JP7144829B2 - 安全性と抗炎症作用を高めた間葉系幹細胞 - Google Patents
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Description
[1]外来のトロンボモジュリンがゲノムに安定して組み込まれ、発現する、間葉系幹細胞であって、前記間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞であり、前記トロンボモジュリンが全長型ヒトトロンボモジュリンである、間葉系幹細胞。
[2]前記全長型ヒトトロンボモジュリンが配列番号2のアミノ酸配列を含む、[1]に記載の間葉系幹細胞。
[3]前記間葉系幹細胞が骨髄由来又は脂肪組織由来である、[1]または[2]に記載の間葉系幹細胞。
[4]トロンビン生成阻害作用及び/又はトロンビン阻害作用を示す、[1]~[3]のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞。
[5][1]~[4]のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞を有効成分として含有する細胞製剤。
[6]移植片対宿主病、敗血症、急性肺障害、播種性血管内凝固症候群(DIC)、膠原病、腎炎、肝炎及び脳障害からなる群より選択される疾患の治療又は予防用である、[5]に記載の細胞製剤。
ADSCは、脂肪基質からの幹細胞の分離、洗浄、濃縮、培養等の工程を経て調製される。例えば公知の方法(Fraser JK et al. (2006), Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends in Biotechnology; Apr;24(4):150-4. Epub 2006 Feb 20. Review.; Zuk PA et al. (2002), Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell; Dec;13(12):4279-95.; Zuk PA et al. (2001), Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering; Apr;7(2):211-28.等が参考になる)に従ってADSCを調製することができる。また、脂肪組織からADSCを調製するための装置(例えば、Celution(登録商標)装置(サイトリ・セラピューティクス社、米国、サンディエゴ))も市販されており、当該装置を利用してADSCを調製することにしてもよい。当該装置を利用すると、脂肪組織より、ADSCを含む細胞集団を分離できる(K. Lin. et al. Cytotherapy(2008) Vol. 10, No. 4, 417-426)。以下、ADSCの調製法の具体例を示す。
脂肪組織は動物から切除、吸引などの手段で採取される。ここでの用語「動物」はヒト、及びヒト以外の哺乳動物(ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等)を含む。免疫拒絶の問題を回避するため、本発明の細胞を適用する対象(患者)と同一の個体から脂肪組織(自己脂肪組織)を採取することが好ましい。但し、同種の動物の脂肪組織(他家)又は異種動物の脂肪組織の使用を妨げるものではない。
細胞集団は続いて遠心処理に供される。遠心処理による沈渣を沈降細胞集団(本明細書では「SVF画分」ともいう)として回収する。遠心処理の条件は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば1~10分間、800~1500rpmである。尚、遠心処理に先立ち、酵素処理後の細胞集団をろ過等に供し、その中に含まれる酵素未消化組織等を除去しておくことが好ましい。
SVF画分にはADSCの他、他の細胞成分(内皮細胞、間質細胞、血球系細胞、これらの前駆細胞等)が含まれる。そこで本発明の一態様では以下の選択培養を行い、SVF画分から不要な細胞成分を除去する。そして、その結果得られた細胞をADSCとして本発明に用いる。
本発明の一態様では、上記(3)の操作の代わりに又は上記(3)の操作の後に以下の低血清培養を行う。そして、その結果得られた細胞をADSCとして本発明に用いる。
293T細胞に下記ベクターを形質導入し、ウイルス粒子を作製した。尚、ベクターマップ(pBGJR-EGFP-TMD123)を図8に示す。
(i)pBGJR-EGFP-TMD123 ベクターまたはpBGJR-EGFPベクター
(ii)pCMV-dR8.91(パッケージングベクター)
(iii)pLP/VSVG(エンベロープエンコーディングプラスミド)
野生株:intact-mBMSC
対照:cont-mBMSC(pBGJR-EGFPベクターを遺伝子導入)
TMD123安定発現株:TMD123-mBMSC(pBGJR-EGFP-TMD123ベクターを遺伝子導入)
