CN104274861A - 一种牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，包括可注射透明质酸凝胶支架材料的制备、牙胚间充质细胞的分离与培养和细胞与可注射支架材料复合物不同微环境中的构建和移植物的取材及组织学检测三大步骤。本发明的方法中第三代牙胚间充质细胞是用组织工程方法再生牙本质牙髓样结构的种子细胞，TGF-β1在牙本质牙髓样结构的构建中发挥着至关重要的作用，同时透明质酸凝胶作为可注射支架材料，适合用于可注射牙组织工程，将三者结合并注射到去髓后的牙髓腔中进行构建，可在低创伤的情况下实现牙本质牙髓复合体样结构的原位再生，为临床上牙本质牙髓复合体的原位和生理性再生提供了新的可能。

Description

一种牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法

技术领域

本发明涉及一种牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，属于利用工程化方法再造出具有生物学活性构造领域。 

背景技术

长期以来，牙体损伤给各年龄段的人带来了诸多苦恼，严重影响了人们的咀嚼，美观和心理。临床上，严重受损的牙齿往往需要去髓，牙齿则因此失去活性，丧失对外界刺激的抵抗能力，很可能需要再次修补，最终也有可能需要将整颗牙齿拔除。目前临床上对于去牙髓后的牙齿常规治疗方法主要是牙科材料充填和义齿修复。但这些治疗手段的最大缺点是牙齿缺乏感觉、咀嚼效率不高，抗力差、固位困难等。 

如何利用工程化方法再造出具有生物学活性的牙齿结构，并用于修复牙体牙髓损伤即牙髓牙本质再生，是目前科研领域科学家们所追求的目标，研究的热点课题之一。 

利用组织工程方法构建并再生牙髓牙本质样复合体，尤其是可注射组织工程方法来再生牙髓牙本质样特殊的结构，有望为临床治疗提供一个更好的选择。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，为临床治疗提供了一个更好的选择，具有重大的医疗意义。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，其创新点在于：包括可注射透明质酸凝胶支架材料的制备、牙胚间充质细胞的分离及培养和细胞与可注射支架材料复合物不同微环境中的构建三大步骤。 

进一步的，所述可注射透明质酸凝胶支架材料的制备步骤为精密称取0.5g 透明质酸，将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中，直至完全溶解； 

向透明质酸溶液中加入20ml 1,4-丁二醇缩水甘油醚交联剂，把溶液平铺于培养皿，室温下交联3d；

之后加入含有9 mg/ml氯化钠、 0.03 mg/ml磷酸二氢钾和0.14 mg/ml磷酸氢二钠，且pH=7的磷酸盐缓冲液PBS溶胀后置于透析袋中先后在去离子水和PBS溶液中室温下分别透析一天，以除去未参加反应的交联剂；

得到的凝胶状透明质酸再用PBS调成含20mg/ml 透明质酸溶液，最后用均质机打碎成0-400mm大小的凝胶颗粒；

置于4^oC冰箱密封保存备用，如用于细胞和体内实验，则应置于高压蒸汽灭菌后使用，设置蒸汽灭菌的温度为120^oC，灭菌时间为20 min。

进一步的，所述牙胚间充质细胞的分离和培养步骤为无菌分离新生乳猪的上下颌骨，将其置于75%的酒精中浸泡30min，于超净台中无菌分离其未萌出的磨牙胚，置于平衡盐溶液Hank’s 液中； 

之后用0.25%的氯霉素洗3次并于摇床中振摇15min，随后于超净台中用镊子分离去除钙化的组织,将剩余组织用剪刀剪成1mm³的小块,剪碎的组织用含15%胎牛血清FBS，DMEM/F-12 1:1培养液溶解NB4胶原酶，将其配成0.2%的浓度，于37℃摇床消化60min；

将消化后的细胞悬液收集到新的离心管中，并用100μm的细胞滤器过滤得到单细胞悬液，之后离心，设置离心转速为1800rmp，离心时间为5min；

离心后的上清液继续用于消化剩余未消化完的组织，并以同样条件消化培养，细胞沉淀则用含15%胎牛血清FBS，DMEM / F-12 1:1培养液重悬细胞并于37℃，5%CO₂培养箱中培养，24小时后第一次换液，之后3天换一次液，待细胞长满80%-90%时用0.25%的胰蛋白酶将其消化，按1：3进行传代培养，传代后的培养液为含15%胎牛血清的DMEM / F-12 1:1培养液。

