CN110564681B - 一种乳牙牙髓干细胞的分离培养和神经定向分化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乳牙牙髓干细胞的长期体外培养和神经定向分化方法，其能更加简便、高效的获取高活性的原代乳牙牙髓干细胞，在神经定向分化过程中，缩短诱导周期、提高转化率。

Description

一种乳牙牙髓干细胞的分离培养和神经定向分化方法
技术领域
本发明属于干细胞培养领域，具体涉及一种乳牙牙髓干细胞的分离培养和神经定向分化方法。
背景技术
口腔干细胞(Oral stem cells)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，被认为是起源于神经嵴的间充质干细胞。乳牙牙髓干细胞(SHED)是口腔干细胞的一种，其高表达STRO-1，CD146，Oct4，CD29，CD31，CD44等细胞标志物，但不表达或低表达CD14，CD34，CD43，CD45在适当条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、神经样细胞等。与骨髓间充质干细胞(BMMSC)相比，SHED更易分离得到，并且增殖更快，具有比BMMSC更强的细胞克隆形成能力。
神经细胞是各种神经性疾病研究和治疗的基础，然而神经细胞较难分离获得，且难以在体外大规模扩增。使用SHED能实现细胞数量的快速扩增，通过神经定向分化诱导即可获得大规模的神经细胞。当进行神经定向分化诱导时，SHED表达神经胶质和神经元细胞表面标志物，如巢蛋白(nestin)。
现有技术分离乳牙牙髓干细胞，一般使用电钻打磨牙冠暴露牙髓腔，提取牙髓组织后使用单一的胶原酶进行消化，这种分离方法较为复杂，并且高活性细胞获得率较低；在SHED的神经定向分化过程中，现有技术通常为一步法，在培养初期加入各种诱导因子，整个诱导期间培养基成分不变，诱导周期较长且转化率较低。
需要对SHED的培养和神经定向分化都进行改进，以提高分离培养和诱导分化的效果。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，提供一种乳牙牙髓干细胞的长期体外培养和神经定向分化体系，其能更加简便、高效的获取高活性的原代乳牙牙髓干细胞，在神经定向分化过程中，缩短诱导周期、提高转化率。
为此，本发明提供了如下技术方案：
一种乳牙牙髓干细胞的分离提取、体外培养和神经定向分化的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1、将牙齿进行消毒清洗；
步骤2、分离：破开牙冠，取出牙髓组织，用含有双抗的PBS溶液清洗牙髓组织；
步骤3、消化：将洗涤后的牙髓组织移入组织消化液中，用眼科手术剪将组织尽可能地剪碎；
步骤4、接种培养：将组织消化液1200rpm离心10min收集单个细胞和少量消化不完全的牙髓组织；小心弃去上清，将沉淀重悬，再次离心，彻底除去除消化酶，接种到12孔板，置于培养箱中进行培养；
步骤5、体外扩增培养：细胞培养用基础DMEM培养液，添加的FBS和双抗，加入10ng/mL生长因子bFGF提高扩增效率；
步骤6、神经定向分化：诱导的第1-5天，在培养基中加入SB431542、Dorsomorphin、Cyclopamine此三种诱导剂；诱导的第6-11天，更换诱导剂为bFGF、EGF、GDF9；诱导的第12-35天，更换诱导剂为BDNF、GDNF、KLF-3、cAMP；随后去除诱导剂，继续培养2-3周。
优选地，步骤1为将牙齿依次浸泡在碘酊、75％的乙醇中进行消毒。将消毒后的牙齿用含1％双抗的PBS溶液清洗多次。
优选地，步骤2中为提高牙髓组织获得率，用研钵敲开牙冠，用无菌注射器针头刮取牙髓腔内壁残留的组织。
优选地，步骤3中消化液为0.3％胶原酶和0.4％中性蛋白酶1：1混合配置而成，待消化的组织通过离心使其浸润在消化液中，于37℃下消化2h左右，直至肉眼看不到明显的组织块为止。
