CN103585177A - 间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞的用途，特别是间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途，本发明还涉及包含间充质干细胞和/或基因修饰的间充质干细胞的组合物和细胞膜片。本发明成功验证了不同来源的MSC对牙周骨缺损和牙周炎软组织的修复治疗作用，为扩大种子细胞来源提供了有力的证据；同时，证明了HGF基因修饰的MSC对牙周骨缺损和牙周炎软组织的修复治疗作用要优于单纯的MSC，表明HGF和MSC可在牙周骨组织或软组织缺损和牙周组织再生的修复治疗中发挥协同作用。

Description

间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞的用途

技术领域

本发明涉及间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞的用途，特别是间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复多种原因（例如牙周病）引起的牙周骨组织及软组织缺损和/或用于牙周组织再生的产品中的用途，本发明还涉及基因修饰的间充质干细胞，以及包含间充质干细胞和/或基因修饰的间充质干细胞的组合物和细胞膜片。

背景技术

牙周病是口腔临床的常见病，是以牙周组织（包括牙周膜、牙骨质、牙槽骨和牙龈）的破坏为主要特征的感染性疾病，临床的主要表现为牙龈炎症和出血、牙周袋的形成、牙槽骨吸收及牙齿松动、移位直至丧失。牙周疾病不仅是牙齿丧失的主要原因，而且与某些全身系统性疾病的发生有关。牙周疾病在人群中普遍存在，其中牙龈炎在儿童和青少年中的患病率达70％～90%，慢性牙周炎达60%以上，侵袭性牙周炎为5%～15%，而且牙周炎占拔牙原因的30％～44％。一旦牙周附着和牙槽骨的破坏已经发生，最理想的方式是完整地重建健康的牙周组织。目前，临床常采用的牙周炎治疗方法包括：牙周基础治疗（洁治、刮治、根面平整）、牙周翻瓣术及牙周组织再生术。牙周组织再生国内外最新的研究方法有：（1）引导性组织再生术（guidedtissue regeneration,GTR）:将可吸收或不可吸收的生物膜或钛膜置于牙周组织缺损处，以避免上皮组织长入牙周缺损内，牙周缺损内可置入充填材料、人工骨、载体或牙周再生诱导因子等。（2）组织工程牙周组织再生技术，其中，种子细胞的获取是研究的热点。目前发现的与牙齿相关的干细胞主要包括：牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞。对这些细胞的深入研究，不仅对牙齿的发生、发育有积极作用，而且可能成为牙齿组织工程种子细胞的来源。当前，随着保存了细胞外基质的细胞膜片技术的发展，为进一步模拟组织工程中种子细胞在体内生长所需的基质微环境，从而促进细胞更好增殖分化提供了新的思路。

目前，已有许多学者尝试利用各种细胞治疗牙周病引起的牙周骨组织及软组织缺损及促进牙周组织的再生，但实验动物多采用大鼠、小鼠和狗等，这些动物的牙周情况与人类尚有差距。许多研究表明，小型猪的牙颌系统、解剖结构、生理病理等与人有极大的相似性。20世纪50年代初期，美国首先开始研究并推出了小型猪。中国实验用小型猪包括贵州香猪、海南五指山猪等，具有体型小、性成熟早、遗传背景清晰、繁殖能力强、抗疾病力较强的特点，达到了国家一级实验动物标准。小型猪作为大型动物模型已越来越多地应用于医学及口腔医学领域的研究。小型猪正常牙周组织结构与人类有极大的相似性，且小型猪可有自发性牙龈炎和牙周炎，并已经具有较成熟的牙周炎动物模型。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）在体内外可以诱导分化为骨、软骨等多种细胞，可以改善多种损伤组织的结构与功能，其表面标志和分化能力与牙周膜干细胞具有许多共性，因此，MSC是治疗牙周骨组织及软组织缺损和促进牙周组织再生的理想种子细胞。

发明内容

本发明的发明人经过大量实验，惊奇地发现不同来源的间充质干细胞可用于修复多种原因（例如牙周病）引起的牙周骨组织及软组织缺损和用于促进牙周组织再生，并且进一步证明了经过基因修饰的间充质干细胞、特别是肝细胞生长因子（HGF）基因修饰的干细胞具有更好的治疗效果。

