BR102013027577A2

BR102013027577A2 - método de detecção de um nível aumentado de axl ou gas6 e método de identificação de um paciente com câncer resistente a inibidor de egfr

Info

Publication number: BR102013027577A2
Application number: BR102013027577A
Authority: BR
Inventors: Trever G Bivona
Original assignee: Memorialsloan Kettering Cancer Ct; Univ California
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2016-03-29
Also published as: US20140121126A1

Abstract

método de detecção de um nível aumentado de axl ou gas6 e método de identificação de um paciente com câncer resistente a inibidor de egfr. são descritos no presente documento, inter alia, composições e métodos para detectar níveis de axl e gas6.

Description

MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM NÍVEL AUMENTADO DE AXL OU GAS 6 E MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UM PACIENTE COM CÂNCER RESISTENTE A INIBIDOR DE EGFR REFERENCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório US N°. 61/718.560, depositado em 25 de outubro de 2012, o qual está incorporado aqui em sua íntegra por referência e para todos os propósitos.

REFERÊNCIA A UM APÊNDICE ENCAMINHADO COMO UM ARQUIVO ASCII COM UMA "LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS", UMA TABELA OU UMA LISTAGEM DE PROGRAMA DE COMPUTADOR A Listagem de Sequências escrita no arquivo 84850-891535_ST25.TXT, criada em 23 de outubro de 2013, com 60.966 bytes, formato IBM-PC, para o sistema operacional MS-Windows, é aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) tem servido como um modelo para terapia de câncer direcionada ao genótipo. Os pacientes de NSCLC cujos tumores possuem mutações no domínio da quinase de ativação no receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) costumam responder inicialmente ao tratamento com um inibidor de tirosina quinase (TKI) de EGFR, como erlotinib. [Paez, J. G. et al., Science 304, 1497-1500 (2004); Pao, W. et al., Proc Natl Acad Sei USA 101, 13306-13311 (2004); Lynch, T. J. et al., The New England journal of medicine 350, 2129-2139 (2004); Sordella, R. , Bell, D. W., Haber, D. A. & Settleman, J-, Science 305, 1163-1167, d (2004)] Entretanto, uma resistência adquirida ao tratamento com EGFR TKI invariavelmente é desenvolvida. [Janne, P. A., Gray, N. & Settleman, J. , Nat Rev Drug Discov 8, 709-723 (2009); Gazdar, A. F., The New England journal of medicine 361, 1018-1020 (2009)] Não há terapia eficaz para pacientes que desenvolvem essa resistência. Já foi mostrado que a resistência ao tratamento com EGFR TKI pode ocorrer por meio de uma mutação secundária de resistência em EGFR (T7 90M), de ativação da quinase MET e de ativação da via NF-kB. [Kobayashi, S. et al. N Engl J Med 352, 786-792 (2005); Pao, W. et al. PLoS Med 2, e73 (2005); Engelman, J. A. et al. Science 316, 1039-1043 (2007); Turke, A. B. et al. Câncer Cell 17, 77-88 (2010); Bivona, T. G. et al. Nature 471, 523-526 (2011); Arcila, Μ. E. et al. Clinicai câncer research : an official journal of the American Association for Câncer Research 17, 1169-1180 (2011)] Os mecanismos por trás da resistência adquirida ao tratamento com EFGR TKI são desconhecidos em mais de 40% dos pacientes com NSCLC com EGFR mutante.

Estudos recentes indicaram que mecanismos de múltiplas resistências podem estar operando em um tumor indivíduo para promover a resistência adquirida a EGFR TKI em pacientes com NSCLC. Por exemplo, a mutação de resistência EGFR T790M e a ativação de MET podem ocorrer simultaneamente em alguns NSCLCs com EGFR mutante com resistência adquirida ao tratamento com EGFR TKI. [Bean, J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007); Arcila, Μ. E. et al. Clinicai câncer research: an official journal of the American Association for Câncer Research 17, 1169-1180 (2011)] Além disso, evidências recentes sugerem que a aquisição de resistência a EGFR TKI em NSCLCs com EGFR mutante pode estar associada não apenas com alterações genotípicas, mas também com mudanças histológicas que ocorrem durante a adaptação à terapia. [Sequist, L. V. et al. Sei Transi Med 3, 75ra26 (2011)] Há necessidade na técnica de identificar novos mecanismos de resistência adquirida ao tratamento com EGFR TKI, esclarecendo a extensão pela qual mudanças genotípicas e histológicas distintas e coexistentes promovem a aquisição de resistência ao tratamento com EGFR TKI em pacientes com NSCLC, e de composições e métodos efetivos para superar a resistência ao tratamento com EGFR TKI. A presente invenção fornece soluções para estes e outros problemas na técnica.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto é fornecido um método para tratar câncer resistente a inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). O método inclui detectar um nivel aumentado de AXL ou GAS6 na amostra de um paciente em relação a um controle (por exemplo, uma amostra controle) e administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de AXL ao paciente.

Em um segundo aspecto é fornecido um método para detectar niveis de AXL ou GAS6 em um paciente com câncer. O método inclui por um amostra do paciente com câncer em contato com um agente de ligação a AXL detectável ou um agente de ligação a GAS6 detectável, permitir que o agente de ligação a AXL detectável ou o agente de ligação a GAS6 detectável se ligue a AXL ou GAS6, respectivamente, permitir que o agente de ligação a AXL detectável e AXL formem um complexo AXL ou que o agente de ligação a GAS6 detectável e GAS6 formem um complexo GAS6, e detectar o complexo AXL ou o complexo GAS6.

Em um terceiro aspecto é fornecido um método para identificar um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR. O método inclui obter uma amostra de uma pluralidade de pacientes com câncer, detectar um nível de AXL ou um nível de GAS6 em cada uma das amostras, comparar o nível de AXL ou o nível de GAS6 com o de um controle, identificar pelo menos uma amostra da pluralidade de pacientes com câncer contendo um nível de AXL ou um nível de GAS6 maior do que o do controle, identificando assim um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR.

Em um quarto aspecto é fornecido um método para tratar o câncer resistente a inibidor de EGFR. O método inclui detectar um nivel aumentado de atividade de AXL em um paciente (por exemplo, de uma amostra do paciente) em relação a um controle (por exemplo, uma amostra controle) e administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de AXL ao paciente.

Em um quinto aspecto é fornecido um método para identificar um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR incluindo obter uma amostra de uma pluralidade de pacientes com câncer, detectar um nível de AXL em cada uma das amostras, comparar o nivel de atividade de AXL com o de um controle, identificar pelo menos uma amostra da pluralidade de pacientes com câncer contendo um nível de atividade de AXL maior do que o do controle, identificando assim um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR.

Em um sexto aspecto é fornecida uma composição farmacêutica incluindo uma quantidade terapeuticamente efetiva combinada de um inibidor de AXL e um inibidor EGFR.

Em outro aspecto é fornecido um método para detectar um nivel de AXL ou GAS6 em um sujeito (por exemplo, um paciente com câncer, o método incluindo: (i) obter uma amostra de um sujeito (por exemplo, um paciente com câncer); e (ii) detectar um nivel de expressão diferencial de AXL ou GAS6 na amostra em relação a um controle.

Em outro aspecto é fornecido um método para detectar um nível aumentado de AXL ou GAS6 em um sujeito (por exemplo, um paciente com câncer), o método incluindo: (i) obter uma amostra de um paciente com câncer; e (ii) detectar um nivel aumentado de AXL ou GAS6 na amostra em relação a um controle.

Em outro aspecto é fornecido um método para identificar um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR incluindo: i) obter uma amostra de um paciente com câncer; e (ii) detectar um nível aumentado de AXL ou GAS6 na amostra em relação a um controle.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. AXL é superexpresso em xenoenxertos de tumor NSCLC com EGFR mutante com resistência adquirida a erlotiníb. a, Efeitos de uma resposta à dose de erlotinib em xenoenxertos de tumor HCC827 em camundongos imunocomprometídos {n=10 tumores/grupo de tratamento). b-f, expressão de mRNA dos genes indicados nos xenoenxertos de tumor HCC827 resistente a erlotinib (tratados com as doses indicadas de erlotinib) em relação aos tumores controle tratados com veículo. O número de tumores analisados de cada coorte de tratamento é indicado entre parênteses. Os dados são expressos como a média ± SEM da mudança de vezes em relação à expressão média dos genes em 2 tumores controle de xenoenxerto tratados com veículo.

Figura 2. Ά superexpressão de AXL é necessária para a resistência adquirida ao tratamento com erlotinib em tumores NSCLC com EGFR mutante in vivo. a, Níveis de proteína AXL e pAXL são aumentados na ausência de pEGFR e pMET aumentada em tumores HCC827 de cada coorte de tratamento com erlotinib comparado aos tumores tratados com veículo. Os tumores foram colhidos para análise na conclusão do estudo para cada grupo de tratamento (Veículo: Dia 45; 6,25 Erl: Dia 60; 12,5 Erl: Dia 110; 25 Erl: Dia 110; 50 Erl: Dia 100) b, Tratamento agudo e transiente de tumores HCC827 tumores com erlotinib (12,5 mg/kg/dia) diminui pAKT, pERK, pRELa e aumenta os níveis de Parp clivada. c, Resposta de tumores de xenoenxerto HCC827 parentais ou tumores de xenoenxerto HCC827 ER (n= 10 tumores/grupo) transduzidos com um shRNA não específico ou um shRNA específico para AXL ao tratamento com veículo ou erlotinib (12,5 mg/kg/dia). Os volumes de tumor são expressos como uma média + SEM. d, Validação de silenciamento de AXL e dos efeitos de tratamento com erlotinib em pEGFR em xenoenxertos de tumores representativos (c) por análise de western blot.

