CN111603610B - 一种脂肪组织细胞外基质的制备方法 - Google Patents
一种脂肪组织细胞外基质的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种脂肪组织细胞外基质的制备方法，属于组织工程与再生医学、临床医学技术领域。其包括如下步骤：取新鲜脂肪组织，进行预处理，再进行冻融处理；将冻融处理后的脂肪组织进行破碎，得到破碎后的脂肪组织；再依次经过高渗氯化钠溶液清洗、第一次无菌去离子水洗涤、TritonX‑100溶液清洗、第二次无菌去离子水洗涤、异丙醇析出油脂、第三次无菌去离子水洗涤和酒精洗脱RNA，即得到脂肪组织细胞外基质。本发明在脱细胞过程中不需酶的参与，一是降低制备成本，二是减少异种属抗原成分导致排斥反应的风险，三是能够保留细胞外基质的天然结构和活性因子，四是实现更有效的脱细胞结果，五是体内成脂能力更强。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂肪组织细胞外基质的制备方法，属于组织工程与再生医学、临床医学技术领域。
背景技术
外伤、肿瘤、先天畸形以及衰老等造成的组织缺损是整形外科工作的重点,自体组织移植和组织工程材料移植是修复组织缺损的两种主要策略。虽然自体组织移植能获得理想的治疗效果，但付出的代价却是大面积手术创伤和供区遗留瘢痕，甚至可能发生较为严重的并发症。而组织工程材料移植具有手术操作简单、创伤小等特点，在组织移植中具有独特的优势。组织工程的三要素分别是组织工程材料、种子细胞和生长因子。其中，支架材料是组织工程领域的核心课题之一，能够为种子细胞提供结构支持和生物力学支撑，与信号分子共同调节细胞的粘附、迁移、增殖、分化等生物学行为，成为种子细胞和生长因子之间的重要桥梁。天然支架材料具有良好的生物相容性，可以通过分泌或募集生长因子与种子细胞及其周围微环境产生动态的相互作用，从而促进细胞的粘附和增殖能力，甚至诱导种子细胞向特定细胞类型进行分化。
脂肪组织细胞外基质作为人体组织中的重要组成部分，成为学者们关注的重点。脂肪组织来源广泛、获取容易，为制备细胞外基质提供了丰富的原材料。脂肪组织细胞外基质由胶原纤维、弹性纤维等纤维成分以及糖胺聚糖、可溶性生长因子等构成，可以为细胞提供结构支撑和信号传递。有研究表明，特定组织来源的细胞外基质更适合于其自身来源的细胞生长。而脂肪组织细胞外基质可能会诱导脂肪干细胞成脂分化形成脂肪细胞，从而可以更有效的维持组织容量，有望将组织工程材料转化为自身组织的一部分。因此，在以组织容量填充为应用目标的前提下，脂肪组织成为制备细胞外基质的首要选择。
脱细胞技术是制备细胞外基质的关键，其核心是通过物理、化学或生物酶等方法去除天然组织内的固有细胞和遗传物质并降低或去除材料的免疫原性。目前，已经成功利用脱细胞技术制备出人工真皮、气管、神经、小肠黏膜、韧带、肺、肾、心脏包膜、脂肪组织等多种组织和器官的脱细胞支架材料。但脱细胞技术在去除细胞成分和遗传物质的同时，也不可避免会对细胞外基质造成损伤。如何才能在有效脱细胞的同时保留细胞外基质上的活性成分和生长因子，成为组织工程学的研究热点。目前脱细胞的方法主要有物理法、化学法、生物酶法和联合法。物理法主要包括冻融法、高水压法和超临界二氧化碳法。虽然物理法相对温和，能够保留细胞外基质的有效成分，对物理结构损伤较小，但单独使用不能完全去除细胞成分和遗传物质，需要与其他方法合用。化学法是通过溶解细胞膜的磷脂成分而达到脱细胞效果，常用的化学试剂包括十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate，SD)和Triton X-100等。化学试剂可以实现较强的脱细胞作用，但容易残留或凝集在细胞外基质材料上，为了减少残留物的影响，需要额外增加洗涤时间，不仅会降低脱细胞效率，而且在反复洗涤过程中糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAG)和生长因子的含量也会随之减少，从而影响细胞的粘附和生长能力。生物酶法是利用酶的水解作用去除细胞成分或切断细胞与细胞外基质之间连接的肽键。常用的生物酶主要有胰蛋白酶、核酸酶和脂肪酶。胰蛋白酶可以直接用于去除细胞外基质上的细胞成分，并且作用效果会随作用时间而增加，但长时间处于胰蛋白酶的环境下会降低细胞外基质中弹性蛋白和GAG含量。核酸酶常与化学试剂SDS或SD联合使用，有助于在化学试剂破坏细胞膜释放出遗传物质后，进一步水解细胞核物质,但核酸酶会对细胞外基质的表面结构造成损伤，影响细胞的粘附和增殖。
鉴于每种脱细胞方法各有其优势和劣势，大多数学者选择将物理、化学或生物酶法进行综合，根据预期使用目标选择合适的方法和作用时间，以利于保留更多天然成分。通常首先使用物理法(如冻融等)有利于保持细胞外基质的微观结构，然后再使用一定浓度的化学试剂和/或生物酶，这样的脱细胞顺序有利于保留细胞外基质与不同生物活性分子和信号位点相结合的能力。加拿大学者Flynn于2009年提出脂肪组织细胞外基质的制备方法，这种方法需要使用多种生物酶，如胰蛋白酶、核酸酶和脂肪酶，生物酶的使用增加了该方法的局限性。一方面，生物酶价格昂贵，极大的提高了制备成本；另一方面，由于以上酶类均为牛或猪等异种属来源，这在制备人脂肪组织细胞外基质的过程中，提高了引入异种抗原的风险。
鉴于此，有必要提供一种新的脂肪组织细胞外基质制备方法，以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种脂肪组织细胞外基质的制备方法。本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法，在脱细胞过程中不需酶的参与，一是极大的降低制备成本，二是减少异种属抗原成分导致排斥反应的风险，三是能够保留细胞外基质的天然结构和活性因子，四是可以实现更有效的脱细胞结果，五是体内成脂能力更强。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种脂肪组织细胞外基质的制备方法，包括如下步骤：
取新鲜脂肪组织，进行预处理，再进行冻融处理；
