, hueso, tendón, ligamento, hueso-tendón, hueso-ligamento, tejido nervioso, grandes vasos sanguíneos como las arterias y venas, y la membrana sinovial. La "presión negativa" incluye la presión ambiental reducida, o un vacío parcial o sustancialmente completo.

El andamio resultante proporciona un excelente implante para la reparación y regeneración de tejido.

Los medios de descelularización se seleccionan para agotar las células y los componentes celulares del tejido a la vez que se minimiza el daño a las proteínas de la matriz extracelular (m Ec ), lo que da como resultado un andamio en el que la estructura y la función de la MEC se conservan en la medida de lo posible.

Los medios de descelularización adecuados incluyen detergentes, tales como dodecilsulfato de sodio (DSS), desoxicolato de sodio (DOS), detergentes que comprenden restos de óxido de polioxietileno hidrófilo e hidrocarburos hidrófobos, tales como Triton X-100 (RTM), enzimas, tales como enzimas proteolíticas, por ejemplo, tripsina y nucleasas, por ejemplo, desoxirribonucleasas como DNasa I y ribonucleasas como RNasa, y combinaciones de las mismas. El trisbutil-n-fosfato (TBnP) también se puede incluir en uno o más medios de descelularización. El TBnP es un solvente que interrumpe las interacciones proteína-proteína.

El procedimiento comprende preferiblemente perfundir el tejido con más de un medio de descelularización. De manera adecuada, el procedimiento comprende perfundir el tejido con al menos un detergente y al menos una nucleasa. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende etapas separadas de perfundir el tejido con un detergente y perfundir el tejido con una nucleasa, y la etapa de perfusión de detergente se puede realizar antes de la etapa de perfusión de nucleasa. Tanto la etapa de perfusión de detergente como la etapa de perfusión de nucleasa se realizan bajo presión negativa.

Cada etapa de perfusión se puede realizar a una temperatura de entre 15 °C y 45 °C, o entre 30 °C y 40 °C. En algunas realizaciones, las etapas de perfusión se realizan a aproximadamente 37 °C, lo que es especialmente ventajoso cuando la etapa de perfusión incluye un material de nucleasa. Cuando la etapa de perfusión es una etapa de perfusión de detergente, se puede realizar a una temperatura de entre 15 °C y 40 °C, como alrededor de la temperatura ambiente o ambiente.

En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender una etapa de lavado entre cada etapa de perfusión. La etapa de lavado puede utilizar cualquier medio o medio de lavado adecuado, como solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina equilibrada de Hanks o agua estéril, por ejemplo. La (s) etapa (s) de lavado se pueden realizar a una temperatura de entre 1 °C y 8 °C, o entre 2 °C y 6 °C. Alternativamente, la o cada etapa de lavado se puede realizar a una temperatura de entre 15 °C y 40 °C, tal como alrededor de 37 °C, o alrededor de la temperatura ambiente o ambiente. Todas las etapas de lavado se realizan a presión negativa. Una etapa de lavado puede comprender incubar el tejido en el medio de lavado.

La perfusión y/o el lavado se pueden realizar en presencia de antibióticos y/o antimicóticos.

El procedimiento puede comprender perfundir el tejido en una serie de etapas que comprenden: al menos dos etapas de perfusión con una nucleasa, seguidos de al menos una etapa de perfusión con un detergente o mezcla de detergente, lavado entre cada etapa con un medio de lavado. En algunas realizaciones, la serie de etapas comprende dos etapas de perfusión con una mezcla de desoxirribonucleasa y ribonucleasa seguida de perfusión con una mezcla de detergentes iónicos y no iónicos, lavados entre cada etapa con una solución salina. En realizaciones preferidas, la mezcla de detergentes comprende desoxicolato de sodio y Triton X-100 (RTM), la desoxirribonucleasa es ADNasa I y la ribonucleasa es ARNasa.

De manera adecuada, cada etapa de perfusión se realiza durante entre 1 hora y 96 horas, más preferiblemente entre 18 horas y 84 horas, y lo más preferiblemente entre 24 horas y 72 horas. Cuando la etapa de perfusión comprende la perfusión de un material detergente, la etapa se puede llevar a cabo durante al menos 12 horas, 18 horas o 24 horas. Cuando la etapa de perfusión comprende la perfusión de una nucleasa, la etapa se puede llevar a cabo durante al menos 1 hora, 18 horas o 24 horas.

De forma adecuada, cada etapa de lavado se puede llevar a cabo durante entre 15 minutos y 96 horas, por ejemplo, entre 12 horas y 96 horas, más preferiblemente entre 18 horas y 72 horas, o entre 24 horas y 72 horas. Puede haber múltiples etapas de lavado entre o después de cada etapa de perfusión y cada uno de los múltiples etapas de lavado se puede llevar a cabo independientemente durante entre 15 minutos y 96 horas.

El procedimiento puede comprender almacenar el tejido descelularizado en un medio adecuado, como una solución salina. La solución salina puede incluir al menos un material antibiótico y/o antimicótico. La solución salina puede comprender una solución salina tamponada con fosfato (PBS) o una solución salina equilibrada de Hanks (opcionalmente con ácido Ca y/o Mg) y puede comprender tanto un material antibiótico como antimicótico. El almacenamiento preferiblemente es a una temperatura de entre 1 °C y 6°, tal como alrededor de 4 °C.

