CN110551692A

CN110551692A - hFGF9基因修饰型间充质干细胞及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN110551692A
Application number: CN201910613765.5A
Authority: CN
Inventors: 吕贯廷; 李丁
Original assignee: Individual
Current assignee: Shaanxi Yungu Zhonghui Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2039-07-09
Also published as: CN110551692B

Abstract

本发明公开一种hFGF9基因修饰型间充质干细胞及其制备方法和应用。本发明以hFGF9基因修饰间充质干细胞或其衍生物作为治疗脱发的活性成分，可以补充局部干细胞数量，并分泌毛囊刺激因子hFGF9及自身生长因子，从而改善局部微环境及免疫调节等作用，刺激毛囊再生或休眠毛囊的复苏。

Description

hFGF9基因修饰型间充质干细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及脱发的预防或治疗，具体涉及hFGF9基因修饰型间充质干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

脱发(Hair loss)是指头发脱落的现象。正常脱落的头发都是处于退行期及休止期的毛发，由于进入退行期与新进入生长期的毛发不断处于动态平衡，故能维持正常数量的头发。然而，快节奏的生活，巨大的精神压力，却使得越来越多的人面临脱发的困扰。脱发不仅仅影响外观，对人的自信心也是一个十分大的打击。脱发治疗已成为越来越多的人迫切需要解决的问题。

毛囊(Hair follicle)是一个具有周期性生长特性的特殊器官，其生长周期可分生长期(Anagen)、退化期(Catagen)和休止期(Telogen)三个阶段。在休止期，毛囊细胞受到某些因素的刺激，会再次进入生长期，如此周而复始在哺乳动物的整个生命期间循环往复。毛囊经历生长期、退化期、休止期循环后再次进入生长期的过程称为毛囊周期性再生。毛囊周期由毛囊干细胞(Hair follicle stem cell，HFSC)介导发生。因此，毛囊周期的再激活调控在毛发再生中至关重要。

毛囊干细胞的激活和静息受到多种信号通路的调控，包括Wnt信号通路、Shh信号通路和BMP信号通路等。研究发现，在这些信号通路中，Wnt信号通路在毛囊发育和周期性再生中发挥着重要的调控作用。这些信号通路的阻断，会严重影响毛囊的生成及再生。如果毛囊各周期转换中的任何一个环节出现问题，就可能会影响毛囊的生长，进而出现毛囊相关疾病，例如雄性激素性脱发(Androgenetic alopecia，AGA)、斑秃性脱发(Alopeciaareata，AA)等。

目前，干细胞疗法已成为治疗许多疾病的重要手段。间充质干细胞(MesenchymalStem Cells，MSCs)存在于机体多种组织，具有向多种细胞分化能力的多能干细胞。体外经诱导可分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、造血基质等。由于MSCs不仅可以向多种组织细胞分化，体外容易分离培养和扩增，还具有低免疫原性的特点，MSCs已经被广泛用于多种疾病的细胞治疗，如心肌梗死、脑卒中、肢端缺血、软骨修复、脊柱融合、自身免疫性疾病等。

当前针对脱发的治疗，有使用口服或外用药物，也有进行手术治疗。然而药物治疗只能起到短暂的缓解作用，当患者停止使用药物后，头发会重新开始脱落。采用自体单个毛囊和毛囊单位移植是一种相对比较可靠的手术治疗方法，但可提供的毛囊数量是有限的，而且移植的毛囊存活率较低。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供基于hFGF9基因型修饰型间充质干细胞来预防或治疗脱发的新方案。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种hFGF9基因修饰型间充质干细胞，其具有下述(1)-(3)的功能：

