CN111500663A - 一种水凝胶、制备方法及其三维细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种水凝胶、制备方法及其三维细胞培养方法,水凝胶的制备方法包括：步骤S1、制备猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱；步骤S2、冻干所述猪脱细胞真皮和/或所述猪脱细胞膀胱；步骤S3、研磨冻干的所述猪脱细胞真皮和/或冻干所述猪脱细胞膀胱成细颗粒；步骤S4、将所述细颗粒加入胃蛋白酶消化液中，搅拌48h‑72h，形成细胞外基质支架；以及步骤S5、调节所述胃蛋白酶消化液的PH值和盐浓度，使得所述胃蛋白酶灭活，所述细胞外基质支架中的蛋白质进行重组形成所述水凝胶。

Description

一种水凝胶、制备方法及其三维细胞培养方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，更具体的说是涉及一种基于脱细胞化制备的水凝胶及其制备方法，以及使用其进行三维细胞培养方法。
背景技术
长期以来，人们一直认为，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)不仅提供结构支持，而且还调节细胞生长、存活、成熟、分化和常驻细胞的发育。虽然ECM的许多组分可在不同的组织类型中保存，但每个组织都被认为具有独特的组成。
最近，从各种组织(包括皮肤、脂肪、心包、心脏、骨骼肌和肝脏)的ECM中衍生出来的ECM支架，在活体和体外实验中用作生物材料时被观察到有助于构建性重塑或形成适当部位的组织。在某些情况下，这些ECM支架对细胞行为具有组织特异性影响。
尽管ECM和常驻细胞之间存在独特的相互作用，但二维体外细胞研究通常评估涂层上的细胞行为，而涂层是由单个纯化蛋白或直接在聚苯乙烯培养皿组成。这些方法不能准确模拟细胞外微环境的复杂性，并可能会显著改变体外观察到的结果，使得体外研究很难在体内进行适当的转化。
在三维体外细胞实验中，使用ECM基质越来越普遍，因为这些基质被认为能够更好地模拟细胞自然环境，实现适当的细胞功能。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种通过机械分层脱细胞制备水凝胶的方法，和以此水凝胶为支架用于两种细胞类型(NIH 3T3成纤维细胞和C2C12成肌细胞)后续三维培养的培养方法。
本发明提供一种用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，所述制备方法包括：
步骤S1、制备猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱；
步骤S2、冻干所述猪脱细胞真皮和/或所述猪脱细胞膀胱；
步骤S3、研磨冻干的所述猪脱细胞真皮和/或冻干所述猪脱细胞膀胱成细颗粒；
步骤S4、将所述细颗粒加入胃蛋白酶消化液中，搅拌48h-72h，形成细胞外基质支架；以及
步骤S5、调节所述胃蛋白酶消化液的PH值和盐浓度，使得所述胃蛋白酶灭活，所述细胞外基质支架中的蛋白质进行重组形成所述水凝胶。
作为可选的技术方案，所述步骤S1中还包括：步骤S11：猪脱细胞真皮原材料处理，其包括：收集来自市场重量的成年猪的全厚皮肤切片；以及将全厚皮肤切片切成35cm×50cm的矩形切块，将矩形切块的皮肤皮下脂肪和结缔组织层与猪真皮层分离。
作为可选的技术方案，将所述猪真皮层在脱细胞处理前可储存至-80℃的冷冻室中，并在脱细胞处理前取出解冻至室温。
作为可选的技术方案，从成年猪的背部外侧侧面收集全厚皮肤切片。
作为可选的技术方案，所述步骤S1中还包括：步骤S12：对所述猪真皮层进行脱细胞处理制得所述猪脱细胞真皮，包括：步骤S121：将所述猪真皮层放入含有0.25％胰蛋白酶溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌所述猪真皮层6小时；步骤S122：移除0.25％胰蛋白酶溶液，将酶解处理后的猪真皮层依次置于含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤三次，每次洗涤时间15分钟；含有70％乙醇溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌10小时；含有3％双氧水溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌15分钟；含有重蒸水的锥形瓶中,在300转/分的轨道摇床上浸泡两次，每次浸泡时间为15分钟；步骤S123：将步骤122处理后的猪真皮层置于含有Triton X-100溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床搅拌16小时；移除锥形瓶中已经使用过的Triton X-100溶液，注入新鲜的Triton