将上述冻融处理后的脂肪组织进行破碎，得到破碎后的脂肪组织；
将上述破碎后的脂肪组织，依次经过高渗氯化钠溶液清洗、第一次无菌去离子水洗涤、Triton X-100溶液清洗、第二次无菌去离子水洗涤、异丙醇析出油脂、第三次无菌去离子水洗涤和酒精洗脱RNA，即得到脂肪组织细胞外基质。
本发明的原理是：
针对现有技术的Flynn法制备脂肪组织细胞外基质存在的各种问题，本申请提出一种以物理方法为主，不需使用生物酶的制备方法。具体是：
本发明中，新鲜的脂肪组织来源于中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院，乳房整形与美容中心进行脂肪抽吸术的健康成年女性，经患者知情同意后使用，并经过医院伦理委员会批准。获取的新鲜脂肪组织于无菌条件下保存，置于4℃恒温保存箱内，2小时内送到实验室进行后续的预处理。
采用人的脂肪组织制备细胞外基质，一是产物表面不存在异种属抗原，有利于减少免疫排斥反应，也有助于避免种属间病毒的传播。二是脂肪抽吸术后会产生大量脂肪组织，中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院每年有超过2000例脂肪吸脂手术，每台手术会产生50ml-4000ml脂肪组织与肿胀液的混合物，预处理后会获得至少20ml-2000ml的脂肪组织。通常吸脂术后的脂肪组织会被当作医疗垃圾处理掉，处理这些脂肪组织会消耗大量的人力、物力和财力。而本发明采用废弃的脂肪组织作为原材料，对医疗垃圾进行再利用，有利于节约成本和环境保护。
本发明还与Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质进行对比，分别从脱细胞效力、吸水率、60μm-200μm直径孔隙占比、DNA残留量方面对比，以及体内移植后成脂能力方面进行考察，得到的结论如下：
1、本发明的制备方法，可以实现有效的脱细胞，同时保留胶原成分。
2、吸水率方面，本发明制备的脂肪组织细胞外基质吸水率与Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质没有差异；60μm-200μm直径孔隙占比方面，本发明制备的脂肪组织细胞外基质较Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质，有明显提高；DNA残留量方面，本发明制备的脂肪组织细胞外基质较Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质，有明显降低；体内移植后成脂能力方面，本发明制备的脂肪组织细胞外基质较Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质，有明显提高。
本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法的有益效果是：
1、本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法，在脱细胞过程中不需生物酶的参与，一是极大的降低制备成本，二是减少异种属抗原成分导致排斥反应的风险，三是能够保留细胞外基质的天然结构和活性因子，四是可以实现更有效的脱细胞结果，五是体内成脂能力更强。
2、本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法，通过物理方法对脂肪组织进行破碎，就可以达到分离细胞和细胞外基质和破坏脂肪细胞的效果，操作更加方便快捷，成本更加低廉，具有广阔的应用前景。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述预处理的方法是：取新鲜的脂肪组织，静置10min-15min，弃去油滴、血液，加入PBS缓冲液清洗3次，即得到预处理后的脂肪组织。
采用上述进一步的有益效果是：经过预处理，可以去除残存的油滴、血液和肿胀液。一般而言，PBS缓冲液的加入体积，与弃去油滴、血液和肿胀液后的脂肪组织的体积相同。
进一步，所述冻融处理的方法是：将预处理后的脂肪组织于-80℃冷冻2h后，于37℃融化；共进行上述冻融过程3次，即得到冻融处理后的脂肪组织。
采用上述进一步的有益效果是：对预处理后的脂肪组织进行冻融循环,可以在细胞内形成冰晶并快速融化，利用细胞内的冰晶破碎脂肪细胞。采用冻融循环对细胞外基质的微观结构、机械强度、GAG含量和胶原蛋白含量等损伤较小。
进一步，所述破碎后的脂肪组织呈乳糜状，所述破碎的方法为研钵法、捣碎法、振荡法、搅拌法、匀浆法、温差法、压差法、超声法和注射器法中的任意一种或两种以上的组合。
采用上述进一步的有益效果是：脂肪组织呈乳糜状，更有利于后续的处理。破碎可以采用多种方式，只要能达到本发明所需要的组织形态，均能达到同样的技术效果。其中，研钵法，是采用研钵进行研磨，来破碎脂肪组织。捣碎法，一般是指使用捣碎机，来破碎脂肪组织。振荡法和搅拌法是借助振荡器或者搅拌器，来破碎脂肪组织。匀浆法，是指利用高压来破碎脂肪组织。温差法，是指通过反复冻融或急热骤冷等温度变化来达到破碎脂肪组织的目的。压差法，是指使用加压的方法，来破碎脂肪组织。超声法，一般是采用功率为15KHz-20KHz的超声波，使脂肪组织在高强度急剧振动下破碎。注射器法，是指采用注射器，来破碎脂肪组织，包括连通管法、空气法和针头法。
进一步，所述高渗氯化钠溶液清洗的具体方法是：在破碎后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述破碎后的脂肪组织的无菌0.5M氯化钠溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡4h；再1000rpm离心5min，去除溶液；然后加入至少一倍体积于上述破碎后的脂肪组织的无菌1M氯化钠溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡4h；再1000rpm离心5min，去除溶液，得到高渗氯化钠清洗后的脂肪组织。