(1)表达CD90、CD73和CD105；

(2)不表达CD45、CD43和CD14；和

(3)稳定地表达活性hFGF9蛋白或其片段、同源物和变体。

优选地，所述间充质干细胞包含通过基因工程手段引入的hFGF9基因。

优选地，所述hFGF9基因经优化从而提高了表达效率和稳定性。

优选地，所述优化包括密码子优化和/或在所述序列中引入SEQ ID NO:1所示的基因表达稳定序列。

本发明的第二方面，提供一种制备hFGF9基因修饰型间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：

1)构建表达hFGF9的病毒载体；

2)将所述病毒载体转染至包装细胞，收集富含hFGF9基因的病毒颗粒的细胞裂解液，浓缩得到含hFGF9的病毒；

3)利用含hFGF9的病毒感染间充质干细胞，从而制备得到hFGF9基因修饰型间充质干细胞。

本发明的第三方面，提供一种用于预防或治疗脱发的药物组合物，其包含hFGF9基因修饰型间充质干细胞或其分泌物、裂解物作为至少部分活性成分。

优选地，所述预防或治疗包括(1)-(3)中所述的至少一种：

(1)刺激毛囊再生或休眠毛囊的复苏；

(2)诱导毛发再生；

(3)阻止毛发的减少或减缓毛发减少的进程。

优选地，所述脱发包括选自雄激素性脱发、脂溢性脱发、神经性脱发、病理性脱发和疤痕性脱发中的至少一种。

优选地，本发明的药物组合物进一步包括生理盐水。

本发明的第四方面，提供hFGF9基因修饰型间充质干细胞在制备用于预防或治疗脱发的药物中的用途。

研究发现，FGF信号通路的重要分子hFGF9与毛囊发育、激活及毛发生长相关。本发明以该基因修饰间充质干细胞作为治疗脱发的活性成分，具有方便获取的优势，其可以补充局部干细胞数量，并分泌毛囊刺激因子hFGF9及自身生长因子(如EGF、bFGF等)来改善局部微环境及免疫调节等作用，刺激毛囊再生或休眠毛囊的复苏。

附图说明

图1间充质干细胞形态图。

图2脐带间充质干细胞不同标志物的流式检测结果。

图3表达hFGF9基因的腺病毒鉴定结果。Lane 1：marker；Lane 2：阴性对照(水)；Lane 3：阴性对照(培养基)；Lane 4和Lane 5：空载质粒；Lane 6：FGF9。

图4hFGF9基因在间充质干细胞中的表达结果图。

图5斑秃模型动物实验结果图。

图6利用本发明的间充质干细胞处理后毛发的生长情况。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

[hFGF9基因修饰型间充质干细胞]

本发明的第一方面，提供hFGF9基因修饰型间充质干细胞，其为通过基因工程手段向间充质干细胞引入外源hFGF9基因得到的修饰型间充质干细胞。本发明的hFGF9基因修饰型间充质干细胞同时具有下述(1)-(3)所述的功能：(1)表达CD90、CD73、CD105；(2)不表达CD45、CD43和CD14；和(3)稳定地表达活性hFGF9蛋白或其片段、同源物和变体。

本发明的修饰型间充质干细胞既包括原有功能，即间充质干细胞的特性，同时还具有额外功能，即稳定表达活性hFGF9蛋白或其片段、同源物和变体。

本发明的间充质干细胞虽经基因修饰但仍保留原有的功能，即间充质干细胞本身特有的性质或功能。此类性质或功能可通过已知方法来鉴定。例如，通过检测细胞表面标志性分子的表达情况来鉴定。本发明的间充质干细胞在表面表达CD90、CD73、CD105，但不表达CD45、CD43和CD14。细胞表面标志性分子的表达情况可使用例如流式细胞术等已知方法方便的检测。