La etapa o las etapas de perfusión se realizan bajo presión negativa. En algunas formas de realización, la presión no es superior a 0,2 kPa ni superior a 0,1 kPa. Se cree que la perfusión del tejido con agentes de descelularización a una presión tan reducida no solo aumenta la velocidad a la que el tejido absorbe la solución de perfusión y el medio de descelularización (o medio), sino que también permite que el medio de descelularización (medio) penetre más profundamente en el tejido de lo que ocurriría de otra manera sin el uso de la presión negativa, asegurando así que todo el tejido esté perfundido con el medio (medios), con el fin de permitir una descelularización sustancialmente completa en un período de tiempo relativamente corto. Además, cuando las etapas de lavado se realizan a presión negativa, los efectos de descelularización se mantienen y mejoran.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende las etapas de:

a) Perfundir el tejido con un medio nucleasa durante entre 1 hora y 36 horas;

b) Lavar el tejido entre 12 horas y 72 horas;

c) Perfundir el tejido con un medio detergente durante entre 12 horas y 36 horas; y

d) Perfundir el tejido con un medio nucleasa durante 12 a 36 horas más.

El medio de nucleasa en las etapas a) y d) es preferiblemente el mismo medio de nucleasa y puede comprender ADNasa I y ARNasa.

El medio detergente en la etapa c) puede comprender una mezcla de detergentes iónicos y no iónicos, como por ejemplo una mezcla de desoxicolato de sodio y Triton X-100 (RTM).

Las etapas de perfusión a), c) y d) se pueden realizar entre 30 °C y 40 °C, tal como alrededor de 37 °C. Las etapas de lavado se pueden realizar entre 2 °C y 6 °C, tal como alrededor de 4 °C, o entre 15 °C y 40 °C, tal como alrededor de 37 °C, o alrededor de la temperatura ambiental o exterior.

Puede haber una etapa e), después de la etapa d), para almacenar el tejido descelularizado en una solución salina entre 1 °C y 6 °C, tal como alrededor de 4 °C. La solución salina puede incluir un antibiótico y/o un antimicótico. Las etapas a), c) y d) se realizan todas bajo presión negativa, de no más de 0,5 kPa, preferiblemente a temperatura ambiente, y preferiblemente a no más de 0,2 kPa o más preferiblemente a no más de 0,1 kPa para tejido intersticial, conectivo o de soporte.

Cada una de las etapas a) a d) se realiza bajo presión negativa de no más de 0,5 kPa a temperatura ambiente, y preferiblemente no más de 0,2 kPa o más preferiblemente no más de 0,1 kPa, para tejido intersticial, conectivo o de soporte.

Puede haber otras etapas de lavado de entre 15 minutos y 72 horas, entre cualquiera de las etapas de la a) a la d) y/o después de la etapa d).

Opcionalmente, el procedimiento del primer o segundo aspecto de la invención puede comprender una etapa de reticulación del tejido procesado. Se puede usar cualquier agente de reticulación adecuado, por ejemplo, uno o más de diisocianato de hexametileno (HMDI), genipina, quercetina o heparina. Normalmente, cuando el procedimiento incluye una etapa de reticulación, esto se lleva a cabo después de la descelularización del tejido.

La reticulación es particularmente ventajosa cuando el implante se produce a partir de la tráquea, ya que ayuda a proteger contra la traqueomalacia.

El procedimiento se puede usar para proporcionar un andamio sustancialmente descelularizado en el que las células se eliminan sustancialmente, habiendo eliminado el andamio suficiente material celular y componentes asociados de manera que no se observe reactividad tisular adversa o reacción inmune in vivo. La reactividad se puede observar mediante implantación subcutánea. El andamio sustancialmente descelularizado está convenientemente libre de células tal como se visualiza mediante microscopía con un aumento de 40x.

Cuando se usa tejido cartilaginoso, el procedimiento de la invención da como resultado la descelularización del tejido cartilaginoso de manera que se eliminan sustancialmente todos los condrocitos dentro de las lagunas. Además, cuando el material cartilaginoso es una tráquea, se eliminan sustancialmente todos los núcleos del epitelio luminal (mucosa), las glándulas submucosas, el músculo traqueal y la adventicia externa.

En una revisión reciente de los procesos de descelularización de tejidos y órganos completos (Crapo, et al. (2011) Biomaterials 32: 3233-3243) se propuso que los siguientes criterios mínimos, además de la falta de respuesta in vivo adversa, son suficientes para satisfacer la intención de descelularización de la matriz extracelular (MEC): <50 ng dsDNA por mg MEC de peso seco; <200 pb de longitud del fragmento; y falta de material nuclear visible en secciones de tejido teñidas con DAPI o H&E.

Estos criterios los satisfacen los tejidos descelularizados producidos mediante el procedimiento de la presente invención.

El andamio restante comprende MEC, en particular colágeno. Preferiblemente, la estructura del MEC se conserva al menos parcialmente en el andamio y de preferencia se conserva sustancialmente. Por tanto, el andamio puede comprender fibras de colágeno que muestren la arquitectura de fibra original y la ultraestructura molecular del material de tejido natural del que se deriva. Las estructuras tridimensionales naturales de estas proteínas de tejido fibroso preferiblemente se retienen sustancialmente, aunque es aceptable algo de soltura o despliegue sin afectar la integridad estructural del andamio.

Se sabe que los componentes celulares específicos para el origen del andamio y/o el lugar de su implantación invocarán una remodelación constructiva adecuada de la MEC solo cuando la arquitectura polimérica de las fibras dentro de los tejidos u órganos descelularizados permanezca al menos parcialmente intacta. Por lo tanto, la MEC es más adecuada que cualquier matriz sintética para provocar una remodelación regenerativa funcional y proporcionar un andamio exitoso para el crecimiento de tejido.

La preservación de las proteínas MEC funcionales también es importante para el mantenimiento de la actividad biológica, la integridad estructural, la durabilidad y las propiedades físico-químicas del andamio. El mantenimiento y preservación de la jerarquía de la estructura desde la estructura molecular de las proteínas y los glicosaminoglicanos (GAG) hasta la ultraestructura macroscópica del tejido es importante para las propiedades físico-mecánicas inherentes que, a su vez, son importantes para la función del tejido. La preservación de las estructuras tridimensionales durante la descelularización y el procesamiento de tejidos también mejoran la repoblación celular final del tejido y la regeneración de la función celular y específica del tejido.

