CN112941017A - 一种诱导人间充质干细胞成脂分化培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可诱导人间充质干细胞成脂分化的培养基及其制备方法，属于干细胞培养技术领域。该成脂诱导培养基包括以下成分：低糖DMEM基础培养基、胎牛血清、3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤、抗牛胰岛素、吲哚美辛、地塞米松。本发明可高效快速特异诱导包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞在内的多种组织来源的人间充质干细胞定向成脂分化，诱导15天内即可成脂分化，大大缩短分化时间，提高分化效率，制备方法简单，使用方便。

Description

一种诱导人间充质干细胞成脂分化培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种用于人间充质干细胞定向分化为脂肪细胞的诱导培养基。
背景技术
间充质干细胞是一类早期未分化的细胞，具有自我更新、自我复制以及多向分化潜能等特点。由于间充质干细胞的自我更新和多向分化潜能，使其具备了细胞再生和组织修复的能力。大量研究已开始关注间充质干细胞疗法在多种器官损伤修复和组织再生中的应用。体外利用诱导培养基诱导间充质干细胞定向成脂分化构建组织工程脂肪，在软组织缺损的修复、整形美容以及再生医学等领域有重要的意义和应用前景。因此，高效促进间充质干细胞体外定向成脂分化，以获得大量优质的脂肪细胞，是为软组织缺损的修复提供合格的自体移植脂肪的关键。
现有的人间充质干细胞成脂诱导分化培养基主要成分一般为：基础培养基、胎牛血清(FBS)、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素和吲哚美辛。该成脂诱导分化培养基分化效率有限，对多种人间充质干细胞的成脂诱导分化效果差异大，诱导时间长达3周，无法满足临床应用的需要，需优化诱导条件以提高人间充质干细胞定向成脂分化，从而在短期内高效获得脂肪细胞进行临床上的组织修复，以及为人间充质干细胞成脂分化能力鉴定、临床整形美容和再生医学提供有利的条件。
发明内容
为解决现有技术中存在的成脂诱导效率不够理想、分化周期较长等问题，本发明提供一种在15天内诱导人间充质干细胞成脂分化的培养基及其诱导方法，其分化效果好，分化周期短。
一种用于诱导人间充质干细胞成软骨分化的培养基，其特征在于：由以下组分制成包含低糖DMEM(LG-DMEM)培养基、胎牛血清5-50％体积百分比、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤111-200μg/ml浓度、牛胰岛素57-100μg/ml浓度、吲哚美辛72-100μg/ml浓度、地塞米松39-100ng/ml浓度。
优选由以下组分配置：LG-DMEM培养基、胎牛血清10％体积百分比、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤111μg/ml浓度、牛胰岛素57μg/ml浓度、吲哚美辛72μg/ml浓度、地塞米松39ng/ml浓度。
优选的基础培养基中也包含有0.5-1％的青霉素和0.5-1％的链霉素。
优选的培养基配置分为A液和B液，A液成分为LG-DMEM培养基、胎牛血清10％体积百分比、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤111μg/ml浓度、牛胰岛素57μg/ml浓度、吲哚美辛72μg/ml浓度、地塞米松39ng/ml浓度；B液成分为LG-DMEM培养基，胎牛血清10％体积百分比，牛胰岛素57μg/ml浓度。
优选的所述人间充质干细胞为脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞第二代至第五代，接种密度为2.25×10^5个/ml，诱导培养条件为37℃，5％CO2，培养时间为12-15天。
一种人间充质干细胞成脂诱导分化培养基的制备方法包括以下步骤：
1)培养瓶消毒：将培养瓶清洗干净后再次用去离子水冲洗三次，晾干后用牛皮纸包好，放入高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min后烘干备用；
2)DMEM培养基添加：无菌条件下添加低糖DMEM培养基到培养瓶中；
3)组分混合：依次加入所述浓度的FBS、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤母液、牛胰岛素母液、吲哚美辛母液、地塞米松母液，混合均匀；
4)过滤除菌：将混合后的培养基用0.22μm的滤膜在超净工作台过滤除菌。
所述人间充质干细胞成脂诱导分化通过以下方法诱导：
1)获得人间充质干细胞：利用含10％FBS的低糖DMEM培养基培养扩增人间充质干细胞；
2)预处理：使用胰酶消化细胞，用含10％FBS的低糖DMEM培养基重悬细胞；
3)细胞接种：取细胞按照2.25×10^5个/ml细胞量接种到六孔板上，用含10％FBS的低糖DMEM培养基培养细胞生长至基本融合；
4)诱导培养：每孔加入2ml所述人间充质干细胞培养基A液，培养箱中进行成脂分化诱导培养培养3天，三天后更换为B液培养，B液培养2天后再次更换为A液培养3天，再更换为B液培养至15天，每隔两天换一次新鲜B液。
附图说明
图1为人脐带间充质干细胞成脂诱导12天时形成的脂滴以及15天后形成的脂滴油红O染色图
图2为人脂肪间充质干细胞成脂诱导12天后形成的脂滴油红O染色图
具体实施方式
下面将结合本发明具体实施例做进一步说明。
实施例1：人脐带间充质干细胞成脂分化
本专利提供的成软骨诱导培养基的配制：
1)将P2代的人脐带间充质干细胞按照2.25×10^5个/ml细胞量接种到六孔板上，接种2ml。
2)按照表1所示的组成和用量配制成软骨诱导分化培养基：
表1.成脂诱导分化培养基
Figure BSA0000197775930000021
Figure BSA0000197775930000031
3)细胞生长至基本融合后加入按照表1方法配制的成脂诱导分化培养基A液2ml培养3天后更换为成脂诱导分化培养基B液培养2天后再次更换为成脂诱导分化培养基A液培养3天，3天后更换为成脂诱导分化培养基B液培养至12天在显微镜下即可看到明显的脂滴，结果如图1a所示。
4)成脂诱导15天后利用油红O染液对成脂分化程度进行鉴定，结果如图1b所示。
实施例2：人脂肪间充质干细胞成脂分化
1)将P2代的人脂肪间充质干细胞按照2.25×l0^5个/ml细胞量接种到六孔板上，接种2ml。按照表2所示的组成和用量配制成脂诱导分化培养基：
表2.成脂诱导分化培养基
A液成份 用量
LG-DMEM 50ml
FBS 10％
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 111μg/ml
牛胰岛素 57μg/ml
吲哚美辛 72μg/ml
地塞米松 39ng/ml
B液成份 用量
FBS 10％
牛胰岛素 57μg/ml
2)细胞生长至基本融合后加入按照表2方法配制的成脂诱导分化培养基A液2ml培养3天后更换为成脂诱导分化培养基B液培养2天后再次更换为成脂诱导分化培养基A液培养3天，3天后更换为成脂诱导分化培养基B液培养至12天。
3)成脂诱导12天后利用油红O染液对成脂分化程度进行鉴定，结果如图2所示。