X-100溶液，在300转/分的轨道摇床上继续搅拌16小时；步骤S124：将步骤S123处理后的猪真皮层置于含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤三次，每次15分钟；步骤S125：将步骤S124处理后的猪真皮层放置于含有过氧乙酸溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上摇晃2小时，制得猪脱细胞真皮；步骤S126：将所述猪脱细胞真皮依次置于含有1X磷酸盐缓冲盐溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤两次，每次15分钟；含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤猪脱细胞真皮15分钟；步骤S127：将步骤S126处理后的猪脱细胞真皮储存在-80℃的冷冻室中，使用前，取出解冻至室温。
作为可选的技术方案，使用的所述0.25％胰蛋白酶溶液的体积为所述猪真皮层重量的20倍。
作为可选的技术方案，所述Triton X-100溶液为浓度1％Triton X-100和浓度0.26％EDTA溶液和0.69％Tris缓冲盐溶液混合形成。
作为可选的技术方案，所述步骤S1中还包括：步骤S13：猪脱细胞膀胱原材料处理，其包括：从市场中收集成年猪膀胱；切除猪膀胱的顶端和颈部；然后沿着结缔组织中线切割成一个矩形切块，所述矩形切块可以平放，且管腔侧朝下；使用硬塑料刮刀，拉伸所述矩形切块增大至原先面积的两倍；用剪刀置于拉伸后的所述矩形切块表面，沿着猪膀胱的中心线剪切；剥离肌肉和粘膜层，保留猪膀胱的基底膜和原皮膜。
作为可选的技术方案，所述猪膀胱的基底膜和原皮膜的厚度为100-150μm。
作为可选的技术方案，所述步骤S1中还包括：步骤S14：猪膀胱基底膜和原皮膜脱细胞处理制得猪脱细胞膀胱，所述猪膀胱基底膜和原皮膜脱细胞处理包括：步骤S141：所述猪膀胱基底膜和原皮膜置于含有过氧乙酸溶液的锥形烧瓶中，在300转/分的轨道摇床上放置2小时，制得猪脱细胞膀胱；步骤S142：在300转/分的轨道摇床上，依次使用1X磷酸盐缓冲盐溶液冲洗猪脱细胞膀胱两次，每次15分钟；使用重蒸水冲洗猪脱细胞膀胱两次，每次15分钟；以及步骤S143：将所述猪脱细胞膀胱储存在-80℃的冷冻室中。
作为可选的技术方案，使用的所述过氧乙酸溶液的体积为所述猪膀胱基底膜和原皮膜的重量的20倍。
作为可选的技术方案，所述过氧乙酸溶液为浓度为0.1％过氧乙酸溶液，浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中含有4％乙醇。
作为可选的技术方案，所述步骤S2包括，从-80℃冰箱中取出冷冻的所述猪脱细胞真皮和/或所述猪脱细胞膀胱，立即将所述猪脱细胞真皮和/或所述猪脱细胞膀胱放入冻干机中冻干；以及所述步骤S3包括，用40目筛网的研磨机将冻干后的猪脱细胞真皮和/或和猪脱细胞膀胱的研磨成细颗粒。
作为可选的技术方案，所述步骤S4包括：将所述细颗粒和浓度为1mg/mL胃蛋白酶消化液中，室温条件下磁力搅拌48-72小时，至所述细颗粒被完全消化，形成细胞外基质支架。
作为可选的技术方案，所述步骤S5包括：通过加入浓度0.1N的NaOH溶液中和所述胃蛋白酶消化液中的浓度0.1N的盐酸溶液以调节所述胃蛋白酶消化液的PH值，添加10X磷酸盐缓冲盐溶液或者1X磷酸盐缓冲盐溶液调节盐浓度，使得所述细胞外基质支架中的蛋白质进行重组形成所述水凝胶。
本发明还提供一种水凝胶，适用于细胞的三维培养，所述水凝胶为使用如上所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法制备。
本发明另外还提供一种水凝胶表面的三维细胞培养方法，所述三维细胞培养方法包括：
步骤S10：在无菌条件下，制备如权利要求16中所述的水凝胶；
步骤S20：植入NIH 3T3成纤维细胞系或C2C12成肌细胞系至所述水凝胶上，所述水凝胶上细胞的播种密度为5.0×105细胞/cm2；
步骤S30：放置16小时，待NIH 3T3成纤维细胞或C2C12成肌细胞充分附着在所述水凝胶表面，并添加与水凝胶齐平的培养基；以及
步骤S40：每间隔3天更换一次培养基，补充NIH 3T3成纤维细胞或C2C12成肌细胞所需要的营养素。
作为可选的技术方案，所述步骤S20还包括对所述水凝胶前处理，所述水凝胶前处理包括：将灭菌不锈钢环放入6孔板中，用吸管吸取0.5毫升新制备的水凝胶溶液至6孔板培养皿中覆盖所述灭菌不锈钢环；将6孔板培养皿放置在37℃的非湿润培养箱中1h，使水凝胶固化；取出固化的水凝胶待用。
作为可选的技术方案，所述步骤S20中还包括制备浓度为6mg/mL水凝胶和浓度为8mg/mL水凝胶。
作为可选的技术方案，所述三维细胞培养方法包括：
步骤S100：制备单细胞悬浮液；
步骤S200：制备如权利要求16中所述的水凝胶，并将所述水凝胶配制成预凝胶溶液；