La presente invención preferiblemente conserva los GAG localizados o derivados de MEC a la vez que elimina sustancialmente los GAG asociados a células. Por tanto, el proceso de descelularización generalmente da como resultado una reducción de los GAG totales, a la vez que los GAG asociados con MEC se conservan preferiblemente en gran medida. Esto es importante, ya que existe una "intercomunicación" entre la MEC y los GAG y los diferentes tipos de células, lo que ayuda a dirigir el tráfico celular y la diferenciación celular. Las MEC y los GAG también sirven como almacén o sumidero de factores de crecimiento, lo que ayuda a dirigir la regeneración de tejido después de la implantación del andamio o del implante.

La etapa o las etapas de perfusión se pueden realizar utilizando un aparato que comprende una bomba de vacío o un aparato de bombeo conectado a un dispositivo generador de vacío. El aparato puede comprender un circuito de perfusión, que puede incluir tubos, mangueras, tuberías o similares, por ejemplo, colocados para administrar el medio de descelularización, y que también se pueda usar para administrar cualquier medio de lavado en realizaciones del procedimiento de la invención que incluyan una o más etapas de lavado.

Se puede proporcionare una cámara de incubación para alojar el tejido y el medio de descelularización se puede bombear a través de la cámara de incubación.

Descripción detallada de la invención

Con el fin de que la invención pueda entenderse más claramente, se describirán ahora unas realizaciones de la misma, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, de los cuales:

La figura 1 es una fotografía que muestra el aspecto macroscópico de una parte de la tráquea humana (A) de control (no descelularizada) y (B) descelularizada, usando los procedimientos de la invención.

La figura 2 es una microfotografía que muestra una evaluación histológica de tráquea porcina descelularizada con y sin uso de vacío durante el proceso de descelularización, en la que las imágenes A y D muestran tejido de control normal mostrando la presencia de células intactas con núcleo (*), las imágenes B & E muestran tejido descelularizado sin el uso de presión negativa durante la perfusión (observe los condrocitos intactos dentro de las lagunas cartilaginosas (*)), y las imágenes C & F muestran descelularización utilizando los procedimientos de la invención (no hay núcleos intactos presentes y las lagunas cartilaginosas están vacías (°)).

La figura 3 muestra un gráfico de barras de los resultados de la cuantificación de ADN en tejido porcino de control y tejido porcino descelularizado con y sin el uso de los procedimientos de la invención, y la cuantificación de ADN para tejido de control traqueal humano y tejido descelularizado usando los procedimientos de la invención.

La figura 4 es una microfotografía que muestra la descelularización de la tráquea humana utilizando los procedimientos de la invención, en la que las imágenes A&C muestran tejido de control normal (nótense los condrocitos intactos (*) y el material nuclear en el tejido conjuntivo externo (**)) y las imágenes B&C muestran tejido descelularizado preparado utilizando los procedimientos de la invención (nótense las lagunas cartilaginosas vacías (°)).

La figura 5 es una microfotografía que muestra secciones teñidas con elastina PSR-ME, en la que las imágenes de la A a la H son imágenes de tejido traqueal porcino (A&B, E&F) y humano (C&D, G&H) tomadas bajo luz microscópica de campo brillante, las imágenes I a L (I&J porcino, K&L humano) se toman bajo luz polarizada, y en las que el tejido de control en las imágenes A&E&I, C&G&K se compara con el tejido descelularizado preparado por los procedimientos de la invención en las imágenes B&F&J, y en las imágenes D&H&L. Las flechas muestran fibras elásticas preservadas (e) y fibras de colágeno (c).

La figura 6 es un gráfico de barras que muestra los resultados del contenido de colágeno del tejido de control y del tejido descelularizado de la tráquea porcina y humana. Para el tejido porcino, se incluyen los datos iniciales para la descelularización sin vacío (n=2). Ambas especies no muestran diferencias significativas entre el tejido de control y las muestras traqueales descelularizadas.

La figura 7 es una serie de imágenes MEB [Microscopía Electrónica de Barrido] o imágenes SEM [por sus siglas en inglés de Scanning Electrón Microscopy] de tejido traqueal en las que A, C, E son tejido de control, y las imágenes B, D, F muestran tejido de tráquea descelularizado preparado usando los procedimientos de la invención. Los paquetes de colágeno, A-D es cerdo y E y F son de tráquea humana. Las flechas marcadas con "*" muestran células en el tejido de control (imagen C). Las flechas marcadas con "f' apuntan hacia las fibras de colágeno.

La figura 8 es una fotomicrografía de una tinción con Azul Alcian de tejido de control de tráquea porcina (A&E), tejido de control de tráquea humana (C&G) en comparación con un cerdo descelularizado (B&F) y tráquea humana (D&H) fabricado de acuerdo con la invención.

La figura 9 es un gráfico de barras que muestra el análisis GAG cuantitativo de tejido porcino y humano comparando tejido de control y muestras de tejido descelularizadas (hechas con y sin usar los procedimientos de la invención).

La figura 10 es una ilustración esquemática de un aparato para la prueba biomecánica de muestras traqueales.

La figura 11 es una fotomicrografía que muestra imágenes de inmunotinción para MHC-I de control porcino (A) y tráquea descelularizada (C) preparada según la invención y control humano (B) y tejido traqueal descelularizado (D) preparado según la invención. Las flechas marcadas con "*" muestran tinción positiva de las membranas celulares, y las flechas marcadas con "°" marcan el área donde se esperaría una tinción de MHC-I en caso de tinción positiva. La tráquea humana no descelularizada teñida con HLA-1 se muestra en (E). La tráquea humana no descelularizada teñida con HLA-1 se muestra en (F). La tinción positiva para HLA-1 se puede ver en toda la sección; el epitelio muestra una intensa positividad. (G) muestra tinción con HLA-1 de tráquea humana descelularizada hecha según la invención (contrateñida con eosina) que no muestra positividad sobre el cartílago y el colágeno. (H) muestra IHC de tráquea humana descelularizada teñida con HLA-1 durante la noche y teñida con eosina.

