CN111905148A - 一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，包括如下步骤：以新鲜气管为原料，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h，随后置于含有0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton‑X 100的溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h，无菌蒸馏水洗涤后置于含2000kU/L Dnase‑Ⅰ和4000U/L RNase的1mol/L NaCl溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h，以溶解细胞核并降解DNA，以上操作均在‑0.96Bar的真空环境下进行，本研究采用真空辅助脱细胞方法能够促进DNA酶及RNA酶的渗透作用，加速并切底清除基质中细胞核物质及其他免疫原性成分，制备出无免疫原性的脱细胞细胞外基质，从而解决异体移植后免疫排异及严重炎症反应等并发症问题，同时，该方法还保留有适当的血管再生因子,有利于异体移植后诱导血管新生。

Description

一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法。
背景技术
气管病损可由狭窄、软化、感染、创伤、肿瘤等引起。长段气管(超过成人50％或儿童30％)病变是外科手术的棘手难题，目前行之有效的办法是气管替代治疗。气管替代治疗始于上世纪，因替代物难以获取、微血管网再生障碍以及需要大量使用免疫抑制剂，使得种种研究均以失败告终。组织工程气管具有构建更新、再生与修复功能的活气管替代物的潜能。
气管支架材料的结构及成分对种子细胞的黏附、生长、迁移以及组织功能重建起着至关重要的作用。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是组织工程重要组成部分，天然生物材料(如纤维蛋白、藻酸盐、同种异体脱细胞基质)具有较好的生物相容性、生物可降解性、以及可促进血管新生性能，是机体内细胞生长的微环境中最主要的成分，在调节细胞的生物学行为方面其重要作用。脱细胞ECM具有促进体内组织修复和再生功能，还可以指导和调节细胞(增殖和分化)反应，支持骨髓间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞分化及上皮细胞的增殖，是细胞生长较为理想的环境。
我们前期研究采用去污剂-联合酶法(detergent enzymatic method,DEM)脱细胞处理兔气管，能够有效去除气管抗原成分，保留与原生组织相似的主要结构特征，为细胞再生提供良好的微环境支持，但制备周期较长，需要9天时间，增加了体外操作污染风险。为进一步缩短脱细胞基质制备周期，我们采用真空脱细胞(vacuum-assisteddecellularization,VAD)方法制备组织工程气管天然ECM，有利于细胞黏附、生长，并能促进血管新生。VAD技术在不破坏气管ECM结构基础上，能够更有效清除DNA及MHC抗原物质。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，克服现有技术的不足。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现的：一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，包括如下操作步骤：
步骤一：以新鲜气管为原料，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h；
步骤二：将气管置于含有0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton-X 100的溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h；
步骤三：采用无菌蒸馏水洗涤气管后置于含2000kU/L Dnase-Ⅰ和4000U/L RNase的1mol/L NaCl溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h。
