CN114279795A - 组织样品快速检测系统、检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种组织样品快速检测系统、检测方法及应用，该组织样品检测系统包含染色试剂盒、组织样品检测装置和显微镜，本发明的染色试剂盒包括以下试剂：组织处理液、苏木素溶液、分化液、返蓝液和清洗液，组织处理液为含有曲拉通X‑100的缓冲液，或者为含有曲拉通X‑100和I型胶原酶的缓冲液。组织样品检测装置包含固定装置和检测单元。本发明组织处理液能够增加组织的透光性和通透性，便于苏木素渗透到组织内部，从而提高厚组织样品的苏木素染色效果。本发明的染色试剂和组织样品检测装置，能够实现较厚的组织样品直接染色，处理后即可直接在显微镜下观察组织结构和细胞形态，能够将检测时间由原来的36h缩短至30min。
Description
技术领域
本发明涉及病理诊断领域，特别涉及组织样品快速检测系统、检测方法及应用。
背景技术
传统的苏木素-伊红染色(HE染色)是生物学、组织学、病理学及细胞学等学科必不可少的最基本的染色方法。苏木素-伊红染色主要用于显示各种组织正常成分和病变的一般形态结构，进行观察。在病理诊断、教学与科研中广泛应用，具有重要价值。
HE染色的质量优劣直接影响病理诊断的准确性。HE染色中，染色液是决定染色效果和切片质量最为重要的因素之一。在长期的实际应用中发现，传统的HE染色存在下列弊端：
(1)传统HE染色方法一般需要先采用石蜡切片或冰冻切片方法切成的3-10μm的薄片再进行染色，组织切片步骤不仅对检测人员的切片技术要求较高，在切片过程中还容易破坏组织样品的整体形态，无法获得组织三维形态。此外，石蜡切片因其需要经历组织固定、包埋、切片等处理，导致石蜡切片的诊断方式耗时较长，结果等待时间较久，在一定程度上延缓了治疗进展。虽然冰冻切片制片快捷，但冷冻切片机价格昂贵且不容易普及。
(2)HE染色中常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿等，各种透明剂均是石蜡的溶剂，都存在一定毒性，这类透明剂透明时间过短，则透明不彻底；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片。
(3)染色步骤复杂，需要经历苏木精染色、水洗、盐酸酒精分化、水洗、返蓝、冲洗、伊红染色、脱水、透明和封片等步骤，每一步骤都对染色质量有影响，且需要经历苏木素和伊红两种染料进行染色观察。每一环节都必须高度重视，才能制作出高质量的HE染色切片，导致其操作流程复杂、耗时较长，且对检测人员的要求较高。为了获得满意的染色效果，HE染色的组织样品的厚度需要控制在3-10μm厚度以内，因此，在使用HE染色前需要将组织切成3-10μm厚度的薄片，而对于较厚的组织样品染色效果较差。
(4)传统HE方法所采用的载玻片和盖玻片仅能进行对组织切片单面观察，无法进行双面检测，更不适用于对整块组织结构进行三维立体检测。此外，现有盖玻片在检测过程中因吸附力较小容易在载玻片上滑动，造成滑落污染风险和影响检测效果。
因此，急需一种能实现双面或立体观察、操作简便、染色效果好、透明效果好、适用于厚度超过3-10μm的组织块的组织样品快速检测系统及方法，来帮助医生进行准确的判断，进而指导临床进行有效治疗。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了组织样品快速检测系统、检测方法及应用。该染色试剂盒及方法省略了伊红染色的步骤，仅采用苏木素对毛囊进行整体染色，染色后组织细胞核呈现蓝紫色，显示清晰；本发明的组织处理液能够增加组织的透光性和通透性，便于苏木素、盐酸酒精和氨水渗透到组织内部，从而提高厚组织样品的染色效果。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种染色试剂盒，包括以下试剂：组织处理液、苏木素溶液、分化液、返蓝液和清洗液，组织处理液为含有曲拉通X-100的缓冲液，或者为含有曲拉通X-100和I型胶原酶的缓冲液。
作为优选，组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.1％～0.5％。
优选地，组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.2％～0.3％。
更优选地，组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.3％。
作为优选，组织处理液中I型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～5％。
优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～0.5％。
更优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.1％。
作为优选，缓冲液的浓度为0.001mol/L～0.1mol/L。
优选地，缓冲液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L。
优选地，缓冲液的浓度为0.008mol/L～0.012mol/L。
更优选地，缓冲液的浓度为0.01mol/L。
组织处理液中的缓冲液为PBS缓冲液。
