CN110643571B - 人角蛋白6a在干细胞培养中的应用及产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞培养领域，具体而言，提供了一种人角蛋白6A在干细胞培养中的应用及产品。本发明提供人角蛋白6A在干细胞培养或制备用于干细胞培养的产品中的应用。发明人在试验中首次发现人角蛋白6A会对干细胞的培养产生影响，该发现令人惊讶，因为无法预测已知用于癌症标志物的蛋白质能够对干细胞培养产生影响。试验结果发现，人角蛋白6A不仅可以减缓干细胞增殖，提高干细胞的稳定性；也可以提高干细胞干性相关基因的表达水平，有利于维持干细胞干性，这些对干细胞培养和保存具有重要意义。因此，制备含有人角蛋白6A的产品用于干细胞培养可以提高干细胞稳定性和干性的维持。

Description

人角蛋白6A在干细胞培养中的应用及产品

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，具体而言，涉及一种人角蛋白6A在干细胞培养中的应用及产品。

背景技术

人角蛋白6A(Keratin 6A，KRT6A)是一种纤维状蛋白，在特定细胞中形成细胞骨架，在人体中承担重要功能。细胞骨架作为一类特殊的连续相细胞器，一方面在维持细胞形态以及保持细胞内部结构的合理布局中起主要作用，另一方面，在细胞内大分子的运输、细胞器的移动、细胞信息的传递、基因的表达与生物大分子的加工等密切相关。

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。随着科技的发展，干细胞的应用越来越多，干细胞的研究也越来越广泛，例如细胞移植、组织器官的构建、新药开发的工具细胞或生物学基础研究等等，这些都会涉及到基础操作，即干细胞的培养。然而，现有技术中对于干细胞的增殖都着眼于提高干细胞的增殖效率，很少有减缓干细胞增殖的研究。另外，干细胞的干性维持对干细胞培养也具有重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供人角蛋白6A在干细胞培养或制备用于干细胞培养的产品中的应用，为现有技术中干细胞培养方面提供新的技术方案。

本发明的第二目的在于提供一种减缓干细胞增殖的产品，以填补现有技术中缺少减缓干细胞增殖技术方案的空白。

本发明的第三目的在于提供一种提高干细胞干性相关基因表达的产品，为现有技术中提高干细胞干性提供新的技术方案。

本发明的第四目的在于提供一组用于扩增人角蛋白6A全基因序列的引物组，该引物组可以有效扩增得到人角蛋白6A全基因序列。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

人角蛋白6A在干细胞培养或制备用于干细胞培养的产品中的应用。

进一步地，所述干细胞培养包括减缓干细胞增殖。

进一步地，所述干细胞培养包括提高干细胞干性相关基因的表达。

进一步地，所述干细胞为牙龈干细胞，干性相关基因包括CD133、OCT4、KLF4、SOX2或NANOG中的至少一种。

进一步地，所述干细胞为牙周膜干细胞，干性相关基因包括CD133、OCT4、KLF4、SOX2、NANOG或ANAX2中的至少一种。

进一步地，所述产品包括培养基、细胞保存液或营养液。

一种减缓干细胞增殖的产品，所述产品包括人角蛋白6A。

一种提高干细胞干性相关基因表达的产品，所述产品包括人角蛋白6A。

进一步地，所述干细胞为牙龈干细胞，干性相关基因包括CD133、OCT4、KLF4、SOX2或NANOG中的至少一种；

优选地，所述干细胞为牙周膜干细胞，干性相关基因包括CD133、OCT4、KLF4、SOX2、NANOG或ANAX2中的至少一种。

一组用于扩增人角蛋白6A全基因序列的引物组，所述引物组的核苷酸序列如下：

KRT6A-F：5’-CCGGAATTCATGGCGAGCACATCCACTACC-3’(SEQ ID NO.1)；

KRT6A-R：

5’-CCGCTCGAGTTATTAGTGCTTATAGCTCTTCCTGCTAGAGG-3’(SEQ ID NO.2)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供人角蛋白6A在干细胞培养或制备用于干细胞培养的产品中的应用。发明人在试验中首次发现人角蛋白6A会对干细胞的培养产生影响，该发现令人惊讶，因为无法预测已知用于癌症标志物的蛋白质能够对干细胞培养产生影响。试验结果发现，人角蛋白6A不仅可以减缓干细胞增殖，提高干细胞的稳定性；也可以提高干细胞干性相关基因的表达水平，有利于维持干细胞干性，这些对干细胞培养和保存具有重要意义。因此，制备含有人角蛋白6A的产品用于干细胞培养可以提高干细胞稳定性和干性的维持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例4中KRT6A基因扩增的PCR检测结果；