Figura 3. A regulação positiva de AXL é necessária e suficiente para a resistência adquirida a erlotinib em modelos celulares de NSCLC com EGFR mutante, a, Sublinhagens de HCC827 ER1-ER5 são resistentes ao tratamento com erlotinib como medido pelo ensaio de viabilidade celular CellTiterGLO. Os dados são de 3 experimentos independentes e são expressos como porcentagem de células tratadas com veiculo e média + SEM. b, Expressão de AXL e GAS6 em sublinhagens ER comparada com células HCC827 parentais (os dados são de análise de Western blot). c, IC50 de erlotinib em linhagens celulares HCC827 (como indicado) medida 48h após o tratamento com um siRNA não especifico ou especifico para AXL ou GAS6. A IC50 de erlotinib é mostrada em parênteses. Os dados são representativos de 3 experimentos independentes, d, IC50 de Erlotinib em linhagens celulares HCC827 (como indicado) medida 48h após o tratamento com veiculo (controle) ou com MP-470 (1 μΜ) ou XL-880 (1 μΜ) e erlotinib. A IC50 de erlotinib é mostrada em parênteses. Os dados são representativos de 3 experimentos independentes, e, Efeitos do tratamento por 48h com um siRNA não especifico (-) ou especifico para AXL em linhagens celulares parentais ou ER1 e ER2 na ausência e presença de erlotinib nos biomarcadores indicados. Os dados representam 3 experimentos independentes, f-g, Efeitos do tratamento por 48h com um veiculo ou com as doses indicadas de (f) MP-470 ou (g) XL-880 em linhagens celulares parentais ou ER1 e ER2 na ausência e presença de erlotinib nos biomarcadores indicados. Os dados representam 3 experimentos independentes, h, IC50 de erlotinib em células HCC827 medida 5 dias após transfecção com construções de cDNA que codificam as proteínas indicadas e tratadas com veículo (esquerda) ou com XL-880 (1 μΜ) e erlotinib. A IC50 de erlotinib é mostrada em parênteses. Os dados são representativos de 3 experimentos independentes, i, Western blot para as proteínas indicadas em lisados de células transfectadas com as construções de cDNA indicadas e tratadas com XL-880 (1 μΜ) por 3 horas antes da lise da célula (h).

Figura 4. A resistência a erlotinib mediada por AXL ocorre em associação com EMT em modelos celulares de NSCLC com EGFR. a, Efeitos do tratamento com um siRNA não específico ou específico para vimentina indicado sobre a expressão de AXL em células HCC827 ER3. b, A IC50 de erlotinb em células HCC827 parentais ou ER3 quando do tratamento com um siRNA não específico ou o específico para vimentina indicado. A IC50 de erlotinib é mostrada em parênteses. Os dados representam 3 experimentos independentes, c, Migração aumentada por uma câmara t ranswell de ER3 comparada a de células HCC827 parentais em células tratadas com um siRNA não específico ou específico para vimentina (VIM) ou para AXL indicados ou com XL-880 (1 μΜ) ; n=3, os dados são expressos como média + SEM. d, Aderência aumentada a plástico de células HCC827 ER3 comparadas a células HCC827 parentais em células tratadas com um siRNA não específico ou específico para vimentina (VIM) ou para AXL indicados ou com XL-880 (1 μΜ). 5 campos microscópicos de por linhagem celular foram contados. n=3, os dados são expressos como média + SEM. e, Western blot para as proteínas indicadas em lisados de células transfectadas com os siRNAs indicados em (c-d).

Figura 5. A regulação positiva de AXL ocorre em NSCLCs humanos com EGFR mutante com resistência adquirida a EGFR TKI . a-b, Expressão representativa das proteínas indicadas por IHC nos (a) caso 7 e (b) caso 9 mostrada na Tabela 2. Coloração com IHC para AXL e GAS6 foi calculada como mostrado na Figura 19. A coloração com IHC de vimentina foi calculada usando um protocolo estabelecido e validado clinicamente [Azumi, N. & Battifora, H. American Journal of clinicai pathology 88, 286-296 (1987)] e a amplificação de EGFR T7 90M e MET foram avaliadas por sequenciamento e FISH, respectivamente, usando ensaios estabelecidos. Barras de escala indicam em (a) 100 μΜ e em (b) 10 μΜ.

Figura 6. Níveis aumentados de AXL e GAS6 não foram observados em tumores ou linhagens celulares HCC827 após tratamento agudo (48h) com erlotinib. A expressão de mRNA de AXL e GAS6 foi medida por Q-RT-PCR e é expressa em amostras tratadas com erlotinib em relação às amostras tratadas com veículo. n=3 para análise de xenoenxertos e linhagens celulares. Os dados são expressos como média + SEM.

Figura 7. A expressão de mRNA de vimentina em xenoenxertos de tumor HCC827 resistente a erlotinib (tratados com as doses indicadas de erlotinib) em relação a tumores controle tratados com veículo. O número de tumores analisados de cada coorte de tratamento é indicado em parênteses. Os dados são expressos como média + SEM da mudança de vezes em relação à expressão média dos genes em 2 tumores de xenoenxertos controle tratados com veículo.

Figura 8. Sublinhagens de HCC827 ER1-ER5 são resistentes ao tratamento com EGFR TKI BIBW2992 irreversível, como medido pelo ensaio de viabilidade celular CellTiterGLO. Os dados são de 3 experimentos independentes e são expressos como uma porcentagem das células tratadas com veículo e média + SEM.

Figura 9. Expressão dos genes indicados por Q RT PCR nas linhagens celulares HCC827 indicadas. Os dados são de 3 experimentos independentes e são normalizados por actina e expressos em relação às células parentais como a média _+ SEM.

Figura 10. a-b, Efeito do tratamento com siRNA não específico, específico para AXL, específico para MET ou especifico para AXL e MET sobre a sensibilidade a erlotinib em células (a) HCC827 parental ou (b) ER1, como medido pelo ensaio de viabilidade CellTiterGLO. Os dados são de 3 experimentos independentes e são expressos como uma porcentagem das células tratadas com veículo e média + SEM. c, Efeito do tratamento com siRNA não específico, específico para AXL, específico para MET ou específico para AXL e MET e erlotinib sobre os biomarcadores de sinalização indicados por western blot em lisados de células HCC827 parentais, ERl e ER2. Os dados são de 3 experimentos independentes.

Figura 11. a-f, Efeito de silenciamento de AXL sobre as linhagens celulares de NSCLC humano indicadas que expressam EFGR selvagem. n=3, os dados são expressos como média + SEM.

Figura 12. Efeito do tratamento com agente único com veículo ou MP-470 ou XL-880, cada um a 1 mM, sobre a viabilidade celular nas linhagens celulares indicadas como medido pelo ensaio CellTiterGLO. n=3, os dados são expressos como média + SEM.

Figura 13. a-d, Tratamento combinado com XL880 e erlotinib, mas não PHA e erlotinib, leva a uma diminuição sinergística da viabilidade celular por análise de índice de combinação. Os valores de Cl menores que 1, 1, e maiores que 1 indicam sinergismo, efeito aditivo e antagonismo, respectivamente. A linha tracejada marca o Cl = 1. Os dados são de 3 experimentos independentes.

Figura 14. a-b, Efeitos do tratamento com erlotinib nos biomarcadores indicados de ativação de via como medidos por western blot em lisados de células HCC827 ou ER3 tratados com (a) erlotinib e EGF ou (b) erlotinib durante um período de tempo, c-d, Efeitos da inibição de AXL por (c) siRNA ou (d) XL880 nos biomarcadores indicados de ativação de via como medidos por western blot em lisados de células HCC827 ou ER3. e-f, Expressão de AXL por (e) Q RT PCR ou (f) western blot nos lisados de células ER4 e ER5. g, Expressão das proteínas indicadas por western blot nos lisados de células ER4 e ER5. h-k, Efeitos da inibição de AXL por (h,j) siRNA ou (i,k) XL880 nos biomarcadores indicados de ativação de via como medidos por western blot em lisados de células HCC827 sobre (h-i) ER4 ou (j-k) ER5 tratadas com veículo ou erlotinib nas doses indicadas.

Figura 15. Superexpressão de AXL é necessária para resistência a erlotinib em células H3255 de NSCLC com EGFR mutante com resistência adquirida a erlotinib. a, AXL é superexpressa na ausência de pEGFR ou pMET aumentadas. A expressão aumentada do marcador de EMT vimentina foi também observada em conjunto com a superexpressão de AXL. b, Silenciamento de AXL por siRNA restaurou a sensibilidade a erlotinib nos subclones H3255 ER subclones (IC50 de erlotinib mostrada em mM) . c, Validação de silenciamento siRNA de AXL em células H3255 ER como medido por Q-RT-PCR e normalizado para células H3255 ER tratadas com controle não específico. Os dados são de 3 experimentos independentes e como a média + SEM. d, IC50 de erlotinib em células H3255 tratadas com MP-470 ou XL-880 na concentração de 1 mM, Os dados representam 3 experimentos independentes.