作为优选，苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为30％～100％。
优选地，苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为50％～100％。
更优选地，苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为100％。
作为优选，分化液为盐酸酒精，返蓝液为氨水溶液，清洗液为PBS缓冲液。
作为优选，盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度为0.2％～1.5％，优选为0.5％～1％；氨水溶液中氨的质量百分浓度为0.1～0.5％，优选为0.11％～0.22％，PBS缓冲液的浓度为0.001mol/L～0.1mol/L。
更优选地，盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度为1％，氨水溶液中氨的质量百分浓度为0.22％，PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L。
本发明染色试剂盒中的组织处理液、苏木素溶液、盐酸酒精分化液、氨水返蓝液或PBS清洗液均分别独立包装，所述包装材料选自塑料、玻璃、或橡胶。
本发明的染色试剂盒中的组织处理液能够增加组织的透光性和通透性，便于苏木素、盐酸酒精和氨水渗透到组织内部，从而提高厚组织样品的苏木素染色效果。
完整的组织样品的透光性和通透性较差，与其组成物质有关，组织中含有水、蛋白质、脂类等多种不同物质，各物质折光系数不尽相同，当光线通过这些不同组分时发生散射，并且组织越厚，散射越强，透射越少，从而导致光学观察受到了限制。
为了提高完整组织样品的透光性，目前有两种方式，一类是以去除折光系数差异较大的物质为主，由于不同物质间具有不同的折光系数，折光系数差异越大，组织越不透明，差异越小，组织越透明。因此，选择性的去除组织中的某些物质，可以减少折光系数间的差异，此类方法可称为“去不同”，例如脱水方法。第二类方法主要是使用与组织折光系数相似的介质溶液，这种方法称为“加相似”。
201810150257.3专利记载了TritonX-100(曲拉通X-100)和尿素组成的生物材料透明剂具有优良的使组织透明的能力，Triton X-100可以增强尿素相对于生物材料的渗透性，可以很大地改进具有高光散射性质的不透明生物材料的透明度(参见201810150257.3专利的说明书第4页的[0069]至[0074])。而本发明采用曲拉通加入尿素形成的处理液(对比例1)对毛囊进行处理后，由于尿素具有水合作用，使组织发生了膨胀，组织通透性和透光度变差，无法清晰地检测毛囊的内部结构，通过单独采用曲拉通X-100处理后，染色后的清晰度比曲拉通X-100+尿素组合的染色清晰度好。
组织处理液中的曲拉通X-100是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂),能在较短的时间内增加细胞膜通透性，曲拉通能够帮助苏木素等染料向生物组织中的侵入。曲拉通X-100的浓度会对苏木素的渗透效果产生影响，优选地，组织处理液的曲拉通X-100的体积百分浓度为0.1％～0.5％，更优选地0.2％～0.3％。因为当曲拉通X-100的浓度过高时(大于1％)会破坏组织结构，影响染色效果。而未添加曲拉通X-100(即曲拉通X-100为0时)，染料无法进入组织和细胞核中，细胞核染色不完全。曲拉通X-100增加细胞膜通透性的效果优于其他表面活性剂，特别是浓度为0.2％～0.3％的曲拉通X-100优于其他表面活性剂。本发明中的“曲拉通的体积百分浓度”代表所使用的曲拉通的体积(v(毫升))相对于组织处理液的体积(v(毫升))的百分数。
本发明人还发现，将曲拉通X-100与I型胶原酶的组合处理后染色效果更佳。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型，I型胶原酶含有比较均匀的各种酶活力(包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性)，作用主要是能消化细胞间质中的胶原纤维，I型胶原酶能够增加组织的通透性，例如能够增加毛囊外毛根鞘的通透性，更利于染料进入毛囊内部，使染色更为彻底。
苏木素是从洋苏木中提取的一种染色剂，它在被氧化后生成苏木精，同媒染剂一起使用，能够使细胞核染色。苏木素原液为市售的苏木素染液，100％的苏木素即为苏木素原液，50％的苏木素溶液为将苏木素原液用水稀释到50％，30％的苏木素溶液为将苏木素原液用水稀释到30％。当苏木素溶液为50％～100％时，染色后组织透光度好，细胞核染色完全，染色后清晰度均在80％以上。
本发明还提供了一种染色方法，采用上述染色试剂盒对组织样品进行染色，包括如下步骤：
1)将组织样品用清洗液清洗；
2)采用组织处理液对组织样品处理；
3)采用苏木素溶液对组织样品染色；
4)将染色后的组织样品置于分化液中进行分化处理；
5)将分化处理后的组织样品置于返蓝液中进行返蓝处理。
作为优选，步骤2)-5)之后均包含用清洗液清洗的步骤。
作为优选，组织处理液为含有曲拉通X-100的缓冲液，或者为含有曲拉通X-100和I型胶原酶的缓冲液。