进一步的，所述细胞与可注射支架材料复合物不同微环境中的构建步骤分为裸鼠皮下注射细胞与可注射支架材料复合物的构建、牙片中注射细胞与可注射支架材料复合物裸鼠皮下植入和成年小型猪牙髓腔中注射细胞与可注射支架材料复合物的构建三种。 

进一步的，所述裸鼠皮下注射细胞与可注射支架材料复合物的构建步骤为将体外培养的第三代牙胚间充质细胞DMC用含10%胎牛血清FBS、10ng/mL TGF-β1和10mM β-磷酸甘油的DMEM / F-12 1:1培养液进行诱导，待其长满至80%-90%时，用0.25%的胰蛋白酶将其消化； 

之后计数并离心收集起来，随后将灭菌好的透明质酸凝胶按5′10⁷细胞/ml凝胶材料混合，并在其中加入1μg/ml的TGF-β1形成细胞材料复合物，将细胞材料复合物按0.2ml的注射量注射至裸鼠背部皮下。

进一步的，裸鼠皮下的另一种构建方法具体为：牙片中注射细胞与可注射支架材料复合物裸鼠皮下植入步骤为将收集的成人健康牙齿用生理盐水洗涤，之后用高速涡轮机从牙颈处横向磨至成1mm厚的薄片，将其泡在生理盐水中，随后用0.25%的氯霉素冲洗5-8次，随后4℃静置过夜，用拔髓针拔去牙片中的牙髓，随后用75%酒精浸泡1.5h，用Hank’s平衡盐缓冲液洗3遍，随后将其浸泡于Hank’s中4℃放置； 

注射前一周将其浸没在含15%FBS， DMEM / F-12 1:1培养液中于37℃，5%CO₂培养箱中预培养，将细胞材料复合物先注射到牙片的髓腔中，之后把注射满细胞材料复合物的牙片植入裸鼠背部皮下。

进一步的，还有一种构建方法具体为：成年小型猪牙髓腔中注射细胞与可注射支架材料复合物构建步骤为取2个月大，10kg重的小型猪麻醉后，用高速涡轮机在其下颌第一，第二前磨牙的牙冠顶端磨出一个小口，之后用拔髓针将其牙髓全部拔去，并将其牙根管用扩大针适度扩大； 

之后用水硬性仮封材作为封闭剂将牙齿髓洞临时封闭；两周后，去除封闭剂，依次用生理盐水、次氯酸钠及3%的过氧化氢冲洗髓腔，之后将细胞材料复合物注射到髓腔中，直至注满溢出；

随后用封闭剂而至富士Ⅱ玻璃离子水门汀封闭髓洞，待一个月后取材染色，这期间每日按0.1mg/kg服用他克莫司胶囊，如是自体回植则不需服用此药。

本方法通过组织学H&E染色和Masson染色证明了在实验中均能观察到典型的牙本质牙髓样复合物结构，在该复合物结构中有成牙本质细胞样细胞沿髓腔呈极性排列，且能观察到典型的放射状牙本质小管结构，通过DSP免疫组化特异性染色进一步证实了再生的组织为牙本质牙髓样结构，证实了采用这样一种可注射构建方法可以再生组织工程牙髓牙本质样结构的结果。 

本发明的有益效果：本发明的这种牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法中，（1）TGF-β生长因子家族尤其是TGF-β1在此调控机制中发挥着举足轻重的作用，因此，用牙胚间充质细胞来构建牙本质和牙髓组织，并在构建体系中加入TGF-β1，就可以在无牙胚上皮诱导的条件下构建出较为典型的牙本质和牙髓组织； 

（2）透明质酸凝胶颗粒在本发明中是充当一种生物相容性较好的可注射支架材料，它能很好地促进混入其中的细胞生长和分化，由于凝胶颗粒的可流动性，它能和细胞及生长因子非常均匀地混合成一体；相对于传统的三维特定结构的支架材料，透明质酸凝胶颗粒的可注射性提供了很多的便利，正是由于支架的可注射性，使得牙髓牙本质的再生或者修复可以采用注射的方式进行，非常适合临床上对于龋病、牙髓病的治疗。