采用上述进一步的有益效果是：冻融处理后的脂肪组织经过破碎后，释放出大量脂滴，且破碎后的脂肪组织经过高渗氯化钠溶液清洗后，借助渗透压差破坏细胞膜并促进细胞裂解和DNA与蛋白质解离。
进一步，所述第一次无菌去离子水洗涤的具体方法是：在高渗氯化钠溶液清洗后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述高渗氯化钠溶液清洗后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡4h；再1000rpm离心5min，去除溶液，得到第一次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。
采用上述进一步的有益效果是：经过第一次无菌去离子水清洗，可以去除脂肪组织内残留的高渗氯化钠溶液。
进一步，所述Triton X-100溶液清洗的具体方法是：在第一次无菌去离子水清洗后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述去离子水清洗后的脂肪组织的体积百分浓度为1％的Triton X-100溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡48h，且每24h更换新的质量百分数为1％的Triton X-100溶液3次，再1000rpm离心5min，去除溶液，得到Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织。
采用上述进一步的有益效果是：使用体积百分浓度为1％的Triton X-100溶液，溶解细胞膜的磷脂成分从而去除细胞成分及遗传物质。
进一步，所述第二次无菌去离子水洗涤的具体方法是：在Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡30min；再1000rpm离心5min，去除溶液；共进行上述第二次无菌去离子水洗涤过程3次，得到第二次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。
采用上述进一步的有益效果是：通过第二次无菌去离子水洗涤，可以去除脂肪组织内残留的Triton X-100溶液。
进一步，所述异丙醇析出油脂的具体方法是：在第二次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的异丙醇，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡8h；再1000rpm离心5min，去除溶液，得到析出油脂后的脂肪组织。
采用上述进一步的有益效果是：通过异丙醇析出油脂，可以获得不含油脂和细胞成分的脂肪组织细胞外基质。
进一步，所述第三次无菌去离子水洗涤的具体方法是：在析出油脂后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述析出油脂后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡30min；再1000rpm离心5min，去除溶液；共进行上述第三次无菌去离子水洗涤过程3次，得到第三次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。
采用上述进一步的有益效果是：通过无菌去离子水洗涤，可以去除脂肪组织内残留的异丙醇溶液。
进一步，所述酒精洗脱RNA的具体方法是：在第三次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的75％体积的酒精，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡30min；再1000rpm离心5min，去除溶液；共进行上述酒精洗脱RNA过程3次，即得到脂肪组织细胞外基质。
采用上述进一步的有益效果是：通过酒精洗脱，可以消除RNA水化层，使RNA发生沉淀并去除。
进一步，所述脂肪组织细胞外基质储存于含体积百分数为1％的双抗的无菌去离子水内，真空冷冻干燥，即得到块状的脂肪组织细胞外基质。
采用上述进一步的有益效果是：经过冷冻干燥后，得到的块状的脂肪组织细胞外基质，为疏松多孔状。后续可以研磨成粉末，适合各种应用场景，比如后续的皮下注射，非常方便保存和使用。
更进一步，所述真空冷冻干燥的具体参数为：先抽真空到7.98Pa，保持在-30℃，干燥16h；再保持在-20℃，干燥16h；然后保持在20℃，干燥9h。
采用上述更进一步的有益效果是：采用上述参数，真空冷冻干燥的效果最佳。
附图说明
图1为本发明的实施例步骤1得到的预处理后的脂肪组织的外观图。
图2为本发明的实施例步骤3得到的破碎后的乳糜状脂肪组织的外观图。
图3为本发明的实施例步骤4得到的0.5M氯化钠清洗后的脂肪组织的外观图。
图4为本发明的实施例步骤4得到的1M氯化钠清洗后的脂肪组织的外观图。
图5为本发明的实施例步骤5得到的无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的外观图。
图6为本发明的实施例步骤6得到的体积百分浓度为1％Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织的外观图。
图7为本发明的实施例步骤8得到的析出油脂后的脂肪组织的外观图。
图8为本发明的实施例制备得到的脂肪组织细胞外基质的外观图。
图9为本发明的实施例制备得到的脂肪组织细胞外基质经冻干后的外观图。
图10为新鲜的脂肪组织的油红O染色图。比例尺为200μm。
图11为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质的油红O染色图。比例尺为200μm。
图12为新鲜的脂肪组织的DAPI染色图。比例尺为200μm。
图13为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质的DAPI染色图。比例尺为200μm。
图14为新鲜的脂肪组织的Masson染色图。比例尺为200μm。