以上操作步骤均在-0.96Bar的真空环境下进行。
本发明的有益效果是：
1、本实验通过真空辅助脱细胞法，对新西兰兔气管进行脱细胞处理，通过组织学染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色和扫描电镜观察基质微观结构改变，DAPI染色、DNA定量分析、MHC-I/MHC-II免疫组化检测其免疫原性，鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测体内诱导血管新生性能，异体埋植术后HE染色、Masson三色染色、CD31免疫荧光、CD68免疫荧光评估基质的体内生物相容性、诱导血管新生性能及体内炎性反应，制备无免疫原性并具有诱导血管新生性能的脱细胞气管基质。本实验发现经过3天真空辅助脱细胞处理，可获取有与原生气管结构相似、无免疫原性、保留有诱导血管新生性能的兔脱细胞气管细胞外基质。与传统改良去污剂-联合酶法脱细胞处理相比，真空辅助脱细胞方法能够更加彻底清除细胞核物质及免疫原性成分，从而解决异体移植后免疫排异及严重的炎症反应等并发症问题，同时，该方法还保留有适当的血管再生因子(bFGF),有利于异体移植后诱导血管新生。
2、本发明发现，经过为期3天的真空辅助脱细胞处理，可制备与原生气管相似结构的脱细胞基质，其黏膜上皮细胞及软骨细胞核物质被完全去除、组织结构完整、无免疫原性，并且保留有良好的细胞黏附及诱导血管新生性能，为制备天然气管脱细胞细胞外基质提供了有效的操作方法，并有望作为3D生物打印的生物墨水来源之一成为市场化商品，为实现利用脱细胞细胞外基质生物墨水构建3D生物打印气管移植物提供研究基础和希望。
附图说明
图1为各组组织病理切片染色结果。
图2为MHC-I、MHC-II、b-FGF免疫组化染色结果。
图3为DAPI、b-FGF、Col-II免疫荧光染色结果。
图4为扫描电镜检查结果。
图5为细胞核计数和DNA定量分析结果。
图6为鸡胚绒毛尿囊膜实验结果。
图7为各组基质在大鼠网膜埋植过程及术后大体标本观察结果。
图8为术后2周HE染色及Masson三色染色结果。
图9为术后2周CD31、CD68免疫荧光染色结果。
图10为术后4周HE染色及Masson三色染色结果。
图11为术后4周CD31、CD68免疫荧光染色结果。
具体实施方式
下面结合附图1-11对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
步骤一：以新鲜气管为原料，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h；
步骤二：将气管置于含有0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton-X 100的溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h；
步骤三：采用无菌蒸馏水洗涤气管后置于含2000kU/L Dnase-Ⅰ和4000U/L RNase的1mol/L NaCl溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h。
以上操作步骤均在-0.96Bar的真空环境下进行。
下面结合具体实施方式对本发明进一步地详细说明。
图1为各组组织病理切片染色结果，A、E、I表示原生组，B、F、J表示VAD8h组，C、G、K表示VAD 16h组，D、H、L表示VAD 24h组；其中，A-D为HE染色，E-H为Masson三色染色，I-L为番红O固绿染色(20×)；结果显示，经过真空脱细胞处理，组织细胞外基质结构保持完整。
图2为MHC-I、MHC-II、b-FGF免疫组化染色结果，A-D为MHC-I免疫组化染色，E-H为MHC-II免疫组化染色，I-L为b-FGF免疫组化染色(20×)；结果显示，原生组、VAD 8h组、VAD16h组有较为明显的MHC-I、MHC-II表达，而VAD24h组无MHC-I、MHC-II表达；但VAD 24h组依然有少量b-FGF表达。