附图说明

图1为10W实验组样本取材后大体图； 

图 2为10W实验组样本HE染色图 40倍；

图3和图4 分别为图2中所标位置的局部放大H&E图 400倍；

图5为0W实验组样本Masson染色 40×；

图6、7、8分别是10W实验组样本Masson染色各个局部放大 400倍；

图9为对照组1样本取材后大体图；

图10为对照组1样本H&E染色图 40×；

图11和图12为图10中的C和D局部放大图200×；

图13为10W对照组2样本取材后大体图；

图14对照组2样本H&E染色图 40×；

图15和图16为图14中的C和D局部放大图200×；

图17为10W实验组样本DSP免疫组化图片40×；

图18和图19为A中两个局部放大图400×；

图20为10W实验组样本DSP免疫组化空白对照组图片40×；

图21和图22为图20中局部放大图片400×；

图23和图24为猪正常牙DSP免疫组化图片（图23 100×，图24  400×）；

图25和图26为 猪正常牙DSP免疫组化空白对照组图片（图25 100×，图26 400×）；

图27为拔除牙髓后的牙片大体图；

图28为实验组细胞材料复合物注射到牙片髓腔后的大体图；

图29为实验组细胞材料复合物注射到牙片髓腔后裸鼠皮下植入图片；

图30为1 0W后样本取材大体图；

图31为样本H&E染色大体图；图32为样本Masson染色大体图；

图31-35为紧贴牙片的牙本质内壁有新的牙本质样结构生成示意图；

图36-38为紧贴牙片的牙本质内壁有新的牙本质样结构生成示意图；

图39为裸鼠皮下牙片中构建10W的实验组样本牙本质涎蛋白( DSP )免疫组化染色局部图（100×）；

图40为图39中的局部放大图（400×）；

图41为小型猪牙髓腔中构建1M的实验组样本H&E染色大体图；

图42和图43为图42中局部的不同倍数放大图（图42 100×，图43  400×）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明。 

实施例1 

一种牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法：裸鼠皮下注射细胞与可注射支架材料复合物的构建

1、可注射透明质酸凝胶支架材料的制备

药品：透明质酸（HA，山东福瑞达生物医药有限公司）；1,4-丁二醇缩水甘油醚（BDDE，美国sigma公司）；氢氧化钠，氯化钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠（国药集团化学制药有限公司）。

步骤：精确称取0.5g HA，将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中，直至完全溶解。向HA溶液中加入20ml BDDE，把溶液平铺于培养皿，室温下交联3d； 

之后加入适量磷酸盐缓冲液（PBS：氯化钠(NaCl) 9mg/ml, 磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 0.03 mg/ml, 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄×2H₂O）0.14 mg/ml，pH=7）溶胀后置于透析袋中先后在去离子水和PBS溶液中室温下分别透析一天，以除去未参加反应的交联剂；

得到的凝胶状HA再用PBS调成含20mg/ml HA，最后用均质机（T10 basic, IKA, Germany）打碎成0-400mm大小的凝胶颗粒。置于4^oC冰箱密封保存备用，用于细胞和体内实验前，置于高压蒸汽灭菌（120^oC,20 min）后使用。

2、牙胚间充质细胞分离和培养

无菌分离新生乳猪的上下颌骨，将其置于75%的酒精中浸泡30min，于超净台中无菌分离其未萌出的磨牙胚于Hank’s 液(HyClone)中，之后用0.25%的氯霉素洗3次并于摇床中振摇15min，随后于超净台中用镊子分离去除钙化的组织,将剩余组织用剪刀剪成约1mm³的小块,剪碎的组织用含15%胎牛血清（FETAL BOVINE SERUM，SAFC Biosciences），DMEM/F-12 1:1（HyClone）培养液溶解NB4胶原酶(Collagenase NB 4 Standard Grade, SERVA)，将其配成0.2%的浓度，于37℃摇床消化60min,将消化后的细胞悬液收集到新的离心管中，并用100μm的细胞滤器(Cell Strainer ,100μm,BD Falcon)过滤得到单细胞悬液；