Figura 16. Efeitos da expressão das construções de cDNA indicadas que codificam AXL ou mutantes deste sobre a IC50 de XL-880 em células HCC827 parentais ou ER3. Os dados representam 3 experimentos independentes.

Figura 17. Efeitos da expressão ectópica de AXL em células PC9 sobre a (a) sensibilidade a erlotinib como medida pelo ensaio de viabilidade CellTiterGLO. n=3, os dados são expressos como média _+ SEM. (b) Western blots para as proteínas indicadas realizados em lisados gerados a partir de células parentais ou que superexpressam AXL (cl) são mostrados em (a).

Figura 18. Modelagem estrutural usando PDB viewer do resíduo gatekeeper no domínio quinase de AXL que prevê-se interagir com XL880 com base na analogia estrutural com o resíduo gatekeeper de EGFR T790M e com a estrutura co-cristalina de c-MET/XL-880. Legenda da sequência: PDB 3LQ8 (SEQ ID NO:35); PDB 2JIT (SEQ ID NO:36).

Figura 19. Validação do sistema de cálculo de IHC para as proteínas examinadas nos espécimes pareados de NSCLC humano com EGFR mutante de pacientes tratados com EGFR TKI nas Tabelas 2-3 e na Figura 5. Barra de escala = 100 pM.

Figura 20. Crizotinib supera resistência a EGFR TKI nos modelos ER de resistência adquirida. O crizotinib usado para tratamento de NSCLC caracterizado por fusão EML4-ALK. Inibe múltiplas quinases, incluindo ALK, MET, e AXL. Crizotinib confere sensibilidade dependente de dose a erlotinib em células ER em 10 μΜ.

Figura 21. Superando a resistência adquirida por meio de tratamento com inibidor de AXL. Erlotinib mais AD57, AD80, ou AD81 em células ER4 (sublinhagem ER4 de células HCC827 que são resistentes ao tratamento com erlotinib). Legenda: os símbolos de diamante são o controle DMSO, símbolos quadrados são 0,1 mícromolar de compostos, símbolos triangulares são 1 mícromolar de composto, símbolos x são 10 mícromolar de composto, tudo em combinação com erlotinib. AD57 e AD80 conferem sensibilidade dependente de dose a erlotinib em células ER4.

Figura 22, Indução de apoptose por inibição combinada de EGFR e AXL, Células ER4 (sublinhagem ER4 de células HCC827 que são resistentes ao tratamento com erlotinib) plaqueadas a 0,5 x 106 células/condição. Exposição de 24 horas à droga. A apoptose foi medida por indução de divagem de PARP e indução de BIM. E é erlotinib, AD57 a 1 micromolar, AD80 a 1 micromolar, AD81 a 10 micromolar. Exposição de 24 horas a AD57 ou AD8G combinada com erlotinib melhora a apoptose em células ER4.

Figura 23. Lista de genes junto com simbolos de gene, números de acesso, e/ou números de sonda Affymetrix para identificar os genes que compõem uma assinatura EMT pela qual células epiteliais e células mesenquimais possam ser diferenciadas; 35 marcadores de assinatura EMT (página 1), 76 marcadores de assinatura EMT (página 2), 76 marcadores de assinatura EMT (páginas 3-10) sendo que as linhas das páginas 3 e 4, 5 e 6, 7 e 8, e 9 e 10 estão alinhadas (por exemplo, a informação na primeira linha da tabela na página 3 da figura 23 descreve um gene marcador, nome do marcador, ou um número de sonda Affymetrix que são todos associados com o mesmo marcador.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições As abreviações suadas aqui possuem o seu significado convencional nas técnicas química e biológica. As estruturas e fórmulas químicas apresentadas aqui são construídas de acordo com as regras padrão de valência química conhecidas nas técnicas químicas.

Deve ser notado que ao longo de todo o pedido alternativas são escritas em grupos Markush, por exemplo, cada posição de aminoácido que contêm um ou mais aminoácidos possíveis. É especificamente contemplado que cada membro do grupo Markush deve ser considerado separadamente, compreendendo assim uma modalidade diferente, e o grupo Markush não deve ser lido como uma unidade única.

Os termos "um" ou "uma," como usados aqui, significam um ou mais. Além disso, a frase "substituído com um[a]", como usado aqui, significa que o grupo especificado pode ser substituído com um ou mais de qualquer um ou de todos os substituintes denominados.

Os termos "tratando" ou "tratamento" se referem a qualquer indício de sucesso no tratamento ou na melhora de um ferimento, doença, patologia ou condição, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo, como abatimento, remissão, diminuição de sintomas ou tornar o ferimento, a patologia ou a condição mais tolerável para o paciente; redução da taxa de degeneração ou declínio, tornar o ponto final da degeneração menos debilitante; melhorar o bem-estar físico ou mental do paciente. O tratamento ou melhora dos sintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos; incluindo os resultados de um exame físico, exames neuropsiquiátricos, e/ou uma avaliação psiquiátrica. Por exemplo, os certos métodos apresentados aqui tratam o câncer de maneira bem sucedida diminuindo a incidência de câncer e ou causando a remissão do câncer. Em algumas modalidades das composições ou métodos descritos aqui, tratar o câncer inclui diminuir a taxa de crescimento ou espalhamento das células do câncer, reduzindo a metástase ou reduzindo o crescimento de tumores metastáticos. 0 termo "tratando" e conjugações deste, incluem prevenção de ferimento, patologia, condição ou doença.

Uma "quantidade efetiva" é uma quantidade suficiente para que um agente farmacêutico ativo (API), como um modulador (por exemplo, inibidor, composto), atinja um objetivo proposto em relação à ausência do API (por exemplo, modulador, inibidor, composto) (por exemplo, conseguir o efeito para o qual foi administrado, tratar uma doença, reduzir a atividade de uma enzima, aumentar a atividade de uma enzima, reduzir uma via de sinalização, reduzir um ou mais sintomas de uma doença ou condição (por exemplo, reduzir a atividade de AXL em uma célula, aumentar a atividade de AXL, reduzir uma via de sinalização estimulada por AXL ou GAS6, reduzir a atividade de via de sinalização de AXL, reduzir a atividade de via de sinalização de GAS6, reduzir a resistência a inibidor de EGFR). Um exemplo de uma "quantidade efetiva" é uma quantidade efetiva para contribuir para o tratamento, prevenção ou redução de um sintoma ou sintomas de uma doença, a qual também pode ser chamada de "quantidade terapeuticamente efetiva". Uma "quantidade combinada terapeuticamente efetiva" é uma quantidade total de uma pluralidade de APIs que juntas são uma "quantidade efetiva" como definida aqui. Uma "redução" de um sintoma ou sintomas (e equivalentes gramaticais desta frase) significa diminuir a severidade ou frequência do (s) sintoma(s) . Uma "quantidade profilaticamente efetiva" de uma droga é uma quantidade da droga que, quando administrada a um sujeito, terão o efeito profilático desejado, por exemplo, impedir ou atrasar o aparecimento (ou a recorrência) de um ferimento, doença, patologia ou condição, ou os seus sintomas. O efeito profilático completo não necessariamente ocorre pela administração de uma dose e pode ocorrer apenas depois da administração de uma série de doses. Assim, uma quantidade profilaticamente efetiva pode ser administrada em uma ou mais administrações. Uma "quantidade diminuidora de atividade", como usada aqui, se refere a uma quantidade de antagonista necessária para diminuir a atividade de uma enzima em relação à ausência do antagonista. Uma "quantidade perturbadora de função," como empregada aqui, se refere a uma quantidade de antagonista necessária para perturbar a função de uma enzima ou proteína em relação à ausência do antagonista (por exemplo, perturbar a interação proteína-proteína entre AXL e GAS6, perturbar a interação entre AXL e os substratos fosforilados por AXL). As quantidades exatas irão depender do objetivo do tratamento e serão averiguáveis por alguém com habilidade na técnica usando técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed. , Lippincott, Williams & Wilkins). "Controle" ou "experimento controle" é usado de acordo com seu significado comum e se refere a um experimento no qual os sujeitos ou reagentes do experimento são tratados como se estivessem em um experimento paralelo, exceto pela omissão do procedimento, reagente ou variável do experimento. Em algumas ocasiões, o controle é usado como um padrão de comparação na avaliação de efeitos experimentais. Em algumas modalidades, um controle é a medida da atividade (por exemplo, atividade, interação proteina-proteina, via de sinalização) de uma proteína (por exemplo, AXL, GAS6, EGFR) na ausência de um modulador (por exemplo, composto, droga, inibidor) como descrito aqui (incluindo modalidades, exemplos) . 0 controle pode ser uma amostra obtida de um paciente ou indivíduo ("amostra controle").

Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle é uma amostra de um paciente sem a doença sendo detectada ou tratada. Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle é de um tecido sem doença ou células sem doença da mesma origem (por exemplo, órgão, tipo celular) que o tecido ou células com doença que estão sendo comparados ao controle. Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle é de um paciente diferente do que o da amostra teste. Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle é do mesmo paciente que o da amostra teste. Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle inclui células cancerosas que não são resistentes a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle é um valor ou conjunto de valores determinados a partir de uma ou uma pluralidade de amostras sem a doença sendo detectada ou tratada. Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle é de células ou tecidos antes de receberem o tratamento com um inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle inclui células cancerosas sensíveis a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle inclui células sensíveis a erlotinib. Em algumas modalidades, o controle ou a amostra controle inclui células sensíveis a gefitinib. "Em contato" é usado de acordo com seu significado comum e se refere ao processo de permitir pelo menos duas espécies distintas (por exemplo, compostos químicos incluindo biomoléculas ou células) se tornarem suficientemente próximas para reagir, interagir ou se tocar fisicamente. Deve ser percebido; entretanto, que o produto resultante da reação pode ser produzido diretamente a partir de uma reação entre os reagentes adicionados ou a partir de um intermediário de um ou mais dos reagentes adicionados que podem ser produzidos na mistura de reação. A expressão "em contato" ode incluir permitir que duas espécies reajam, interajam ou se toquem fisicamente, sendo que as duas espécies podem ser um modulador (por exemplo, composto, droga, inibidor) como descrito aqui e uma proteína ou enzima (por exemplo, AXL, GAS6, EGFR, MET) . Em algumas modalidades, a proteína pode ser AXL. Em algumas modalidades, a proteína pode ser GAS6. Em algumas modalidades, a proteína pode ser EGFR. Em algumas modalidades, a proteína pode ser EGFR mutante. Em algumas modalidades, em contato inclui permitir que um modulador (por exemplo, composto, droga, inibidor) descrito aqui interaja com uma proteína ou enzima que está envolvida com uma via de sinalização.

Como definido aqui, o termo "inibição", "inibir", "inibindo" e similares em referência a uma interação proteína-inibidor significava que afeta negativamente (por exemplo, diminuindo) a atividade ou função da proteína (por exemplo, diminuindo a via de sinalização estimulada por AXL, GAS6, EGFR ou EGFR mutante) em relação à atividade ou função da proteína na ausência do inibidor (por exemplo, AXL, GAS6, EGFR ou EGFR mutante). Em algumas modalidades, a inibição se refere à redução de uma doenças ou dos sintomas de doença. Em algumas modalidades, a inibição se refere à redução da atividade de uma via de transdução de sinal ou de uma via de sinalização (por exemplo, redução de uma via envolvendo AXL, redução de uma via envolvendo GAS6 mutante, redução de uma via envolvendo EGFR). Assim, inibição inclui, pelo menos em parte, o bloqueio parcial ou total do estimulo, diminuindo, impedindo ou atrasando a ativação, ou inativando, dessensibilizando ou regulando negativamente a via de sinalização ou atividade enzimática ou a quantidade de proteína (por exemplo, AXL, GAS6, EGFR, EGFR mutante). Em algumas modalidades, a inibição se refere à inibição das interações de AXL com os parceiros de ligação da via de sinalização (por exemplo, GAS6, substratos de fosforilação). Em algumas modalidades, a inibição se refere à inibição de interações de AXL com GAS6. O termo "modulador" se refere a uma composição que aumenta ou diminui o nível de uma molécula alvo ou a função (por exemplo, atividade quinase, troca de nucleotídeo, ligação de proteína efetora. ativação de proteína efetora, liberação de fosfato, liberação de nucleotídeo, ligação de nucleotídeo) de uma molécula alvo ou o estado físico (por exemplo, localização subcelular, processamento pós- traducional, modificações pós-traducionais) do alvo da molécula (por exemplo, um alvo pode ser AXL e a função pode ser fosforilar um substrato ou ativar uma via de sinalização que seja ativada por AXL ou GAS6, interação de AXL com parceiros de ligação de proteína). Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que reduz a atividade de AXL em uma célula. Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que aumenta a atividade de AXL. Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que reduz a via de sinalização em uma célula que é ativada por AXL. Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que aumenta a via de sinalização em uma célula que é ativada por AXL. Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que reduz a severidade de uma ou mais sintomas de uma doença associada com AXL (por exemplo, câncer, câncer metastático). Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que aumenta ou diminui a atividade ou função ou nivel de atividade ou nível de função de AXL ou nível de AXL ou nível de AXL em estado físico específico {por exemplo, AXL fosforilada). Em algumas modalidades, um modulador de AXL mutante é um composto que aumenta ou diminui a atividade ou função ou nível de atividade ou nível de função de uma AXL mutante ou nível de AXL mutante ou nível de AXL mutante em um estado físico específico. Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que reduz a atividade de GAS6, Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que aumenta a atividade de GAS6. Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que reduz a via de sinalização em uma célula que é ativada por GAS6. Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que aumenta a via de sinalização em uma célula que é ativada por GAS6. Em algumas modalidades, um modulador de doença de AXL é um composto que reduz a severidade de uma ou mais sintomas de uma doença associada com GAS6 (por exemplo, câncer, câncer metastático). Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um composto que aumenta ou diminui a atividade ou função ou nível de atividade ou nivel e função de GAS6 ou nivel de GAS6 ou nível de GAS6 em um estado físico específico. Em algumas modalidades, um modulador de AXL mutante é um composto que aumenta ou diminui a atividade ou função ou nível de atividade ou nível e função de GAS6 mutante ou nivel de GAS6 mutante ou nível de GAS6 mutante em um estado físico específico. Em algumas modalidades, um modulador de AXL é um inibidor de AXL. O termo "modular" é usado de acordo com seu significado comum e se refere ao ato de mudar ou variar uma ou mais propriedades. "Modulação" se refere ao processo de mudar ou variar uma ou mais propriedades. Por exemplo, como aplicado aos efeitos de um modulador sobre uma proteína alvo, modular significa mudar aumentando ou diminuindo uma propriedade ou função da molécula alvo ou a quantidade da molécula alvo. "Paciente" ou "sujeito com necessidade disto" se refere a um organismo vivo sofrendo de ou passivel de sofrer uma doença ou condição que pode ser tratada pela administração de um modulador, droga, composto ou composição farmacêutica como fornecido aqui. Exemplos não limitantes incluem humanos, outros mamíferos, bovinos, ratos, camundongos, cachorros, macacos, bodes, ovelhas, vacas, cervos e outros animais que não são mamíferos. Em algumas modalidades, um paciente é humano. "Doença" ou "condição" se refere a um estado de ser ou estado de saúde de um paciente ou sujeito capaz de ser tratado com os moduladores, inibidores, drogas, compostos ou métodos fornecidos aqui. Em algumas modalidades, a doença é uma doença relacionada a (por exemplo, causada por) AXL. Em algumas modalidades, a doença é uma doença relacionada a (por exemplo, causada por) GAS6. Em algumas modalidades, a doença é uma doença relacionada a (por exemplo, causada por) uma AXL mutante, atividade aberrante de via de sinalização de AXL, uma GAS6 mutante ou atividade aberrante de via de sinalização de GAS6 (por exemplo, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de fígado, glioblastoma, astrocitoma-glioblastoma, câncer de pulmão de células não pequenas, formas resistentes a inibidor de EGFR de qualquer um dos cânceres descritos aqui). Exemplos de doenças, desordens ou condições incluem, mas não estão limitados a câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de fígado, glioblastoma, astrocítoma-glioblastoma, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer resistente a inibidor de EGFR, câncer de pulmão resistente a inibidor de EGFR, câncer pancreático resistente a inibidor de EGFR, câncer de mama resistente a inibidor de EGFR, câncer de cólon resistente a inibidor de EGFR, câncer de esôfago resistente a inibidor de EGFR, câncer de tireoide resistente a inibidor de EGFR, câncer de fígado resistente a inibidor de EGFR, glioblastoma resistente a inibidor de EGFR, astrocitoma-glioblastoma resistente a inibidor de EGFR, câncer de pulmão de células não pequenas resistente a inibidor de EGFR. Em algumas ocasiões, "doença" ou "condição" se refere a câncer. Em algumas outras ocasiões, "câncer" se refere a cânceres e carcinomas, sarcomas, adenocarcinomas, linfomas, leucemias humanos etc., incluindo cânceres sólidos e linfoides, cânceres de rim, mama, pulmão, bexiga, cólon, ovário, próstata, pâncreas, estômago, cérebro, cabeça e pescoço, pele, útero, testículo, glioma, esôfago, pulmão e fígado, incluindo hepatocarcinoma, línfoma, incluindo linfoma linfoblástico agudo de célula B, linfoma não-Hodgkin (por exemplo, linfomas de Burkitt, de pequenas células, e de grandes células), linfoma de Hodgkin, leucemia (incluindo AML, ALL, e CML), câncer de pulmão de células não pequenas, ou mieloma múltiplo.