作为优选，组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.1％～0.5％。
优选地，组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.2％～0.3％。
更优选地，组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.3％。
作为优选，组织处理液中I型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～5％。
优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～0.5％。
更优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.1％。
作为优选，缓冲液的浓度为0.001mol/L～0.1mol/L。
优选地，缓冲液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L。
优选地，缓冲液的浓度为0.008mol/L～0.012mol/L。
更优选地，缓冲液的浓度为0.01mol/L。
在本发明中，组织处理液中的缓冲液为PBS缓冲液。
作为优选，苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为30％～100％。
优选地，苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为50％～100％。
更优选地，苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为100％。
作为优选，分化液为盐酸酒精，返蓝液为氨水溶液，清洗液为PBS缓冲液。
作为优选，盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度为0.2％～1.5％，优选为0.5％～1％；氨水溶液中氨的质量百分浓度为0.1～0.5％，优选为0.11％～0.22％，PBS缓冲液的浓度为0.001mol/L～0.1mol/L。
更优选地，盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度为1％，氨水溶液中氨的质量百分浓度为0.22％，PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L。
作为优选，组织处理液对组织样品处理时间为8～15分钟。
进一步优选地，组织处理液对组织样品处理时间为10分钟。
作为优选，苏木素溶液的染色时间为2～6分钟。
进一步优选地，苏木素溶液的染色时间为2～3分钟。
进一步优选地，苏木素溶液的染色时间为3分钟。
作为优选，分化时间为0.5～2分钟。
作为优选，返蓝时间为0.5～3分钟。
进一步优选地，返蓝时间为2分钟。
本发明还提供了一种组织样品快速检测系统，包括上述染色试剂盒、组织样品检测装置和显微镜，组织样品检测装置包含固定装置和检测单元，
固定装置由标记区(1)、夹持区(5)和固定区组成，固定区位于标记区(1)和夹持区(5)之间，标记区(1)靠近固定区的一侧与夹持区(5)靠近固定区的一侧均设置有插槽(7)，固定区由第一支架(2)和第二支架(3)构成，第一支架和第二支架均设置有容纳检测单元的空腔(6)，第一支架(2)、第二支架(3)、标记区(1)和夹持区(5)围成的矩形为样品检测区(4)，
检测单元为检测玻片(8)。
作为优选，检测玻片包括上玻片(801)或下玻片(802)，组织样品放置于上玻片(801)和下玻片(802)之间，装有组织样品的检测玻片放置于第一支架(2)和第二支架(3)的空腔中。
作为优选，标记区(1)、夹持区(5)和固定区为一体成型结构。
作为优选，固定区的第一支架(2)或第二支架(3)由左支架和右支架组成，左支架或右支架为可拆卸连接。
作为优选，第一支架(2)为中空结构，且第一支架(2)的内侧和外侧均设置有开口；第二支架(3)为中空结构，第二支架(3)的仅内侧设置有开口。
本发明还提供了一种组织样品快速检测方法，采用上述组织样品快速检测系统对组织样品进行检测，包括如下步骤：
1)将组织样品用清洗液清洗；
2)采用组织处理液对组织样品处理；
3)采用苏木素溶液对组织样品染色；
4)将染色后的组织样品置于分化液中进行分化处理；
5)将分化处理后的组织样品置于返蓝液中进行返蓝处理；
6)将经分化、返蓝处理后的组织样品封片后，放置于组织样品检测装置中进行检测；
7)在显微镜下观察待检测组织样品的正反两面的形态，拍照。
作为优选，步骤2)-5)之后均包含用清洗液清洗的步骤。
作为优选，组织处理液为含有曲拉通X-100的缓冲液，或者为含有曲拉通X-100和I型胶原酶的缓冲液。
作为优选，组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.1％～0.5％。
优选地，组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.2％～0.3％。
更优选地，组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.3％。