步骤S300：均匀混合所述单细胞悬浮液和所述预凝胶溶液形成混合物，将所述混合物移入含有不锈钢环的培养皿中；
步骤S400：将含有所述混合物和不锈钢环的培养皿置于37℃的干热培养箱中45分钟，待水凝胶固化，除去围绕固化后的水凝胶的不锈钢环，并添加足够的新鲜介质来覆盖固化后的水凝胶；以及
步骤S500：每间隔3天更换一次培养基，以补充细胞活力所需要的营养素。
作为可选的技术方案，所述步骤S100：制备单细胞悬浮液包括：待分离细胞，从培养箱中取出细胞培养瓶，并在不干扰细胞的情况下吸入培养基；向烧瓶中加入2-3毫升加热的胰蛋白酶-EDTA混合溶液，并放入培养箱中5-15分钟；分离细胞后，向烧瓶中加入6-8毫升新鲜细胞培养基，形成细胞悬浮液；转移细胞悬浮液到离心管中，并取等分试样进行计数，并将细胞悬浮液调整至最终浓度1.0×106细胞/mL水凝胶。
作为可选的技术方案，所述细胞培养瓶中的细胞为NIH 3T3成纤维细胞或C2C12成肌细胞。
本发明提出了对猪真皮和猪膀胱机械分层脱细胞后制备水凝胶，制得的水凝胶可用于两种细胞类型(NIH 3T3成纤维细胞和C2C12成肌细胞)后续三维(3D)培养。虽然描述的水凝胶制备方法是针对特定的组织和细胞类型而设计的，但基本原理可用于多种其他组织类型的脱细胞和水凝胶制备，以及随后形成的3D细胞培养模型。
附图说明
图1是本发明猪脱细胞膀胱形成水凝胶的过程图片。
图2是本发明的水凝胶固化的图片。
具体实施方式
以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
本发明目的之一在于提供一种用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，所述制备方法包括：
步骤S1、制备猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱；
步骤S2、冻干所述猪脱细胞真皮和/或所述猪脱细胞膀胱；
步骤S3、研磨冻干的所述猪脱细胞真皮和/或冻干所述猪脱细胞膀胱成细颗粒；
步骤S4、将所述细颗粒加入胃蛋白酶消化液中，搅拌48h-72h，形成细胞外基质支架；以及
步骤S5、调节所述胃蛋白酶消化液的PH值，使得所述胃蛋白酶灭活，所述细胞外基质支架中的蛋白质分别进行重组形成所述水凝胶。
实施例1、准备猪真皮组织和猪膀胱组织脱细胞试剂
1)原材料收集，从当地屠宰场获得成年猪的猪全厚皮肤和膀胱。
2)脱细胞试剂包括，但不限于：三蒸馏水、重蒸水、过氧乙酸(英文缩写：PAA)溶液、0.25％胰蛋白酶溶液、3％双氧水(H2O2)溶液、70％乙醇溶液、Triton X-100溶液以及1X磷酸盐缓冲盐溶液(英文缩写：1XPBS)。
过氧乙酸(PAA)溶液为浓度0.1％过氧乙酸的乙醇溶液，乙醇的含量为4％，其按照表1中所示的各组分及其体积进行混合。
表1：基于猪真皮组织和/或猪膀胱组织的重量和对应的PAA溶液体积的配比
Figure BDA0002447279860000071
以表1中第一行中数据为例，量取1.33mL浓度15％过氧乙酸(PAA)溶液、8mL乙醇和192mL三蒸水，三者混合制得浓度0.1％过氧乙酸(PAA)溶液，其含有4％乙醇。
由表1中所示的数据可知，在以上述制备的过氧乙酸(PAA)溶液对猪真皮组织和/或猪膀胱组织处理时，过氧乙酸(PAA)溶液的体积大致上约为猪真皮组织和/或猪膀胱组织的重量的20倍。
0.25％胰蛋白酶溶液配置：在180毫升三蒸水中加入20毫升2.5％胰蛋白酶原液(2.5％胰蛋白酶原液为用10倍Hank’s平衡盐溶液配制)。
表2：基于猪真皮组织和/或猪膀胱组织的重量和0.25％胰蛋白酶溶液的体积配比
Figure BDA0002447279860000072
由表2中所示的数据可知，在以0.25％胰蛋白酶溶液对猪真皮组织和/或猪膀胱组织处理时，0.25％胰蛋白酶溶液的体积大致上约为猪真皮组织和/或猪膀胱组织的重量的20倍。
Triton X-100溶液配置：1％Triton X-100溶液加入含有0.26％EDTA和0.69％Tris缓冲盐溶液中。首先，称取56mg EDTA和138mg Tris，合并到量筒中，然后注入三蒸水至200mL；其次，将198mL含有EDTA和Tris的溶液转移到烧瓶中；最后，向烧瓶中添加2mLTriton X-100溶液形成混合溶液，边添加边用磁力搅拌棒制得Triton X-100溶液。
1×磷酸盐缓冲盐溶液(1×PBS)配置：混合浓度137mM NaCl溶液、2.7mM KCl溶液、10mM Na2HPO4溶液和2mM KH2PO4溶液于三蒸水中。
实施例2、准备猪脱细胞真皮和猪脱细胞膀胱的酶消化和水凝胶形成用试剂和设备
酶消化和水凝胶形成试剂，包括但不限于：猪胃蛋白酶、0.1N盐酸、0.1N氢氧化钠、10XPBS和1XPBS。
浓度1mg/mL胃蛋白酶配置，10毫克猪胃蛋白酶和10mL 0.1N HCl在容量为25mL锥形瓶中混合。
酶消化和水凝胶形成设备：冻干机、40目筛网、非加湿培养箱。