之后离心（1800rpm,5min),上清液继续用于消化剩余未消化完的组织，并以同样条件消化培养，细胞沉淀用含15%胎牛血清， DMEM / F-12 1:1培养液重悬细胞并于37℃，5%CO₂培养箱中培养，24小时后第一次换液，之后3天换一次液，待细胞长满80%-90%时用0.25%的胰蛋白酶（HyClone）将其消化；

按1比3进行传代培养，传代后的培养液为含15%胎牛血清的DMEM / F-12 1:1培养液。

3、牙胚间充质细胞的鉴定

将消化好的第二代牙胚间充质细胞（dental mesenchymal cells，DMC）接种至放有预处理盖玻片的六孔板中培养，待细胞在盖玻片上长至约90%时，吸去培养液，将盖玻片用PBS洗三遍，4%多聚甲醛4℃固定10min，PBS洗3次、擦干，1%曲拉通×100（沪试，国药集团化学试剂有限公司）破裂细胞膜5min，PBS洗3次，1%牛血清白蛋白第V部分（Amresco进口分装，上海源聚生物科技有限公司）封闭30min（每5min冲一次），甩干；

之后用1%牛血清白蛋白稀释的抗波形丝蛋白单克隆抗体（Monoclonal Anti-Vimentin，SIGMA)湿盒里4℃孵育过夜，第二天用1%牛血清白蛋白洗5min，6次，甩干，加入1%牛血清白蛋白稀释的二抗Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG（Alexa Fluor? 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，Invitrogen)37℃湿盒避光孵育1小时，蒸馏水洗3遍，用1%的PI(PI染色试剂盒，贝博生物）衬核45s，蒸馏水冲洗3次，共聚焦显微镜拍照。

4、细胞与可注射支架材料复合物不同微环境中构建

4.1方案一：裸鼠皮下注射细胞与可注射支架材料复合物构建

将体外培养的第三代DMC用含10%胎牛血清、10ng/mL TGF-β1和10mM β-磷酸甘油（Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate, SIGMA）的DMEM / F-12 1:1培养液进行诱导，待其长满至80%-90%时，用0.25%的胰蛋白酶将其消化，之后计数并离心收集起来；

随后将灭菌好的透明质酸凝胶按5′10⁷细胞/ml凝胶材料混合，并在其中加入1μg/ml的TGF-β1，将该组作为实验组；

于此同时设立相应的对照组，对照组1将灭菌好的透明质酸凝胶按5′10⁷细胞/ml与常规培养未诱导的第三代牙胚间充质细胞混合；对照组2为单纯的无菌透明质酸凝胶支架材料。

实验组：DMC+透明质酸凝胶+TGF-β1 

对照组1：DMC+透明质酸凝胶

对照组2：透明质酸凝胶

将以上各组用1ml的注射器收集起来，按每样本0.2ml分别注射至裸鼠背部皮下，每只裸鼠注入4个样本，每个组注射至少6个样本。

实验组的条件范围：细胞和材料的相对浓度一般为1′10⁶细胞/ml—5′10⁸细胞/ml，5′10⁶细胞/ml—5′10⁸细胞/ml较佳，2.5′10⁷细胞/ml-5′10⁸细胞/ml 最佳。 

注射时TGF-β1的混合浓度：0.01μg/ml-4μg/ml，0.1μg/ml-2μg/ml较佳，1μg/ml-2μg/ml最佳。 

时间：5-15周，7周-15周较佳，10周-15周最佳； 

4.2方案二：牙片中注射细胞与可注射支架材料复合物裸鼠皮下植入

将收集的成人健康牙齿用生理盐水洗涤，之后用高速涡轮机从牙颈处横向磨至成大概1mm厚的薄片，将其泡在生理盐水中，随后用0.25%的氯霉素冲洗5-8次，随后4℃静置过夜 ，用拔髓针拔去牙片中的牙髓，随后用75%酒精浸泡1.5h，用Hank’s平衡盐缓冲液洗3遍，随后将其浸泡于Hank’s中4℃放置；