图15为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质的Masson染色图。比例尺为200μm。
图16为新鲜的脂肪组织的天狼猩红染色图。比例尺为200μm。
图17为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质的天狼猩红染色图。比例尺为200μm。
图18为新鲜的脂肪组织的扫描电镜图。比例尺为100μm。
图19为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质在未冻干时的扫描电镜图。比例尺为100μm。
图20为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质在冻干后的扫描电镜图。比例尺为500μm。
图21为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质在冻干后的扫描电镜图。比例尺为100μm。
图22为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质在冻干后的扫描电镜图。比例尺为500μm。
图23为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质在冻干后的扫描电镜图。比例尺为100μm。
图24为本发明实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质的吸水率对比图。
图25为本发明实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质的孔隙直径在60-200μm占比百分比的对比图。
图26为本发明的实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质的DNA残留量对比图。
图27为本发明实施例和Flynn法制备的细胞外基质冻干后，研磨成粉末状，取5mg与生理盐水混合，注射到裸鼠皮下(n＝5)，并于第1周、第2周和第4周取材，样本重量的对比图。
图28为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植1周后的Perilinpin染色图。比例尺为100μm。
图29为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质体内移植1周后的Perilinpin染色图。比例尺为100μm。
图30为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植2周后的Perilinpin染色图。比例尺为100μm。
图31为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质体内移植2周后的Perilinpin染色图。比例尺为100μm。
图32为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植4周后的Perilinpin染色图。比例尺为100μm。
图33为Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质体内移植4周后的Perilinpin染色图。比例尺为100μm。
图34为本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植1周、2周和4周后的Perilinpin染色呈阳性的脂肪细胞个数图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例
本实施例的脂肪组织细胞外基质的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：脂肪组织的预处理
取新鲜的脂肪组织，静置10min-15min，弃去油滴、血液和肿胀液，加入PBS缓冲液清洗3次，得到预处理后的脂肪组织(如图1所示)。
步骤2：冻融循环
将步骤1得到的预处理后的脂肪组织于-80℃冷冻2h后，于37℃融化；共进行上述冻融过程3次，得到冻融处理后的脂肪组织。
步骤3：破碎
将步骤2得到的冻融处理后的脂肪组织破碎成乳糜状，破碎方式可以采用很多方式，比如研钵法、捣碎法、振荡法、搅拌法、匀浆法、温差法、压差法、超声法和注射器法中的任意一种或两种以上的组合，得到破碎后的脂肪组织(如图2所示)。
步骤4：高渗氯化钠溶液清洗
在步骤3得到的破碎后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述破碎后的脂肪组织的无菌0.5M氯化钠溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡4h，采用转速为1000rpm，离心5min，去除溶液(如图3所示)；再加入至少一倍体积于上述破碎后的脂肪组织的无菌1M氯化钠溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm,震荡4h，采用转速为1000rpm，离心5min，去除溶液，得到高渗氯化钠清洗后的脂肪组织(如图4所示)。
步骤5：无菌去离子水洗涤
在步骤4得到的高渗氯化钠溶液清洗后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述高渗氯化钠溶液清洗后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm,震荡12h，采用转速为1000rpm，离心5min，去除溶液，得到无菌去离子水洗涤后的脂肪组织(如图5所示)。
步骤6：Triton X-100溶液清洗
在步骤5得到的无菌去离子水清洗后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述去离子水清洗后的脂肪组织的体积百分浓度为1％的Triton X-100溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡48h，且每24h更换新的质量百分数为1％的Triton X-100溶液3次，采用转速为1000rpm，离心5min，去除溶液，得到Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织(如图6所示)。