本发明所述的额外功能是指稳定地表达活性hFGF9蛋白或其片段、同源物和变体。本文中，可将hFGF9蛋白的片段、同源物和变体统称为hFGF9蛋白的衍生物。本发明的间充质干细胞中活性hFGF9蛋白或其衍生物的稳定表达是重要的。正常情况下，活性hFGF9蛋白在间充质干细胞的表达并非稳定情况。本发明通过特定的优化并进一步引入特定的促进稳定表达的序列，从而提高了蛋白在间充质干细胞表达的稳定性。具体地，该额外功能优选通过将外源性hFGF9基因通过基因工程手段引入间充质干细胞而获得。外源性hFGF9优选为经过修饰或优化的基因。例如，经优化从而使其在适应于间充质干细胞表达。更优选地，本发明的hFGF9基因经优化从而提高了hFGF9基因在间充质干细胞中的表达效率和稳定性。在某些实施方案中，本发明的优化包括密码子优化，或包括在hFGF9基因序列中引入SEQ ID NO:1所示的序列。本发明发现通过引入SEQ ID NO:1所示的序列能够提高基因在间充质干细胞内表达的稳定性。

本发明的间充质干细胞的来源不特别限定，优选哺乳动物来源的间充质干细胞。更优选动物或人脐血来源的间充质干细胞。

[制备方法]

本发明的第二方面，提供hFGF9基因修饰型间充质干细胞的制备方法，其至少包括下述步骤1)-3)：

1)构建表达hFGF9的病毒载体；

步骤1)中，病毒载体不特别限定，但优选为腺病毒载体，例如，pAd/CMV/V5-DEST。在示例性构建方法中，步骤1)包括在病毒载体中从5’端到3’端依次包括CMV启动子、密码子优化的hFGF9基因开放读码框、基因表达稳定序列、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)胸苷激酶(thymidine kinase，TK)的加尾信号(TKpA)。

步骤2)为病毒载体的包装步骤。具体地，包括将病毒载体转染至包装细胞，收集富含hFGF9基因的病毒颗粒的细胞裂解液，浓缩得到含hFGF9的病毒。包装细胞的实例包括但不限于人胚肾细胞HEK293。

步骤3)为转染步骤，其包括利用含hFGF9的病毒感染间充质干细胞，从而制备得到hFGF9基因修饰型间充质干细胞。转染时间充质干细胞优选为处于对数生长期的间充质干细胞。转染时细胞的培养条件包括37℃、5％CO₂条件下培养24-48小时。

除非另有说明，否则本发明中基因工程或分子操作的条件、流程均为本领域已知的。具体可参见例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物。

本领域技术人员已知，除了上述步骤外，本发明的生产方法还可包括其他步骤。这些其他步骤可以在上述步骤1)-3)之间，也可在上述步骤(1)之前或步骤3)之后。

[药物组合物]

本发明的第三方面，提供用于预防或治疗脱发的药物组合物，其包含hFGF9基因修饰型间充质干细胞或其分泌物、裂解物作为至少部分活性成分。

本发明的药物组合物的活性成分包括hFGF9基因修饰型间充质干细胞，也可以包括由此类细胞的产物，例如分泌物和裂解物。

可选地，本发明的药物组合物还可包括药物学可接受载体。本发明中，药物学可接受载体在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。药物学可接受载体包括稀释剂和赋形剂。

合适的药物学可接受载体的实例包括但不限于：(1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白；(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠，也称作生理盐水)，和(3)5％(w/v)葡萄糖；也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween 20。

本发明的药物组合物可以是任何适宜的剂型。优选注射剂、悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过注射递送到皮肤组织，例如头皮的真皮组织，也可通过其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。

本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。一般情况下，在每1cm³皮肤表面上注射1-100μg，优选5-80μg，更优选10-50μg。在注射的情况下，药物组合物的注射频率没有特别限定，可以是一次性注射，也可以是多次注射，从而进一步增强效果。例如，在三个月期间可以分两次注射。

[用途]

本发明的第四方面，提供hFGF9基因修饰型间充质干细胞在制备药物中的用途。本发明的药物可以是任何剂型。优选为注射剂。关于药物的说明可参考上述药物组合物的说明，在此不再赘述。