实施例3、猪脱细胞真皮的制备
首先，猪真皮组织机械分层预处理，获得猪真皮层；其次，对猪真皮层进行酶洗、水洗等，制备猪脱细胞真皮。对应于，步骤S1中还包括：步骤S11：猪脱细胞真皮原材料处理；和步骤S12：对所述猪真皮层进行脱细胞处理制得所述猪脱细胞真皮。
步骤S11：猪脱细胞真皮原材料处理包括：
收集来自市场重量的成年猪的全厚皮肤切片，全厚皮肤切片尤其是从背外侧侧面收集皮肤切片。
收集全厚皮肤切片切成35cm×50cm的矩形切块，将矩形切块上的皮肤皮下脂肪和结缔组织层与真皮层分离。或者，预脱层的皮肤(真皮层)可以直接从当地屠宰场购买。
其中，分离出的真皮层可以储存到-80℃的冷冻室中，在去细胞化处理前，取出解冻至室温。
步骤S12：对所述猪真皮层进行脱细胞处理制得所述猪脱细胞真皮，包括：
步骤S121：将猪真皮放入含有0.25％胰蛋白酶溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌6小时。其中，根据待处理的猪真皮层的重量加入大约为其重量20倍的体积的0.25％胰蛋白酶溶液。
步骤S122：经酶洗后6小时后，移除0.25％胰蛋白酶溶液，猪真皮层依次置于含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤三次，每次洗涤时间15分钟；含有70％乙醇溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌10小时；含有3％双氧水溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌15分钟；含有重蒸水的锥形瓶中,在300转/分的轨道摇床上浸泡两次，每次浸泡时间为15分钟；
步骤S123：继续用Triton X-100溶液处理猪真皮，猪真皮植入含有Triton X-100溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床搅拌16小时；移除锥形瓶中已经使用过的TritonX-100溶液，注入新鲜的Triton X-100溶液，在300转/分的轨道摇床上继续搅拌6小时；
步骤S124：随后，猪真皮层置于含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上，洗涤三次，每次15分钟。
步骤S125：将猪真皮放入含有PAA溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上，摇动2h，制得猪脱细胞真皮。
步骤S126：在300转/分的轨道摇床上，在含有1×PBS中冲洗猪脱细胞真皮两次，每次15分钟；然后在300转/分的轨道摇床上，再次用重蒸水冲洗猪脱细胞真皮15分钟；以及
步骤是27：将猪脱细胞真皮储存在-80℃的冷冻室中；使用前，取出解冻至室温。
实施例4、猪脱细胞膀胱的制备
首先，猪膀胱组织机械分层预处理，获得猪膀胱基底膜和原皮膜；其次，对猪膀胱基底膜和原皮膜进行化学洗、水洗等，制备猪脱细胞膀胱。对应于，步骤S1中还包括：所述步骤S1中还包括：步骤S13：猪脱细胞膀胱原材料处理；和步骤S14：猪膀胱基底膜和原皮膜脱细胞处理制得猪脱细胞膀胱。
步骤S13：猪脱细胞膀胱原材料处理，包括：
从市场中收集成年猪膀胱。
切除猪膀胱的顶端和颈部；然后沿着结缔组织中线切割成一个矩形切块，矩形切块可以平放，且管腔侧朝下。
使用硬塑料刮刀，拉伸所述矩形切块增大至原先面积的两倍；用剪刀置于拉伸后的所述矩形切块表面，沿着猪膀胱的中心线剪切；
用镊子小心地剥下肌肉和粘膜层，并丢弃，保留猪膀胱基底膜和原皮膜。其中，猪膀胱在机械分层过程中去除太多或太少的组织层，猪膀胱脱细胞方案的有效性可能会降低。因此，保留的猪膀胱基底膜和原皮膜的厚度约为100-150μm，且分层后猪膀胱基底膜和原皮膜应几乎但不完全透明。
最后，用重蒸水冲洗猪膀胱基底膜和原皮膜，去除其它异物，待用。
步骤S14：猪膀胱基底膜和原皮膜脱细胞处理制得猪脱细胞膀胱，包括：
步骤S141：猪膀胱基底膜和原皮膜放入含有PAA溶液的锥形烧瓶中，在300转/分的轨道摇床上放置2小时；PAA溶液的体积与猪膀胱基底膜和原皮膜的重量的配比参照表1。
步骤S142：在300转/分的轨道摇床上，依次使用1X磷酸盐缓冲盐溶液冲洗猪脱细胞膀胱两次，每次15分钟；使用重蒸水冲洗猪脱细胞膀胱两次，每次15分钟；
步骤S143：将所述猪脱细胞膀胱储存在-80℃的冷冻室中。
实施例4、实施例3中的猪脱细胞真皮和/或实施例4中的猪脱细胞膀胱经冻干、酶消化、重组形成水凝胶。
冻干、酶消化、重组形成水凝胶的过程对应上述步骤S2至步骤S5，具体包括：
首先，从-80℃冰箱中取出冷冻的猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱，并立即将其放入冻干机中。为了快速冷冻和冻干猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱，将猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱铺在不粘铝箔上，增大表面积，加快冻干干燥过程