步骤7：无菌去离子水洗涤
在步骤6得到的Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm,震荡30min，采用转速为1000rpm，离心5min，去除溶液；共进行上述无菌去离子水洗涤过程3次，得到无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。
步骤8：异丙醇析出油脂
在步骤7得到的无菌去离子水洗涤后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的异丙醇，37℃恒温摇床，转速为100rpm,震荡8h，采用转速为1000rpm，离心5min，去除溶液，得到析出油脂后的脂肪组织(如图7所示)。
步骤9：无菌去离子水洗涤
在步骤8得到的析出油脂后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述析出油脂后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm,震荡30min，采用转速为1000rpm，离心5min，去除溶液；共进行上述无菌去离子水洗涤过程3次，得到无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。
步骤10：酒精洗脱RNA
在步骤9得到的无菌去离子水洗涤后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的75％体积的酒精，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡30min，采用转速为1000rpm，离心5min，去除溶液；共进行上述酒精洗脱RNA过程3次，即得到脂肪组织细胞外基质(如图8所示)。
将上述所述脂肪组织细胞外基质储存于含体积百分数为1％双抗的无菌去离子水内，真空冷冻干燥，具体参数为：先抽真空到7.98Pa，保持在-30℃，干燥16h；再保持在-20℃，干燥16h；然后保持在20℃，干燥9h，即得到疏松多孔的块状的脂肪组织细胞外基质(如图9所示)。可将块状的脂肪组织细胞外基质研磨成粉末状，用于皮下注射。
1、油红O染色、DAPI染色
取新鲜的脂肪组织和本发明实例制备的脂肪组织细胞外基质，用质量百分数为4％的多聚甲醛溶液固定，冰冻切片前一晚，将溶液更换为质量百分数为20％的蔗糖溶液。-25℃进行包埋，冰冻切片机切取厚度为8μm切片。然后分别进行油红O染色和DAPI染色。
(1)油红O染色
油红O染液染10min，体积百分数为60％异丙醇分色，蒸馏水洗，苏木素复染，自来水蓝化，自来水洗，甘油明胶封片。
(2)DAPI染色
在冰冻切片上滴加DAPI染液，室温放置10min。弃去染液，流水缓流冲洗3次，吸去多余液体后，滴加防荧光淬灭封片液封片，玻片置于荧光显微镜下观察。
2、Masson染色、天狼猩红染色
取新鲜的脂肪组织和本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质，用质量百分数为4％的多聚甲醛溶液固定，流水缓流冲洗后梯度酒精脱水(分别为30％体积、50％体积、70％体积、80％体积、90％体积和95％体积酒精中各1次，100％体积酒精2次，5min/次)，二甲苯透明后，石蜡包埋。切片厚度为8μm。对切片进行脱蜡和梯度酒精脱水(分别为30％体积、50％体积、70％体积、80％体积、90％体积和95％体积酒精中各1次，100％体积酒精2次，5min/次)。然后进行Masson染色和天狼星红染色。
(1)Masson染色
Weigert铁苏木素染液染色10min，流水缓流冲洗2min；置于体积百分浓度1％盐酸酒精溶液中分化2s，丽春红品红染液5min，快速水洗；1％磷钼酸分化2-5min；苯胺蓝染液染色2min；冰醋酸快速分化；酒精脱水，透明，中性树胶封片，普通光学显微镜观察。
(2)天狼星红染色
天狼星红染色液滴染1h。流水缓流冲洗10s，吸去多余染液。酒精脱水，透明，中性树胶封片，偏振光显微镜观察。
3、宏观微观形貌观察
(1)宏观形貌观察
观察冻干后脂肪组织细胞外基质的整体结构，并用佳能100D相机对其进行拍照。
(2)扫描电镜微观形貌观察
取脂肪组织和本发明实例制备的脂肪组织细胞外基质，室温条件下用体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液固定，24h后进行梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯浸泡，真空干燥，喷金，扫描电镜观察微观结构。取部分真空冷冻干燥处理后的脂肪组织细胞外基质，喷金，扫描电镜观察。
结果：与新鲜的脂肪组织相比，本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质内已经完全去除油脂成分(如图10和图11所示)、去除细胞核物质(如图12和图13所示)并保留胶原成分(如图14-图17所示)，扫描电镜观察微观结构也未见脂肪细胞(图18和图19所示)。将本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质冻干后，扫描电镜观察呈现疏松多孔的微观结构，具体是在低放大倍数下可见孔隙分布均匀且大小较为一致(如图20所示)，在高放大倍数下可见孔隙较多，孔隙直径多为100μm(如图21所示)。
对比试验
取新鲜的脂肪组织，分别采用本发明实施例的方法和现有技术的Flynn法，进行脂肪组织细胞外基质的制备。其中，现有技术的Flynn法制备脂肪组织细胞外基质的具体方法如下：
(1)溶液配制
配制冷冻缓冲液：包含1M Tris和0.5M EDTA，调整pH值为8。