La figura 12 es una serie de fotografías que muestran imágenes macroscópicas de un experimento de biocompatibilidad. La imagen A, flecha "t", muestra la implantación de muestras traqueales descelularizadas humanas hechas de acuerdo con la invención en ratas Sprague Dawley. La imagen B muestra el área de implantación (nótese la flecha "I") y la imagen C, la flecha "s" muestra muestras de tejido explantadas después de 2 semanas.

La figura 13 es una fotomicrografía de una tinción H&E de tejido traqueal descelularizado humano explantado elaborado según la invención después de 2 semanas de implantación en un modelo animal xenógeno. La imagen A incluye flechas que indican el músculo subyacente (m) y el (los) andamio (s) implantado. Las imágenes B&C muestran imágenes después de la explantación y el área muestra integración del tejido con neovascularización (v) y una fina cápsula fibrosa con algunas células neutrofílicas (*) correspondiente a una inflamación aguda leve.

La figura 14 es una fotomicrografía de imágenes teñidas con PSR-ME de andamios traqueales humanos descelularizados hechos de acuerdo con la invención después de 2 semanas de implantación en ratas. Las flechas muestran la estructura de matriz extracelular conservada del andamio con la parte cartilaginosa (*) y las fibras colágenas (c).

La figura 15 es una electroforesis en gel de ADN que muestra el contenido de ADN de muestras de tejido traqueal humano y de cerdo descelularizado preparado de acuerdo con la invención en comparación con marcadores de control de hasta 1 kba.

La figura 16 es una fotomicrografía de una tinción H&E de tejido tendinoso porcino descelularizado fabricado de acuerdo con la invención.

La figura 17 es una fotomicrografía de la tinción H&E de tejido tendinoso porcino descelularizado de control elaborado sin el uso de presión negativa durante la descelularización.

La figura 18 es una fotomicrografía de muestras de hueso porcino teñidas con H&E. (a) Muestra de control (sin presión negativa durante la descelularización), aumento 40x. (b) Muestra de control, aumento 200x. (c) DSS al 1%, solución hipotónica de 36 h, muestra de vacío, aumento 40x. (d) DSS al 1%, solución hipotónica de 36 h, muestra de vacío, aumento 200x. Clave -(AD) Adipocito; (CMH) Células madre hematopoyéticas; (OC) Osteocito dentro de lagunas de hueso trabecular; (HT) Hueso trabecular teñido de rosa.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Producción de un andamio traqueal descelularizado según la invención y controles

Toda la cirugía y manipulación de animales se realizó de acuerdo con la Normativa de Procedimientos Científicos (Procedimientos Científicos) con Animales del Ministerio del Interior del Reino Unido de 1986 tras la aprobación ética del Instituto de Investigación Médica de Northwick Park (NPIMR). Las tráqueas se recolectaron de cerdos de cruce [de razas] Large-White con Landrace de estudios no relacionados en condiciones estándar de laboratorio. Después de la eutanasia mediante una sobredosis de anestésico, se recolectaron las tráqueas y se usaron frescas (control) o descelularizadas. Para la descelularización se extrajo todo el tejido conectivo y se enjuagó la tráquea en solución salina equilibrada de Hanks (de Sigma-Aldrich). A continuación, el tejido se almacenó a -20 °C durante un mínimo de 24 horas.

Las tráqueas humanas se obtuvieron en el Reino Unido de su Sistema Nacional de Salud (NHS por sus siglas en inglés de National Health Service), y de su departamento de "donación y trasplante de órganos y donación de sangre" (NHSBT por sus siglas en inglés de NHS Blood and Transplant). Se recuperaron tráqueas de cadáveres de 2 donantes que no tenían enfermedad conocida de las vías respiratorias. La transferencia y el almacenamiento iniciales se realizaron en solución tamponada de Hank a -80 °C. Para la descelularización, ambas tráqueas se transfirieron a -20 °C.

Descelularización según la invención y control de la descelularización

Un total de once (11) tráqueas porcinas fueron descelularizadas; siete (7) se descelularizaron usando los procedimientos de la invención mientras que cuatro (4) se descelularizaron usando exactamente el mismo protocolo de descelularización pero bajo presión atmosférica normal en lugar de presión negativa. Ambas tráqueas humanas se descelularizaron utilizando los procedimientos de la invención. Para cada proceso de descelularización se utilizó una longitud máxima de tráquea de 5 cm.

Todo el proceso de descelularización se llevó a cabo utilizando un pequeño desecador (de Sigma Aldrich, Reino Unido). Para crear un vacío (presión negativa), el desecador se conectó a una bomba de vacío Telstar 2F-10 (de Pendle Refrigeration Wholesale Ltd, Reino Unido) equipada con un medidor de vacío digital (de Pendle Refrigeration Wholesale Ltd, Reino Unido). Se creó un vacío a un nivel de 1500 micrones (se lee en el manómetro de vacío que 1500 micrones equivale a <1 KPa abs). A continuación, el desecador se colocó en una incubadora con agitación (ajustada a 100 rpm) a 4 °C ó 37 °C, dependiendo de la temperatura requerida dentro del protocolo. Todas las soluciones utilizadas durante el proceso de descelularización contenían penicilina o estreptomicina al 1% (de Sigma-Aldrich, Reino Unido).