本发明第一方面涉及间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

根据本发明第一方面的用途，其中所述的间充质干细胞来源于牙周膜、脐带、脂肪组织、骨髓、脐血或胎盘。

本发明的第二方面涉及基因修饰的间充质干细胞，其特征在于将外源肝细胞生长因子基因导入间充质干细胞，并使外源肝细胞生长因子表达。

根据本发明第二方面的间充质干细胞，其中所述的间充质干细胞来源于牙周膜、脂肪组织、骨髓、脐带、脐血或胎盘。

本发明第三方面还涉及本发明第二方面所述的间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

本发明还涉及组合物，其包含有效量的间充质干细胞以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生。在本发明的一个实施方案中，所述组合物为包含间充质干细胞的细胞悬液。优选地，所述的间充质干细胞来源于牙周膜、脂肪组织、骨髓、脐带、脐血或胎盘。

本发明还涉及细胞膜片，其包含有效量的间充质干细胞，所述细胞膜片用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生。优选地，所述的间充质干细胞来源于牙周膜、脂肪组织、骨髓、脐带、脐血或胎盘。

本发明还涉及组合物，其包含有效量的本发明第二方面任一项的间充质干细胞以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还涉及细胞膜片，其包含有效量的本发明第二方面任一项的间充质干细胞。

本发明还涉及本发明的组合物或细胞膜片在制备用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

本发明还涉及肝细胞生长因子在制备用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

以下进一步详述本发明。

本发明首先证实了不同来源的间充质干细胞对牙周骨组织及软组织缺损和牙周组织再生的治疗作用，因此本发明第一方面涉及间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

本发明首先从不同组织（例如牙周膜、骨髓、脂肪和脐带）中分离培养间充质干细胞，并对得到的MSC分别进行细胞表面标志检测和成骨、成脂肪诱导分化，证明为MSC。接着将得到的MSC制成细胞悬液或细胞膜片，并用实验证明了不同来源的间充质干细胞对牙周骨组织及软组织缺损和牙周组织再生具有较好的治疗作用。

因此本发明还涉及包括有效量的间充质干细胞的组合物或细胞膜片，所述组合物或细胞膜片用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织或软组织缺损和/或用于促进牙周组织再生。

同时，发明人也发现，MSC局部应用治疗牙周病也存在一定的局限性，因为细胞植入体内后脱离了特殊的培养环境，只能通过微循环渗透方式摄取营养，而营养所及范围仅在100-200μm之间。因此，90%以上的细胞在植入的几天内因营养缺乏而很快死亡，细胞并不能很好发挥其抗炎、抗凋亡、促增殖等功能。

发明人经过大量的实验，令人惊奇地发现，采用基因治疗策略，用肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）修饰的MSC治疗牙周病，具有干细胞治疗和细胞生长因子治疗的双重优势，并发挥协同作用。一方面通过局部注射或移植，间充质干细胞大部分蓄留或归巢于损伤的牙周组织，在发挥干细胞修复作用的同时，使局部高表达HGF，同时发挥HGF的生物学作用；而高表达HGF又可以促进MSC的存活和增殖，从而加强MSC的治疗效果。

因此本发明的第二方面涉及基因修饰的间充质干细胞，其特征在于将外源肝细胞生长因子基因导入间充质干细胞，并使肝细胞生长因子表达。在本发明的实施方案中，所述肝细胞生长因子表达是指分泌到细胞外的分泌表达。

其中所述将外源肝细胞生长因子基因导入间充质干细胞的方法为本领域常用的外源基因导入细胞的方法，例如可以为病毒转染、质粒转染和脂质体转染等。在本发明的一个实施方案中，所述将外源基因导入间充质干细胞的方法为病毒转染的方法。在本发明的一个实施方案中，所述病毒为腺病毒。

在本发明的一个实施方案中，所述的HGF为人肝细胞生长因子，其基因序列记载于Miyazawa K等，Molecular cloning and sequenceanalysis of cDNA for human hepatocyte growth fator.BiochemBiophys Res Commun,1989,163(2):967-973。

本发明所述的HGF修饰的间充质干细胞制备方法为：

（1）分离、培养MSC（例如牙周膜、骨髓、脂肪或者脐带来源的），体外培养至第2-5代、例如第3代，用肝细胞生长因子对MSC进行修饰（例如采用携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒（Ad-HGF）进行转染）。修饰后12-48小时，例如24小时，即可收集细胞悬液用于注射治疗；或者

（2）取第2-5代、例如第3代MSC细胞接种于培养板，加入抗坏血酸-2-磷酸诱导成为细胞膜片，细胞成膜片后用HGF进行修饰（例如采用Ad-HGF进行转染），修饰后12-48小时，例如24小时，收集细胞膜片用于移植治疗。