图3为DAPI、b-FGF、Col-II免疫荧光染色结果，A-D为DAPI免疫荧光染色，E-H为b-FGF免疫荧光染色，I-L为Col-II免疫荧光染色(20×)；结果显示，VAD 8h组、VAD 16h组细胞核较原生组明显减少，但依然有所残留，VAD 24h组细胞核近乎完全去除；不同组脱细胞处理的基质均匀明显的b-FGF、Col-II表达。
图4为扫描电镜检查结果，A-D为立面观察，E-H为内表面观察，I-L为外表面观察(5000×)；结果显示，经过VAD 24h处理，基质软骨陷凹中的细胞核完全去除，纤毛上皮完全去除，基底膜裸露，纤维组织排列未见明显改变。
图5为细胞核计数和DNA定量分析结果，其中A表示各组基质在DAPI染色40×光镜下细胞核数目，B表示各组基质DNA含量统计分析，结果显示，与其他组相比VAD 24h组基质细胞核数目及DNA含量明显降低。
图6为鸡胚绒毛尿囊膜实验结果，其中A-E分别表示VAD 24h基质在鸡胚绒毛尿囊膜种植当天、第1天、第2天、第3天、第4天周围血管新生情况，结果显示基质组织具有明显的血管新生；F表示在鸡胚绒毛尿囊膜种植第4天在光学显微镜下观察血管新生情况。
图7为各组基质在大鼠网膜埋植过程及术后大体标本观察结果，其中A-C表示脱细胞气管基质在大鼠网膜埋植的术中情况；D-E分别表示埋植前、术后2周、术后4周各组基质大体标本，从左往右依次为原生组、VAD 8h组、VAD 16h组、VAD 24h组。
图8为术后2周HE染色及Masson三色染色结果，其中A、E表示原生组，B、F表示VAD8h组，C、G表示VAD 16h组，D、H表示VAD 24h组(20×)。
图9为术后2周CD31、CD68免疫荧光染色结果，其中A、E表示原生组，B、F表示VAD 8h组，C、G表示VAD 16h组，D、H表示VAD 24h组(20×)。图A-D均有明显的CD31表达，表面脱细胞处理组织依然具有诱导血管内皮新生性能；图H没有CD68表达，表明VAD 24h组基质没有体内炎性反应。
图10为术后4周HE染色及Masson三色染色结果，其中A、E表示原生组，B、F表示VAD8h组，C、G表示VAD 16h组，D、H表示VAD 24h组(20×)。图D、H显示基质结构完整，软骨区未见炎性细胞浸润。
图11为术后4周CD31、CD68免疫荧光染色结果，其中A、E表示原生组，B、F表示VAD8h组，C、G表示VAD 16h组，D、H表示VAD 24h组(20×)。图A-D均有明显的CD31表达，表面脱细胞处理组织依然具有诱导血管内皮新生性能；图H没有CD68表达，表明VAD 24h组基质没有体内炎性反应。
实施例1
1.1实验动物选取与分组
实验采用健康成年新西兰兔40只，雌雄不限，体重2.5～3.0Kg。采用随机数字表法分4组，每组10只，A组为对照组，B组为VAD 8h脱细胞组，C组为VAD 16h脱细胞组，D组为VAD24h脱细胞组。
1.2真空辅助脱细胞气管基质的制备
将4组新西兰兔耳缘静脉注射空气法处死，采用标准外科操作获取整段气管，立即剥离气管外壁的结缔组织。将A组新鲜气管(对照组，n＝10)浸泡于含1％抗生素、抗真菌药物(AA)的4℃PBS缓冲液中待测。B、C、D组制备真空辅助脱细胞气管基质：在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h，随后置于0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton-X 100的溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速进行孵育(B组8h，C组16h，D组24h)，无菌蒸馏水洗涤后置于含2000kU/LDnase-Ⅰ和4000U/L RNase的1mol/L NaCl溶液中孵育(B组8h，C组16h，D组24h)，以溶解细胞核并降解DNA，以上操作均在-0.96bar的真空环境下进行，并置于60rpm转速的恒温摇床中。脱细胞处理结束后将各组样用无菌蒸馏水洗涤后保存在含1％AA的4℃PBS缓冲液中待测。
实施例2效果验证
方法：
1、组织学常规染色分析
将各组样本浸于4％多聚甲醛，室温下固定24h，石蜡包埋、切片(4μm)，通过光学显微镜观察切片在HE染色、Masson三色和番红O染色中的组织形态学变化。
2、免疫组化分析