intact-mBMSCとTMD123-mBMSCの増殖率をWST-1アッセイで比較・評価した。cont-mBMSCとTMD123-mBMSCの細胞増殖能をWST-1アッセイで比較した。対照群のcont-mBMSCとTMD123-mBMSCは増殖能に有意差を認めなかった(図3)。TMD123はMSCの細胞増殖に影響を及ぼさないと考えられる。
intact-mBMSCとTMD123-mBMSCの細胞浮遊液の凝固時間を比較した。細胞浮遊液、CaCl2、健常人血漿をガラス試験管に入れて混和し、ストップウォッチを始動した。絶えず試験管を混和しながら37℃の恒温槽で加温した。フィブリンが析出し流動性がなくなった時にストップウォッチを停止し、凝固時間とした。培養液と比較すると対照群のcont-mBMSCでは凝固時間が有意に短縮した(図5)。これに比べてTMD123-mBMSCでは凝固時間が対照群よりも有意に延長し、培養液に比べても凝固時間の短縮を認めなかった。この結果から、TMD123はMSCの血栓傾向をリカバーする作用を持つと考えられる。
(1)全長型TM-mBMSCの作製
ヒト全長TM遺伝子を保持する発現ベクターからクローニングしたヒト全長TM遺伝子をレンチウイルスベクターのクローニングサイトに挿入した。このレンチウイルスベクターを用い、TMD123安定発現株(TMD123-mBMSC)の作製と同様の方法(上記1.を参照)でヒト全長TM遺伝子が導入された全長型TM-mBMSCを得た。全長型TM-mBMSCと可溶性TM-mBMSC(TMD123-mBMSC)の抗血栓作用及び治療効果を比較、検討した。尚、ヒトTMの構造(全長及び可溶性/分泌型)を図9に示す。
細胞(全長型TM-mBMSC、可溶性TM-mBMSC、cont-mBMSC)をトリプシンEDTAで処理し、10%FBS添加α-MEMでピペッティングにより剥がした。遠心処理して細胞を回収し、FBS(-)RPMIで一度細胞を洗浄した。この操作により、培養上清中に存在し得る可溶性TMが除去される。次に、細胞浮遊液を40μmのフィルターに通して夾雑物を取り除いた。フィルター処理後の細胞浮遊液と健常人のプール血漿をガラス試験管に入れ、37℃恒温槽で3分ほど予備加温した。塩化カルシウムを加えてストップウォッチをスタートした。37℃の恒温槽に試験管を入れた状態でよく混和しながら、2~3秒に一度試験管を傾けて混合液の流動性を確認した。フィブリンが析出し流動性が無くなったらストップウォッチを止め、凝固時間とした。
細胞(全長型TM-mBMSC、可溶性TM-mBMSC、cont-mBMSC)をトリプシンEDTAで処理し、10%FBS添加α-MEMでピペッティングにより剥がした。遠心処理して細胞を回収し、FBS(-)RPMIで一度細胞を洗浄した。この操作により、培養上清中に存在し得る可溶性TMが除去される。次に、細胞浮遊液を40μmのフィルターに通して夾雑物を取り除いた。フィルター処理後の細胞浮遊液を尾静脈からマウスに投与し、24時間後の生存率を比較した。
Claims (6)
- 外来のトロンボモジュリンがゲノムに安定して組み込まれ、発現する、間葉系幹細胞であって、前記間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞であり、前記トロンボモジュリンが全長型ヒトトロンボモジュリンである、間葉系幹細胞。
- 前記全長型ヒトトロンボモジュリンが配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の間葉系幹細胞。
- 前記間葉系幹細胞が骨髄由来又は脂肪組織由来である、請求項1または2に記載の間葉系幹細胞。
- トロンビン生成阻害作用及び/又はトロンビン阻害作用を示す、請求項1~3のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞を有効成分として含有する細胞製剤。
- 移植片対宿主病、敗血症、急性肺障害、播種性血管内凝固症候群(DIC)、膠原病、腎炎、肝炎及び脳障害からなる群より選択される疾患の治療又は予防用である、請求項5に記載の細胞製剤。
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Biochemical and Biophysical Research Communications, 2013年,Vol.431,p.203-209,http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.12.134 |
トロンボモジュリン遺伝子導入により安全性を高めた間葉系幹細胞の作成,KAKEN, 2014年度 実績報告書, 2016年公開,p.1-2,https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-26930010/269300102014jisseki/, 検索日:2022年4月8日 |
血栓止血誌, 2009年,Vol.20, No.1,p.9-11 |
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