El tejido se descongeló a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas y luego se incubó en una solución de detergente que contenía Triton X-100 al 0,25% (de Sigma-Aldrich, Reino Unido), desoxicolato de sodio al 0,25% (Fluka) en PBS a 37°C durante 24 horas. A continuación, el tejido se enjuagó dos veces con solución salina equilibrada de Hanks de 4° a 6 °C durante 15 minutos. Después del lavado, el tejido se incubó con solución salina equilibrada de Hanks durante 24 horas de 4° a 6 °C seguido de incubación con 2000 KU (Unidades Kunitz) / l DNAsa (de Sigma-Aldrich) y 0,1 g/l RNAsa (de Roche) a 37 °C durante 24 horas, para solubilizar el contenido nuclear y degradar el ADN. Después de un enjuague adicional (dos veces) con solución salina equilibrada de Hanks de 4° a 6 °C, las tráqueas se incubaron durante 24 horas desde el lavado con solución salina equilibrada de Hanks a 4 °C. A continuación, las tráqueas se almacenaron en una solución salina equilibrada de Hanks que contenía una solución de antibiótico y antimicótico al 1% de 4° a 6 °C, o se procesaron según se requiera para un análisis adicional. El proceso de descelularización total se llevó a cabo bajo presión negativa y duró entre 4 y 5 días, lo que es un período de tiempo sustancialmente más corto que el uso de técnicas de descelularización conocidas.

Análisis de implantes de los andamios

Evaluación histológica e inmunohistoquímica: Las muestras se fijaron durante un mínimo de 24 horas en una solución de formalina tamponada neutra al 10% a temperatura ambiente. Se deshidrataron en alcohol graduado, se incrustaron en parafina y se seccionaron a 5 pm. Las secciones se tiñeron con tinción de hematoxilina y eosina (H&E), azul alciano, rojo picro-sirius y tinciones de elastina de Miller.

Para el análisis inmunohistoquímico, tanto las secciones en parafina como congeladas se probaron para inmunotinción de MHC-I incrustada. Las secciones de parafina de 5 pm se montaron en portaobjetos recubiertos con (3-aminopropil) trietoxisilano (de Sigma-Aldrich, Reino Unido). Las secciones recién congeladas se fijaron con acetona enfriada con hielo durante 10 minutos. Las secciones de parafina se desparafinaron y rehidrataron con dos cambios de xileno seguido de un aclarado [lavado] en gradiente de alcohol decreciente y aclarado con agua fría del grifo. Los portaobjetos se colocaron en una cámara de humidificación y se bloqueó la peroxidasa endógena usando peroxidasa de hidrógeno al 3% en metanol (de Sigma-Aldrich, Reino Unido) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Para las secciones de parafina, la recuperación de antígeno se llevó a cabo utilizando tripsina a 37 °C durante 40 minutos. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con suero de caballo al 2,5% (de Vector Laboratories Ltd., Peterborough, Reino Unido) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las secciones de tejido humano se sometieron a incubación con el anticuerpo primario monoclonal (anticuerpo anti-MHC de clase I humano producido en conejos / EP1395Y, ab52922, Abcam, Reino Unido) durante 1 hora a temperatura ambiente a una dilución 1:150 en solución salina tamponada con fosfato. Las secciones de tejido porcino se incubaron con el anticuerpo primario (MHCI, H17A anti porcino, de VMRD Inc., en Pullman Estados Unidos de América) a 4 °C durante la noche a una dilución 1:100 en solución salina tamponada con fosfato.

Después de 3 lavados de 3 minutos con PBS, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario (kit Impress anti-ratón o Impress anti-conejo inmunoglobulina G / peroxidasa, de Vector Laboratories) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar de nuevo con PBS de 3 x 3 minutos, se aplicó el sustrato cromogénico diaminobencidina (sustrato de peroxidasa Impact, de Vector Laboratories) a las secciones durante 3 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar, las secciones se contratiñeron en hematoxilina de Harris durante 30 segundos antes de deshidratarlas, aclararlas y colocarles un cubreobjetos. Para los controles negativos se aplicó el mismo protocolo, sin embargo, se omitió el anticuerpo primario y se utilizó una solución salina tamponada con fosfato. Como control positivo, se utilizó bazo de cerdo o humano.

Microscopía electrónica de barrido (MEB)

Para evaluar cualitativamente la estructura de la matriz descelularizada, las muestras de tejido se fijaron con glutaraldehído al 3% (v/v = volumen/volumen) (de Sigma-Aldrich) un tampón de fosfato de 0,1M.

A continuación, los fragmentos se lavaron con agua destilada y se deshidrataron en un gradiente de etanol y se secaron en un punto crítico. A continuación, las muestras se montaron en una cinta adhesiva de doble cara fijada a un talón de microscopía electrónica de barrido y se recubrieron con una aleación de oro antes de hacer las fotografías.

Análisis molecular

Análisis de ADN: Para la extracción y cuantificación del ADN se utilizó el kit de minipreparación de ADN genómico de mamíferos GenElute (de Sigma-Aldrich, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se colocaron 25 mg de tejido húmedo picado del tejido traqueal fresco o descelularizado (humano y porcino) en un tubo de microcentrífuga con proteinasa K y se incubaron en un baño de agua a 55 °C durante 4 horas con agitación en vórtex a intervalos de 30 minutos. La digestión completa se confirmó macroscópicamente y las muestras se sometieron luego a una solución de ribonucleasa A a temperatura ambiente durante 2 minutos. Las muestras se incubaron con reactivos lisos del kit de ensayo de extracción de ADN a 70 °C durante 10 minutos. Los lisados se cargaron en columnas preparadas para unir ADN. Después de varias etapas de lavado para eliminar los contaminantes, finalmente se eluyó el ADN en 200 pl de una solución de ácido tris-etiledeiaminotetraacético. La absorbancia se leyó a 260 nm y 280 nm usando una microcubeta de cuarzo de autoenmascaramiento y un espectrofotómetro (Helios Alpha, de Thermo Fisher Scientific, en Loughborough, Reino Unido) y se calculó la cantidad absoluta de ADN por miligramo de tejido.