注射前一周将其浸没在含15%FBS， DMEM / F-12 1:1培养液中于37℃，5%CO₂培养箱中预培养，待培养的细胞长满后，将以上实验组细胞材料复合物注射到牙片的髓腔中，之后把注射满细胞材料复合物的牙片植入裸鼠背部皮下。

4.3方案三：成年小型猪牙髓腔中注射细胞与可注射支架材料复合物

取2个月大，约10kg重的小型猪麻醉后，用高速涡轮机在其下颌第一，第二前磨牙的牙冠顶端磨出一个小口，之后用拔髓针将其牙髓拔去，并将其牙根管用扩大针适度扩大，之后用水硬性仮封材（GC ，J日本）将髓洞封闭；

两周后，待培养的细胞长好，注射前用生理盐水、次氯酸钠及3%的过氧化氢冲洗髓腔；

之后将以上实验组细胞材料复合物注射到髓腔中，直至注满溢出，随后用封闭剂而至富士Ⅱ玻璃离子水门汀（GC，日本）封闭髓洞，待一个月后取材染色，这期间每日按0.1mg/kg服用他克莫司胶囊（普乐可复）。

5、移植物取材及组织学检测

5.1裸鼠皮下移植物取材和组织学检测

于术后10W取材，将裸鼠颈椎脱臼处死，用剪刀在裸鼠背部正中剪开一个小口，之后分离背部皮肤，暴露样本，随之用镊子及剪刀小心分离获取样本，并将样本置于4%多聚甲醛中于4℃固定24h，之后用PBS洗2次，并用10%EDTA室温下脱钙2个月，待脱钙完全后进行常规脱水，石蜡包埋，制备5μm连续切片，进行H&E及Masson三色法染色（Masson三色染色试剂盒，MST-8003，福建迈新生物技术开发有限公司）及牙本质涎蛋白DSP免疫组化染色。

5.2小型猪牙髓腔移植物取材和组织学检测

于术后一个月取材，将小型猪过量麻醉致死，随后用涡轮机将回植牙的牙冠按其牙根的走向分离开，并将其拔出，之后用4%多聚甲醛中于4℃固定24h，之后用PBS洗2次，并用10%EDTA室温下脱钙2个月，待脱钙完全后进行常规脱水，石蜡包埋，制备5μm连续切片，进行H&E及Masson三色法染色（Masson三色染色试剂盒，MST-8003，福建迈新生物技术开发有限公司）。

Masson 三色法染色步骤：（1）石蜡切片脱蜡至水；（2）滴加1滴(100μl)Masson复合染色液（试剂A）染色5min，蒸馏水冲掉染液；（3）滴加1滴(100μl)磷钼酸（试剂C）染色5min，甩干；（4）直接滴加一滴(100μl)苯胺蓝（试剂D）染色5min，蒸馏水稍冲；（5）滴加1滴(100μl)分化液（试剂B）分化30~60s，将其甩掉再重复分化一次；（6）依次用95%酒精、无水酒精脱水，二甲苯I、II、III透明、中性树脂封片。 

DSP免疫组化染色步骤：（1）石蜡切片脱蜡至水；（2）用PBS洗3次, 5min/次；（3）滴加3%过氧化氢溶液室温下放15分钟阻断内源性酶；（4）PBS漂洗3次，5min/次；（5）0.1%胰蛋白酶于湿盒中放37℃恒温箱中消化15分钟；（6）PBS漂洗3次，5min/次；(6)山羊血清（用0.5%BSA稀释比例1：10）37℃恒温箱中孵育30分钟，甩去血清；（7）加入兔抗人DSP（H300）（SANTA CRUZ）第一抗体（用0.5%BSA稀释比例1：100），4℃孵育过夜；（8）室温放置1小时，之后用PBS洗3次, 5min/次；（9）加入抗兔二抗，37℃恒温恒湿箱孵育30分钟；(10)用PBS洗3次, 5min/次；（11）用DAB显色液惊吓控制显色, 显色约4-7分钟，充分水洗；（12）用苏木素染核2分钟，75%盐酸酒精分化，流水冲30分钟返蓝；（13）依次经过85%、90%、95%、100%梯度酒精脱水，二甲苯I、II、III透明，中性树脂封片。 