作为优选，组织处理液中I型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～5％。
优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～0.5％。更优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.1％。
作为优选，缓冲液的浓度为0.001mol/L～0.1mol/L。优选地，缓冲液的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L。优选地，缓冲液的浓度为0.008mol/L～0.012mol/L。更优选地，缓冲液的浓度为0.01mol/L。
组织处理液中的缓冲液为PBS缓冲液。
作为优选，苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为30％～100％。
优选地，苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为50％～100％。
更优选地，苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为100％。
作为优选，分化液为盐酸酒精，返蓝液为氨水溶液，清洗液为PBS缓冲液。
作为优选，盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度为0.2％～1.5％，优选为0.5％～1％；氨水溶液中氨的质量百分浓度为0.1～0.5％，优选为0.11％～0.22％，PBS缓冲液的浓度为0.001mol/L～0.1mol/L。
更优选地，盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度为1％，氨水溶液中氨的质量百分浓度为0.22％，PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L。
作为优选，组织处理液对组织样品处理时间为8～15分钟。进一步优选地，组织处理液对组织样品处理时间为10分钟。
作为优选，苏木素溶液的染色时间为2～6分钟。进一步优选地，苏木素溶液的染色时间为2～3分钟。进一步优选地，苏木素溶液染色时间为3分钟。
作为优选，分化时间为0.5～2分钟。
作为优选，返蓝时间为0.5～3分钟。进一步优选地，返蓝时间为2分钟。
本发明组织样品检测装置置于显微镜下能正反两面翻转或多面翻转观察组织样品形态。
在常规的病理检测中，组织需要经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后再用染色液着色，切片会破坏组织的完整性，对组织或细胞造成损坏，整个检测过程需要36h。而本发明的检测方法缩短组织病理检测的时间和减少操作流程，不需要进行组织包埋和切片，通过采用本发明的组织处理液处理后，对组织进行染色，整个时间检测只需20-30min，使用方便，且能够实现全面观察。
本发明还提供了上述染色试剂盒或组织样品快速检测系统在制备检测受试者的组织结构、细胞组成、数量和/或组织病变的产品中的用途，组织选自毛囊、皮肤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、肠或肠系膜。
作为优选，受试者为哺乳动物。
在本发明中，组织为毛囊，用途为在制备毛囊检测或脱发诊断产品中的用途。
本发明提供了组织样品快速检测系统、检测方法及应用。该染色试剂盒包括组织处理液、苏木素溶液、分化液、返蓝液和清洗液，组织处理液为含有曲拉通X-100的缓冲液，或者为含有曲拉通X-100和I型胶原酶的缓冲液。本发明具有的技术效果如下：
本发明的组织处理液(曲拉通或曲拉通和Ⅰ型胶原酶的组合)能增加组织的通透性和透光度，更利于染色液渗透到组织内部，染色后的效果较好。与传统的二甲苯、苯等透明剂相比，本发明的组织处理液的毒性显著降低，处理时间更短，透明化效果显著提高。并且，本发明的组织处理液对毛囊组织处理后的染色效果也优于现有技术已公开的曲拉通+尿素的透明剂处理后的染色效果，在处理时间和染色效果方面也优于现有技术已公开的胰蛋白酶+核酸酶+曲拉通处理后的染色效果。
本发明的组织样品检测装置通过对传统的载玻片的结构进行了改进，增加了样品检测区，能够对组织样品的正反双面，从而实现对组织的整体状态进行全面检测，可清晰显示不同层面的细胞和结构。通过设置固定检测玻片的插槽和空腔，能够减少检测玻片的滑动和污染风险。
本发明的染色方法与传统的HE染色方法相比，具有以下优点：
1)本发明的染色方法省略了伊红染色的步骤，仅采用苏木素对毛囊进行整体染色，本发明染色效果更佳，染色后组织细胞核呈现蓝紫色，显示清晰。
2)本发明的检测方法不仅缩短组织病理检测的时间和减少操作流程，不需要进行组织包埋和切片，直接对组织进行染色，且时间只需20-30min，使用方便，且能够实现全面观察。
3)本发明的染色试剂和组织样品检测装置，能够实现较厚的组织样品(厚度≤1mm)直接染色处理后即可直接在显微镜下观察组织结构和细胞形态，不仅将检测时间从原来的36h缩短至30min，还能够减少了组织或细胞在切片过程中损坏的风险，并能够提供组织样品正反两面的检测结果，方便同时，本发明的方法具有检测时间短、操作更简便，使用的试剂更少、成本更低廉、检测更灵敏等优点。
附图说明