通过免疫组化染色检测各组样本中MHC-I、MHC-II、b-FGF抗原的表达情况，将冰冻切片用5％BSA在37℃恒温摇床封闭60min，随后滴加稀释的一抗(MHC-Ⅰ、MHC-II、b-FGF，抗体浓度为1：200)在4℃过夜，次日滴加二抗室温反应10min，DAB显色后苏木素复染。
3、DAPI染色以及b-FGF、Col-II免疫荧光染色
DAPI与双链DNA结合，可发出较强的蓝色荧光，观察细胞核在脱细胞基质中的去除情况。将石蜡切片用0.1％胰酶消化20min，5％BSA在37℃恒温摇床封闭30min，随后滴加稀释的一抗(b-FGF、Col-II，抗体浓度为1：200)在4℃过夜，次日滴加荧光二抗室温避光孵育60min，DAPI避光孵育5min，随后在荧光显微镜下观察并采集图像。
4、扫描电镜观察
将4组气管样本于2.5％戊二醛溶液中固定24h，蒸馏水清洗3次，每次15min，梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷金，扫描电子显微镜观察分析。
5、细胞核计数与DNA定量分析
将四组DAPI染色组织在40×荧光镜下分别取3个不同区域计数区域内细胞核数目，并进行统计分析；取新鲜组织与脱细胞基质样本经液氮研磨干燥并各称重100mg，通过动物组织DNA分离试剂盒提取样本组织DNA，并在酶标仪下进行DNA定量分析。
6、血管生成性能检测
将鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验作为基质的血管生成性能的体内模型评估。将已受精的鸡蛋(30枚/组)置于37℃恒定湿度的环境下培育。在孵化的第3天，在尚未成熟时破一方形小口并分离发育中的CAM，制备假气室。随后用医用封膜将小口密封，并将鸡蛋放回孵化器中。在孵化的第8天，将3mm×3mm大小的各组气管样本，将浸泡有PBS的3mm×3mm大小的明胶海绵作为阴性对照。所有的程序都是在无菌条件下完成。随后连续4天每天对CAM进行检查并用照相设备进行拍照。
7、异体埋植实验及术后染色分析
将四组真空辅助兔脱细胞气管分别种植于4组新西兰兔腹部大网膜包裹，移植后2周、4周收获各组移植样本，4％多聚甲醛(pH7.4)固定24h后常规石蜡包埋。用切片机制片(厚度4μm)，脱蜡水化后，用HE染色、Masson观察术后各组基质结构变化；CD31免疫荧光观察诱导血管新生情况；CD68免疫荧光观察免疫及炎症反应。
结果：
2.1组织学常规染色分析
进行HE(图1A-D)、Masson三色(图1E-H)、番红O固绿(图1I-L)的组织学染色，在光镜下分别观察各组基质的上皮层、粘膜及粘膜下层、软骨环、纤维(网状及弹性纤维)、GAG等成份的形态学改变。
HE染色显示：原生气管(图1A)存在大量纤毛、结构清晰，VAD 8h(图1B)、VAD 16h(图1C)组气管基质通过脱细胞处理后黏膜上皮细胞基本被去除，部分软骨细胞核残留，VAD24h(图1D)组脱细胞气管基质上皮细胞及软骨细胞全部去除。Masson三色染色结果显示VAD8h(图1F)、VAD 16h(图1G)、VAD 24h(图1H)组较原生气管(图1E)相比胶原纤维未见明显变化。番红O固绿染色显示与原生气管(图1I)相比，VAD 8h(图1J)、VAD 16h(图1K)、VAD 24h(图1L)组基质中糖胺聚糖含量减少。如图1所示。
2.2免疫组化染色分析
原生气管中MHC-I(图2A)、MHC-II(图2E)类抗原强阳性表达，抗原表达在粘膜层、纤维外膜层及细胞膜表面(核成深蓝色)，VAD 8h、VAD 16h组的基质黏膜及黏膜下层MHC-I(图2B、C)、MHC-II(图2F、G)类抗原表达较原生气管组稍减弱，但依然有弱阳性表达，VAD24h组的MHC-I(图2D)、MHC-II(图2H)类抗原几乎无表达。b-FGF免疫组化显示，原生组气管b-FGF(图2I)强阳性表达，表达区域主要位于粘膜区，经过真空脱细胞处理，b-FGF(图2J-L)阳性表达有所降低，但依然有弱阳性表达。如图2所示。
2.3免疫荧光染色分析
荧光显微镜可见原生气管(图3A)组的软骨区及粘膜区均含有丰富的细胞核，VAD8h(图3B)、VAD 16h(图3C)组黏膜及黏膜下层较原生气管组细胞核明显减少，软骨区细胞核轻微下降，VAD 24h(图3D)组黏膜及黏膜下层细胞核近乎完全消失。b-FGF荧光显微镜观察显示，原生气管组(图3E)、VAD 8h组(图3F)、VAD 16h组(图3G)、VAD 24h组(图3H)均有b-FGF表达(绿色荧光部分)。Col-II荧光显微镜观察显示，原生气管组(图3I)、VAD 8h组(图3J)、VAD 16h组(图3K)、VAD 24h组(图3L)均有Col-II表达(红色荧光部分)。如图3所示。