El tamaño, la calidad y la pureza del ADN extraído se determinaron mediante electroforesis en gel de agarosa de ADN al 0,8%. El gel de agarosa al 0,8% corría en un tampón 0,5X de ácido tris-borato-etilendiaminotetraacético a 4 a 5 V/cm entre los electrodos. Se cargaron volúmenes iguales de ADN (2 pl) en cada pocillo. La visualización se logró mediante la tinción con bromuro de etidio y el ADN se midió mediante transiluminación ultravioleta frente a una escalera de ADN de 1 kb (escalera de ADN cuantitativa Q-Step 4, de Yorkshire Bioscience Ltd., en York, Reino Unido).

Cuantificación de GAG: El kit de ensayo Blyscan GAG (Biocolor) se utilizó para cuantificar el contenido de glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) de muestras traqueales humanas y porcinas frescas y descelularizadas. En resumen, se colocaron 50 mg de tejido húmedo picado en un tubo de microcentrífuga y se incubaron con 1 ml de tampón de digestión de papaína a 65 °C durante 18 horas. Se mezclaron alícuotas de cada muestra con colorante azul de 1,9-dimetil-metileno y reactivos del kit de ensayo GAG. Se midió la absorbancia a 656nm con un espectrofotómetro y se calculó el contenido absoluto de GAG comparándolo con un gráfico de patrones elaborado a partir de condroitin-4-sulfato traqueal bovino.

Cuantificación de colágeno: El contenido de colágeno de la tráquea humana y porcina fresca y desencelulada se cuantificó con el kit de ensayo de colágeno Sircol (de Biocolor, Carrickfergus, Irlanda del Norte). En resumen, se colocaron 50 mg de tejido húmedo picado en un tubo de microcentrífuga con 1,5 ml de medio de extracción ácidopepsina (0,1 mg / ml de pepsina en 0,5 mol/l de ácido acético). Se incubaron alícuotas de cada muestra con reactivo neutralizador de ácido y reactivos de aislamiento de colágeno durante la noche a 4 °C. A continuación, las muestras se sometieron al tinte rojo Sirius del kit de ensayo de colágeno. La absorbancia a 555 nm se midió con un espectrofotómetro. Comparando con un gráfico de patrones elaborado a partir de colágeno de piel bovina de tipo I, se calculó el contenido absoluto de colágeno.

Ensayos biomecánicos

Las probetas fueron sometidas a tensión uniaxial hasta su rotura, confirmada por la pérdida de carga y la aparición de desgarros en el tejido. El proceso se muestra en el esquema de la figura 10.

Para cada ensayo se utilizó un anillo traqueal abierto (porcino o humano, fresco o descelularizado). Se abrieron muestras de tráquea (2) para formar piezas rectangulares planas (4) con una longitud máxima de 33 mm, se sujetaron con abrazaderas (6,6') en soportes (8, 8') y se cargaron a una tasa de tensión constante de 100 mm/min y una fuerza máxima de 500N. Las pruebas se realizaron con la aplicación de tensión uniaxial con un Tester Portátil de Sobremesa Instron In-Spec 2200 a temperatura ambiente.

El medidor de tracción registró en tiempo real la carga y el alargamiento a los que se sometió el tejido. Se registraron parámetros como fuerza máxima (N), fuerza de ruptura (N), extensión a carga máxima (cm). Se calculó la relación de tensión a deformación (módulo de Young) con una medida de la rigidez de un material elástico

Biocompatibilidad del andamio descelularizado

Todas las cirugías y el manejo de animales se realizaron de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986. Toda la cirugía y manipulación de animales se realizó de acuerdo con la Normativa (Procedimientos Científicos) con Animales de 1986 y el Código de Prácticas del Ministerio del Interior [del Reino Unido].

Antes de la implantación, cada andamio se esterilizó adicionalmente usando esterilización UV; las muestras se expusieron a luz ultravioleta durante un período de 2x20 min. Se utilizaron un total de 6 ratas Sprague-Dawley. Bajo anestesia general y utilizando técnicas asépticas, se hizo una incisión en la línea media en la pared abdominal y se creó un pequeño bolsillo entre la piel y el músculo a ambos lados de la línea media. A continuación, cada bolsillo recibió una pieza de tráquea descelularizada o no descelularizada de 1 cm x 1 cm. Dos semanas más tarde, cada animal se sacrificó con una dosis letal de penotbarbitona. El tejido implantado fue explantado y procesado para evaluación histológica.

Análisis estadístico

Los datos se calcularon como media /- de error estándar, y su relevancia se determinó mediante la realización de "pruebas t" de Student de 2 colas y ANOVA ordinario de una vía con Bonferroni como prueba post-hoc (Prism 6: Graphpad Software, La Jolla, California). Se consideró relevante un valor de "p" inferior a 0,05.

Resultados

Se recogió tejido traqueal de 11 cerdos y 2 donantes humanos y se trató con el proceso de descelularización (en adelante, "DC") según la invención.

Análisis de ADN:

Después de la descelularización macroscópicamente, el tejido aparece incoloro, probablemente debido a la eliminación de glóbulos rojos (véase la figura 1).

Las tráqueas porcinas se descelularizaron con y sin vacío para ayudar a la penetración de las soluciones en el tejido. En los portaobjetos histológicos teñidos con H&E, hubo una eliminación completa de todos los núcleos intactos dentro del epitelio luminal (mucosa), las glándulas submucosas, el músculo traqueal y la adventicia externa en el tejido que había sido sometido a descelularización asistida mediate vacío, que es el procedimiento según la invención. Dentro del cartílago, todos los condrocitos se eliminaron de manera eficiente dentro de las lagunas. Sin embargo, el tejido que no había sido sometido a descelularización asistida por vacío mostró condrocitos intactos dentro de algunas, pero no todas, lagunas (figura 2). Esta observación fue apoyada por la cuantificación de ADN molecular que mostró una reducción significativa en la cantidad de ADN que queda después de la descelularización con y sin vacío en comparación con el tejido de control. Además, se observó una reducción no significativa en el ADN entre el protocolo sin vacío y asistido por vacío (figura 3: control n=7; 300,4±27,05 ng/mg vs. DC sin vac: n=3; 109,8±37,45 ng/mg frente a DC vac n=6; 36,14±7,834 ng/mg, p<0,05.).