对于HGF修饰的MSC，分别检测细胞培养上清中HGF的表达（例如采用ELISA法）；检测细胞表面分子标志（例如采用流式细胞术）；检测细胞增殖（例如采用Dy670染料法）；检测细胞抗缺氧损伤能力（例如采用缺氧模型）。

实验证明，HGF修饰的MSC可以归巢到损伤牙周组织的局部，并表达HGF。HGF不但能够发挥抗炎、促进血管生成等生物学效应，还能促进移植的MSC细胞的存活和增殖；而MSC则能够发挥其免疫调节作用，减轻损伤局部的炎症。在HGF和MSC的联合作用下，可有效减轻牙周组织损伤，从而达到治疗目的。

因此本发明还涉及本发明第二方面任一项所述的基因修饰的间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

本发明还涉及组合物或细胞膜片，其包含有效量的间充质干细胞或者本发明第二方面任一项所述的基因修饰的间充质干细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述基因修饰的间充质干细胞是指用HGF修饰的间充质干细胞，即通过导入HGF基因而大量表达HGF的间充质干细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物或细胞膜片用于治疗牙周病、修复牙周病引起的牙周骨组织及软组织缺损和/或用于促进牙周组织再生。

在本发明的一个实施方案中，采用MSC或HGF修饰的MSC治疗牙周骨骨缺损的方法是：

于小型猪下颌第一磨牙建立实验性牙周炎模型后，于骨缺损区移植入MSC制成的细胞膜片或HGF修饰的MSC细胞膜片或注射MSC或HGF修饰的MSC细胞悬液。临床检查（包括菌斑指数、龈沟出血指数、牙周袋深度、临床附着丧失）和影像学、组织学等指标来评价治疗效果。

因此本发明还涉及一种治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或牙周组织再生的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的间充质干细胞或本发明第二方面任一项所述的基因修饰的间充质干细胞。在本发明的一个实施方案中，其中所述间充质干细胞来源于牙周膜、脂肪组织、骨髓或脐带。在本发明的一个实施方案中，以细胞膜片移植或细胞悬液注射的方式用于上述治疗。

在本发明中，所述间充质干细胞是指来源于发育早期的中胚层和外胚层的一类干细胞，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。不表达造血干细胞系的表面标志如CD14、CD31、CD34、CD45等及白细胞分化抗原HLA-DR，但表达CD29、CD44、CD90、CD105、CD166、CD73等表面标志。在本发明的实施方案中，所述间充质干细胞选自牙周膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。

在本发明中，所述间充质干细胞来源于哺乳动物，在本发明的一个实施方案中，所述的间充质干细胞来自选自以下的哺乳动物：人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。

在本发明中，所述基因修饰的间充质干细胞是指将外源肝细胞生长因子基因导入间充质干细胞后，外源肝细胞生长因子基因得以表达的间充质干细胞。

在本发明中，所述用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或用于牙周组织再生是指用于自体或异体的疾病的治疗或组织再生。

在本发明中，所述牙周病主要包括牙龈炎和牙周炎两大类，前者只发生在牙龈组织，而后者则是累及四种牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）的慢性感染性疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏，其主要临床表现是牙龈炎症、出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙槽骨高度降低、牙齿松动、移位、咀嚼无力，严重者牙齿可自行脱落或者导致牙齿的拔除。

在本发明中，所述牙周组织即指牙周支持组织，包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质。

在本发明中，所述牙周骨组织包括牙槽骨和牙骨质。

在本发明中，所述牙周软组织包括牙龈和牙周膜。

所述牙周骨组织及软组织缺损包括慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、坏死性和溃疡性牙周病损伤所致的骨缺损及软组织缺损。

在本发明中，所述细胞膜片（cell sheet）是指由一层或数层排列紧密的细胞组成的膜片状物，细胞外基质作为细胞膜片的骨架，起到支撑作用并赋予细胞膜片良好的可塑性（亦可参考Vitamin CTreatment Promotes Mesenchymal Stem Cell Sheet Formation andTissue Regeneration by Elevating Telomerase Activity.J Cell Physiol.2012;227(9):3216-24.）。

在本发明中，所述细胞膜片可以由本领域技术人员按照本领域常规方法制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述细胞膜片的制备方法为：在间充质干细胞培养上清中加入20-50μg/ml（例如20μg/ml）抗坏血酸2-磷酸诱导剂，10-13天（例如10天）后MSCs形成细胞排列紧密的膜片状物，即得到细胞膜片。

在本发明中，所述未修饰是指未经HGF修饰，即未将外源HGF导入细胞。在本发明中，术语“产品”是指适于间充质干细胞应用的各种形式，例如药物、组合物、药物组合物、细胞膜片等。