、试验结果

A．裸鼠皮下10W样本大体及组织学染色实验结果如图所示

图1为10W实验组样本取材后大体图；图 2为10W实验组样本HE染色图 40倍；图3和图4 分别为图2中所标位置的局部放大H&E图 400倍。

从图1中可以看出裸鼠皮下构建10W的实验组样本为坚硬组织。从组织学结构看，有多个牙本质牙髓复合体样结构形成，如图2所示，管状牙本质样结构沿髓腔样结构呈放射状排列，如图3中箭头所示。同时还可以看到髓腔样结构中的红血球被染成橘红色，如图4中箭头所示。材料已基本降解。此外还可见成牙本质样细胞沿牙本质样结构边缘呈柱状极性排列（图3和图4）。上述结构特征均符合牙髓牙本质组织的特殊结构。 

．裸鼠皮下构建10W的实验组样本Masson染色图如图所示

如图5所示10W实验组样本Masson染色 40×; 图6、7、8分别是10W实验组样本Masson染色各个局部放大 400倍。

从图5中可以看出10W实验组样本中胶原被染成蓝色，红血球呈橘红色（如黑色箭头所示，图8），在局部放大的图中均可见管状牙本质样结构沿髓腔样结构呈放射性排列（如白色箭头所示，图6和图8），此外还可见成牙本质样细胞沿髓腔样结构呈极性排列（如箭头所示，图7）。 

．裸鼠皮下构建10W的对照组1样本大体图及H&E染色图如图所示

如图9所示，对照组1样本取材后大体图；图10为对照组1样本H&E染色图 40×；图11和图12为图10中的C和D局部放大图200×。

从图9中可以看出对照组1样本在裸鼠皮下构建10W后基本没有坚硬的牙体样组织生成，组织相对较软（如图9所示），且从H&E染色图中（如图10、11、12所示）看不出有特异性组织生成，没有观察到牙本质牙髓样结构生成；细胞和材料相间，有一部分均匀的软组织或纤维样组织。图12中左部箭头所示为细胞，右部箭头所示为没有降解的材料，即未诱导的细胞和同样材料复合后不形成牙体样坚硬的结构。 

．裸鼠皮下构建10W的对照组2样本大体图及H&E染色图如图所示

如图13所示：10W对照组2样本取材后大体图；图14对照组2样本H&E染色图 40×；图15和图16为图14中的C和D局部放大图200×。

从图13中可以看出，透明质酸凝胶材料注射到体内10W后依然柔软透明，材料大部分仍未降解（如箭头所示，图15中）。 

．裸鼠皮下构建10W的实验组样本牙本质涎蛋白( DSP )免疫组化染色图如图所示

如图17所示，10W实验组样本DSP免疫组化图片40×，图18和图19为A中两个局部放大图400×；图20为10W实验组样本DSP免疫组化空白对照组图片40×，图21和图22为图20中局部放大图片400×，图23和图24为猪正常牙DSP免疫组化图片（图23 100×，图24  400×），图25和图26为 猪正常牙DSP免疫组化空白对照组图片（图25 100×，图26 400×）.

从图17中可以看出裸鼠皮下构建10W的实验组样本中DSP染色为阳性（如箭头所示的区域，图18），其染色与正常牙中染色一致（如箭头所示右部褐色区域，图24），图中也可以看到实验组管状牙本质样结构为DSP阳性染色（如箭头所指区域，图18，19），正常牙中也显示管状牙本质样结构为DSP阳性染色（如箭头所指区域，图24），尽管实验组中管状结构没有正常牙明显，但两者都显示DSP阳性染色，证明了实验组与正常牙的一致性，实验组与正常牙的空白对照组都显示DSP阴性染色（图20，图21、图22、图25、26）。

．裸鼠皮下牙片髓腔中构建10W的实验组样本大体及H&E染色和Masson染色图如图所示

如图27所示，拔除牙髓后的牙片大体图；图28为实验组细胞材料复合物注射到牙片髓腔后的大体图；图29为实验组细胞材料复合物注射到牙片髓腔后裸鼠皮下植入图片；图30为1 0W后样本取材大体图；图31为样本H&E染色大体图；图32为样本Masson染色大体图。