图2为实施例5中重组质粒pET28-KRT6A的PCR验证结果，其中，M为DL5000 DNAMarker；1道为PCR扩增KRT6A基因；2道通用引物扩增空载载体；3道为扩增连接了KRT6A基因的pET28a重组载体；

图3为实施例6中目标蛋白诱导表达结果验证；

图4为实施例7中KRT6A表达位置检验结果；

图5为实施例7中KRT6A纯化后质谱检测结果；

图6为实施例8中角蛋白对GMSCs增殖的影响；

图7为实施例9中KRT6A对GMSCs相关基因的mRNA表达结果；

图8为实施例9中KRT6A对PDLSCs相关基因的mRNA表达结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

人角蛋白6A在干细胞培养或制备用于干细胞培养的产品中的应用。发明人在试验中首次发现人角蛋白6A会对干细胞的培养产生影响，该发现令人惊讶，因为无法预测已知用于癌症标志物的蛋白质能够对干细胞培养产生影响。试验结果发现，人角蛋白6A不仅可以减缓干细胞增殖，提高干细胞的稳定性；也可以提高干细胞干性相关基因的表达水平，有利于维持干细胞干性，这些对干细胞培养和保存具有重要意义。因此，制备含有人角蛋白6A的产品用于干细胞培养可以提高干细胞稳定性和干性的维持。

在优选地实施方式中，干细胞培养包括减缓干细胞增殖。减缓干细胞增殖有利于干细胞对外界信号作出反应，同时减少基因突变的危险，有利于干细胞的稳定性。

在优选地实施方式中，干细胞培养包括提高干细胞干性相关基因的表达。干细胞干性相关基因的有效表达可以减缓干细胞衰老以及提高干细胞自主分化、增殖能力，这对干细胞的干性维持具有重要意义。

在优选地实施方式中，干细胞为牙龈干细胞，干性相关基因包括CD133、OCT4、KLF4、SOX2或NANOG中的至少一种。发明人通过试验研究发现，人角蛋白6A可以显著提高牙龈干细胞CD133、OCT4、KLF4、SOX2和NANOG基因的表达量，对牙龈干细胞干性的维持，干细胞的稳定性具有重要意义。

在优选的实施方式中，干细胞为牙周膜干细胞，干性相关基因包括CD133、OCT4、KLF4、SOX2、NANOG或ANAX2中的至少一种。发明人通过试验研究发现，人角蛋白6A可以显著提高牙周膜干细胞CD133、OCT4、KLF4、SOX2、NANOG和ANAX2基因的表达量，对牙周膜干细胞干性的维持，干细胞的稳定性具有重要意义。

在优选地实施方式中，用于干细胞培养的产品包括培养基、细胞保存液或营养液。可以理解的是，由于发明人首次发现人角蛋白6A对干细胞培养产生影响，所以在干细胞培养过程中涉及减缓干细胞增殖和/或提高干细胞干性相关基因表达的应用场景均可利用人角蛋白6A实现，例如干细胞的培养基、干细胞的保存液或单独作为营养液向干细胞中进行添加等等。

本发明又提供一种减缓干细胞增殖或提高干细胞干性相关基因表达的产品，产品包括人角蛋白6A。

在优选地实施方式中，干细胞为牙龈干细胞，干性相关基因包括CD133、OCT4、KLF4、SOX2或NANOG中的至少一种。

在优选地实施方式中，干细胞为牙周膜干细胞，干性相关基因包括CD133、OCT4、KLF4、SOX2、NANOG或ANAX2中的至少一种。

一组用于扩增人角蛋白6A全基因序列的引物组，引物组的核苷酸序列如下：

KRT6A-F：5’-CCGGAATTCATGGCGAGCACATCCACTACC-3’(SEQ ID NO.1)；

KRT6A-R：

5’-CCGCTCGAGTTATTAGTGCTTATAGCTCTTCCTGCTAGAGG-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明提供的引物组可以特异性得到人角蛋白6A全基因序列，特异性强，可以表达完整人角蛋白6A，有利于人角蛋白6A的基因工程操作。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1细胞培养