在本发明中，术语“组合物”是具有本领域技术人员通常理解的含义，并且通常是指可直接或间接(例如临用前稀释)用于临床使用的形式，例如剂型、药物剂型、给药形式等。在临床应用领域或者药物领域，术语“组合物”还通常与“药物组合物”具有同等含义。

可改变本发明组合物或药物组合物中间充质干细胞的实际剂量水平，以便所得的干细胞量能有效针对具体宿主、患者在特定组合物及其组成以及相应给药方式的情况下得到所需的治疗或预防反应。剂量水平须根据具体干细胞的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度、疾病或病情的治疗进程、形成和修复（以及生成、再生、培养等）处理或操作的进程、以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，干细胞的剂量以及施用时间从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。因此，就本发明而言，本领域技术人员在本发明详细公开的信息的教导下，可以根据例如但不限于上述的具体情况来确定在具体情况下所适用的具体剂量，而无需要作具体限定。特别是，可以参考本发明实施例部分中所用的具体量来确定任一情况下的使用量。

本发明间充质干细胞可以单独（即以原样形式）或以药物组合物的形式给药。本发明药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将间充质干细胞加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂形式取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。在本发明的一个实施方案中，所述间充质干细胞存在于细胞相容的介质（例如，生理盐水如0.9%生理盐水，等等）中。在本发明的一个实施方案中，所述间充质干细胞存在于细胞相容的介质中，并且在低温下保存，例如在冷藏、冷冻等条件下保存，并且可任选在临用前复溶成适用根据本发明精神而施用的形式。

发明的有益效果

本发明成功验证了不同来源的MSC对牙周骨组织及软组织缺损的修复治疗作用，为扩大种子细胞来源提供了有力的证据；同时，证明了HGF基因修饰的MSC对牙周骨组织及软组织缺损的修复治疗作用要优于单纯的MSC，表明HGF和MSC可在牙周骨组织及软组织缺损的修复治疗中发挥协同作用。

附图说明

图1Ad-HGF修饰后MSC培养上清中HGF的含量，其中MSC-Null为Ad-Null修饰的MSC，Ad-Null是未转入外源基因的腺病毒；MSC-HGF为HGF修饰的MSC。

图2流式细胞术检测MSC细胞的表面分子。MSC-Null为Ad-Null修饰的MSC；MSC-HGF为HGF修饰的MSC；Control为不标抗体的阴性对照；Ad-Null的含义同上；MSC表达CD29、CD73、CD166、HLA-ABC，不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR。

图3Dy670染色法检测MSC细胞的增殖能力。con为Dye670处理MSC细胞后即刻检测结果；MSC-HGF24h为感染Ad-HGF后24h检测结果；MSC-HGF48h为感染Ad-HGF后48h检测结果；MSC-HGF96h为感染Ad-HGF后96h检测结果（上两排）；MSC-Null24h为感染Ad-Null后24h检测结果；MSCs-Null48h为感染Ad-Null后48h检测结果；MSC-Null96h为感染Ad-Null后96h检测结果（下两排）；Ad-Null的含义同上。

图4HGF对MSC细胞凋亡的作用。1为常氧培养的MSC对照；2为低氧培养的Ad-Null感染的MSC细胞；3为低氧培养的Ad-HGF感染的MSC细胞；Ad-Null的含义同上。

图5小型猪实验性牙周炎动物模型建立。A为建模前的牙齿及其CT影像；B为牙周手术后28天建立牙周炎模型的牙齿及其CT影像，可以看出，小型猪实验性牙周炎动物模型已成功建立。

图6间充质干细胞治疗小型猪实验性牙周炎疗效。A为对照组治疗前牙齿CT影像；B为对照组三个月后牙齿CT影像；C为HGF修饰的MSC膜片治疗前牙齿CT影像；D为HGF修饰的MSC膜片治疗三个月后牙齿CT影像;E为MSC膜片治疗前牙齿CT影像；F为MSC膜片治疗三个月后牙齿CT影像；G为MSC悬液治疗前牙齿CT影像，H为MSC悬液治疗后牙齿CT影像；I为对照组三个月后牙齿大体图像；J为HGF修饰的MSC膜片治疗三个月后牙齿大体图像；K为MSC膜片治疗三个月后牙齿大体图像；L为MSC悬液治疗后牙齿大体图像。