Claims (7)

1.一种用于诱导间人充质干细胞成脂分化的培养基，其特征在于：由以下组分制成，包含低糖DMEM(LG-DMEM)培养基、胎牛血清5-50％体积百分比、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤111-200μg/ml浓度、牛胰岛素57-100μg/ml浓度、吲哚美辛72-100μg/ml浓度、地塞米松39-100ng/ml浓度。
2.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞成脂诱导分化培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养瓶消毒：将培养瓶清洗干净后再次用去离子水冲洗三次，晾干后用牛皮纸包好，放入高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min后烘干备用；
2)DMEM培养基添加：无菌条件下添加低糖DMEM培养基到培养瓶中；
3)组分混合：依次加入所述浓度的FBS、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤母液、牛胰岛素母液、吲哚美辛母液、地塞米松母液，混合均匀；
4)过滤除菌：将混合后的培养基用0.22μm的滤膜在超净工作台过滤除菌。
3.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞成脂诱导分化培养基的制备方法，其特征在于，所述人间充质干细胞成脂诱导分化通过以下方法：
1)获得人间充质干细胞：利用含10％FBS的低糖DMEM培养基培养扩增人间充质干细胞；
2)预处理：使用胰酶消化细胞，用含10％FBS的低糖DMEM培养基重悬细胞；
3)细胞接种：取细胞按照2.25×10^5个/ml细胞量接种到六孔板上，用含10％FBS的低糖DMEM培养基培养细胞生长至基本融合；
4)诱导培养：每孔加入2ml所述人间充质干细胞培养基A液，培养箱中进行成脂分化诱导培养培养3天，三天后更换为B液培养，B液培养2天后再次更换为A液培养3天，再更换为B液培养至15天，每隔两天换一次新鲜培养基。
4.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞成脂诱导分化培养基的制备方法，其特征在于，所述人间充质干细胞为脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞成脂诱导分化培养基的制备方法，其特征在于，所述人间充质干细胞为脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞第二代至第五代。
6.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞成脂诱导分化培养基的制备方法，其特征在于，所述牛胰岛素为MedChemExpress公司生产，货号为11070-73-8。
7.根据权利要求2所述的人间充质干细胞成脂诱导分化的方法，其中所述间充质干细胞在具有5％的二氧化碳含量和37℃环境下培养所述间充质干细胞。
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