从液氮罐中取出人类永生化表皮细胞(以下简称HaCat)，37℃融化后，取出冻存液加入到培养基中，离心1000rpm，5min，然后用新鲜培养基重悬，置于25mm培养皿中培养。待长满至80-90％融合时，传代。

实施例2提取细胞RNA和反转录

取出实施例1中培养皿，直接按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-3min。然后4℃12,000rpm离心15min。离心后混合物分成三相，RNA全部在上层无色水相中。小心吸取上层水相至另一离心管中。按0.5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀，充分混匀后，室温放置10min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA形成白色小团沉于管底。按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇，温和振荡，漂洗2-3次RNA沉淀。4℃7500rpm离心5min，尽量弃上清。在无菌工作台中室温干燥5-10min。可用50μL H₂O，TE buffer或0.5％SDS溶解RNA样品，55-60℃，5-10min温育以完全溶解RNA。测O.D值定量RNA浓度，或电泳检测RNA含量，将RNA逆转录成cDNA，作为下一步试验中的模板。

实施例3引物设计与合成

首先，应用设计引物的工具Primer Premier 5，选择合适参数设计出能合成KRT6A蛋白的引物序列，生成文件交由公司合成。引物序列如下：

KRT6A-F：5’-CCGGAATTCATGGCGAGCACATCCACTACC-3’(SEQ ID NO.1)；

KRT6A-R：

5’-CCGCTCGAGTTATTAGTGCTTATAGCTCTTCCTGCTAGAGG-3’(SEQ ID NO.2)。

实施例4KRT6A基因的扩增

利用实施例2和3中的模板和引物进行KRT6A扩增，PCR反应体系如下：

	体积
		ddH<sub>2</sub>O	20μL
2×PCRmix	25μL
		cDNA模板	1μL
KRT6A-F	2μL
		KRT6A-R	2μL
Total	50μL

PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec、57℃退火30sec、72℃延伸1min，30cycles，72℃终延伸10min。

PCR产物利用琼脂糖电泳检测，结果如图1所示。

实施例5重组质粒的构建与转化

为PCR得到的目的基因制备相应限制性内切酶cos位点(双酶切)，同时对pET28空质粒做相应酶切。将双酶切目标片段与双酶切质粒片段进行酶连反应，得到重组质粒。重组质粒中目的基因的PCR验证结果如图2所示。

将重组质粒转化进感受态细胞中，混匀使两者最大可能接触，分步热击、冰浴、加SOC培养基、37℃培养1h。

将上述感受态细胞均匀涂在Kan抗性的培养皿上，过夜培养，挑取4-5个大小不一的菌落在液体LB培养基中培养。过夜后取部分溶液送往公司测序。结果与用工具美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)对比，选择与目的基因开放序列覆盖率和吻合度最高的重组质粒，进行下一步实验。测序结果如下：

GGGGGGAACAAGGCCAGTGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGGTGGTAGCTCTTGATCCGGCCAACAAACCACCGCTTGGTAGCGGTGTTTTTTTTTGTTTGCAAGCAG(SEQ IDNo.3)。

实施例6诱导表达

(1)将上一步过夜培养得到的菌液，1:100(取20μL)接种至新的含有Kan抗性(30μg/mL)的5mL LB培养基中(剩余菌液置于4℃备用)，37℃、200rpm振荡培养至OD 0.4-0.6(大约培养5h)时，加入0.25mM IPTG诱导表达，分组培养，寻找适用于该蛋白的表达条件，一组置于37℃培养5h；一组置于28℃培养过夜。

(2)将诱导表达结束的菌液立即置于冰上，收集培养产物4mL。

(3)10000rpm、离心2min，倒去LB培养液，并用黄枪头吸去残余液体。

(4)PBS重悬洗去残余LB培养液，10000rpm、离心2min，去上清。

(5)加入50μL上样buffer，小心捶打，使菌混合均匀后，沸水浴10min，12000rpm离心10min。

(6)取20-30μL做SDS-PAGE(依蛋白大小不同，制作不同分离范围凝胶)。

(7)考马斯亮蓝染色30min后，加入去离子水于微波炉中脱色15-20min两次，查看蛋白表达情况。

(8)选用表达效果良好的诱导条件，做200mL量菌液诱导表达(1L锥形瓶)。

取上一步的备用菌液(4℃保存)，1:100接种至新的含有Kan抗性(30μg/mL)的2mLLB培养基中，活化培养12h左右，再1:100接种至新的含有Kan抗性(30μg/mL)的200mL LB培养基中，待OD值达到0.4-0.6左右时，做诱导表达。结果见附图3。