图1为毛囊的苏木素染色照片，图1A-G依次为浓度为0.3％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％和4％的曲拉通X-100的PBS溶液处理后的毛囊苏木素染色照片，图1H为PBS溶液处理后的毛囊苏木素染色照片；
图2为不同染料组成及浓度染料染色后的毛囊照片，图2A为100％浓度的苏木素染色的毛囊照片，图2B为50％浓度的苏木素染色的毛囊照片，图2C为30％浓度的苏木素染色的毛囊照片，图2D为100％浓度的苏木素+伊红染色后的毛囊照片；
图3为不同染色时间的毛囊染色照片，图3A和3B为染色3分钟的毛囊照片，图3C为染色5分钟的毛囊照片，图3D为染色15分钟的毛囊照片；
图4为不同配方的组织处理液预处理后的毛囊染色照片，图4A为实施例1预处理的毛囊染色照片，图4B为实施例2的组合预处理后的毛囊染色照片，图4C为对比例1的组合预处理后的毛囊染色照片，图4D为对比例2的组合物预处理后的毛囊染色照片，图4E为对比例3的组合预处理后的毛囊染色照片，图4F为对比例4的组合预处理后的毛囊染色照片，图4G为对比例5的组合预处理后的，图4H为对比例6的组合预处理后的毛囊染色照片；
图5为不同检测方法获得的人毛囊照片，图5A-C为采用本发明实施例1的方法获得的人毛囊照片，图5D为采用传统的HE切片染色方法获得的人毛囊照片；
图6为组织样品检测装置的主视图；
图7为组织样品检测装置的立体图；
图8为组织样品检测装置的侧视图；
图9为检测玻片的主视图；
图10为检测玻片的侧视图；
其中：1-标记区，2-第一支架，3-第二支架，4-样品检测区，5-夹持区，6-空腔，7-插槽，8-检测玻片，801-上玻片，802-下玻片。
具体实施方式
本发明公开了组织样品快速检测系统、检测方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明组织样品快速检测系统、检测方法及应用中所用试剂、仪器、材料、设备均可由市场购得。苏木素原液为市售的苏木素染液，目前市售的苏木素染液都能用于本发明染色，例如，Harris苏木素染色液(珠海贝索公司等)、Cole氏苏木素染色液(金克隆生物技术等)、Mayer苏木素染色液(南京生航生物等)、改良Lillie-Mayer苏木素染色液(Solarbio公司等)、Ehrlich苏木素染色液(上海如吉生物等)、Carazzi苏木素染色液(南京森贝伽生物等)、Gill改良苏木素染色液(北京雷根生物等)。
100％的苏木素即为苏木素原液，50％的苏木素溶液为将苏木素原液用双蒸水稀释到50％，30％的苏木素溶液为将苏木素原液用双蒸水稀释到30％。
本发明的盐酸酒精分化液的配制方法：将0.2ml、0.5ml、1ml或1.5ml浓盐酸(37％)分别溶于200ml 75％乙醇溶液中，搅拌均匀，即得浓盐酸体积百分浓度为0.2％、0.5％、1％或1.5％的分化液。本发明的氨水返蓝液的配制方法：将0.5ml、1ml或2.2ml的质量分数为28％氨水分别溶于400ml双蒸水中，搅拌均匀，即得氨的质量百分浓度为0.11％、0.22％或0.5％的返蓝液。
本发明组织处理液中的曲拉通X-100溶液的配制方法：将10μL、20μL、30μL、40μL或50μL的曲拉通X-100分别溶于10ml的0.01mol/L PBS缓冲液，即得浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％曲拉通X-100的PBS溶液。
本发明组织处理液中的I型胶原酶溶液的配制方法：将5mg、10mg、20mg、30mg、40mg或50mg的I型胶原酶分别溶于10ml的0.01mol/L PBS缓冲液，即得浓度为0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％I型胶原酶的PBS溶液。
0.01mol/L PBS缓冲液和0.01mol/LPBS清洗液的配制方法相同，配制方法如下：将称取的23.48g市售PBS缓冲液粉末(pH7.3)溶于2L双蒸水中，搅拌均匀即得。
本发明伊红染液的制备方法：2g伊红溶于1000ml 75％乙醇溶液中，再加入2ml冰醋酸，搅拌均匀呈半透明状。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1组织样品快速检测系统
本发明的组织样品快速检测系统，包括染色试剂盒、组织样品检测装置和显微镜，所述染色试剂盒包括以下试剂：0.3％曲拉通X-100的PBS溶液(组织处理液)、苏木素溶液(苏木素浓度为100％)、盐酸酒精分化液(浓盐酸体积百分浓度为1％)、氨水返蓝液(氨的质量百分浓度为0.22％)和PBS清洗液(PBS浓度0.01mol/L)。
本发明的组织样品检测装置包含固定装置和检测单元，所述固定装置由标记区1、夹持区5和固定区组成，所述固定区位于所述标记区和所述夹持区之间，所述标记区1靠近所述固定区的一侧与所述夹持区5靠近所述固定区的一侧均设置有插槽7，所述固定区由第一支架2和第二支架3构成，所述第一支架2和第二支架3均设置有容纳检测单元的空腔6，所述第一支架2、第二支架3、标记区和夹持区围成的矩形为样品检测区4，所述检测单元为检测玻片8。
在其中一个或多个实施例，所述检测玻片分为上玻片801或下玻片802，所述组织样品放置于所述上玻片801和下玻片802之间，装有组织样品的检测玻片8放置于所述第一支架2和第二支架3的空腔中。