Como usado aqui, o termo "câncer" se refere a todos os tipos de câncer, neoplasias ou tumores malignos encontrados em mamíferos (por exemplo, humanos), incluindo leucemias, carcinomas e sarcomas. Exemplos de cânceres que podem ser tratados com um composto ou método fornecido aqui incluem câncer de tireoide, sistema endócrino, cérebro, ama, cérvix, cólon, cabeça e pescoço, fígado, rim, pulmão, pulmão de células não pequenas, melanoma, mesotelioma, ovário, sarcoma, estômago, útero, meduloblastoma, câncer colorretal, câncer pancreático. Exemplos adicionais incluem, doença de Hodgkin, linfoma de não-Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, gliorna, glioblastoma multiforme, câncer ovariano, rabdomíossarcoma, trombocitose primária, macroglobulinemia primária, tumores cerebrais primários, câncer, insulinoma pancreático maligno, carcinoide maligno, câncer de bexiga urinária, lesões pré-malignas de pele, câncer testicular, linfomas, câncer de tireoide, neuroblastoma, câncer esofágico, câncer do trato geniturinário, hipercalcemia maligna, câncer endometrial, câncer do córtex adrenal, neoplasias endócrinas ou exócrinas do pâncreas, câncer medular da tireoide, carcinoma medular da tireoide, melanoma, câncer colorretal, câncer papilar da tireoide, carcinoma hepatocelular, ou câncer de próstata. O termo "leucemia" se refere amplamente à doenças malignas progressivas dos órgãos formadores de sangue e é geralmente caracterizada por uma proliferação e desenvolvimento distorcidos dos leucócitos e seus precursores na sangue e na medula óssea. Ά leucemia é geralmente classificada clinicamente com base na (1) duração e caráter da doença - aguda ou crônica; (2) o tipo de célula envolvida; mieloide (mielogênicas ) , linfoide (linfogênicas) , ou monocitica; e (3) o aumento ou não do número de células anormais no sangue - leucêmica ou aleucêmica (subleucêmica). Exemplos de leucemias que podem ser tratadas com um composto ou método fornecido aqui incluem, por exemplo, leucemia não linfocitica aguda, leucemia linfocitica crônica, leucemia granulocitica aguda, leucemia granulocitica crônica, leucemia promielocitica aguda, leucemia de células T do adulto, leucemia aleucêmica, uma leucemia leucocitêmica, leucemia basofilica, leucemia linfoblástica, leucemia bovina, leucemia mielocítica crônica, leucemia cútis, leucemia embrionária, leucemia eosinofilica, leucemia de Gross, tricoleucemia, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocitica, leucemia de células-tronco, leucemia monocitica aguda, leucemia leucopêniea, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfogênica, leucemia linfoide, leucemia celular de linfossarcoma, leucemia de mastócitos, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia raonocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia mieloide granulocitica, leucemia mielomonocítica, leucemia mieloide tipo Naegeli, leucemia de células plasmáticas, mieloma múltiplo, leucemia plasmacitica, leucemia promielocítica, leucemia de células de Rieder, leucemia mieloide tipo Schilling, leucemia de células-tronco, leucemia subleucêmica, ou leucemia de células indiferenciadas. O termo "sarcoma" geralmente se refere a um tumor que é composto de uma substância similar ao tecido conjuntivo embrionário e é geralmente composta de células amontoadas muito próximas umas das outras inseridas em uma substância fibrilar ou homogênea. Os sarcomas que podem ser tratados com um composto ou método fornecido aqui incluem condrossarcoma, fibrossarcoma, linfossarcoma, melanossarcoma, mixossarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, lipossarcoma, sarcoma alveolar de partes moles, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioide, sarcoma cloroma, coriocarcinoma, sarcoma embrionário, sarcoma tumor de Wilms, sarcoma endometrial, sarcoma de estroma, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocitico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentar múltiplo idiopático, sarcoma imunoblástico de células B, linfoma, sarcoma imunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiossarcoraa, leucossarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma serocistico, sarcoma sinovial, ou sarcoma telangiectásico. O termo "melanoma" é entendido como significando um tumor que se origina do sistema melanocitico da pele e de outros órgãos. Os melanomas que podem ser tratados com um composto ou método fornecido aqui incluem, por exemplo, melanoma lentiginoso acral, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungueal, ou melanoma extensivo superficial. O termo "carcinoma" se refere a um novo crescimento maligno formado de células epiteliais tendendo a infiltrar os tecidos vizinhos e levar à formação de metástases. Exemplos de carcinomas que podem ser tratados com um composto ou método fornecido aqui incluem, por exemplo, carcinoma medular de tireoide, carcinoma medular de tireoide familiar, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocistico, carcinoma adenoide cistico, carcinoma adenomatoso, carcinoma do córtex adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basais, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células escamosas, carcinoma brônquiolo-alveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogênico, carcinoma cerebríforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriônico, carcinoma coloide, carcinoma comedo, carcinoma do corpo, carcinoma cribriforme, carcinoma em couraça, carcinoma cutâneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de duto, carcinoma durum, carcinoma embrionário, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma adenoide epitelial, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma do folículo piloso, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipernefroide, carcinoma embrionário infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma mole, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparo, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucoso, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatoide, carcinoma nasofaringeo, carcinoma de células de aveia, carcinoma ossificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma pré-invasivo, carcinoma de queratinócito, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renais de rim, carcinoma sarcomatoide, carcinoma schneideriano, carcinoma cirroso, carcinoma do escroto, carcinoma de células em anel de sinete, carcinoma simplex, carcinoma de células pequenas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esféricas, carcinoma de células fusiformes, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma de cólon, carcinoma telangiectásico, carcinoma telangiectod.es, carcinoma de células transicionais, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso, ou carcinoma viloso. "Câncer associado a AXL" (também chamado aqui de "câncer relacionado a AXL") se refere a um câncer causado por atividade ou sinalização aberrantes de AXL (por exemplo, quantidade aumentada de AXL ou GAS6, atividade aumentada de AXL) . Um "câncer associado com atividade aberrante de AXL" (também chamado aqui de "câncer relacionado a AXL") é um câncer causado por atividade ou sinalização aberrantes de AXL (por exemplo, uma AXL mutante, quantidade aumentada de AXL ou GAS6, atividade aumentada de AXL, atividade diminuída de AXL, quantidade reduzida de AXL ou GAS6). Cânceres relacionados a AXL podem incluir câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de fígado, glioblastoma, astrocitoma-glioblastoma, câncer resistente a inibidor de EGFR, câncer de pulmão resistente a inibidor de EGFR, câncer pancreático resistente a inibidor de EGFR, câncer de mama resistente a inibidor de EGFR, câncer de cólon resistente a inibidor de EGFR, câncer de esôfago resistente a inibidor de EGFR, câncer de tireoide resistente a inibidor de EGFR, câncer de fígado resistente a inibidor de EGFR, glioblastoma resistente a inibidor de EGFR, astrocitoma-glioblastoma resistente a inibidor de EGFR, câncer de pulmão de células não pequenas resistente a inibidor de EGFR. Determinar outros cânceres que estejam associados à atividade aberrante de AXL ou GAS6 está dentro da habilidade de uma pessoa com habilidade na técnica.

Como usado aqui, a expressão "células relacionadas à doença" significa células que estão associadas com uma doença ou condição, as quais incluem, mas não estão limitadas a células que iniciam a doença, células que propagam a doença, células que causam a doença, células que causam um ou mais sintomas de uma doença, células que são uma característica marcante da doença, células que contêm uma proteína ou molécula de mRNA específica que causa um sintoma da doença. Em algumas modalidades, a doença é um câncer e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer. Em algumas modalidades, a doença é um câncer metastático e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer metastático. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de fígado e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de fígado. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de pulmão e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de pulmão. Em algumas modalidades, a doença é um câncer pancreático e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer pancreático. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de mama e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de mama. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de cólon e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de cólon. Em algumas modalidades, a doença é um câncer esofágico e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer esofágico. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de tireoide e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de tireoide. Em algumas modalidades, a doença é um glioblastoma e a célula relacionada à doença é uma célula de glioblastoma. Em algumas modalidades, a doença é um astrocitoma-glioblastoma e a célula relacionada à doença é uma célula de astrocitoma-glioblastoma. Em algumas modalidades, a doença é um câncer resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um câncer metastático resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer metastático resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de figado resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de fígado resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de pulmão resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de pulmão resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de pulmão de células não pequenas resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de pulmão de células não pequenas resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um câncer pancreático resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer pancreático resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de mama resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de mama resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de cólon resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de cólon de pulmão resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um câncer esofágico resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer esofágico resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um câncer de tireoide resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de câncer de tireoide resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um glioblastoma resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de glioblastoma resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a doença é um astrocitoma-glioblastoma resistente a inibidor de EGFR e a célula relacionada à doença é uma célula de astrocitoma-glioblastoma resistente a inibidor de EGFR. O termo "expressão" se refere a um gene que é transcrito ou traduzido em um nível detectável. Como usado aqui, expressão também engloba "superexpressão", a qual se refere a um gene que é transcrito ou traduzido em um nível maior detectável, geralmente em uma célula de câncer, em comparação com uma célula normal. Expressão, portanto, se refere tanto à expressão da proteína e RNA de AXL (ou de GAS6) quanto à superexpressão local devido a padrões alterados de tráfego de proteína e/ou atividade funcional aumentada. A expressão pode ser detectada usando técnicas convencionais para detectar proteínas (por exemplo, ELISA, Western blotting, citometria de fluxo, imunofluorescência, imunohistoquímica etc.) ou mRNA (por exemplo, qPCR, RT-PCR, PCR, hibridização etc.). Alguém com habilidade na técnica saberá de outras técnicas apropriadas para detectar a expressão de proteina ou mRNA de AXL (ou GAS6) . Células cancerosas de, por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de figado, glíoblastoma, astrocitoma-glioblastoma ou formas resistentes a inibidor de EGFR destes, podem expressar AXL (ou GAS6) em um nível de pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, em comparação com uma célula normal não cancerosa. Células cancerosas também podem ter um nivel de transcrição ou tradução de AXL (ou GAS6) 1-vez, 2-vezes, 3-vezes, 4-vezes, 5-vezes, 6-vezes, 7-vezes ou mais maior do que células normais não cancerosas, Em algumas ocasiões, a amostra de célula de câncer normal é autóloga. Cânceres, células tumorais e tumores "resistentes à terapia" se referem a cânceres que se tornaram resistentes (por exemplo, não são susceptíveis a serem tratados pela terapia a que se tornaram resistentes comparado com câncer, célula tumoral ou tumor não resistente) a uma ou mais terapias de câncer (por exemplo, mediada por apoptose, não mediada por apoptose, tratamento com inibidor de EGFR), incluindo, mas não limitado à quimioterapia, terapia hormonal, radioterapia, imunoterapia e combinações destas. "Inibidor de EGFR" se refere a um inibidor (por exemplo, composto, anticorpo, droga) que trata uma doença usando como alvo EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR se liga a EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR inibe a atividade enzimática de EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR inibe uma função de EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR inibe uma interação proteina-proteína de EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR inibe a localização normal de EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR inibe a ligação do ligante a EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR inibe a ligação de EGF a EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR induz uma conformação inativa de EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR aumenta a degradação de EGFR. Em algumas modalidades, um inibidor de EGFR inibe modificações pós-traducionais de EGFR. Um câncer, ou forma especifica de câncer (por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de figado, glioblastoma, astrocitoma-glioblastoma) "resistente a inibidor de EGFR" é um câncer que é tratado de maneira menos efetiva por um ou mais dos inibidores de EGFR do que um câncer que não é resistente a um inibidor de EGFR, sendo que a comparação da efetividade dos cânceres resistente e não resistente é feita com base no(s) mesmo(s) inibidor(es). Inibidores de EGFR incluem gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-272, CP-724714, TAK-28 5, AST-1306, ARRY334543, ARRY-380, AG-1478 , dacomitínib/PF299804, 0 SI-4 2 0/de sme t i1 erlotinib, AZD8931, AEE788, pelítinib/EKB-5 69, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-4 90, XL647, PD153035, BMS-599626, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, AP26113, e CO-1686. Outros inibidores de EGFR são bem conhecidos na técnica e determinar que esses inibidores de EGFR possam ser exemplos de "inibidores de EGFR" faz parte da habilidade de uma pessoa de habilidade comum na técnica. As expressões "EGFR TKI" e "inibidor de EGFR" são usadas de maneira intercambiável e são equivalentes .