从图27中可以看出，把实验组细胞材料注射到牙片的髓腔中，于裸鼠皮下构建10W后整个髓腔中都充满了新生的组织（如箭头所示，图30中），H&E染色和Masson染色图显示了髓腔中有多个牙本质牙髓复合物样结构生成（如箭头所示，图31，图32）。 

．裸鼠皮下牙片中构建10W的实验组样本H&E染色局部放大图 400×

从图中可以看出紧贴牙片的牙本质内壁有新的牙本质样结构生成（图中箭头所示，图33～35），有成牙本质样细胞沿着新生的牙本质内壁成线性柱状极化排列（如左侧箭头所示，图34），在生成的牙髓样结构中有血管生成（如最上侧箭头所示,图34），同样有管状牙本质样结构沿髓腔样结构向外呈放射状排列（如前后对称箭头指向的区域所示，图34）。

．裸鼠皮下牙片中构建10W实验组样本Masson染色局部放大图 400×

从图中可以看出紧贴牙片的牙本质内壁有新的牙本质样结构生成（图箭头所示，图36～38），有成牙本质细胞样细胞沿着新生的牙本质内壁成线性柱状极性排列（如上部绿色箭头所示，图36），在生成的牙髓样结构中有血管生成（如箭头指向左下侧的箭头所示,图36），同样有管状牙本质样结构沿髓腔样结构向外呈放射状排列（如对称箭头指向的区域所示，图36）。

图39为裸鼠皮下牙片中构建10W的实验组样本牙本质涎蛋白( DSP )免疫组化染色局部图（100×）；图40为图39中的局部放大图（400×），从图39～40中可以看出，在牙片的髓腔中生成的牙本质牙髓复合物样结构中DSP染色呈阳性（如箭头所示，图39,图40）。 

图41为小型猪牙髓腔中构建1M的实验组样本H&E染色大体图，图42和图43为图42中局部的不同倍数放大图（图42 100×，图43  400×）当构建环境换成猪牙髓腔时，再生组织的结构从图41～43中可以看出，在实验组牙髓腔中紧贴牙本质内侧有新生牙本质样结构生成（图箭头所示，图43）。从而进一步确认了上述牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法。 

基于本实施例实验组大体图、H&E染色Masson染色和DSP免疫组化染色结果可以看出，经短暂诱导的第三代牙胚间充质细胞是用组织工程方法再生牙本质牙髓样结构的种子细胞， TGF-β1在牙本质牙髓样结构的构建中发挥着至关重要的作用，同时透明质酸凝胶作为可注射支架材料，适合用于可注射牙组织工程，是本发明方法的三个要素。 

在临床应用中，可用成体干细胞如骨髓干细胞，脂肪干细胞，牙髓干细胞，牙乳头干细胞，脱落乳牙干细胞，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）及胚胎干细胞等不同细胞代替本发明中的牙胚来源间充质细胞。 

当在临床上将三者结合并注射到去髓后的牙髓腔中构建一段时间后，有可能在低创伤的情况下实现牙本质牙髓复合体样结构的原位再生，为临床上牙本质牙髓复合体的原位和生理性再生提供了新的可能。 

Claims (7)

1.一种牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，其特征在于：包括可注射透明质酸凝胶支架材料的制备、牙胚间充质细胞的分离及培养和细胞与可注射支架材料复合物不同微环境中的构建三大步骤。

2.根据权利要求1所述的牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，其特征在于：所述可注射透明质酸凝胶支架材料的制备步骤为称取0.5g 透明质酸，将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中，直至完全溶解；

向透明质酸溶液中加入20ml 1,4-丁二醇缩水甘油醚交联剂，把溶液平铺于培养皿，室温下交联3d；

之后加入含有9mg/ml氯化钠、0.03 mg/ml磷酸二氢钾和0.14 mg/ml磷酸氢二钠，且pH=7的磷酸盐缓冲液PBS溶胀后置于透析袋中先后在去离子水和PBS溶液中室温下分别透析一天；