在其中一个或多个实施例中，所述标记区1、夹持区5和固定区为一体成型结构，所述固定区的第一支架2或第二支架3由左支架和右支架组成，所述左支架或右支架为可拆卸连接。
实施例2组织样品快速检测系统
本发明的组织样品快速检测系统，包括染色试剂盒、组织样品检测装置和显微镜，所述染色试剂盒包括以下试剂：0.3％曲拉通X-100+0.1％I型胶原酶的PBS溶液(组织处理液)、苏木素溶液(苏木素浓度为100％)、盐酸酒精分化液(盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度为1％)、氨水返蓝液(氨的质量百分浓度为0.22％)和PBS清洗液(PBS浓度为0.01mol/L)。
本实施例的组织样品检测装置同实施例1。
实施例3组织样品快速检测方法
1)取5个离心管，向每个离心管中加入实施例1的组织处理液、苏木素溶液、盐酸酒精分化液、返蓝液或PBS清洗液的其中一种溶液，每种溶液的加入体积均为200μL。
2)从生理盐水中取出待检测的毛囊，用清洗液清洗1分钟；
3)采用组织处理液对毛囊处理10分钟，用清洗液清洗1分钟；
4)采用染色液(苏木素溶液)对毛囊染色2分钟，用清洗液清洗0.5分钟；
5)将毛囊置于分化液中分化处理0.5分钟；用清洗液清洗0.5分钟；
6)毛囊置于返蓝液中处理2分钟，用清洗液清洗1分钟；
7)向检测玻片上滴加2滴甘油，将毛囊置于甘油里用检测玻片进行封片。
8)将封片后的毛囊置于毛囊检测装置上进行观察和检测，并用正置光学显微镜(80i，Nikon)和图像采集系统(SPOT FLEX)拍照。
实施例4组织样品快速检测方法
1)取5个离心管，向每个离心管中加入实施例2的组织处理液、苏木素溶液、盐酸酒精分化液、返蓝液或PBS清洗液的其中一种溶液，每种溶液的加入体积均为200μL。
2)从生理盐水中取出待检测的毛囊，用清洗液清洗1分钟；
3)采用组织处理液对毛囊处理10分钟，用清洗液清洗1分钟；
4)采用染色液(苏木素溶液)对毛囊染色3分钟，用清洗液清洗1分钟；
5)将毛囊置于分化液中分化处理1分钟；用清洗液清洗1分钟；
6)毛囊置于返蓝液中处理2分钟，用清洗液清洗1分钟；
7)向检测玻片上滴加2滴甘油，将毛囊置于甘油里用检测玻片进行封片。
8)将封片后的毛囊置于毛囊检测装置上进行观察和检测，并用正置光学显微镜(80i，Nikon)和图像采集系统(SPOT FLEX)拍照。
试验例1不同浓度的曲拉通对染色结果的影响实验
检测组织：C57小鼠的胡须毛囊，为了考察不同浓度的曲拉通溶液对染色结果的影响，采用实验组1-8的染色试剂盒对C57小鼠的胡须毛囊进行检测，实验组1-8的染色试剂盒的组成如表1所示，检测方法如下：
1)取5个离心管，向每个离心管中加入组织处理液、苏木素溶液、盐酸酒精分化液、返蓝液或PBS清洗液的其中一种溶液，每种溶液的加入体积均为200μL。
2)从生理盐水中取出待检测的毛囊，用清洗液清洗1分钟；
3)采用组织处理液对毛囊处理10分钟，用清洗液清洗1分钟；
4)采用染色液对毛囊染色2分钟，用清洗液清洗0.5分钟；
5)将毛囊置于分化液中分化处理0.5分钟；用清洗液清洗0.5分钟；
6)毛囊置于返蓝液中处理2分钟，用清洗液清洗1分钟；
7)向检测玻片上滴加2滴甘油，将毛囊置于甘油里用检测玻片进行封片。
8)将封片后的毛囊置于毛囊检测装置上进行观察和检测，并用正置光学显微镜(80i，Nikon)和图像采集系统(SPOT FLEX)拍照。采用图像清晰度评定免费版0.4软件对实验组1-8染色后组织清晰度进行评价。
表1不同浓度的曲拉通对染色结果的影响
注：该清晰度测定结果为相对值，仅说明本批次实验组之间的相对清晰度。表1中盐酸酒精的百分浓度是指盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度，表1中氨水溶液的百分浓度是指氨水溶液中氨的质量百分浓度。
不同浓度的曲拉通X-100处理后的实验结果参见表1和图1，当曲拉通X-100的浓度为0.05～0.3％(图1A-C)时，染色后的图片清晰度均大于75％，其中曲拉通X-100为0.3％时，组织透光度改善最明显；表明0.3％的曲拉通X-100能够在毛囊细胞膜上形成具有合适的孔隙率和大小的开口，有利于苏木素染料均匀渗入到组织内部。当曲拉通X-100的浓度过高时(大于1％)会破坏组织结构，影响染色效果，组织透光度变差，细胞核染色不清晰(参见图1D-G)，染色后的图片清晰度均小于55％。而未添加曲拉通X-100(参见图1H)打孔，染料无法进入组织和细胞核中，细胞核染色不完全，特别是组织内部所显示细胞核数量较少，且染后的图片清晰度仅为34.48％。
试验例2不同染料组成及浓度对染色结果的影响实验
为了考察不同浓度的苏木素和不同染料组成对染色结果的影响，采用实验组1、9-11的染色试剂盒(参见表2)对C57小鼠的胡须毛囊进行检测，检测方法与试验例1所述的方法相同。
实验结果参见表2和图2，实验组1(苏木素浓度为100％)和实验组9(苏木素为50％)染色2分钟后，组织透光度好，细胞核染色完全，染色后清晰度均在80％以上，而实验组10(苏木素为30％)染色2分钟后，细胞核染色不完全，染色后清晰度仅为64.6％。而实验组11为苏木素和伊红混合染料染色，染色后组织颜色太深，组织透光度差，结构模糊，细胞核不清楚。实验结果表明，在对毛囊进行整体染色时，采用苏木素的染色效果优于苏木素和伊红混合染料的染色效果，且苏木素溶液的浓度在50％-100％时染色效果较好。