Como empregado aqui, a expressão "inibidor de AXL" se refere a uma composição (por exemplo, composto, anticorpo, droga, ácido nucleico, siRNA, RNAi, proteína, modulador) que diminui a atividade de AXL, a função de AXL, o nível de atividade de AXL, o nível de função de AXL, o nível (por exemplo, quantidade) de AXL (por exemplo, proteína, RNA), o nível de AXL em um estado físico específico (por exemplo, AXL fosforilada) , a expressão de AXL, a atividade de GAS6, a função de GAS6, o nível de atividade de GAS6, o nível de função de GAS6, o nível (por exemplo, quantidade) de GAS6 (por exemplo, proteína, RNA), o nível de GAS6 em um estado físico específico, a expressão de GAS6, ou a atividade, nível (por exemplo, quantidade) ou função de outro ligante de AXL. Em algumas modalidades, um inibidor de AXL mutante é um composto que diminui a atividade ou função ou nível de atividade ou nível de função de AXL mutante ou o nível de AXL mutante ou o nível de AXL mutante em um estado físico específico. Em algumas modalidades, um inibidor de AXL é um composto que diminui a atividade ou função ou nível de atividade ou nível de função de GAS6 ou o nível e GAS6 ou o nível de GAS6 em um estado físico específico. Em algumas modalidades, um inibidor de AXL mutante é um composto que diminui a atividade ou função ou nível de atividade ou nível de função de GAS6 mutante ou o nível de GAS6 mutante ou o nível de GAS6 mutante em um estado físico específico. Inibidores de AXL incluem BGB324, amuvatinib/MP-470, foretinib/XL880, BMS-777607, SGI-7079, bosutinib, crizotinib, YW327.6S2, AD57, AD80, AD81, e anticorpos de ligação a AXL, proteína de fusão Axl-Fc. Outros inibidores de AXL são bem conhecidos na técnica e determinar que esses inibidores de AXL possam ser exemplos de "inibidores de AXL" faz parte da habilidade de uma pessoa de habilidade comum na técnica.

Como usado aqui? o termo "marcador" se refere a qualquer marcador bioquímico, marcador serológico, marcador genético ou outra característica clínica que pode ser usada para diagnosticar ou fornecer um prognóstico para um câncer que expresse {por exemplo, superexpresse) AXL ou GAS6 de acordo com os métodos da presente invenção. Preferivelmente, o marcador é uma proteína AXL ou GAS6 ou um marcador de ácido nucleico. Um marcador também pode se referir a uma característica (por exemplo, ACL ou GAS6) que pode ser detectada pelos métodos descritos aqui.

Uma "biópsia" se refere ao processo de remover uma amostra de tecido para avaliação diagnostica ou prognostica, e ao próprio espécime de tecido. Qualquer técnica de biópsia conhecida na técnica pode ser aplicada aos métodos de diagnóstico e prognóstico da presente invenção. A técnica de biópsia aplicada irá depender do tipo de tecido a ser avaliado (por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de fígado, glioblastoma, astrocitoma-glioblastoma, formas resistentes a inibidor de EGFR destes etc.), do tamanho e tipo do tumor (por exemplo, sólido ou suspenso, sangue ou ascite), entre outros fatores. Técnicas representativas de biópsia incluem, mas não estão limitadas a biópsia excisiva, biópsia incisiva, biópsia com agulha, biópsia cirúrgica, e biópsia de medula óssea. Uma "biópsia excisiva” se refere à remoção de toda uma massa tumoral com uma pequena margem de tecido normal ao seu redor. Uma "biópsia incisiva" se refere à remoção de uma fatia de tecido que inclui o diâmetro transversal do tumor. Um diagnóstico ou prognóstico feito por endoscopia ou fluoroscopia pode necessitar de uma "biópsia central" da massa tumoral ou uma "biópsia de aspiração por agulha fina", a qual geralmente obtém uma suspensão de células de dentro da massa tumoral. Técnicas de biópsia são discutidas, por exemplo, em Harrison's Principies of Internai Medicine, Kasper, et al., eds., 16- ed., 2005, Capitulo 70, e ao longo da Parte V. "Excípiente farmaceuticamente aceitável" e "carreador farmaceuticamente aceitável" se referem a uma substância que auxilia na administração de uma agente ativo a um sujeito e na sua absorção por um sujeito e pode ser incluído nas composições da presente invenção sem causar um efeito toxícológico adverso significativo ao paciente. Exemplos não limitantes de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem água, NaCl, soluções salinas normais, Ringer com lactato, sacarose normal, glicose normal, ligantes, cargas, desintegrantes, lubrificantes, revestimentos, adoçantes, flavorizantes, soluções salinas (como a solução de Ringer), álcoois, óleos, gelatinas, carboidratos como lactose, amilose ou amido, ésteres de ácido graxo, hidroximetiIcelulose, polivinilpirrolidona, e colorizantes, e similares. Essas preparações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares como lubrificantes, preservantes, estabilizadores, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, colorizantes e/ou substâncias aromáticas e similares que não reagem de maneira deletéria com os compostos da invenção. Alguém com habilidade na técnica irá reconhecer que outros excipientes farmacêuticos são úteis na presente invenção. 0 termo "preparação" tem a intenção de incluir a formulação do composto ativo com material encapsulante como um carreador fornecendo um cápsula na qual o componente ativo, com ou sem outros carreadores, é cercado por um carreador, o qual está assim em associação com ele. De maneira similar, cápsulas e comprimidos estão incluídos.

Tabletes, pós, cápsulas, pílulas, drágeas, e comprimidos podem ser usados como formas de dosagem sólidas apropriadas para administração oral.