Las tráqueas humanas que habían sido sometidas a la desccelulización al vacío también mostraron una eliminación completa de todo el material nuclear en todo el tejido tanto histológicamente (figura 4) así como con el análisis de ADN molecular (control n=2; 304,4±8,268 ng/mg frente a DC n=7; 50,04±6,003 ng/mg, p<0.05 véase la figura 3). La figura 15 también indica la eliminación de prácticamente todo el ADN.

Evaluación de colágeno

La evaluación de tejido de ambas especies mediante rojo Picro-Sirius con elastina Miller mostró buena conservación y morfología del cartílago y colágeno (figura 5, A-D). Además, también se conservó la elastina fina dentro de las pequeñas arteriolas y vénulas (figura 5, E-H). Cuando las secciones se observaron bajo luz polarizada (figura 5, I-L), todo el colágeno se birrefringió de un color rojo-naranja-amarillo brillante que representa la buena integridad estructural del colágeno.

Con respecto al análisis molecular para la degradación del colágeno, hubo una marcada reducción entre las muestras porcinas de control y no asistidas por vacío. No se observó ninguna reducción en la degradación del colágeno entre el control porcino y las muestras preparadas por el procedimiento de la invención, ni se observó ninguna diferencia entre el tejido descelularizado humano elaborado de acuerdo con la invención y con el tejido de control (de cerdo: control n=9; 27,8±8,829 pg/mg; DC: sin vac n=2, 6,774±0,067 pg/mg, DC vac: n=49; 23,03±3,897 |jg/mg; de humano: control n=3; 12,86±3,657 pg/mg, DC n=9; 8,186±2,322 pg/mg (véase la figura 6).

La ultraestructura del colágeno también se evaluó usando MEB, la fibra de colágeno dentro del tejido descelularizado porcino fabricado de acuerdo con la invención parecía estar más unida que en el tejido porcino de control. También se observó una apariencia similar para el tejido humano (figura 7).

Evaluación del andamio GAG

La evaluación de la cantidad de GAG retenidos en el andamio descelularizado de ambas especies se evaluó mediante tinción histológica con azul de Alcian (figura 8) y pruebas moleculares cuantitativas. Mientras que los andamios de cerdos perdieron más del 70% de su contenido de GAG durante el proceso de descelularización con y sin vacío (control n=14, 488,3±75,61 ng/mg frente a DC sin vacío n=10; 59,12 ± 11,54 ng/mg frente a DC vacío n=8; 47,37±3,921; p<0,05), el tejido humano no muestra grandes diferencias (control n=2; 44,03±0,89 frente a DC/ n=7; 57,64±3,12)

Biomecánica

También se realizó un análisis biomecánico tanto del control como descelularizado (preparado según la invención únicamente) para ambas especies, como se muestra en la figura 10. Las muestras se prepararon tomando un anillo cartilaginoso (2), cortándolo y extrayendo la pars membranacea para producir una pieza rectangular homogénea de tejido (4) que luego se sujetó entre papel de lija en los portamuestras (8, 8'). No se observaron diferencias significativas para ninguno de los siguientes parámetros; resistencia a la tensión, fuerza de rotura, alargamiento a la rotura y módulo de Young, la fecha para cada uno se muestra en la tabla 1.

Tabla 1

Biocompatibilidad

Antes de emprender un estudio de biocompatibilidad in vivo, las muestras descelularizadas de ambas especies se tiñeron con IHC para evaluar si eran capaces de provocar una respuesta inmunológica potencial del huésped cuando se implantasen. Las muestras se tiñeron con MHC I /HLA -1. Las secciones teñidas con MHC mostraron positividad en la facia / adventicia superpuesta en ambas especies. Se observó muy poca o ninguna tinción en los anillos cartilaginosos (tal como se muestra en la figura 11). Las secciones humanas teñidas con MHC1/ HLA-1 no mostraron positividad en el cartílago, el colágeno o la facia suprayacente (tal y como se muestra en la figura 11). Se implantaron subcutáneamente pequeños trozos de tráquea descelularizada en ratas y se dejaron durante 2 semanas. Tras la explantación (tal y como se muestra en la figura 12), aún se pudo identificar cada muestra implantada. Todas las secciones histológicas de la tráquea humana DC implantada mostraron una respuesta inflamatoria menor, aguda poca crónica (neutrófilos, eosinófilos en una pequeña cantidad, cantidades moderadas de macrófagos con sincitios ocasionales de linfocitos), tal y como se muestra en la Figura 13. Además, hubo buena neovascularización y buena integración y la matriz extracelular apareció intacta, tal y como se muestra en la figura 14.

Ejemplo 2

Producción y control de un andamio [•esqueleto] descelularizado para hueso y tendón según la invención

Se obtuvieron muestras de tejido de cerdos sacrificados, en estudios que no están relacionados. Los cerdos eran todos hembras, de aproximadamente 5 meses de edad y 50 kg de peso. Se obtuvieron muestras de hueso del calcáneo porcino. Se obtuvieron muestras de tendón del tendón extensor largo de los dedos. Las muestras se extrajeron durante la autopsia y se almacenaron en un congelador a -20 °C en bolsas de plástico para muestras hasta que se requirieron para su uso en los protocolos. [0078] Se realizó un protocolo similar al descrito anteriormente para la producción de implantes traqueales para la producción de implantes óseos y tendinosos, utilizando DSS, TnBP (tri-n-butil fosfato), Triton X-100, DNAsa y RNAsa como agentes descelularizantes realizados en condiciones bajo presión negativa. También se utilizaron muestras de control óseas y tendinosas perfundidas por agentes descelularizantes sin el uso de presión negativa y el tejido resultante se analizó histológicamente.