配制清洗液：8g/L NaCl、200mg/L KCl、1g/L Na2HPO4和200mg/L KH2PO4，调整pH值为8.0。
配制酶消化溶液：55mM Na2HPO4、17mM KH2PO4、4.9mM MgSO4·7H2O、15000U脱氧核糖核酸酶I(牛胰腺来源)、12.5mg核糖核酸酶A(牛胰腺来源)和2000U脂肪酶(猪胰腺来源)。
(2)制备方法
步骤1：脂肪组织的预处理，同本发明实施例。
步骤2：冻融循环，同本发明实施例。
步骤3：在步骤2得到的冻融处理后的脂肪组织，加入与上述冻融处理后的脂肪组织等体积的质量百分数为0.25％的胰蛋白酶溶液，恒温摇床，震荡16h；
步骤4：异丙醇萃取
用极性溶剂——体积百分浓度为99％的异丙醇溶液对脂质进行萃取，16h后更换新的异丙醇溶液，继续震荡8h后再次更换新的异丙醇溶液，再重复前一个24h脱细胞步骤，总计异丙醇萃取时长为48h；
步骤5：清洗
加入上述配制好的清洗液摇床震荡30min，重复3次；
步骤6：消化
加入质量百分数为0.25％的胰蛋白酶溶液消化6h；
步骤7：清洗液清洗
加入上述配制好的清洗液，恒温摇床，震荡30min，重复3次；
步骤8：酶消化溶液
加入上述配制好的酶消化溶液，恒温摇床震荡16h；
步骤9：清洗液清洗
加入上述配制好的清洗液，摇床震荡30min，重复3次；
步骤10：酒精清洗
加入75％体积酒精清洗3次，每次30min，即得到脂肪组织细胞外基质。
将两种方法制备得到的脂肪组织细胞外基质进行如下对比：
1、Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质冻干后扫描电镜观察呈现粗大且互相缠绕的微观结构，具体是在低放大倍数下可见结构较为致密(如图22所示)，在高放大倍数下可见孔隙较少且孔隙直径不均匀(如图23所示)。
2、60-200μm直径孔隙占比
使用扫描电镜对每个冻干后的样本随机拍照15张(n＝3)，用ImageProPlus6.0软件标记出每张照片所有孔隙，并测量其直径。导出结果后，根据直径大小分为3组：小于60μm组、60-200μm组以及大于200μm组。计算直径为60-200μm的孔隙在所有孔隙中所占比例。
3、吸水率(water uptake ratio)
称量冻干后的脂肪组织细胞外基质(n＝6)干重记为W1，室温下完全浸没于无菌去离子水内2h，取出后再次称量重量记为W2。根据以下公式计算吸水率为：(W2-W1)/W1×100％。
4、DNA残留量定量检测
使用Quant-iTTMPico
dsDNA Reagent and Kits定量测量样本DNA含量。首先绘制标准曲线：用1×TE溶液按体积比为1:200稀释PicoGreen试剂。DNA标准品用1×TE溶液稀释至25ng/ml、2.5ng/mg、250pg/ml和25pg/ml。以上浓度分别取1ml加入1ml稀释后的PicoGreen试剂。空白对照为1ml1×TE溶液，同样加入1ml稀释后的PicoGreen试剂。室温避光孵育5min，酶标仪设定激发光波长480nm，发射光波长520nm，开始测量，测量组荧光值结果减去阴性对照组荧光值结果后，绘制标准曲线，从而得到回归方程。
称量5mg冻干后的细胞外基质材料(n＝3)，加入500μlDNA裂解缓冲液和5μl蛋白酶K，55℃水浴60min后，12000rpm4℃离心10min。取上清100μl用于检测，空白对照为100μl1×TE，均加入900μl1×TE溶液，混匀后加入1ml稀释后的PicoGreen试剂，室温避光孵育5min，酶标仪设定激发光波长480nm，发射光波长520nm，开始测量。测量组荧光值结果减去空白对照组荧光值结果后，将数值结果导入回归方程，从而计算出细胞外基质中含有的DNA量(ng/mg干重)。
结果：在吸水率方面(如图24所示)，对两组脂肪组织细胞外基质的吸水率进行独立样本t检验，P＝0.254，P>0.05，认为差异无统计学意义。其中，本发明实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质的吸水率分别为(11.7±1.7)％和(10.6±1.5)％。说明两种方法制备的脂肪组织细胞外基质有相似的亲水力。
在60-200μm直径孔隙占比方面(如图25所示)，对两组脂肪组织细胞外基质扫描电镜图内孔隙直径进行测量，统计60-200μm孔隙所占比例，并进行独立样本t检验，P＝0.005，P<0.01，认为差异有统计学意义。其中，本发明实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质中直径为60-200μm孔隙所占比例分别为(64.3±11.8)％和(23.3±4.3)％。说明本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质直径在60-200μm孔隙占比更多。
在DNA残留量方面(如图26所示)，使用PicoGreen法定量DNA残留量，并进行独立样本t检验，P＝0.000，P<0.01，认为差异有统计学意义。其中，本发明实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质中DNA残留量分别为(2.2±0.1)ng/mg和(60.2±1.1)ng/mg。说明本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质DNA残留量更低，去除遗传物质效果更好。
5、体内移植重量保持情况
方法：体内植入后标本重量方面(如图27所示)，BALB/c自身免疫缺陷小鼠15只(6-8周龄)，雌性，体重20-25g，购自北京联合利华实验动物公司，动物实验经过伦理委员会批准，动物饲养于中国医学科学院整形外科医院动物研究中心，常规给予饮食饲养。所有动物在本实验中均得到了人道主义关爱。准确称量5mg粉末状脂肪组织细胞外基质，与0.3ml生理盐水混合均匀后，用1ml注射器注射入裸鼠背部皮下，裸鼠背部左侧、右侧分别注射本发明实施例和Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质。注射前后用碘伏消毒裸鼠皮肤。在皮下注射后第1周、第2周和第4周时取材，按照福利伦理要求将裸鼠安乐死，每个时间点对5只裸鼠进行取材。称量样本，对样本重量进行两因素方差分析。
