CN112608890A - 一种防止间充质干细胞粘连的培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种防止间充质干细胞粘连的培养方法，包含以下步骤：在间充质干细胞的培养过程中，在基础培养液中添加生长因子和凝血酶特异性抑制剂对间充质干细胞进行培养。本发明采用阶段性加入细胞因子可有效提高间充质干细胞的干性，抑制间充质干细胞的分化，减少细胞分泌细胞外基质的量，减少了间充质干细胞发生粘连及团块的形成，并可有效提高间充质干细胞治疗的安全性。这种方法经济，易于操作，可用于间充质干细胞的临床治疗。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一防细胞粘连的间充质干细胞制剂及其制备方法
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，广泛存在于脐带、骨髓、牙髓、脂肪或胎盘组织中，具有易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议、刺激组织再生、调节免疫功能等诸多优点。
目前间充质干细胞的培养多采用胎牛血清加基础培养液，有部分采用无血清培养基进行培养，但是间充质干细胞在培养过程中在局部密度过高，从而出现细胞粘连，细胞注射入体内容易引起栓塞，严重阻碍了间充质干细胞的临床转化。
目前在行业中一般采用过筛的方式除去粘连的细胞，但此类操作会浪费大量的细胞，不利于细胞产业的发展。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种防止间充质干细胞粘连的培养方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一方面，提供一种防止间充质干细胞粘连的培养方法，包含以下步骤：在间充质干细胞的培养过程中，在基础培养液中添加生长因子和凝血酶特异性抑制剂对间充质干细胞进行培养。
优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞中的至少一种。
优选地，所述基础培养液为含有10％胎牛血清的aMEM培养液。
优选地，所述生长因子为选自纤维细胞生长因子或血小板衍生生长因子中的至少一种。
优选地，所述凝血酶特异性抑制剂选自水蛭素。
优选地，所述培养过程具体为：
(1)在P1-P3代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加成纤维细胞生长因子及水蛭素；
(2)在P4，P5代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加了成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B和水蛭素。
优选地，步骤(1)中，所述成纤维细胞生长因子的浓度为1ng/ml-30ng/ml，例如：1ng/ml、 2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、 13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、 23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml或30ng/ml；所述水蛭素的浓度为5μ/ml-30μ/ml，例如5μ/ml、6μ/ml、7μ/ml、8μ/ml、9μ/ml、10μ/ml、11μ/ml、12μ/ml、 13μ/ml、14μ/ml、15μ/ml、16μ/ml、17μ/ml、18μ/ml、19μ/ml、20μ/ml、20μ/ml、21μ/ml、22μ/ml、 23μ/ml、24μ/ml、25μ/ml、26μ/ml、27μ/ml、28μ/ml、29μ/ml或30μ/ml。
优选地，步骤(2)中，所述成纤维细胞生长因子的浓度为1ng/ml-30ng/ml，例如：1ng/ml、 2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、 13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、 23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml或30ng/ml；所述血小板衍生生长因子B的浓度为1ng/ml-30ng/ml，例如：1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、 6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、 16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、 26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml或30ng/ml；所述水蛭素的浓度为5μ/ml-30μ/ml，例如5μ/ml、6μ/ml、7μ/ml、8μ/ml、9μ/ml、10μ/ml、11μ/ml、12μ/ml、13μ/ml、14μ/ml、15μ/ml、 16μ/ml、17μ/ml、18μ/ml、19μ/ml、20μ/ml、20μ/ml、21μ/ml、22μ/ml、23μ/ml、24μ/ml、25μ/ml、 26μ/ml、27μ/ml、28μ/ml、29μ/ml或30μ/ml。
第二方面，提供一种防细胞粘连的间充质干细胞，所述防细胞粘连的间充质干细胞由上述的培养方法培养而成。
第三方面，提供一种防细胞粘连的间充质干细胞制剂，所述防细胞粘连的间充质干细胞制剂包含上述的防细胞粘连的间充质干细胞。
优选地，所述防细胞粘连的间充质干细胞制剂还包括药学上可接受的辅料、载体或添加剂中的至少一种。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明采用阶段性加入细胞因子可有效提高间充质干细胞的干性，抑制间充质干细胞的分化，减少细胞分泌细胞外基质的量，减少了间充质干细胞发生粘连及团块的形成，并可有效提高间充质干细胞治疗的安全性。这种方法经济，易于操作，可用于间充质干细胞的临床治疗。
附图说明
图1为正常组的间充质干细胞的形态学照片；
图2为诱导组的间充质干细胞的形态学照片；
图3为正常组的间充质干细胞的悬浮状态照片；
图4为诱导组的间充质干细胞的悬浮状态照片。
具体实施例
以下将结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行举例说明。
实施例1
本实施例提供一种防止间充质干细胞粘连的培养方法，包含以下步骤：采用37度水浴锅，复苏P0代间充质干细胞，离心后获得P1代间充质干细胞，加入细胞培养液(正常组含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组采用含有10％胎牛血清的aMEM培养液并添加10ng/ml 成纤维细胞生长因子及5μ/ml水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P2代间充质干细胞，加入细胞培养液培养，正常组的细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组的细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液并添加10ng/ml成纤维细胞生长因子及5μ/ml水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P3代间充质干细胞，加入细胞培养液培养，正常组的细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组的细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液并添加10ng/ml成纤维细胞生长因子及5μ/ml水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入细胞培养液培养，正常组的细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组的细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液添加10ng/ml成纤维细胞生长因子，10ng/ml血小板衍生生长因子B，20μ/ml水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入细胞培养液培养，正常组的细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组的细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液添加10ng/ml的成纤维细胞生长因子，10ng/ml 的血小板衍生生长因子B，20μ/ml的水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞。