其次，通过切割猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱最厚的部分，确保猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱完全无水。其中，对于非冻干样品(猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱)会使收集猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱变得困难，且水分会阻止上述基质自由流过过滤器并进入收集室。
第三、确认猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱冻干后，用40目筛网的研磨机将冻干后的猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱分别或者一并研磨成细颗粒。其中，使用40μm筛网研磨机，可以提供足够小的上述基质颗粒，便于消化。而较大的网孔可能导致上述基质颗粒完全消化的潜伏期更长。
第四、猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱的胃蛋白酶消化液，形成10mL细胞外基质消化液。将100毫克上述研磨的细颗粒与10毫克猪胃蛋白酶((最终浓度1mg/mL胃蛋白酶)和10mL 0.1N HCl在25mL锥形瓶中混合，在室温下，使用磁性搅拌棒将部件彻底混合48-72h，直到完全消化；形成10mL的细胞外基质消化液。其中，在锥形瓶的顶部保留一块帕拉胶片，以防止溶液蒸发。另外，上述细颗粒在胃蛋白酶和HCl中消化超过72小时，已被证明对水凝胶的凝胶化和生物活性都有负面影响。
在一较佳的实施例中，在组织完全消化后形成10mL的细胞外基质(ECM)溶液，将10mL的细胞外基质溶液分成10个等分，将每10个1mL的细胞外基质溶液分别放入10个1.5mL微量离心管中，并在-80℃下冷冻直至使用。通过分装，将猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱的消化保持在最少的冻融循环次数。这是由于大量的冻融循环对水凝胶的生物活性存在负面影响。
此外，胃蛋白酶盐酸溶液消除处理后，根据收集到的细胞外基质支架的产量，调整必要的胃蛋白酶和盐酸用量。
第五、制备水凝胶。将上述ECM消化液在冰上或者RT出解冻。
通过添加0.1N NaOH(1/10消化体积)中和ECM消化液中盐酸，调节ECM消化液pH值，以及通过添加10×PBS(1/9消化体积)调整盐浓度，并将样品稀释至所需的最终水凝胶浓度。使用1×PBS(见表3)，在制备水凝胶时，保持ECM在冰上消化，直到立即使用。在新的1.5毫升微型离心管中轻轻地上下移动移液管混合成分，直到ECM消化液进入溶液。
表3、四种浓度下形成水凝胶所需成分的体积，其中，所有水凝胶均使用起始浓度为10mg/mL的凝胶制备，水凝胶最终体积为0.5毫升。
水凝胶起始浓度/(mg/mL) 10 10 10 10
水凝胶最终浓度/(mg/mL) 2 4 6 6
水凝胶最终体积/mL 0.5 0.5 0.5 0.5
水凝胶消化液体积/μL 100 200 300 400
0.1N NaOH/μL 10 20 30 40
10xPBS/μL 11.11 22.22 33.33 44.44
10xPBS/μL 378.89 257.78 136.67 15.56
将灭菌不锈钢环放入6孔板培养皿中，用吸管吸取0.5毫升新制备的水凝胶溶液，同时避免形成气泡。将6孔板培养皿小心地放置在37℃的非湿润培养箱中1h；其中，在将6孔板培养皿移入培养箱之前去除所有气泡。
上述混合水凝胶成分时，很难防止气泡形成。可通过缓慢吸取溶液预先排出气泡形成，将移液管尖端保持在液体中。一旦尖端中有空气，气泡就会形成，很难去除。或者，用大容量的微量移液管施加气压。在制备水凝胶溶液并用移液管输送到金属环中之后，可以通过将大量空气直接引导到气泡中来去除气泡。气压增加的表面张力应该可以消除任何残留的气泡。
从培养箱中取出水凝胶，确保水凝胶固化(如图2所示)。使用非加湿室培养箱将有助于缩短水凝胶凝胶时间；而加湿培养箱增加水分，使水凝胶中的天然组分的能力形成。因此，建议使用干热制备水凝胶。
图1为猪脱细胞膀胱(UBM)和对应的猪脱细胞膀胱的细胞外基质支架重组成水凝胶的过程图片，包括四个阶段：
(1)猪膀胱组织脱细胞以去除遗传物质，同时保存猪膀胱基底膜和原皮膜细胞中的细胞外基质；(2)冻干猪脱细胞膀胱组织并碾磨成细颗粒；(3)用胃蛋白酶和HCl消化细颗粒形成细胞外基板支架；(4)通过调节pH和盐浓度，细胞外基板支架进行物理交联或者重组(37℃)形成水凝胶。