结果：结果显示组别对样本重量的影响有统计学意义(如图27所示)，P＝0.000，P<0.01；移植时间对样本重量的影响有统计学意义，P＝0.022，P<0.05；组别与移植时间之间不存在交互作用，P＝0.13，P>0.05。因时间因素有三个水平，故进行两两比较，移植1周与2周时样本重量的差异有统计学意义，P＝0.019,P<0.05；移植1周和4周时样本重量的差异有统计学意义，P＝0.013，P<0.05；移植2周和4周时样本重量的差异无统计学意义，P＝0.887，P>0.05。说明本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内植入后样本重量保持较好，吸收率低。随着移植时间的延长，两组样本重量均逐渐减轻，到第2周时两组样本重量保持稳定，且本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质在1周、2周和4周时重量高于Flynn法。
6、体内移植成脂能力
方法：称重后的标本在质量百分比为4％的多聚甲醛溶液中固定，包埋、切片。对切片进行脱蜡和梯度酒精脱水。免疫组织化学染色，滴加适当比例用抗体稀释液稀释的一抗，Perilinpin抗体稀释体积百分浓度为1:400。染色完成后使用普通光学显微镜观察并拍照。对每个样本拍照1-12张，其中包括所有Perilinpin染色阳性的脂肪细胞，用Image ProPlus 6.0软件计数阳性染色的脂肪细胞个数。使用非参数检验对阳性染色的脂肪细胞数量进行统计学分析。
结果：
体内植入后生成脂肪细胞能力方面(图28-图34所示)，本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植1周时，可见大量阳性染色的细胞核(如图28所示)、Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质体内移植1周时，未见阳性染色细胞核(如图29所示)、本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植2周时，可见阳性染色脂肪细胞体积大于1周时，同时可见大量阳性染色细胞核(如图30所示)、Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质体内移植2周时，可见阳性染色的脂肪细胞和大量蓝染的细胞核，且脂肪细胞数量较少(如图31所示)、本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植4周时，可见满视野阳性染色脂肪细胞，且大小均匀以成熟脂肪细胞为主，单位视野内脂肪细胞所占面积明显多于脂肪组织细胞外基质(如图32所示)、Flynn法制备的脂肪组织细胞外基质体内移植4周时，可见大量阳性染色脂肪细胞，脂肪细胞周围散在大量蓝染细胞核(如图33所示)。对阳性染色的脂肪细胞数量进行统计学分析(如图34所示)，体内移植1周时，脂肪细胞数量较少，P＝0.881，P>0.05，认为两组差异无统计学意义；体内移植2周，本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质内脂肪细胞个数多于Flynn法，P＝0.009，P<0.05,认为差异有统计学意义；体内移植4周时，本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质内脂肪细胞个数多于Flynn法，P＝0.009，P<0.05认为差异有统计学意义。说明本发明实施例制备的脂肪组织细胞外基质体内移植后具有更强的成脂能力。
7、成本对比
两种方法的成本对比，如表1所示。
表1两种方法的成本对比
由此可见，现有技术的Flynn法的成本远远超过本发明实施例的成本。另外，现有技术的Flynn法组织来源为动物来源，这在制备人脂肪组织细胞外基质的过程中，提高了引入异种抗原的风险。
8、生物酶对细胞外基质成分的损害
生物酶通过切割细胞与细胞外基质之间的肽键，或靶向水解细胞破碎后残留的细胞成分实现脱细胞效果。常用的酶有胰蛋白酶、核酸酶和脂肪酶。胰蛋白酶用来水解精氨酸和赖氨酸的羧基侧肽键。有文献表明，质量百分浓度为0.02％的胰蛋白酶处理猪脂肪1h,对细胞外基质的成分和结构不会产生明显影响。但若长时间暴露于胰蛋白酶环境下，细胞外基质中的弹性蛋白含量和糖胺聚糖(GAG)含量会显著降低。但是在脱细胞过程中，胰蛋白酶的使用浓度和使用时间往往要增加许多，比如Flynn法中，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.25％，作用时间为24h，这会很大程度损伤细胞外基质的超微结构和蛋白含量。核酸酶：包括核酸内切酶和核酸外切酶，通过切割磷酸二酯键使DNA发生断裂，在脱细胞过程中用于水解核酸物质，但核酸酶会对细胞外基质的表面结构造成损伤，影响细胞的粘附和增殖。脂肪酶可以使甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，常被使用于脂肪组织的脱细胞过程中，但是单独使用并不能去除所有脂肪细胞，常需与其它试剂合用。因此，在脂肪组织脱细胞过程中，会使用胰蛋白酶破坏细胞，再使用核酸酶和脂肪酶去除遗传物质和水解油脂，以获得较好的脱细胞效果。然而，生物酶会与细胞外基质中的胶原、糖胺聚糖和弹性蛋白互相作用，导致其天然成分发生改变或断裂，阻碍了细胞外基质的临床应用。
综上，本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法，在脱细胞过程中不需酶的参与，一是极大的降低制备成本，二是减少异种属抗原成分导致排斥反应的风险，三是能够保留细胞外基质的天然结构和活性因子，四是可以实现更有效的脱细胞结果，五是体内成脂能力更强。此外，本发明的脂肪组织细胞外基质的制备方法，通过物理方法对脂肪组织进行破碎，就可以达到分离细胞和细胞外基质和破坏脂肪细胞的效果，操作更加方便快捷，成本更加低廉，具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种脂肪组织细胞外基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取新鲜脂肪组织，进行预处理，再进行冻融处理；所述冻融处理的方法是：将预处理后的脂肪组织于-80℃冷冻2h后，于37℃融化；共进行上述冻融过程3次，即得到冻融处理后的脂肪组织；