图7MSC治疗组与对照组小型猪牙周组织HE染色。A为HGF修饰的MSC膜片治疗组，可见骨缺损区形成大量牙槽骨，新形成的牙周膜纤维附着在牙骨质与牙槽骨之间，牙周组织再生良好。B为MSC膜片治疗组，可见骨缺损区形成较大量牙槽骨，新形成的牙周膜纤维附着在牙骨质与牙槽骨之间，牙周组织再生较好。C为MSC悬液治疗组，可见骨缺损区形成中等量牙槽骨，新形成的牙周膜纤维附着在牙骨质与牙槽骨之间，牙周组织再生较好。与经HGF修饰的MSC治疗组相比较，单纯MSC治疗组在牙周沟内上皮处可见较多的上皮条索。D为对照组，显示为典型的牙周炎表现，包括深牙周袋、缺乏新骨和新牙周膜形成，结合上皮可见大量粗而长的上皮钉突，牙周组织中可见大量炎性细胞浸润。图片中各字母的含义如下，D：牙本质，C：牙骨质，B：骨，PDL：牙周膜，SE:沟内上皮。

图8MSC治疗组与对照组小型猪牙周临床指标。Sheet AD-HGF表示经HGF修饰的牙周膜干细胞膜片组；sheet表示未修饰牙周膜干细胞膜片组；shame surgery表示对照组；injection表示未修饰牙周膜干细胞注射组。

图9MSC治疗组与对照组小型猪牙周组织中炎症因子的表达。经HGF修饰的MSC治疗组牙周软组织中，TNF-a和IFN-r的表达量低于单纯MSC治疗组和对照组，各组间均有显著性差异（P<0.05）；抗炎因子IL-10表达量高于单纯干细胞治疗组和对照组，各组间也存在显著性差异（P<0.05），其中HGF-PDLSCs表示经HGF修饰的牙周膜干细胞膜片组，PDLSCs表示未修饰牙周膜干细胞膜片组；CONTROL表示对照组。

图10MSC治疗组与对照组小型猪血液学指标中谷丙转氨酶（ALT）与尿素氮（BUN）的变化。Sheet AD-HGF表示经HGF修饰的牙周膜干细胞膜片组；sheet表示未修饰牙周膜干细胞膜片组；shamesurgery表示对照组；injection表示未修饰牙周膜干细胞注射组。

图11MSC治疗组与对照组小型猪血液学指标中免疫球蛋白IgA，IgG，IgE，IgM的变化。Sheet AD-HGF表示经HGF修饰的牙周膜干细胞膜片组；sheet表示未修饰牙周膜干细胞膜片组；shame surgery表示对照组；injection表示未修饰牙周膜干细胞注射组。

图12MSC治疗组与对照组小型猪血液学指标中CD20的变化。Sheet AD-HGF表示经HGF修饰的牙周膜干细胞膜片组；sheet表示未修饰牙周膜干细胞膜片组；shame surgery表示对照组；injection表示未修饰牙周膜干细胞注射组；横坐标分别表示0、3天、1周、2周、4周。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

其中α-MEM培养基购自美国GIBCO公司，其主要成分为丙酮酸钠、L-缬氨酸、丙氨酸、亚油酸、L-盐酸精氨酸、抗坏血酸、L-天门冬酰胺、生物素、L-天门冬氨酸、D-泛酸钙、L-盐酸半胱氨酸、叶酸、L-盐酸胱氨酸、肌醇、L-谷氨酰胺、烟酰胺、L-谷氨酸、氯化胆碱、甘氨酸、盐酸吡哆辛、L-盐酸组氨酸、核黄素、L-异亮氨酸、盐酸硫胺、L-亮氨酸、维生素、L-盐酸赖氨酸等。

实施例1间充质干细胞的分离、培养、扩增和基因修饰

（1）MSC的分离培养

分别采用组织块培养法或酶消化法分离牙周膜、脐带、脂肪或骨髓MSC，培养至第三代。对得到的MSC分别进行细胞表面标志检测和成骨、成脂诱导分化，证明为MSC。具体分离培养方法见下：

牙周膜MSC的分离培养方法：

麻醉下无菌拔除人阻生第三磨牙或正畸需要拔除牙齿，新鲜拔除的牙齿立即放入装有无菌PBS和抗生素的离心管，在12小时内分离培养牙周膜干细胞。轻轻剥离牙根中部1/3牙周膜组织，用PBS反复清洗，尽量剪碎，置含3mg/mlⅠ型胶原酶和4mg/ml Dispase溶液中，37℃水浴消化0.5-1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用适量培养基重悬成单细胞悬液。将细胞接种于10cm培养皿中，在α-MEM培养基（含10%胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺）中于37℃、5%CO₂培养，每3-5天换液一次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。1-2周后，取克隆性生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。