实施例1

一、脐带间充质干细胞培养：

无菌条件下，用无血清低糖DMEM培养基(Low glucose DMEM)冲洗正常脐带组织，在培养皿中把脐带组织剪碎为细颗粒状。将剪碎的组织碎块转入低糖DMEM培养基中，置于37℃细胞培养箱中用胶原酶充分消化。常温下离心，弃上清。将组织碎块悬液转入细胞培养瓶，用含20％胎牛血清的低糖DMEM培养，置于37℃、5％CO₂恒温细胞培养箱。如图1所示，用显微镜观察细胞形态，从中初步确认间充质干细胞。当初选细胞约80％汇合时用0.25％胰酶消化细胞进行传代培养。

二、脐带间充质干细胞的鉴定：

取第2-3代细胞，使用流式细胞术检测细胞表面分子标志(CD14-、CD34-、CD45-、CD73+、CD90+、CD105+)来验证所培养的细胞是否具有间充质干细胞的表型。如图2所示，鉴定得到的脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD14、CD34和CD45。将此类细胞作为本实施例的间充质干细胞。

三、基因修饰腺病毒颗粒的制备：

对hFGF9基因的蛋白编码序列进行一系列的密码子优化，并将这一系列的优化序列转入间充质干细胞中进行蛋白表达的鉴定。从中鉴定得到能够在间充质干细胞中高效稳定表达的SEQ ID NO:2所示的优化序列。在该优化序列的3’端进一步连接SEQ ID NO:1所示的HBB序列。通过人工合成的方法将上述融合的序列导入pENTR1A载体的BamHI和XhoI酶切位点之间，命名为pENTR1A-hFGF9；通过Gateway系统把hFGF9从pENTR1A-hFGF9转移到pAd/CMV/V5-DEST腺病毒表达载体中，命名为pAd-CMV-hFGF9。把经PacI处理的线性化pAd-CMV-hFGF9转染HEK293细胞制备腺病毒颗粒。取5μl病毒上清加入5μl 2×PBS，煮沸5分钟，离心后取1-2μl作为模板进行PCR，检测hFGF9基因。结果如图3所示。

四、hFGF9基因修饰人脐带间充质干细胞制备：

用T175cm²培养瓶培养人脐带间充质干细胞，当细胞汇合度达到70％时，把表达hFGF9的腺病毒颗粒加入到T175cm²培养瓶中，混匀，37℃5％CO₂恒温培养箱中继续培养24-48小时，加入胰酶进行消化，制备细胞悬液。把盖玻片置于6孔细胞培养板中，加入5×10⁵单细胞悬液，待细胞在盖玻片上长满80％左右时，用-20℃预冷的甲醇在-20℃固定10min；1×PBS洗3遍，每遍5min，抗体用3％BSA/PBS稀释，于37℃孵育45min；1×PBS洗3遍，每次10min，再用荧光标记的二抗(1:100稀释)与细胞37℃孵育45min；1×PBS洗3遍，每次10min，DAPI(100μg/mL)室温染色20min；1×PBS洗3遍，三蒸水清洗一遍，用封片剂封片，正置荧光显微镜观察拍照。如图4所示鉴定得到的细胞悬液为FGF9表达型间充质干细胞。

实施例2

实验动物均为6周龄C57BL/6小鼠，雌雄不限，重约20g，由第四军医大学实验动物中心提供。使用剃须刀把小鼠背部的毛发剃掉，然后用脱毛膏完全去掉残留的背毛。把小鼠随机分为两组，每组1只，腹腔注射1.5％戊巴比妥钠溶液(0.1ml/20g)对小鼠进行麻醉。小鼠麻醉后，采用皮下注射的方式将1×10⁶FGF9基因修饰型间充质干细胞移植到实验组小鼠裸露的皮肤组织中。对照组注射同体积的生理盐水。在一定时间内对小鼠的背部毛发生长情况进行观察并拍照。如图5所示，MSC注射组皮肤处有毛发长出，且小鼠再生毛发与原生毛发的疏密、毛色最为接近。与此形成明显区别的是，对照组小鼠背部仍然存在裸露区域。