将上述冻融处理后的脂肪组织进行破碎，得到破碎后的脂肪组织；
将上述破碎后的脂肪组织，依次经过高渗氯化钠溶液清洗、第一次无菌去离子水洗涤、Triton X-100溶液清洗、第二次无菌去离子水洗涤、异丙醇析出油脂、第三次无菌去离子水洗涤和酒精洗脱RNA，即得到脂肪组织细胞外基质，其中，所述Triton X-100溶液清洗的具体方法是：在第一次无菌去离子水清洗后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述去离子水清洗后的脂肪组织的体积百分浓度为1％的Triton X-100溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡48h，且每24h更换新的质量百分数为1％的Triton X-100溶液3次，再1000rpm离心5min，去除溶液，得到Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织；所述酒精洗脱RNA的具体方法是：在第三次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的75％体积的酒精，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡30min；再1000rpm离心5min，去除溶液；共进行上述酒精洗脱RNA过程3次，即得到脂肪组织细胞外基质。
2.根据权利要求1所述的脂肪组织细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述预处理的方法是：取新鲜的脂肪组织，静置10min-15min，弃去油滴、血液，加入PBS缓冲液清洗3次，即得到预处理后的脂肪组织。
3.根据权利要求1所述的脂肪组织细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述破碎后的脂肪组织呈乳糜状，所述破碎的方法为研钵法、捣碎法、振荡法、搅拌法、匀浆法、温差法、压差法、超声法和注射器法中的任意一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1所述的脂肪组织细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述高渗氯化钠溶液清洗的具体方法是：在破碎后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述破碎后的脂肪组织的无菌0.5M氯化钠溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡4h；再1000rpm离心5min，去除溶液；然后加入至少一倍体积于上述破碎后的脂肪组织的无菌1M氯化钠溶液，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡4h；再1000rpm离心5min，去除溶液，得到高渗氯化钠清洗后的脂肪组织。
5.根据权利要求1所述的脂肪组织细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述第一次无菌去离子水洗涤的具体方法是：在高渗氯化钠溶液清洗后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述高渗氯化钠溶液清洗后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡4h；再1000rpm离心5min，去除溶液，得到第一次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。
6.根据权利要求1所述的脂肪组织细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述第二次无菌去离子水洗涤的具体方法是：在Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述Triton X-100溶液清洗后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡30min；再1000rpm离心5min，去除溶液；共进行上述第二次无菌去离子水洗涤过程3次，得到第二次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。
7.根据权利要求1所述的脂肪组织细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述异丙醇析出油脂的具体方法是：在第二次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述无菌去离子水洗涤后的脂肪组织的异丙醇，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡8h；再1000rpm离心5min，去除溶液，得到析出油脂后的脂肪组织。
8.根据权利要求1所述的脂肪组织细胞外基质的制备方法，其特征在于，所述第三次无菌去离子水洗涤的具体方法是：在析出油脂后的脂肪组织中，加入至少一倍体积于上述析出油脂后的脂肪组织的无菌去离子水，37℃恒温摇床，转速为100rpm，震荡30min；再1000rpm离心5min，去除溶液；共进行上述第三次无菌去离子水洗涤过程3次，得到第三次无菌去离子水洗涤后的脂肪组织。
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