优选地，步骤4中，培养基成分为含有15％FBS和1％双抗的DMEM培养基，提取的原代乳牙牙髓干细胞接种48h后对其进行首次换液，对孔板内的培养基半换液，防止还未贴壁的原代乳牙牙髓干细胞被不小心吸走，此后每3-4天换液，显微镜下观察，贴壁后全换液，原代干细胞融合率达80％-90％时，对其传代；其中培养箱的培养条件为置于含5％CO2、饱和湿度的37℃培养箱中进行培养。
优选地，所述的步骤5中，在基础DMEM培养基中添加15％的FBS和1％的双抗(青霉素、链霉素)，bFGF的浓度为10ng/mL。
优选地，所述的步骤6中，在诱导的第1-35天，培养皿用5％的基底胶(Matrigel)包被。
优选地，所述的步骤6中，所有培养基均含有15％FBS和1％双抗，在诱导的第1-5天时，培养基为DMEM培养基；在诱导的第6-9天，逐步用DMEM/F12替换DMEM培养基，四天中DMEM/F12与DMEM培养基的比例分别为25/75，50/50，75/25，100/0；在诱导的第35天之后，用NB培养基。
优选地，所述的步骤6中，诱导期间各诱导剂浓度分别为：Dorsomorphin 4μM，SB431542 10μM，Cyclopamine 1μM，bFGF 10ng/mL，EGF 10ng/mL，GDF9 1μM，BDNF 10ng/mL，GDNF 10ng/mL，KLF-3 10ng/mL，cAMP 100μM。
本发明具有以下积极效果：
(1)与现有的SHED分离培养方法相比，具有以下优势：首先，简化了机械分离方法的同时避免了对牙髓组织的损伤，采用研钵和基础手术器械分离牙髓组织，不需要传统的牙科钻机；其次，提高了原代细胞的活性和获得率，采用胶原酶和中性蛋白酶的联合使用，优化这两种酶的最佳浓度，提高了消化效率(相同时间内，此方法消化所得的组织块最小)，保留更高的细胞活力；最后：长期体外培养时，通过调整血清浓度，较好的保留了SHED的细胞特性(如细胞表面标志物、分化潜能)。
(2)与现有的SHED神经定向分化体系相比，本发明采用分时段诱导，分别在特定时间段加入不同的诱导剂，同时通过对诱导剂特定组分构成的优化，提高了转化效率；通过包被基底胶，避免细胞分化过程中上漂导致的细胞损失；逐步更换基础培养基，使细胞更易适应分化后的营养环境。
附图说明
图1为原代SHED。
图2为不同代次SHED细胞表面标志物流式鉴定，P2,P5,P8分别指不同细胞代次，即第2代、第5代、第8代细胞。表明实验成功分离得到SHED，并且长期培养时，细胞特性基本没有改变。
图3为SHED神经定向分化后的形态。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1乳牙牙髓干细胞的分离提取、长期体外培养和神经定向分化
实验组按照如下步骤进行：
步骤1、消毒清洗：将牙齿依次浸泡在碘酊、75％的乙醇中进行消毒。将消毒后的牙齿用含1％双抗的PBS溶液清洗多次。
步骤2、分离：破开牙冠，取出牙髓组织，用含有双抗的PBS溶液清洗牙髓组织。为简化实验方案，提高牙髓组织获得率，用研钵敲开牙冠，用无菌注射器针头刮取牙髓腔内壁残留的组织。
步骤3、消化：将洗涤后的牙髓组织移入组织消化液中，用眼科手术剪将组织尽可能地剪碎。消化液为0.3％胶原酶和0.4％中性蛋白酶1：1混合配置而成，待消化的组织通过离心使其浸润在消化液中，于37℃下消化2h左右，直至肉眼看不到明显的组织块为止。在该步骤中，对胶原酶和中性蛋白酶I的用量进行了优化，优化这两种酶的最佳浓度，达到最佳消化效率(相同时间内，此方法消化所得的组织块最小)，保留更高的细胞活力。
步骤4、接种培养：将组织消化液1200rpm离心10min收集单个细胞和少量消化不完全的牙髓组织。小心弃去上清，将沉淀重悬，再次离心，彻底除去除消化酶，接种到12孔板，置于含5％CO2、饱和湿度的37℃培养箱中进行培养。培养基成分为含有15％FBS和1％双抗的DMEM培养基，提取的原代乳牙牙髓干细胞接种48h后对其进行首次换液。对孔板内的培养基半换液，防止还未贴壁的原代乳牙牙髓干细胞被不小心吸走。此后每3-4天换液。显微镜下观察，贴壁后全换液。原代干细胞融合率达80％-90％时，对其传代。其中原代SHED的形态如图1所示，表明实验成功分离得到SHED。