El protocolo utilizado se muestra a continuación en la tabla 2 y todos las etapas se realizaron bajo presión negativa de 0,2 kPa para el tejido perfundido utilizando los procedimientos de la invención o con presión ambiental para muestras de tejido de control. Entre cada etapa que se muestra en la tabla 2, se realizaron tres lavados de 15 minutos con agua desionizada.

Tabla 2

Tabla 2: Etapas del protocolo de descelularización para muestras de tejido óseo y tendinoso.

Después de la descelularización, se llevó a cabo la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) para establecer la presencia de cualquier material nuclear remanente. Se realizó la tinción con Picro-Sirius Red y Miller's Elastin (P&M) para evaluar el estado de las fibras de colágeno y elastina dentro del MEC. Se tomaron fotografías representativas de todas las muestras a través de un microscopio óptico con aumentos de 40x y 200x. Todos los portaobjetos de P&M se fotografiaron con luz polarizada y no polarizada para ayudar a enfatizar el estado de las fibras de colágeno y elastina. Las figuras 16 y 17 muestran los resultados de la tinción H&E del tejido tendinoso preparado según la invención (figura 16) y el tejido tendinoso de control (figura 17). La figura 18 muestra los resultados de la tinción H&E del tejido óseo según la invención.

La descelularización completa con eliminación de material nuclear del tejido tendinoso se logró en condiciones de presión negativa (figura 16) según los procedimientos de la invención, mientras que el material nuclear aún era visible en las muestras de tendón de control preparadas a presión ambiente (figura 17). Asimismo, se encontró que las muestras de tejido óseo preparadas de acuerdo con la invención bajo descelulización por presión negativa no tenían sustancialmente material nuclear presente, dejando lagunas visiblemente vacías, tal y como se muestra en las muestras teñidas con H&E de la figura 18.

Ejemplo 3

Producción de una laringe descelularizada según la invención

Se obtuvieron muestras de tejido de cadáveres humanos y se almacenaron a -20 °C en bolsas de plástico.

Se realizó un protocolo similar al descrito en el ejemplo 1 para las muestras de laringe utilizando ADNasa, ARNasa, Triton X-100 y desoxicolato de sodio (DCS) como agentes de descelularización. Todas las etapas del procedimiento se llevaron a cabo en condiciones de presión negativa de <1kPa usando un desecador y una bomba de vacío Telstar 2F-10 tal y como se describe para el ejemplo 1, a 1500 micras.

Los componentes del protocolo se describen a continuación y el protocolo se muestra a continuación en la tabla 3:

Preparación de la solución

Latrunculina B (Lat B) en forma de polvo -1 mg Lat B 395,51 g/mol.

A esto se le añadieron 25 ml de DMEM con alto contenido de glucosa que produjo una solución madre 100 ^jM, se dividió en alícuotas en 25 tubos de 1 ml y se almacenó en un congelador a -20°C.

1. 50 nM de latrunculina B (Lat B) en DMEM con alto contenido de glucosa (4500 mg de glucosa) - 50jl of Lat B en 100 ml de DMEM con alto contenido de glucosa (medio Eagle modificado de Dulbecco). 2. 0,25% Triton X y DCS al 0,25% - a 1 litro de PBS se le añadieron 2,5 g de solución de desoxicolato de sodio (DCS) y 2,5 ml de Triton X.

3. PBS - se añadieron tabletas de PBS -5 PBS a 1 litro de agua desionizada.

4. Solución salina equilibrada de Hanks con calcio y magnesio añadidos, de Sigma Aldrich H6648.

5. 0.6 de cloruro de potasio M (KCl) - a 1 litro de PBS se le añadieron 44,73 g de KCl

6. 1M de yoduro de potasio (KI) - a 1 litro de PBS se le añadieron 166 g de KI

7. Tampón de incubación - a 1 litro de PBS se le añadieron 0,5 g de cloruro de magnesio (MgCh), 0,055 g de cloruro de calcio (CaCh), se añadió ADNsa al volumen requerido de tampón de incubación inmediatamente antes de su uso.

8. ADNasa - se mezcló 1 vial de ADNasa que contenía 2000 ku de enzima en 1 litro de agua desionizada. Se colocaron 5 ml de agua en un vial de ADNasa y se dividieron en alícuotas en un tubo Eppdorff de 5 ml. Se usó 1 ml de la solución de enzima preparada para 200 ml de tampón de incubación.

9. ARNasa - se mezclaron 100 ml de tampón de incubación con 0,01 g de ARNasa.

Tabla 3

Los resultados del protocolo produjeron tejido laríngeo descelularizado con descelularización completa y eliminación de material nuclear.

Las realizaciones anteriores se describen únicamente a modo de ejemplo. Son posibles muchas variaciones sin apartarse del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones siguientes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para producir un implante a partir de tejido intersticial, conectivo o de soporte, el procedimiento comprende al menos una etapa de perfusión del tejido con al menos un medio de descelularización a presión negativa, y que comprende además al menos una etapa de lavado después de la etapa de perfusión o en cada etapa de perfusión, en el que todo el proceso de descelularización se realiza bajo una presión negativa de no más de 0,5 kPa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el medio o cada medio de descelularización comprende un detergente y/o una enzima.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el procedimiento comprende al menos una etapa de perfusión que comprende un medio de descelularización con detergente y al menos una etapa de perfusión que comprende un medio de descelularización de nucleasa.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende una primera etapa de perfusión que comprende un medio de descelularización con detergente, una segunda etapa de perfusión que comprende un medio de descelularización de nucleasa y una tercera etapa de perfusión que comprende un medio de descelularización de nucleasa.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tejido se selecciona de la tráquea, o de parte de la tráquea o de un tejido traqueal; de hueso; tendón; ligamento; hueso-tendón; cartílago; de laringe, parte de la laringe o tejido de la laringe; de un vaso sanguíneo grande o parte del mismo; y/o de tejido nervioso.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento se realiza bajo una presión negativa de no más de 0,2 kPa.