实施例7目的蛋白的纯化

(1)表达产物上柱样品的制备：

(a)按照上述得出的最佳培养条件培养pET28a-目的基因-Rosetta(DE3)菌株进行诱导培养，12000rpm，4℃，5min离心收集菌体。尽弃上清，称量计算菌体湿重。

(b)收集菌体后，每100mg菌体(湿重)加入3-5ml Soluble Binding Buffer，吹打重悬菌体后进行超声破碎。超声条件为：功率400W，超声3Sec，停止5Sec，共计99个循环。

(c)5000rpm，4℃，30min，离心，取上清加1mM PMSF冻存于-20℃，并取出少许于1.5离心管用于跑胶。

(d)将沉淀重悬于Soluble Binding Buffer中(如有需要，可进行超声波处理，超声前可加入1-5mM PMSF)。混匀后，5000rpm，4℃，离心10min，弃上清。

(e)重复操作(d)，直至包涵体清洗干净(呈较洁净的乳白色状)。

(f)将沉淀重悬于Inclusion Body Binding Buffer中，冰浴1小时，使包涵体溶解。

(g)10,000×g离心20分钟，取上清(若d操作未超声加蛋白抑制剂则加入1mMPMSF)，冻存于-20℃，并取少许于1.5mL离心管处理后用于跑胶。

(h)跑胶验证目标蛋白位于上清还是包涵体。结果见附图4。

(2)柱层析：(上柱之前将上清以孔径为0.22μm的滤膜过滤。)

若目标蛋白在可溶上清中，则

(a)柱平衡：用10倍柱体积的结合缓冲液B过柱平衡柱床，流速控制为0.2mL/min。

(b)样品过柱：将可溶上清在4℃融化后，将上清以孔径为0.45μm的滤膜过滤，负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。并作SDS-PAGE分析观察结合情况。

(c)洗柱：使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰作SDS-PAGE分析观察杂蛋白的洗脱情况。

(d)洗脱目的蛋白：使用5倍柱体积的Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰并进行SDS-PAGE分析以检查目的蛋白的洗脱情况。(至多收集8管)

(e)洗脱后，依次使用3倍柱体积的Soluble Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，4℃保存。

若目标蛋白在包涵体中，则

(a)样品过柱：将可溶上清在4℃融化后，将上清以孔径为0.22μm的滤膜过滤，负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。

(b)样品过柱：将可溶上清在4℃融化后，将上清以孔径为0.22μm的滤膜过滤，负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。

(c)洗柱：使用15倍柱体积的Inclusion Body Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。

(d)洗脱目的蛋白：使用5倍柱体积的Inclusion Body Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰(洗到用考马斯亮兰染色呈现的颜色浅为止。至多收集8管)。

(e)SDS-PAGE检验流穿峰和洗脱峰蛋白漂洗以及洗脱情况。加入BSA对照，粗略估算蛋白浓度。

(f)洗脱后，依次使用3倍柱体积的Inclusion Body Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，4℃保存。

注意：在纯化包涵体蛋白时，所有缓冲液均含有变性剂，需要降低Binding Buffer中的咪唑浓度(5mM或更低)。洗脱时，若蛋白在较高pH下洗脱失败，可以选用低pH缓冲液作为洗脱缓冲液(pH6.5，pH5.9或pH4.5)。

(3)柱再生

当填料使用多次后，结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色)，可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。

(4)纯化蛋白的复性与浓缩

(a)用BCA测蛋白质浓度，将上述收集的目的蛋白和流穿峰(如果里面也有目的蛋白的话)，稀释5-10倍进行浓度测定。

(b)将待透析蛋白进行取出一半进行稀释至0.05mM，另一半原样进行透析。(注：浓度低的蛋白可以全部混合在一起进行透析)

(c)按需剪去透析袋。析袋处理：分别先后用2％NaHCO₃、1mM EDTA,Na溶液煮沸10min。再用去离子水洗2min摇床，再用1mM EDTA,Na溶液煮沸10分钟。最后放在去离子水中4℃保存。