Como usado aqui, o termo "administrando" significa administração parenteral, administração oral, administração como um supositório, contato tópico, administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intratecal, intranasal ou subcutânea, ou a implantação de um dispositivo de liberação lenta, por exemplo, uma minibomba osmótica, em um sujeito. A administração é por qualquer rota, incluindo parenteral e transmucosal (por exemplo, bucal, sublingual, palatal, gengival, nasal, vaginal, retal, ou transdérmica). A administração parenteral inclui, por exemplo, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intraventricular, e intracranial. Outros modos de entrega incluem, mas não estão limitados ao uso de formulações lipossômicas, infusões intravenosas, adesivos transdérmicos etc. Por "co-administrar", se quer dizer que a composição descrita aqui é administrada ao mesmo tempo, exatamente antes, ou exatamente depois da administração de uma ou mais terapias adicionais, por exemplo, terapias de câncer como quimioterapia, terapia hormonal, radioterapia ou imunoterapia. Os compostos da invenção podem ser administrados sozinhos ou podem ser coadministrados ao paciente. A coadministração tem a intenção de incluir a administração simultânea ou sequencial dos compostos individualmente ou em combinação (mais de um composto). Assim, as preparações podem também ser combinadas, quando desejado, com outras substâncias ativas (por exemplo, para reduzir a degradação metabólica). As composições da presente invenção podem ser entregues por via transdérmica, por uma rota tópica, formulados como hastes aplicadoras, soluções, suspensões, emulsões, géis, cremes, linimentos, pastas, geleias, tintas, pós e aerossóis. O termo "administrar (ou administrando) um inibidor de AXL" significa administrar um inibidor (por exemplo, composto) que inibe a atividade ou nível (por exemplo, quantidade) de AXL e/ou GAS 6 ou nível de uma via de sinalização de AXL e/ou GAS6 (por exemplo, um inibidor de AXL)a um sujeito. A administração pode incluir, sem ser limitada pelo mecanismo, permitir tempo suficiente para que o inibidor de AXL reduza a atividade das proteínas AXL ou GAS6 ou para que o inibidor de AXL reduza um ou mais sintomas (por exemplo, resistência a inibidor de EGFR) de uma doença (por exemplo, câncer, sendo que o inibidor de AXL pode superar a resistência a inibidor de EGFR, interromper o ciclo celular, reduzir a replicação de DNA, reduzir o crescimento celular, reduzir a metástase ou causar morte celular). O termo "associado" ou "associado com" no contexto de uma substância ou atividade ou função da substância associada com uma doença (por exemplo, uma doença associada à proteína, um câncer associado com atividade aberrante de AXL, câncer associado a AXL, câncer associado a AXL mutante, câncer associado a AXL ativada, câncer associado a AXL mutante, um câncer associado com atividade aberrante de GAS6, câncer associado a GAS6, câncer associado a GAS6 mutante, câncer associado a GAS6 ativada, câncer associado a GAS6 mutante) significa que a doença (por exemplo, câncer) é causada pela (na íntegra ou em parte) , ou um sintoma da doença é causado pela (na integra ou em parte) substância ou pela atividade ou função da substância. Por exemplo, um câncer associado com atividade ou função aberrante de AXL pode ser um câncer que resulta (integralmente ou parcialmente) da atividade ou função aberrante de AXL (por exemplo, atividade enzimática, interação proteína-proteína, via de sinalização) ou um câncer no qual um sintoma especifico da doença é causado {integralmente ou parcialmente) pela atividade ou função aberrante de AXL (por exemplo, resistência a inibidor de EGFR). Como usado aqui, o que é descrito como sendo associado com uma doença, se for um agente causador, podería ser um alvo para o tratamento da doença. Por exemplo, um câncer associado com atividade ou função aberrante de AXL ou um câncer associado a AXL pode ser tratado com um modulador de AXL ou um inibidor de AXL, na ocasião em que atividade ou função aumentada de AXL (por exemplo, atividade de via de sinalização) cause o câncer. Por exemplo, um câncer associado com AXL aumentada pode ser um câncer que um sujeito com AXL aumentada tenha um risco mais alto de desenvolver quando comparado com um sujeito sem AXL aumentada (por exemplo, câncer resistente a inibidor de EGFR). 0 termo "aberrante", como usado aqui, se refere a diferente do normal. Quando usado para descrever atividade enzimática, aberrante se refere à atividade que é maior ou menor que um controle normal ou que a média das amostras controle normais sem doença. Atividade aberrante pode se referir a uma quantidade ou atividade que resulta em doença, sendo que o retorno da atividade aberrante a uma quantidade normal ou não associada com a doença (por exemplo, pela administração de um composto ou usando um método descrito aqui) resulta na redução da doença ou de um ou mais sintomas da doença. A expressão "via de sinalização", como usada aqui, se refere a uma série de interações entre os componentes celulares e opcionalmente extracelulares (por exemplo, proteínas, ácidos nucleicos, moléculas pequenas, íons, lipídeos) que leva a uma mudança em um componente para um ou mais outros componentes, os quais por sua vez podem levar a uma mudança a componentes adicionais, a qual é opcionalmente propagada a outros componentes de via de sinalização. Por exemplo, a ligação de AXL a um composto, como descrito aqui, pode resultar em uma mudança em uma ou mais interações proteína-proteina de AXL, resultando em mudanças no crescimento, proliferação e sobrevivência celulares, ou em resistência a inibidor de EGFR.

Um resíduo de aminoácido em uma proteína "corresponde" a um dado resíduo quando ele ocupa a mesma posição estrutural essencial dentro da proteína que o dado resíduo. Por exemplo, um resíduo selecionado em uma proteína selecionada corresponde à Thr 790 do EGFR humano quando o resíduo selecionado ocupa a mesma relação espacial essencial ou outra relação estrutural que Thr 7 90 em EGFR humano. Em algumas modalidades, quando uma proteína selecionada é alinhada para homologia máxima com a proteína de EGFR humano, diz-se que a posição na proteína selecionada alinhada que se alinha com Thr 7 90 corresponde à Thr 790. Em vez de um alinhamento por sequência primária, um alinhamento por estrutura tridimensional também pode ser usado, por exemplo, quando a estrutura da proteína selecionada é alinhada para correspondência máxima com a proteína de EGFR humano e as estruturas como um todo são comparadas. Neste caso, diz-se que um aminoácido que ocupa a mesma posição essencial que Thr 790 no modelo estrutural corresponde ao resíduo de Thr 790. A expressão "nível de AXL" ou "nível de AXL" se refere à quantidade de ácido nucleico, proteína ou atividade de AXL. Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de ácido nucleico de AXL ou fragmentos deste. Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de proteína de AXL ou fragmentos desta. Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de atividade de AXL (por exemplo, atividade quinase, atividade de via de sinalização envolvendo AXL, ligação proteína-proteina). Em algumas modalidades, um nível pode se referir a uma subpopulação de AXL (por exemplo, fosforilada, ligada a um ligante, localizada). Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de RMA de AXL. Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de DNA de AXL (por exemplo, número de cópias do gene). Em algumas modalidades, o nivel se refere à quantidade de ácido nucleico, proteína ou atividade de AXL mutante. A expressão "nível de GAS6" ou "nível de GAS6" se refere à quantidade de ácido nucleico, proteína ou atividade de GAS6. Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de ácido nucleico de GAS6 ou fragmentos deste. Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de proteína de GAS6 ou fragmentos desta. Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de atividade de GAS6 (por exemplo, atividade quinase, atividade de via de sinalização envolvendo GAS6, ligação proteína-proteína). Em algumas modalidades, um nível pode se referir a uma subpopulação de GAS6 (por exemplo, fosforilada, ligada a um ligante, localizada). Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de RNA de GAS6. Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de DNA de GAS6 (por exemplo, número de cópias do gene). Em algumas modalidades, o nível se refere à quantidade de ácido nucleico, proteína ou atividade de GAS6mutante. A expressão "agente de ligação a AXL detectável", como usado aqui, se refere a uma composição capaz de ligar um ácido nucleico ou fragmento deste, ou uma proteína ou fragmento desta de AXL, sendo que o complexo (por exemplo, incluindo AXL e o agente de ligação a AXL detectável) é capaz de ser detectado. Alguns exemplos incluem um ácido nucleico que é capaz de se ligar a AXL, ou fragmento deste, sendo que o complexo do agente de ligação a AXL detectável (por exemplo, ácido nucleico) e do ácido nucleico de AXL pode ser detectado por reação em cadeia de polimerase resultando em ácidos nucleicos aumentados derivados do complexo (por exemplo, amplificação de pelo menos uma porção do ácido nucleico de AXL) ; um anticorpo que se liga a AXL, o qual é marcado com uma fração detectável ou é capaz de ser marcado com uma fração detectável por meio da ligação de um anticorpo secundário conjugado à fração detectável ao anticorpo que se liga a AXL. A expressão "agente de ligação a GAS6 detectável", como usado aqui, se refere a uma composição capaz de ligar um ácido nucleico ou fragmento deste, ou uma proteína ou fragmento desta de GAS6, sendo que o complexo (por exemplo, incluindo GAS6 e o agente de ligação a GAS6 detectável) é capaz de ser detectado. Alguns exemplos incluem um ácido nucleico que é capaz de se ligar a GAS6, ou fragmento deste, sendo que o complexo do agente de ligação a GAS6 detectável (por exemplo, ácido nucleico) e do ácido nucleico de GAS6 pode ser detectado por reação em cadeia de polimerase resultando em ácidos nucleicos aumentados derivados do complexo (por exemplo, amplificação de pelo menos uma porção do ácido nucleico de GAS6); um anticorpo que se liga a GAS6, o qual é marcado com uma fração detectável ou é capaz de ser marcado com uma fração detectável por meio da ligação de um anticorpo secundário conjugado à fração detectável ao anticorpo que se liga a GAS6. O termo "diagnóstico" se refere à probabilidade relativa de que uma doença (por exemplo, câncer, câncer resistente a inibidor de EGFR, ou outra doença) esteja presente no sujeito. Similarmente, o termo "prognóstico" se refere à probabilidade relativa de que um certo resultado futuro possa ocorrer no sujeito com respeito ao estado da doença. Por exemplo, no contexto da presente invenção, prognóstico pode se referir à chance de que um indivíduo irá desenvolver a doença {por exemplo, câncer, câncer resistente a inibidor de EGFR, ou outra doença), ou à severidade provável da doença (por exemplo, duração da doença). Os termos não têm a intenção de serem absolutos, como será percebido por qualquer um com habilidade no campo de diagnósticos médicos. "Ácido nucleieo" ou "oligonucleotídeo" ou "polinucleotídeo" ou equivalentes gramaticais usados aqui significam pelo menos dois nucleotídeos ligados um ao outro covalentemente. Δ expressão "ácido nucleieo" inclui DNA, RNA e análogos (derivados) destes de uma, duas ou múltiplas fitas. Oligonucleotideos têm tipicamente cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50 ou mais nucleotídeos de comprimento, até cerca de 100 nucleotídeos de comprimento. Ácidos nucleicos e polinucleotideos são polímeros de qualquer comprimento, incluindo comprimentos mais longos, por exemplo, 200, 300, 500, 1.000, 2.000, 3.000, 5.000, 7.000, 10.000 etc. Em certas modalidades, os ácidos nucleicos aqui contêm ligações fosfodiéster. Em outras modalidades, análogos de ácidos nucleicos são incluídos que podem ter esqueletos alternativos compreendendo, por exemplo, ligações fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, ou O-metilfosforoamidito (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); e esqueletos e ligações de ácido nucleieo peptídicas. Outros ácidos nucleicos análogos incluem aqueles com esqueletos positivos, esqueletos não iônicos, e esqueletos sem ribose, incluindo aqueles descritos em Patentes US N° 5.235.033 e 5.034.506, e nos capítulos 6 e 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modificatíons in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds. Ácidos nucleicos um ou mais açúcares carbocíclicos também estão incluídos em uma definição de ácidos nucleicos.