融合度达到80％时，检测结果如图1-2所示，图1显示：正常组的细胞成长呈梭形，贴壁生长，符合间充质干细胞的基本形态；图2显示：诱导组的细胞成长呈梭形，贴壁生长，符合间充质干细胞的基本形态。
P5代间充质干细胞进行检测，检测结果参考图3-图4，如图3图所示，正常组的细胞悬浮状态呈圆形分散状态，偶有细胞团块存在；如图4图所示，诱导组的细胞悬浮状态呈圆形分散状态，镜下无明显团块存在。采用流式检测法进行细胞的鉴定，如表1所示，诱导前后的间充质干细胞表面分子检测结果均符合国际细胞治疗协会的要求，CD73，CD90，CD105 均高于95％，CD14，CD19，CD34，CD45，HLA-DR的均低于2％，说明诱导后支持细胞的表面分子表达。
表1-细胞表面分子检测结果
| 表面分子名称 | CD90 | CD105 | CD73 | CD14 | CD19 | CD34 | CD45 | HLA-DR |
| 未处理组 | 97.8％ | 97.8％ | 98.8％ | 0.5％ | 0.8％ | 0.7％ | 0.8％ | 0.8％ |
| 诱导组 | 98.8％ | 97.9％ | 99.3％ | 0.6％ | 0.5％ | 0.3％ | 0.2％ | 0.6％ |
实施例2
本实施例提供一种防止间充质干细胞粘连的培养方法，包括以下步骤：
采用37度水浴锅，复苏P0代间充质干细胞，离心后获得P1代间充质干细胞，加入细胞培养液培养，正常组细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组细胞培养液含有 10％胎牛血清的aMEM培养液并添加10ng/ml成纤维细胞生长因子及5μ/ml水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P2代间充质干细胞，加入细胞培养液培养，正常组细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液并添加10ng/ml成纤维细胞生长因子及5μ/ml水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P3代间充质干细胞，加入细胞培养液培养，正常组细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液并添加10ng/ml成纤维细胞生长因子及5μ/ml水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入细胞培养液培养，正常组细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组采用含有10％胎牛血清的aMEM培养液添加10ng/ml成纤维细胞生长因子，10ng/ml血小板衍生生长因子B，20μ/ml水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入细胞培养液培养，正常组细胞培养液含有10％胎牛血清的aMEM培养液，诱导组采用含有10％胎牛血清的aMEM培养液添加10ng/ml成纤维细胞生长因子，10ng/ml血小板衍生生长因子B，20μ/ml水蛭素，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；
培养3天后待细胞生长至融合度达到80％时，消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞，采用生理盐水重悬后，静脉注射入小鼠体内，结果如表2所示，正常组细胞静脉注射入小鼠体内，当剂量增大时小鼠死亡概率增大，在相同剂量下，诱导组细胞注射的老鼠在大剂量未出现死亡，显示出诱导后细胞提高了注射的安全性。
表2正常组与诱导后的间充质干细胞的单次给药急毒结果
实施例3
本实施例提供一种防细胞粘连的间充质干细胞，所述防细胞粘连的间充质干细胞由实施例1或2的培养方法培养而成。
实施例4
本实施例提供一种防细胞粘连的间充质干细胞，所述防细胞粘连的间充质干细胞制剂包含上述的防细胞粘连的间充质干细胞。
在一些实施例中，所述防细胞粘连的间充质干细胞制剂还包括药学上可接受的辅料、载体或添加剂中的至少一种。
在一些实施例中，所述药学上可接受的辅料、载体或添加剂选自生理盐水。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种防止间充质干细胞粘连的培养方法，其特征在于，包含以下步骤：在间充质干细胞的培养过程中，在基础培养液中添加生长因子和凝血酶特异性抑制剂对间充质干细胞进行培养。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述基础培养液为含有10%胎牛血清的aMEM培养液。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述生长因子为选自纤维细胞生长因子或血小板衍生生长因子中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述凝血酶特异性抑制剂选自水蛭素。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养过程具体为：
（1）在P1-P3代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加成纤维细胞生长因子及水蛭素；
（2）在P4，P5 代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加了成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子B和水蛭素。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述成纤维细胞生长因子的浓度为1ng/ml-30ng/ml；所述水蛭素的浓度为5µ/ml-30 µ/ml。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述成纤维细胞生长因子的浓度为1ng/ml-30ng/ml；所述血小板衍生生长因子B的浓度为1ng/ml-30ng/ml；所述水蛭素的浓度为5µ/ml-30 µ/ml。
8.一种防细胞粘连的间充质干细胞，其特征在于，所述防细胞粘连的间充质干细胞由权利要求1-7任一项所述的培养方法培养而成。
9.一种防细胞粘连的间充质干细胞制剂，其特征在于，包含权利要求8所述的防细胞粘连的间充质干细胞。
10.根据权利要求9所述的防细胞粘连的间充质干细胞制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料、载体或添加剂中的至少一种。
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| CN113502262A (zh) * | 2021-07-22 | 2021-10-15 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 一种提高Treg细胞活性的外泌体的培养方法 |
| CN113564107A (zh) * | 2021-07-22 | 2021-10-29 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞的培养方法 |
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| JP2018201499A (ja) * | 2017-06-01 | 2018-12-27 | 学校法人 愛知医科大学 | 安全性と抗炎症作用を高めた間葉系幹細胞 |
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