实施例3

把1×10⁷个hFGF9基因修饰人脐带间充质干细胞用胰酶消化，充分吹打成单细胞悬液，2000rpm离心收集细胞沉淀，用2ml医用生理盐水把沉淀重新悬浮；用CFDA批准的微量注射器把双基因修饰间充质干细胞注入患者(性别:男，年龄41岁，治疗前的头发如图6a所示)脱发部位皮下每隔2-3周注射一次。在注射3-6次后，脱发部位可长出新生毛发(如图6b所示)。

综上所述，本发明hFGF9基因修饰的人脐带间充质干细胞能有效地治疗脱发，双基因修饰干细胞治疗的应用可提高治疗效果，方法安全、可靠、有效，具有很好的应用前景。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

序列表

<110> 吕贯廷

李丁

<120> hFGF9基因修饰型间充质干细胞及其制备方法和用途

<130> BH1900117-1

<141> 2019-07-09

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 268

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60

taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120

tattttcatt gcaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 180

ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 240

taataaaaaa catttatttt cattgcaa 268

<210> 2

<211> 627

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggctccct taggtgaagt tgggaactat ttcggtgtgc aggatgcggt accgtttggg 60

aatgtgcccg tgttgccggt ggacagcccg gttttgttaa gtgaccacct gggtcagtcc 120

gaagcagggg ggctccccag gggacccgca gtcacggact tggatcattt aaaggggatt 180

ctcaggcgga ggcagctata ctgcaggact ggatttcact tagaaatctt ccccaatggt 240

actatccagg gaaccaggaa agaccacagc cgatttggca ttctggaatt tatcagtata 300

gcagtgggcc tggtcagcat tcgaggcgtg gacagtggac tctacctcgg gatgaatgag 360

aagggggagc tgtatggatc agaaaaacta acccaagagt gtgtattcag agaacagttc 420

gaagaaaact ggtataatac gtactcatca aacctatata agcacgtgga cactggaagg 480

cgatactatg ttgcattaaa taaagatggg accccgagag aagggactag gactaaacgg 540

caccagaaat tcacacattt tttacctaga ccagtggacc ccgacaaagt acctgaactg 600

tataaggata ttctaagcca aagttga 627

Claims

1.一种hFGF9基因修饰型间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞具有下述(1)-(3)的功能：

(1)表达CD90、CD73和CD105；

(2)不表达CD45、CD43和CD14；

(3)稳定地表达活性hFGF9蛋白或其片段、同源物和变体。

2.根据权利要求1所述的hFGF9基因修饰型间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞包含通过基因工程手段引入的hFGF9基因。

3.根据权利要求2所述的hFGF9基因修饰型间充质干细胞，其特征在于，所述hFGF9基因经优化从而提高了表达效率和稳定性。

4.根据权利要求3所述的hFGF9基因修饰型间充质干细胞，其特征在于，所述优化包括密码子优化和/或在所述序列中引入SEQ ID NO:1所示的基因表达稳定序列。

5.一种制备根据权利要求1-4任一项所述的hFGF9基因修饰型间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建表达hFGF9的病毒载体；

6.一种用于预防或治疗脱发的药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1-4任一项所述的hFGF9基因修饰型间充质干细胞或其分泌物、裂解物作为至少部分活性成分。

7.根据权利要求6所述的用于预防或治疗脱发的药物组合物，其特征在于，所述预防或治疗包括(1)-(3)所述的至少一种：

(1)刺激毛囊再生或休眠毛囊的复苏；

(2)诱导毛发再生；

(3)阻止毛发的减少或减缓毛发减少的进程。

8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗脱发的药物组合物，其特征在于，所述脱发包括选自雄激素性脱发、脂溢性脱发、神经性脱发、病理性脱发和疤痕性脱发中的至少一种。

9.根据权利要求6所述的用于预防或治疗脱发的药物组合物，其特征在于，进一步包括(1)pH 7.4的Dulbecco磷酸缓冲盐溶液；(2)生理盐水；或(3)5％w/v葡萄糖。

10.根据权利要求1-4任一项所述的hFGF9基因修饰型间充质干细胞在制备用于预防或治疗脱发的药物中的用途。