脐带MSC的分离培养方法：将新鲜脐带放入大培养皿中，PBS冲洗2遍，洗净表面血液。去除羊膜及血管：用组织剪将脐带剪成2cm左右的小段，每段用眼科剪纵向剖开，用血管钳去除脐带内三根血管（两条动脉、一条静脉），同时去除脐带外层羊膜。将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm³大小的组织块，取适量放入无菌培养皿中，覆盖70%培养皿的底面积。加入含10%胎牛血清的α-MEM培养基，左右摇晃1min，使组织块分散均匀。放入5%CO₂37℃培养箱中培养。第5天半量换培养基，继续培养10天左右有长梭形细胞从组织块边缘长出；14天左右待细胞团长至约50%时倒掉组织块，同时收集细胞传代培养。

脂肪MSC的分离培养方法：

抽取40-60ml脂肪与生理盐水混合物（包含脂肪量20-30ml），加入生理盐水离心2次，去除麻醉剂及血细胞，取上层脂肪层，加入0.075%I型胶原酶于37℃恒温摇床消化60min,1500r/min,离心15min；然后去除上层脂肪组织，沉淀用生理盐水重悬；100μm细胞筛过滤，去除残余结缔组织，再次离心，1500r/min，离心5min；加入5ml红细胞裂解液，裂解5min,用生理盐水清洗两遍，计数，用含10%胎牛血清的α-MEM培养基以10⁵/ml铺于培养皿中。记为P0代，待细胞长满后，0.05%胰蛋白酶消化，按照1:6的比例传代。传至第二代做细胞免疫表型鉴定及成脂、成骨分化鉴定。

骨髓MSC的分离培养方法：

肝素抗凝的正常人骨髓用1ml注射器过滤后，加入PBS稀释骨髓，充分混匀，按照1:1比例将骨髓细胞悬液小心加于淋巴细胞分离液Ficoll液面之上，1600rpm离心30min；吸出单个核细胞层，用两倍体积的PBS稀释，混匀，2000rpm离心8min；用PBS再洗细胞1次；用完全培养基（α-MEM＋10%FBS）重悬细胞计数后按2×10⁵cells/cm²密度分瓶培养；72h后换液，去除未贴壁细胞。以后每3-4天换液。细胞生长至80%汇合时，胰酶消化传代，记为第1代（P1）。

按照上述方法分离培养的MSC分别进行细胞表面标志检测和成骨、成脂诱导分化，证明为MSC。

（2）MSC的体外修饰

按照上述（1）中的方法制备得到MSC，体外培养至第3代，以每平方厘米培养面积接种10000个MSC，培养24小时后，按150MOI加入Ad-HGF（Ad-HGF的制备方法请参照专利“一种重组腺病毒及其在心肌缺血治疗中的应用，ZL专利号01129209.1”），对MSC进行转染，转染后24小时，得到HGF修饰的MSC。

（3）MSC膜片的制备和修饰

按照上述（1）中的方法制备得到MSC，体外培养至第3代，以每平方厘米培养面积接种10000个MSC,培养上清中加入20μg/ml抗坏血酸2-磷酸诱导细胞膜片，十天后MSC形成排列紧密的细胞膜片。按150MOI加入Ad-HGF对MSC膜片进行修饰，修饰后24小时，得到HGF修饰的MSC细胞膜片。

实施例2HGF修饰的MSC生物学性能检测

按照实施例1的方法，Ad-HGF感染MSC后48h，ELISA检测HGF的表达水平；流式细胞术检测细胞表面分子的改变；Dy670染料法检测细胞增殖能力的改变；低氧诱导模型检测HGF的抗凋亡效应。以下以骨髓MSC为例，检测HGF修饰的MSC生物学性能。

（1）HGF表达水平检测

Ad-HGF感染MSCs后，采用ELISA检测HGF的表达，结果显示，Ad-HGF感染后，HGF的表达水平逐渐升高，直至第7天（如图1所示）。

（2）HGF修饰对MSC细胞表面分子的影响

采用流式细胞术检测多种表面分子CD29、CD73、CD166、HLA-ABC、HLA-DR、CD31、CD34和CD45的表达，结果表明，感染Ad-HGF对MSC表面分子的表达没有影响（如图2所示）。

（3）HGF修饰对MSC增殖能力的影响

Dy670染料检测Ad-HGF感染后MSC的增殖能力。结果表明，感染Ad-HGF对MSC的增殖能力没有影响（如图3所示）。

（4）HGF的抗凋亡效应

在1%氧含量的条件下培养MSC，建立凋亡诱导模型，结果显示，

1%氧培养2h可诱导MSC凋亡，而Ad-HGF修饰后，可明显降低其凋亡细胞比例（如图4所示），表明经HGF基因修饰后的MSCs细胞可以减少组织修复过程中的细胞凋亡。