2.4扫描电子显微镜观察
电镜下立面观可清晰观察到原生气管组(图4A)软骨区细胞核饱满，VAD 8h组(图4B)细胞核依然残留，VAD 16h组(图4C)细胞核逐渐清除，VAD 24h组(图4D)软骨陷凹内的细胞核完全去除。内表面显示原生气管组(图4E)黏膜层被大量纤毛覆盖，摆动较一致，VAD 8h组(图4F)、VAD 16h组(图4G)、VAD 24h组(图4H)基质纤毛上皮细胞均被去除，基质基底膜裸露，胶原纤维排列未见明显改变。外表面显示原生气管组(图4I)纤维结缔层较为致密，VAD8h组(图4J)、VAD 16h组(图4K)、VAD 24h组(图4L)外层结构未见破坏。如图4所示。
2.5细胞核计数与DNA定量分析。
细胞核计数分析显示，VAD 24h组(1.7±1.5)细胞核含量较原生组(169.7±34.9,P<0.01)显著降低，较VAD 8h组(37.7±4.2,P<0.05)、VAD 16h组(22.3±7.5,P<0.05)也有所降低。DNA定量分析显示，VAD 24h组(37.0±7.8ng/mg)DNA含量较原生组(568.1±1.8ng/mg,P<0.01)显著降低，且较VAD 8h组(133.7±52.4ng/mg,P<0.05)、VAD 16h组(65.2±8.5ng/mg,P<0.05)也有所降低。如图5所示。
2.6体内血管再生性能观察
肉眼观察VAD 24h组气管基质在CAM诱导血管新生显示：样本逐渐被尿囊血管环绕，并呈辐轮状向基质内放射性生长，有些新生血管在样本基质内形成闭合回路，说明VAD24h组气管基质能够积极诱导CAM血管网的构成及生长。如图6所示。
2.7异体埋植实验分析
异体动物实验结果显示：将原生组、VAD 8h组、VAD 16h组、VAD 24h组气管基质分别包埋在Wistar大鼠腹部网膜(图7A-C)，术后2周(图7E)、术后4周(图7F)观察大体标本，VAD 24h组气管基质周围无明显炎症反应，且有微血管网包裹。术后2周(图8)、4周(图10)HE、Masson三色染色结果显示：原生气管基质周围大量炎性细胞浸润，软骨区逐渐被破坏；VAD 8h组、VAD 16h组炎性浸润逐渐减少；VAD 24h组气管基质周围无明显炎症细胞浸润、软骨区结构完整。术后CD31免疫荧光可见原生气管组、VAD 8h组、VAD 16h组、VAD 24h组均有CD31表达，表达区主要集中在气管粘膜区；术后CD68免疫荧光标记可见原生气管、VAD 8h组巨噬细胞浸润较多，免疫反应强烈，VAD 16h组、VAD 24h组巨噬细胞浸润少，但基质周围以圆形或梭形细胞核为主，考虑为成纤维细胞等肉芽组织成分，如图9、11所示。
结论：采用本发明真空辅助脱细胞处理方法，仅需要3天的处理，就可获取有与原生气管结构、无免疫原性并保留有诱导血管新生性能的的兔脱细胞气管细胞外基质，具有制备周期短、成本低、污染风险小、效果佳等优点，可用于组织工程气管基质材料的研究，并有望进一步制备成脱细胞细胞外基质生物墨水，以便于3D生物打印组织工程气管的研究与应用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
步骤一：以新鲜气管为原料，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h；
步骤二：将气管置于含有0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton-X 100的溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h；
步骤三：采用无菌蒸馏水洗涤气管后置于含2000kU/L Dnase-Ⅰ和4000U/L RNase的1mol/L NaCl溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h。
以上操作步骤均在-0.96Bar的真空环境下进行。
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