得到的凝胶状透明质酸再用PBS调成含20mg/ml 透明质酸溶液，最后用均质机打碎成0-400mm大小的凝胶颗粒。

3.根据权利要求1所述的牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，其特征在于：所述牙胚间充质细胞的分离和培养步骤为无菌分离新生乳猪的上下颌骨，将其置于75%的酒精中浸泡30min，于超净台中无菌分离其未萌出的磨牙胚，置于平衡盐溶液Hank’s 液中；

之后用0.25%的氯霉素洗3次并于摇床中振摇15min，随后于超净台中用镊子分离去除钙化的组织,将剩余组织用剪刀剪成1mm³的小块,剪碎的组织用含15%胎牛血清FBS， DMEM/F-12 1:1培养液溶解NB4胶原酶，将其配成0.2%的浓度，于37℃摇床消化60min；

将消化后的细胞悬液收集到新的离心管中，并用100μm的细胞滤器过滤得到单细胞悬液，之后离心，设置离心转速为1800rmp，离心时间为5min；

离心后的上清液继续用于消化剩余未消化完的组织，并以同样条件消化培养，细胞沉淀则用含15%胎牛血清FBS， DMEM / F-12 1:1培养液重悬细胞并于37℃，5%CO₂培养箱中培养，24小时后第一次换液，之后3天换一次液，待细胞长满80%-90%时用0.25%的胰蛋白酶将其消化，按1：3进行传代培养，传代后的培养液为含15%胎牛血清的DMEM / F-12 1:1培养液。

4.根据权利要求1所述的牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，其特征在于：所述细胞与可注射支架材料复合物不同微环境中的构建分为裸鼠皮下注射细胞与可注射支架材料复合物的构建、牙片中注射细胞与可注射支架材料复合物裸鼠皮下植入和成年小型猪牙髓腔中注射细胞与可注射支架材料复合物的构建三种类型。

5.根据权利要求4所述的牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，其特征在于：所述裸鼠皮下注射细胞与可注射支架材料复合物的构建步骤为将体外培养的第三代牙胚间充质细胞DMC用含10%胎牛血清FBS、10ng/mL TGF-β1和10mM β-磷酸甘油的DMEM / F-12 1:1培养液进行诱导，待其长满至80%-90%时，用0.25%的胰蛋白酶将其消化；

之后计数并离心收集起来，随后将灭菌好的透明质酸凝胶按5′10⁷细胞/ml凝胶材料混合，并在其中加入1μg/ml的TGF-β1形成细胞材料复合物，将细胞材料复合物按0.2ml的注射量注射至裸鼠背部皮下。

6.根据权利要求4所述的牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，其特征在于：所述牙片中注射细胞与可注射支架材料复合物裸鼠皮下植入步骤为将收集的成人健康牙齿用生理盐水洗涤，之后用高速涡轮机从牙颈处横向磨至成1mm厚的薄片，将其泡在生理盐水中，随后用0.25%的氯霉素冲洗5-8次，随后4℃静置过夜，用拔髓针拔去牙片中的牙髓，随后用75%酒精浸泡1.5h，用Hank’s平衡盐缓冲液洗3遍，随后将其浸泡于Hank’s中4℃放置；

注射前一周将其浸没在含15%FBS， DMEM / F-12 1:1培养液中于37℃，5%CO₂培养箱中预培养，将细胞材料复合物先注射到牙片的髓腔中，之后把注射满细胞材料复合物的牙片植入裸鼠背部皮下。

7.根据权利要求4所述的牙髓牙本质再生的可注射组织工程构建方法，其特征在于：所述成年小型猪牙髓腔中注射细胞与可注射支架材料复合物构建步骤为取2个月大，10kg重的小型猪麻醉后，用高速涡轮机在其下颌第一，第二前磨牙的牙冠顶端磨出一个小口，之后用拔髓针将其牙髓全部拔去，并将其牙根管用扩大针适度扩大；

之后用水硬性仮封材作为封闭剂将牙齿髓洞临时封闭；两周后，去除封闭剂，依次用生理盐水、次氯酸钠及3%的过氧化氢冲洗髓腔，之后将细胞材料复合物注射到髓腔中，直至注满溢出；

随后用封闭剂而至富士Ⅱ玻璃离子水门汀封闭髓洞，待一个月后取材染色，这期间每日按0.1mg/kg服用他克莫司胶囊，如是自体回植则不需服用此药。