实施例3MSC对牙周骨组织及软组织缺损的修复治疗作用

首先建立五指山小型猪实验性牙周炎模型，然后，采用细胞膜片植入和细胞悬液注射技术，在CT影像和临床检查确定牙周炎模型建立后，将细胞膜片植入或细胞悬液注射至牙周炎骨缺损部位，分别于治疗后3d、7d、14d、28d和3m，观察牙周骨组织及软组织缺损的修复、牙周组织病理改变、血液学检测指标（血常规、血生化、免疫球蛋白）的改变、炎症因子表达改变等。以下以牙周膜MSC为例，检测MSC对牙周骨组织及软组织缺损的治疗作用。

（1）小型猪实验性牙周炎模型的建立

采用制造骨缺损及结扎丝线的方法建立小型猪实验性牙周炎模型。选择牙周健康14月龄小型猪6头，对照组、MSC细胞膜片组、及MSC细胞悬液注射组各2头。分别在下颌第一恒磨牙近中邻面形成3mm×5mm×7mm缺损（图5B），然后在缺损处放置4.0丝线，10d后取出，分别在术前、术后4周、3月进行临床指标（菌斑指数、龈沟出血指数、牙周袋深度、临床附着丧失）和影像学观察。从图5可以看出，小型猪实验性牙周炎模型已成功建立。

（2）MSC治疗小型猪实验性牙周炎所致骨组织及软组织缺损

①手术后4w，采用细胞膜片植入技术，将含有1×10⁷个MSC的细胞膜片移植入小型猪牙周炎骨缺损部位，以假手术作为对照。

②手术后4w，采用细胞悬液注射技术，将含有1×10⁷个MSC的细胞悬液注射至小型猪牙周炎骨缺损部位，以生理盐水作为对照。

（3）MSC治疗的结果

MSC膜片移植治疗后3月，牙周炎骨组织及软组织缺损的恢复明显好于对照组。CT薄层冠状扫描图显示与治疗前相比较，在第一磨牙近中颊根区域有明显的新生骨质影像，而对照组新生骨不明显。大体标本观察，MSC治疗组牙周组织修复较好，牙龈轻度红肿，而对照组牙龈明显红肿，退缩（如图6-B,F,I,K）。组织学HE染色结果显示，MSC治疗组可见骨缺损区形成较大量牙槽骨，新形成的牙周膜纤维附着在牙骨质与牙槽骨之间，牙周组织再生较好；而对照组，显示为典型的牙周炎表现，包括深牙周袋、缺乏新骨和新牙周膜形成，结合上皮可见大量粗而长的上皮钉突，牙周组织中可见大量炎性细胞浸润（如图7-B,C,D）。

MSC细胞膜片植入和细胞悬液注射组动物的牙周组织的临床指标（菌斑指数、龈沟出血指数、牙周袋深度、临床附着丧失）都好于对照组（如图8）。

实施例4HGF修饰的MSC对牙周骨组织及软组织缺损治疗作用

首先建立小型猪实验性牙周炎模型，然后，采用细胞膜片植入和细胞悬液注射技术，在CT影像和临床检查确定牙周炎模型建立后，将细胞膜片植入或细胞悬液注射至牙周炎骨缺损部位，分别于治疗后3d、7d、14d、28d和3m，观察牙周骨组织及软组织缺损的修复、牙周组织病理改变等。以下以HGF修饰的牙周膜MSC为例，检测HGF修饰的MSC对牙周骨组织及软组织缺损的治疗作用。