实施例5、水凝胶表面的三维细胞培养
步骤S10：在无菌条件下，制备两种浓度6和8mg/ml的水凝胶各500μl；其中，选择这些浓度是由于在这些浓度之间观察到水凝胶具有不同的机械和结构特性。
步骤S20：选择一个细胞系水凝胶上：植入NIH 3T3成纤维细胞系或C2C12成肌细胞系在所述水凝胶的表面。其中，C2C12成肌细胞可以在生长培养基和融合培养基中培养。将C2C12成肌细胞用含有2％马血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM融合培养基，在培养基7天内培养2天后分化为肌管。目前发现C2C12成肌细胞仅在浓度6mg/ml的水凝胶下使用。对于细胞培养应用，重要的是，水凝胶能够保持水合介质，以防止凝胶干燥。
另外，向水凝胶表面添加1ml细胞悬浮液，细胞在水凝胶上的播种密度为5.0×105细胞/cm2。
步骤S30：让入NIH 3T3成纤维细胞系或C2C12成肌细胞系在16小时内充分附着在水凝胶表面；一旦细胞附着，移除水凝胶周围的金属环，并添加足够的新鲜介质覆盖水凝胶。
步骤S40：每间隔3天更换一次培养基，以补充细胞活力所必需的营养素。
另外，可以使用活/死检测试剂盒分析细胞在水凝胶上3T3成纤维细胞和c2c12成肌细胞的存活率。
另外，通过将水凝胶固定在10％中性缓冲福尔马林中，分成两半暴露横截面并嵌入paraf fin中，可以实现凝胶内部和顶部细胞的可视化。然后切片石蜡块并用Masson的三色图染色。
实施例6、水凝胶内部的三维细胞培养
步骤S100：制备单细胞悬浮液；包括：待分离细胞，从培养箱中取出细胞培养瓶，并在不干扰细胞的情况下吸入培养基；向烧瓶中加入2-3毫升加热的胰蛋白酶-EDTA溶液，并放入培养箱中5-15分钟；分离细胞后，向烧瓶中加入6-8毫升新鲜细胞培养基；将细胞悬液转移到离心管中，并取等分试样进行计数，例如使用血细胞仪；传代培养时，用移液管以2.25×105至3.75×105细胞/75cm2的接种密度将NIH 3T3成纤维细胞和1.5×105至1×106细胞/75cm2的细胞悬液移入新的烧瓶中，加入适量的新鲜细胞培养基，置于细胞培养皿中，37℃恒温箱恒温放置。
其中，待分离细胞建议体积基于75cm2烧瓶中的培养物。细胞每周至少分裂两次，80％或更少的重叠。重要的是不要让细胞融合，因为这可能导致接触抑制。每2-3天更换一次培养基。细胞可以冷冻保存在补充5％(v/v)二甲基亚砜的完整生长培养基中，并保存在液氮中。
步骤S200：制备如权利要求16中所述的水凝胶，并将所述水凝胶配制成预凝胶溶液；
步骤S300：均匀混合所述单细胞悬浮液和所述预凝胶溶液形成混合物，将所述混合物移入含有不锈钢环的培养皿中；
步骤S400：将含有所述混合物和不锈钢环的培养皿置于37℃的干热培养箱中45分钟，待水凝胶固化，除去围绕固化后的水凝胶的不锈钢环，并添加足够的新鲜介质来覆盖固化后的水凝胶；以及
步骤S500：每间隔3天更换一次培养基，以补充细胞活力所需要的营养素。
在一较佳的实施方式中，制备单细胞悬浮液后还包括计算单细胞悬浮液中的细胞数(例如，使用血细胞仪)，并将细胞悬浮液调整至最终浓度1.0×106细胞/ml水凝胶。“凝胶内培养”的细胞用含细胞培养基取代1×PBS组分的体积。例如：在8mg/ml水凝胶中，应在15.56μl的细胞培养基中重新悬浮5.0×105个细胞。
在一较佳的实施方式中，所述细胞的三维培养中还包括播种环，所述播种环设置所述培养皿中，播种环为奥氏体不锈钢，外径2.0cm，内径1.38cm，环的高度为1.3厘米。
综上，本发明提出了对猪真皮和猪膀胱机械分层脱细胞后制备水凝胶，制得的水凝胶可用于两种细胞类型(NIH 3T3成纤维细胞和C2C12成肌细胞)后续三维(3D)培养，可以维持肿瘤组织的异质性的同时，保持肿瘤微环境特征不被破坏。。虽然描述的水凝胶制备方法是针对特定的组织和细胞类型而设计的，但基本原理可用于多种其他组织类型的脱细胞和水凝胶制备，以及随后形成的3D细胞培养模型。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (22)

1.一种用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤S1、制备猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱；
步骤S2、冻干所述猪脱细胞真皮和/或所述猪脱细胞膀胱；
步骤S3、研磨冻干的所述猪脱细胞真皮和/或冻干所述猪脱细胞膀胱成细颗粒；
步骤S4、将所述细颗粒加入胃蛋白酶消化液中，搅拌48h-72h，形成细胞外基质支架；以及
步骤S5、调节所述胃蛋白酶消化液的PH值和盐浓度，使得所述胃蛋白酶灭活，所述细胞外基质支架中的蛋白质进行重组形成所述水凝胶。
2.根据权利要求1所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中还包括：步骤S11：猪脱细胞真皮原材料处理，其包括：