(d)将洗脱的目的蛋白缓缓加入透析袋中，夹紧另外一端。将透析袋置于装有透析缓冲液的2L烧杯中，调节pH使得透析过程pH不会越过蛋白等电点，4℃磁搅拌透析，缓冲液每6h换一次液。(注：换液时，保证尿素浓度呈8M,6M,4M,2M,0M下降。且缓冲液pH不能跨过蛋白的等电点，免得蛋白沉淀。若是蛋白沉淀，可加原来含有8M尿素的溶液重新溶解，再次透析。)

(5)蛋白浓缩：将PEG6000颗粒倒入一洁净干燥的玻璃瓶中，而后将透析袋放玻璃瓶，置于4℃，放置约24h(PEG6000会吸收透析袋中的水分，达到浓缩目的)。用EP管分装，-20℃保存。对纯化得到的蛋白进行质谱检测，结果见附图5，用质谱肽段的结果，进行了搜库，结果表明通过基因工程表达成功得到人角蛋白6A。

实施例8人角蛋白6A对干细胞增殖的影响

牙龈间充质干细胞(GMSCs)在含有FBS的MEM培养基中培养，到达80％融合率后，用胰酶消化，然后加入新鲜培养基重悬，10³个/孔接种于96孔板中培养，加入100μg上述基因工程得到的KRT6A角蛋白，同时以角蛋白18，19和BSA作为对照。培养24h后，加入CCK-8继续培养1-4h，酶标仪测定OD₄₅₀的值。结果见附图6，图中，从左往右，在培养有GMSCs的96孔板中依次添加了人角蛋白6A(图中为KRT6)为实验组，角蛋白18、19作为结构相似家族的无关蛋白组、BSA作为无关蛋白组以及无添加物作为阴性对照组。结果可以看到，相比于无添加物的正常生长的GMSCs、以及相比于其他添加物，KRT6A能够让GMSCs生长变得缓慢，且统计学上通过T检验有显著性差异。

实施例9人角蛋白6A对干细胞干性基因表达的影响

分别用1μg通过上述方法得到的KRT6A蛋白刺激牙龈干细胞(GMSCs)和牙周膜干细胞(PDLSCs)后，提取总RNA，反转录，进行相关干性基因和增殖基因包括如SOX2、NANOG、OCT4、CD133、KLF4、CD44、ANAX2mRNA表达的测定。结果见附图7和附图8。

图7为牙龈干细胞结果：相比于正常生长的GMSCs，添加KRT6A分子能够让GMSCs高表达CD133、OCT4、KLF4、SOX2、NANOG且统计学有显著性差异，而CD44和ANAX2则没有变化。

图8牙周膜干细胞结果：相比于正常生长的PDLSCs，添加KRT6A分子能够让PDLSCs高表达CD133、OCT4、KLF4、SOX2、NANOG、ANAX2且统计学有显著性差异，而CD44则没有变化。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 康妍葆(北京)干细胞科技有限公司

<120> 人角蛋白6A在干细胞培养中的应用及产品

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccggaattca tggcgagcac atccactacc 30

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgctcgagt tattagtgct tatagctctt cctgctagag g 41

<210> 3

<211> 1048

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggggaaca aggccagtga ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga gtcgacctgc 60

aggcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 120

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 180

tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 240

ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 300

gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 360

gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 420

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 480

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 540

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 600

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 660

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 720

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 780

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 840

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 900

tggtggccta actacggcta cactagaaga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 960

cagttacctt cggaaaaaga ggtggtagct cttgatccgg ccaacaaacc accgcttggt 1020

agcggtgttt ttttttgttt gcaagcag 1048

Claims (2)

1.人角蛋白6A在干细胞培养或制备用于干细胞培养的产品中的应用，其特征在于，所述人角蛋白6A由如SEQ ID NO.3所示的基因编码得到，所述干细胞培养为减缓牙龈干细胞增殖，或提高牙龈干细胞和牙周膜干细胞干性相关基因的表达，所述干细胞为牙龈干细胞时，干性相关基因为CD133、OCT4、KLF4、SOX2或NANOG中的至少一种；

所述干细胞为牙周膜干细胞时，干性相关基因为CD133、OCT4、KLF4、SOX2、NANOG或ANAX2中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为培养基、细胞保存液或营养液。

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