（1）小型猪实验性牙周炎模型的建立

同实施例3。另外，HGF基因修饰细胞膜片组2头猪。

（2）HGF修饰的MSC干预小型猪实验性牙周炎

手术后4w，采用细胞膜片植入技术将含有1×10⁷个HGF修饰的MSC的细胞膜片移植入小型猪牙周炎骨缺损部位，以假手术作为对照。同时设立未修饰的MSC治疗组。

（3）HGF修饰的MSC治疗的结果

HGF修饰的MSC治疗后3个月，牙周炎骨组织及软组织缺损的恢复明显好于对照组也好于未修饰MSC治疗组。CT薄层冠状扫描图显示与治疗前相比较，HGF修饰的MSC治疗组在第一磨牙近中颊根区域有明显的大量新生骨质影像，未修饰MSC治疗组有中等量的新生骨质影像,而对照组新生骨不明显。大体标本观察，HGF修饰的MSC治疗组牙周组织基本恢复正常,牙龈无红肿，MSC治疗组牙周组织修复较好，牙龈轻度红肿，而对照组牙龈明显红肿，退缩（如图6-B,D,F,H,J,L）。组织学HE染色结果显示，经HGF修饰的MSC治疗组，可见骨缺损区形成大量牙槽骨，新形成的牙周膜纤维附着在牙骨质与牙槽骨之间，牙周组织再生良好。与经HGF修饰的MSC治疗组相比较，单纯MSC治疗组在牙周沟内上皮处可见较多的上皮条索。而为对照组，显示为典型的牙周炎表现，包括深牙周袋、缺乏新骨和新牙周膜形成，结合上皮可见大量粗而长的上皮钉突（如图7-A,B,C,D）。

HGF修饰的MSC细胞膜片植入和细胞悬液注射组动物的牙周组织的临床指标（菌斑指数、龈沟出血指数、牙周袋深度、临床附着丧失）都好于对照组（如图8）。经HGF修饰的MSC治疗组牙周软组织中炎症刺激TNF-a和IFN-r的表达量低于单纯MSC治疗组和对照组，各组间均有显著性差异（P<0.05）；抗炎因子IL-10表达量高于单纯干细胞治疗组和对照组，各组间也存在显著性差异（P<0.05）（如图9）。

此外，由血液学检测指标（如图10的尿素氮和转氨酶）和免疫学检测指标显示（图11的免疫球蛋白，图12的CD20），HGF修饰的人MSC膜片植入和细胞悬液局部注射都未引起明显的血液学、血生化和免疫指标的改变。

HGF修饰的其它来源的MSC也具有相似的治疗效果。

上述结果表明，HGF修饰的MSC治疗组动物牙周软组织和牙周骨缺损的修复较未修饰MSC组动物好，且治疗后动物的炎性反应低于对照和未修饰MSC组，显示出HGF修饰的MSC比无HGF修饰的MSC具有更好的治疗效果。

采用小型猪实验性牙周炎模型，通过临床指标观察、影像学检查和组织学观察发现，无论是未修饰的人MSC，还是HGF基因修饰的人MSC，均成功地修复了牙周炎骨缺损，远远好于空白对照组。血液学研究表明，无论是治疗前、还是治疗后，各个治疗组的血常规、血生化、免疫球蛋白和免疫学指标都没有显著性变化，说明人MSC移植和注射治疗后，无炎性病变产生，无肝肾功能的损伤，无近期或者远期体液免疫反应产生和细胞免疫排斥反应产生。该研究结果为人MSC移植或注射治疗牙周炎，从而扩大种子细胞来源提供了有力的实验依据。

综上所述，MSC修复牙周骨组织及软组织缺损，获得良好的治疗效果，表明利用MSC进行组织工程牙周组织再生是可行的，可获得较好的效果。HGF修饰的MSC可在损伤牙周组织的局部表达HGF，通过分泌多种细胞因子发挥抗炎等生物学效应表明HGF和MSC可在牙周骨缺损治疗中，发挥协同效应。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (11)

1.间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述的间充质干细胞来源于牙周膜、脂肪组织、骨髓、脐带、脐血或胎盘。

3.基因修饰的间充质干细胞，其特征在于将外源肝细胞生长因子基因导入间充质干细胞，并使外源肝细胞生长因子表达。

4.权利要求3的间充质干细胞，其中所述的间充质干细胞来源于牙周膜、脂肪组织、骨髓、脐带、脐血或胎盘。

5.权利要求3或4的间充质干细胞在制备用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

6.组合物，其包含有效量的间充质干细胞以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或用于促进牙周组织再生；优选地，所述的间充质干细胞来源于牙周膜、脂肪组织、骨髓、脐带、脐血或胎盘。

7.细胞膜片，其包含有效量的间充质干细胞，所述细胞膜片用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或用于牙周组织再生；优选地，所述的间充质干细胞来源于牙周膜、脂肪组织、骨髓、脐带、脐血或胎盘。

8.组合物，其包含有效量的权利要求3或4的间充质干细胞以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。

9.细胞膜片，其包含有效量的权利要求3－5任一项的间充质干细胞。

10.权利要求6或8的组合物、或者权利要求7或9的细胞膜片在制备用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

11.肝细胞生长因子在制备用于治疗牙周病、修复牙周骨组织或软组织缺损和/或促进牙周组织再生的产品中的用途。

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