收集来自市场重量的成年猪的全厚皮肤切片；以及
将全厚皮肤切片切成35cm×50cm的矩形切块，将矩形切块的皮肤皮下脂肪和结缔组织层与猪真皮层分离。
3.根据权利要求2所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，将所述猪真皮层在脱细胞处理前可储存至-80℃的冷冻室中，并在脱细胞处理前取出解冻至室温。
4.根据权利要求2所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，从成年猪的背部外侧侧面收集全厚皮肤切片。
5.根据权利要求2所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中还包括：步骤S12：对所述猪真皮层进行脱细胞处理制得所述猪脱细胞真皮，包括：
步骤S121：将所述猪真皮层放入含有0.25％胰蛋白酶溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌所述猪真皮层6小时；
步骤S122：移除0.25％胰蛋白酶溶液，将酶解处理后的猪真皮层依次置于含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤三次，每次洗涤时间15分钟；含有70％乙醇溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌10小时；含有3％双氧水溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌15分钟；含有重蒸水的锥形瓶中,在300转/分的轨道摇床上浸泡两次，每次浸泡时间为15分钟；
步骤S123：将步骤122处理后的猪真皮层置于含有Triton X-100溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床搅拌16小时；移除锥形瓶中已经使用过的Triton X-100溶液，注入新鲜的Triton X-100溶液，在300转/分的轨道摇床上继续搅拌16小时；
步骤S124：将步骤S123处理后的猪真皮层置于含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤三次，每次15分钟；
步骤S125：将步骤S124处理后的猪真皮层放置于含有过氧乙酸溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上摇晃2小时，制得猪脱细胞真皮；
步骤S126：将所述猪脱细胞真皮依次置于含有1X磷酸盐缓冲盐溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤两次，每次15分钟；含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤猪脱细胞真皮15分钟；
步骤S127：将步骤S126处理后的猪脱细胞真皮储存在-80℃的冷冻室中，使用前，取出解冻至室温。
6.根据权利要求5所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，使用的所述0.25％胰蛋白酶溶液的体积为所述猪真皮层重量的20倍。
7.根据权利要求5所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述Triton X-100溶液为浓度1％Triton X-100和浓度0.26％EDTA溶液和0.69％Tris缓冲盐溶液混合形成。
8.根据权利要求1所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中还包括：步骤S13：猪脱细胞膀胱原材料处理，其包括：
从市场中收集成年猪膀胱；
切除猪膀胱的顶端和颈部；然后沿着结缔组织中线切割成一个矩形切块，所述矩形切块可以平放，且管腔侧朝下；使用硬塑料刮刀，拉伸所述矩形切块增大至原先面积的两倍；用剪刀置于拉伸后的所述矩形切块表面，沿着猪膀胱的中心线剪切；剥离肌肉和粘膜层，保留猪膀胱的基底膜和原皮膜。
9.根据权利要求8所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述猪膀胱的基底膜和原皮膜的厚度为100-150μm。
10.根据权利要求8所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中还包括：步骤S14：猪膀胱基底膜和原皮膜脱细胞处理制得猪脱细胞膀胱，所述猪膀胱基底膜和原皮膜脱细胞处理包括：
步骤S141：所述猪膀胱基底膜和原皮膜置于含有过氧乙酸溶液的锥形烧瓶中，在300转/分的轨道摇床上放置2小时，制得猪脱细胞膀胱；
步骤S142：在300转/分的轨道摇床上，依次使用1X磷酸盐缓冲盐溶液冲洗猪脱细胞膀胱两次，每次15分钟；使用重蒸水冲洗猪脱细胞膀胱两次，每次15分钟；以及