步骤5、体外扩增培养：细胞培养用基础DMEM培养液，添加不同浓度的FBS和1％的双抗(青霉素、链霉素)，加入10ng/mL生长因子bFGF提高扩增效率。该步骤中，设置了多个浓度梯度的FBS，包括1％、5％、10％、15％、20％共5个梯度。传代数次后，通过流式细胞仪对细胞表面标志物CD146、CD34和CD90进行鉴定。发现当培养基中加入15％FBS时，较好的保留了SHED的细胞特性。如图2所示，P2,P5,P8分别指不同细胞代次，即第2代、第5代、第8代细胞。可以看出表明实验成功分离得到的SHED长期培养时，细胞特性基本没有改变。
步骤6、神经定向分化：诱导的第1-5天，在培养基中加入SB431542、Dorsomorphin、Cyclopamine此三种诱导剂；诱导的第6-11天，更换诱导剂为bFGF、EGF、GDF9；诱导的第12-35天，更换诱导剂为BDNF、GDNF、KLF-3、cAMP；随后去除诱导剂，继续培养2-3周。所有培养基均含有15％FBS和1％双抗，在诱导的第1-5天时，培养基为DMEM培养基；在诱导的第6-9天，逐步用DMEM/F12替换DMEM培养基，四天中DMEM/F12与DMEM培养基的比例分别为25/75，50/50，75/25，100/0；在诱导的第35天之后，用NB培养基。诱导期间各诱导剂浓度分别为：Dorsomorphin 4μM，SB431542 10μM，Cyclopamine 1μM，bFGF 10ng/mL，EGF 10ng/mL，GDF91μM，BDNF 10ng/mL，GDNF 10ng/mL，KLF-3 10ng/mL，cAMP 100μM。
同时设立神经定向分化的比较组1-3和对照组：具体试验条件按照下表所示，对照组中不加入诱导因子，比较组1-2与实验组相比，均是按照三个阶段诱导，仅在每个阶段的诱导因子有所不同；比较组3采用一步诱导法。除此之外，其他条件与实验组相同。
Figure BDA0002208542550000071
Figure BDA0002208542550000081
实验结果：上述多组平行试验中，对照组无神经定向分化；而比较组1-3与实验组相比，比较组3的分化效果明显不如比较组1-2和实验组，而且实验组出现了大量神经样细胞，其定向分化显著优于其他比较组(图3展示的是实验组和比较组1的定向分化后的形态比较图)。可以看出本发明采用分时段诱导，分别在特定时间段加入不同的诱导剂，同时通过对诱导剂特定组分构成的优化，提高了转化效率。
分化结果：对照组无神经定向分化，而实验组和比较组均出现了神经定向分化，如图3所示，实验组出现了大量神经样细胞，其定向分化显著优于比较组。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (3)

1.一种乳牙牙髓干细胞的分离提取、体外培养和神经定向分化的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1、将牙齿进行消毒清洗；
步骤2、分离：破开牙冠，取出牙髓组织，用含有双抗的PBS溶液清洗牙髓组织；为提高牙髓组织获得率，用研钵敲开牙冠，用无菌注射器针头刮取牙髓腔内壁残留的组织；
步骤3、消化：将洗涤后的牙髓组织移入组织消化液中，用眼科手术剪将组织尽可能地剪碎；消化液为0.3％胶原酶和0.4％中性蛋白酶1：1混合配置而成，待消化的组织通过离心使其浸润在消化液中，于37℃下消化2h左右，直至肉眼看不到明显的组织块为止；
步骤4、接种培养：将组织消化液1200rpm离心10min收集单个细胞和少量消化不完全的牙髓组织；小心弃去上清，将沉淀重悬，再次离心，彻底除去除消化酶，接种到12孔板，置于培养箱中进行培养；