表2不同浓度的苏木素和不同染料组成对染色结果的影响
注：表2中盐酸酒精的百分浓度是指盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度，表2中氨水溶液的百分浓度是指氨水溶液中氨的质量百分浓度。
试验例3不同染色时间对染色结果的影响实验
为了考察不同浓度的苏木素对染色结果的影响，采用不同染色时间对C57小鼠的胡须毛囊进行检测，苏木素的浓度为100％，曲拉通X-100的浓度为0.3％，图3A和图3B为苏木素染色3分钟，可见组织透光度好，结构明显，细胞核染色清晰；图3C为苏木素染色5分钟，组织透光度变低，结构较明显，细胞核染色较清晰；图3D为苏木素染色15分钟，组织透光度差，结构不明显，细胞核染色不清楚。
试验例4不同配方的组织处理液对染色效果的影响实验
为了提高染色效果，将0.3％的曲拉通X-100溶液分别与H2O2、I型胶原酶和尿素中的其中一种或两种组合使用，考察不同配方的组织处理液(参见表3)对染色效果的影响。实施例1-2和对比例1-6的检测方法如下：
1)取5个离心管，向每个离心管中加入组织处理液、苏木素溶液、盐酸酒精分化液、返蓝液或PBS清洗液的其中一种溶液，每种溶液的加入体积均为200μL；
2)从生理盐水取出待检测的毛囊，用清洗液清洗1分钟；
3)采用组织处理液对毛囊处理10分钟，用清洗液清洗1分钟；
4)采用染色液对毛囊染色3分钟，用清洗液清洗0.5分钟；
5)将毛囊置于分化液中分化处理1分钟；用清洗液清洗0.5分钟；
6)毛囊置于返蓝液中处理2分钟，用清洗液清洗1分钟；
7)向检测玻片上滴加2滴甘油，将毛囊置于甘油里用检测玻片进行封片。
8)将封片后的毛囊置于毛囊检测装置上进行观察和检测，并用正置光学显微镜(80i，Nikon)和图像采集系统(SPOT FLEX)拍照。采用图像清晰度评定免费版0.4软件对实施例1-2和对比例1-6染色后组织清晰度进行评价。
表3不同配方的组织处理液对染色效果的影响
注：表3中盐酸酒精的百分浓度是指盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度，表3中氨水溶液的百分浓度是指氨水溶液中氨的质量百分浓度。
实验结果参见表3和图4，对比例3(曲拉通X-100+H2O2)、对比例4(曲拉通X-100+H2O2+尿素)、对比例5(曲拉通X-100+H2O2+I型胶原酶)、对比例6(曲拉通X-100+H2O2+尿素+I型胶原酶)的处理液在处理组织的过程中，H2O2均氧化产生氧气，造成检测玻片中产生气泡，因此，对比例3-6染色后效果均不理想(参见图4E-H)。
曲拉通X-100中加入I型胶原酶形成的处理液(实施例2)处理毛囊后，能够增加毛囊的通透性，更利于染料进入毛囊内部，使染色更为彻底。与单独采用曲拉通X-100(实施例1)相比(清晰度为82％)，曲拉通X-100+I型胶原酶染色效果得到显著提高，染色后的清晰度为100％。
201810150257.3专利记载了TritonX-100(曲拉通X-100)和尿素组成的生物材料透明剂具有优良的使组织透明的能力，Triton X-100可以增强尿素相对于生物材料的渗透性，可以很大地改进具有高光散射性质的不透明生物材料的透明度(参见201810150257.3专利的说明书第4页的[0069]至[0074])。而本发明采用曲拉通X-100中加入尿素形成的处理液(对比例1)对毛囊进行处理后，由于尿素具有水合作用，使组织发生了膨胀，组织通透性和透光度变差，无法清晰地检测毛囊的内部结构，与单独采用曲拉通X-100(实施例1)相比(清晰度为82％)，曲拉通X-100+尿素处理后染色效果变差，染色后的清晰度为71.29％。
在曲拉通X-100中同时加入I型胶原酶和尿素(对比例2)对毛囊进行处理，与单用曲拉通X-100的染色效果相比，染色效果变差，染色后的清晰度为72.53％。这是由于尿素影响了I型胶原酶增加毛囊通透性的作用，同时使组织发生了膨胀，组织透光度变差，影响了染色效果。
上述实验结果表明，在苏木素染色前，采用曲拉通X-100单独使用(实施例1)或曲拉通X-100与I型胶原酶的组合(实施例2)处理后毛囊染色效果优于曲拉通X-100+尿素的处理后毛囊染色的效果。
试验例4本发明的检测方法与传统染色方法的比较实验
检测组织：移植针提取的人毛囊，本发明的检测方法的步骤如下：将人毛囊后生理盐水清洗；放置于实施例1的染色试剂中进行染色处理；将染色后的组织样品置于在检测玻片上，滴加90％甘油覆盖组织，用检测玻片进行盖片；将包含组织样品的检测单元从固定装置侧面的空腔插入固定在固定装置上；置于显微镜下观察结果，可正反两面翻转观察组织形态。而传统染色方法采用常规切片HE染色方法，实验结果如图5所示，图5A-C均为采用实施例1的方法和本发明的装置对人毛囊进行不同平面拍摄图像，可清晰显示不同层面的细胞和结构，具有立体感。图5D为常规切片HE染色拍摄的图像，由于切片厚度较薄，仅能显示一个平面的细胞和结构，且不立体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (19)