步骤S143：将所述猪脱细胞膀胱储存在-80℃的冷冻室中。
11.根据权利要求10所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，使用的所述过氧乙酸溶液的体积为所述猪膀胱基底膜和原皮膜的重量的20倍。
12.根据权利要求5或者10所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述过氧乙酸溶液为浓度为0.1％过氧乙酸溶液，浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中含有4％乙醇。
13.根据权利要求1所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，
所述步骤S2包括，从-80℃冰箱中取出冷冻的所述猪脱细胞真皮和/或所述猪脱细胞膀胱，立即将所述猪脱细胞真皮和/或所述猪脱细胞膀胱放入冻干机中冻干；以及
所述步骤S3包括，用40目筛网的研磨机将冻干后的猪脱细胞真皮和/或和猪脱细胞膀胱的研磨成细颗粒。
14.根据权利要求13所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，
所述步骤S4包括：将所述细颗粒和浓度为1mg/mL胃蛋白酶消化液中，室温条件下磁力搅拌48-72小时，至所述细颗粒被完全消化，形成细胞外基质支架。
15.根据权利要求14所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，
所述步骤S5包括：通过加入浓度0.1N的NaOH溶液中和所述胃蛋白酶消化液中的浓度0.1N的盐酸溶液以调节所述胃蛋白酶消化液的PH值，添加10X磷酸盐缓冲盐溶液或者1X磷酸盐缓冲盐溶液调节盐浓度，使得所述细胞外基质支架中的蛋白质进行重组形成所述水凝胶。
16.一种水凝胶，适用于细胞的三维培养，其特征在于，所述水凝胶为使用权利要求1-15中任意一项所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法制备。
17.一种水凝胶表面的三维细胞培养方法，其特征在于，所述三维细胞培养方法包括：
步骤S10：在无菌条件下，制备如权利要求16中所述的水凝胶；
步骤S20：植入NIH 3T3成纤维细胞系或C2C12成肌细胞系至所述水凝胶上，所述水凝胶上细胞的播种密度为5.0×105细胞/cm2；
步骤S30：放置16小时，待NIH 3T3成纤维细胞或C2C12成肌细胞充分附着在所述水凝胶表面，并添加与水凝胶齐平的培养基；以及
步骤S40：每间隔3天更换一次培养基，补充NIH 3T3成纤维细胞或C2C12成肌细胞所需要的营养素。
18.根据权利要求17所述水凝胶表面的三维细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S20还包括对所述水凝胶前处理，所述水凝胶前处理包括：将灭菌不锈钢环放入6孔板中，用吸管吸取0.5毫升新制备的水凝胶溶液至6孔板培养皿中覆盖所述灭菌不锈钢环；将6孔板培养皿放置在37℃的非湿润培养箱中1 h，使水凝胶固化；取出固化的水凝胶待用。
19.根据权利要求17所述三维细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S20中还包括制备浓度为6mg/mL水凝胶和浓度为8mg/mL水凝胶。
20.一种水凝胶内的三维细胞培养方法，其特征在于，所述三维细胞培养方法包括：
步骤S100：制备单细胞悬浮液；
步骤S200：制备如权利要求16中所述的水凝胶，并将所述水凝胶配制成预凝胶溶液；
步骤S300：均匀混合所述单细胞悬浮液和所述预凝胶溶液形成混合物，将所述混合物移入含有不锈钢环的培养皿中；
步骤S400：将含有所述混合物和不锈钢环的培养皿置于37℃的干热培养箱中45分钟，待水凝胶固化，除去围绕固化后的水凝胶的不锈钢环，并添加足够的新鲜介质来覆盖固化后的水凝胶；以及
步骤S500：每间隔3天更换一次培养基，以补充细胞活力所需要的营养素。
21.根据权利要求19所述水凝胶内的三维细胞培养方法，其特征在于，
所述步骤S100：制备单细胞悬浮液包括：
待分离细胞，从培养箱中取出细胞培养瓶，并在不干扰细胞的情况下吸入培养基；
向烧瓶中加入2-3毫升加热的胰蛋白酶-EDTA混合溶液，并放入培养箱中5-15分钟；
分离细胞后，向烧瓶中加入6-8毫升新鲜细胞培养基，形成细胞悬浮液；
转移细胞悬浮液到离心管中，并取等分试样进行计数，并将细胞悬浮液调整至最终浓度1.0×106细胞/mL水凝胶。
22.根据权利要求20所述水凝胶内的三维细胞培养方法，其特征在于，所述细胞培养瓶中的细胞为NIH 3T3成纤维细胞或C2C12成肌细胞。
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