步骤5、体外扩增培养：细胞培养用基础DMEM培养液，添加FBS和双抗，加入10ng/mL生长因子bFGF提高扩增效率；
步骤6、神经定向分化：诱导的第1-5天，在培养基中加入SB431542、Dorsomorphin、Cyclopamine此三种诱导剂；诱导的第6-11天，更换诱导剂为bFGF、EGF、GDF9；诱导的第12-35天，更换诱导剂为BDNF、GDNF、KLF-3、cAMP；随后去除诱导剂，继续培养2-3周，诱导期间各诱导剂浓度分别为：Dorsomorphin 4μM，SB431542 10μM，Cyclopamine 1μM，bFGF 10ng/mL，EGF 10ng/mL，GDF9 1μM，BDNF 10ng/mL，GDNF 10ng/mL，KLF-3 10ng/mL，cAMP 100μM；
所述步骤4中，培养基成分为含有15％FBS和1％双抗的DMEM培养基，提取的原代乳牙牙髓干细胞接种48h后对其进行首次换液，对孔板内的培养基半换液，防止还未贴壁的原代乳牙牙髓干细胞被不小心吸走，此后每3-4天换液，显微镜下观察，贴壁后全换液，原代干细胞融合率达80％-90％时，对其传代；其中培养箱的培养条件为置于含5％CO2、饱和湿度的37℃培养箱中进行培养；
所述步骤5中，在基础DMEM培养基中添加15％的FBS和1％的双抗青霉素和链霉素，bFGF的浓度为10ng/mL；
所述步骤6中，所有培养基均含有15％FBS和1％双抗，在诱导的第1-5天时，培养基为DMEM培养基；在诱导的第6-9天，逐步用DMEM/F12替换DMEM培养基，四天中DMEM/F12与DMEM培养基的体积比例分别为25/75，50/50，75/25，100/0；在诱导的第35天之后，用NB培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1为将牙齿依次浸泡在碘酊、75％的乙醇中进行消毒，将消毒后的牙齿用含1％双抗的PBS溶液清洗多次。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述的步骤6中，在诱导的第1-35天，培养皿用5％的基底胶包被。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110643571B (zh) * 2019-10-22 2021-07-27 康妍葆(北京)干细胞科技有限公司 人角蛋白6a在干细胞培养中的应用及产品
CN111235098B (zh) * 2020-01-17 2022-06-28 康妍葆(北京)干细胞科技有限公司 青蒿素在制备培养干细胞的产品中的应用、培养基及培养方法
TR202006919A2 (tr) * 2020-05-04 2021-11-22 Univ Yeditepe Di̇ş kök hücresi̇nden nöron hücresi̇ farklilaştirmasi amaciyla gerçekleşti̇ri̇len besi̇yeri̇ tabanli bi̇r yöntem
CN111909898B (zh) * 2020-08-17 2021-03-23 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种人牙髓干细胞的分离和扩增方法及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104726406B (zh) * 2015-02-13 2018-05-01 中国医科大学 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法
CN105087475B (zh) * 2015-09-17 2018-12-04 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法

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