1.一种染色试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：组织处理液、苏木素溶液、分化液、返蓝液和清洗液，所述组织处理液为含有曲拉通X-100的缓冲液，或者为含有曲拉通X-100和I型胶原酶的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的染色试剂盒，其特征在于，所述组织处理液中曲拉通X-100的体积百分浓度为0.1％～0.5％。
3.根据权利要求1所述的染色试剂盒，其特征在于，所述组织处理液中I型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～5％，缓冲液的浓度为0.001mol/L～0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述的染色试剂盒，其特征在于，所述苏木素溶液中苏木素原液的体积百分含量为30％～100％。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的染色试剂盒，其特征在于，所述分化液为盐酸酒精，所述返蓝液为氨水溶液，所述清洗液为PBS缓冲液。
6.根据权利要求5所述的染色试剂盒，其特征在于，所述盐酸酒精中浓盐酸的体积百分浓度为0.2％～1.5％；所述氨水溶液中氨的质量百分浓度为0.1％～0.5％，所述PBS缓冲液的浓度为0.001mol/L～0.1mol/L。
7.一种染色方法，其特征在于，采用权利要求1至6中任一项所述染色试剂盒对组织样品进行染色，包括如下步骤：
1)将组织样品用清洗液清洗；
2)采用组织处理液对组织样品处理；
3)采用苏木素溶液对组织样品染色；
4)将染色后的组织样品置于分化液中进行分化处理；
5)将分化处理后的组织样品置于返蓝液中进行返蓝处理。
8.根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于，所述步骤2)-5)之后均包含用清洗液清洗的步骤。
9.根据权利要求7或8所述的染色方法，其特征在于，所述组织处理液对组织样品处理时间为8～15分钟，所述苏木素溶液的染色时间为2～6分钟，所述分化时间为0.5～2分钟，所述返蓝时间为0.5～3分钟。
10.一种组织样品快速检测系统，其特征在于，包括权利要求1至6中任一项所述的染色试剂盒、组织样品检测装置和显微镜，所述组织样品检测装置包含固定装置和检测单元，
所述固定装置由标记区(1)、夹持区(5)和固定区组成，所述固定区位于所述标记区(1)和所述夹持区(5)之间，所述标记区(1)靠近所述固定区的一侧与所述夹持区(5)靠近所述固定区的一侧均设置有插槽(7)，所述固定区由第一支架(2)和第二支架(3)构成，所述第一支架(2)和第二支架(3)均设置有容纳检测单元的空腔(6)，所述第一支架(2)、第二支架(3)、标记区(1)和夹持区(5)围成的矩形为样品检测区(4)，
所述检测单元为检测玻片(8)。
11.根据权利要求10所述的组织样品快速检测系统，其特征在于，所述检测玻片包括上玻片(801)或下玻片(802)，组织样品放置于所述上玻片和下玻片之间，装有组织样品的检测玻片放置于所述第一支架和第二支架的空腔中。
12.根据权利要求10或11任一项所述的组织样品快速检测系统，其特征在于，所述标记区(1)、夹持区(5)和固定区为一体成型结构。
13.根据权利要求10或11任一项所述的组织样品快速检测系统，其特征在于，所述固定区的第一支架(2)或第二支架(3)由左支架和右支架组成，所述左支架或右支架为可拆卸连接。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的组织样品快速检测系统，其特征在于，所述第一支架(2)为中空结构，且第一支架(2)的内侧和外侧均设置有开口；第二支架(3)为中空结构，第二支架(3)仅内侧设置有开口。
15.一种组织样品快速检测方法，其特征在于，采用权利要求10至14中任一项所述组织样品快速检测系统对组织样品进行检测，包括如下步骤：
1)将组织样品用清洗液清洗；
2)采用组织处理液对组织样品处理；
3)采用苏木素溶液对组织样品染色；
4)将染色后的组织样品置于分化液中进行分化处理；
5)将分化处理后的组织样品置于返蓝液中进行返蓝处理；
6)将经分化、返蓝处理后的组织样品封片后，放置于组织样品检测装置中进行检测；
7)在显微镜下观察待检测组织样品的正反两面的形态，拍照。
16.根据权利要求15所述的组织样品快速检测方法，其特征在于，所述步骤2)-5)之后均包含用清洗液清洗的步骤。
17.根据权利要求15或16所述的组织样品快速检测方法，其特征在于，所述组织处理液对组织样品处理时间为8～15分钟，所述苏木素溶液的染色时间为2～6分钟，所述分化时间为0.5～2分钟，所述返蓝时间为0.5～3分钟。
18.权利要求1至6中任一项所述染色试剂盒或权利要求10至14中任一项所述组织样品快速检测系统在制备检测受试者的组织结构、细胞组成、数量和/或组织病变的产品中的用途，其特征在于，所述组织选自毛囊、皮肤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、肠或肠系膜。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述组织为毛囊，所述用途为在制备毛囊检测或脱发诊断产品中的用途。
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