Modificações do esqueleto de ribose-fosfato podem ser realizadas por várias razões, por exemplo, para aumentar a estabilidade e meia vida dessas moléculas em ambientes fisiológicos ou como sondas em um biochip. Misturas de ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente e análogos podem ser feitas; alternativamente, misturas de diferentes análogos de ácido nucleico, e misturas de ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente e análogos podem ser feitas.

Um sequência especifica de ácido nucleico também abrange "variantes de recomposição" (splice) Similarmente, uma proteína especifica codificada por um ácido nucleico abrange qualquer proteína codificada por uma variante de recomposição daquele ácido nucleico. "Variantes de recomposição," como o nome sugere, são produtos de recomposição alternativos de um gene. Após a transcrição, um transcrito inicial de ácido nucleico pode ser recomposto de maneira que diferentes (alternativos) produtos de recomposição de ácido nucleico codifiquem diferentes polipeptideos. Mecanismos para a produção de variantes de recomposição variam, mas incluem a recomposição alternativa de éxons. Polipeptideos alternativos derivados do mesmo ácido nucleico por transcrição read-through também são abrangidos por esta definição. Quaisquer produtos de uma reação de recomposição, incluindo formas recombinantes dos produtos de recomposição, estão incluídos nesta definição. A menos que indicado de outra forma, uma sequência específica de ácido nucleico também implicitamente abrange variantes modificadas de maneira conservativa desta (por exemplo, substituições degeneradas de códon) , alelos, ortólogos, SNPs (haplótipo) , e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, substituições degeneradas de códon podem ser obtidas gerando-se sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída cora resíduos de base mista ou de deoxinosina (Batzer et al. , Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Um ácido nucleico está "operacionalmente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou um líder secretório está operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que participa da secreção de um polipeptídeo; um promotor ou um acentuador está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomo está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se ele estiver posicionado de maneira a facilitar a tradução. Geralmente, "operacíonalmente ligado" significa que as sequências de DNA sendo ligadas são próximas uma da outra, e, no caso de um líder secretório, contíguas e em fase de leitura. Contudo, acentuadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios não existirem, adaptadores ou linkers de oligonucleotídeos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.

Os termos "idêntico” ou porcentual de "identidade," no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeo, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou que possuem uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, cerca de 60% de identidade, preferivelmente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade sobre uma região especifica quando comparadas e alinhadas para máxima correspondência em uma janela de comparação ou região designada) como medido usando algoritmos de comparação de sequência BLAST ou BLAST 2.0 com os parâmetros básicos descritos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, a página de internet do NCBI ou similares) . Essas sequências são então chamadas de ''substancialmente idênticas". Esta definição também se refere, ou pode ser aplicada ao complemento de uma sequência teste. A definição também inclui sequências que possuem deleções e/ou adições, bem como aquelas que possuem substituições. Como descrito abaixo, os algoritmos preferidos podem lidar com lacunas e similares. Preferivelmente, a identidade existe sobre uma região que tenha um comprimento de pelo menos cerca de 10 aminoácidos ou 20 nucleotideos, ou mais preferivelmente sobre uma região que tenha um comprimento de 10-50 aminoácidos ou 20-50 nucleotideos. Como usado aqui, porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácido é definida como a porcentagem de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos aminoácidos em uma sequência de referência, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência. Alinhamento para o propósito de determinar porcentagem de identidade de sequência pode ser obtido de várias maneiras que estão contidas na habilidade na técnica, por exemplo, usando programas de computador disponíveis publicamente, como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se obter alinhamento máximo sobre o comprimento completo das sequências sendo comparadas, podem ser determinados por métodos conhecidos.

Para comparações de sequência, normalmente uma sequência age como a sequência de referência, contra a qual sequências de teste são comparadas. Quando se está usando um algoritmo de comparação de sequência, sequências de teste e de referência são registradas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. Preferivelmente, parâmetros básicos do programa podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula os porcentuais de identidade de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

Uma "janela de comparação", como usado aqui, inclui referência ao segmento de qualquer um dos números de posições contíguas selecionadas do grupo que consiste em de 10 a 600, comumente cerca de 50 a cerca de 200, mais comumente cerca 100 a cerca de 150, nas quais uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência de mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem alinhadas de maneira ótima. Métodos de alinhamento de sequência são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smíth & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, <J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetícs Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)). A frase "hibridíza seletivamente (ou especificamente) com" se refere à ligação, formação de dupla fita ou hibridização de uma molécula apenas com uma sequência de nucleotídeo com uma afinidade maior, por exemplo, sob condições mais estringentes, do que com outras sequências de nucleotideos (por exemplo, DNA ou RN A celular ou de biblioteca totais). A frase "condições estringentes de hibridização " se refere a condições sob as quais uma sonda irá se hibridizar com sua subsequência alvo, comumente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas com nenhuma outra sequência. Condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas se hibridizam especificamente em altas temperaturas. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos pode ser encontrado em Tijssen, Technlques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para ser de cerca de 5-10°C mais baixas que a temperatura de desnaturação (Tm) para a sequência específica em um pH de força iônica específico. A Tm é a temperatura (sob força iônica, pH e concentração nucleica definidos) na qual 50% das sondas complementares ao alvo se hibridizam à sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, em Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). As condições estringentes também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabílízantes, como a formamida. Para hibridizações seletivas ou específicas, um sinal positivo é uma hibridização de pelo menos duas vezes o background, preferivelmente 10 vezes o background. Exemplos de condições estringentes de hibridização podem ser os seguintes: formamida 50%, SSC 5x, e SDS 1%, incubando a 42°C, ou, SSC 5x, SDS 1%, incubando a 65°C, com lavagem em SSC 0,2x, e SDS 0,1% a 65°C. Ácidos nucleicos que não se hibridizam um com outro sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se os polipeptideos que eles codificam são substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degeneração máxima de códons permitida pelo código genético. Nesses casos, os ácidos nucleicos comumente se hibridizam sob condições de hibridização moderadamente estringentes. "Condições de hibridização moderadamente estringentes" incluem uma hibridização em tampão de formamida 40%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em SSC IX a 45°C. Uma hibridização positiva é de pelo menos duas vezes o background. Aqueles de habilidade comum irão reconhecer que condições alternativas de hibridização e lavagem podem ser utilizadas para fornecer condições de estringência similares. Diretrizes adicionais para determinar os parâmetros de hibridização são fornecidos em numerosas referências, por exemplo, e em Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.

Vinte aminoácidos são comumente encontrados em proteínas. Esses aminoácidos podem ser agrupados em nove classes ou grupos com base nas propriedades químicas de suas cadeias laterais. A substituição de um resíduo de aminoácido por outro da mesma classe ou grupo é chamada aqui de uma substituição "conservadora". As substituições conservadoras de aminoácidos podem frequentemente ser feitas em uma proteína sem alterar significativamente a conformação ou função da proteína. A substituição de um resíduo de aminoácido por outro de uma classe ou grupo diferente é chamada aqui de substituição "não conservadora". Em contraste, as substituições não conservadoras de aminoácidos tendem a modificar a conformação e função de uma proteína.

Exemplo de classificação de aminoácido Resíduos Gly, Ala, Vai, pequenos/alifáticos: Leu, Ile Iminoácido cíclico: Pro Resíduos contendo Ser, Thr hidroxila: Resíduos ácidos: Asp, Glu Resíduos amida: Asn, Gin Resíduos básicos: Lys, Arg Resíduos imidazóis: His Resíduos aromáticos: Phe, Tyr, Trp Resíduos que contêm Met, Cys enxofre: Em algumas modalidades, a substituição conservadora de aminoácido compreende substituir qualquer um entre glicina (G) , alanina (A), isoleucína (I), valina (V), e leucina (L) por qualquer outro desses aminoácidos alifáticos; serina <S) por treonina (T) e vice versa; ácido aspártico (D) por ácido glutâmico (E) e vice versa; glutamina (Q) por asparagina (N) e vice versa; lisina (K) por arginina (R) e vice versa; fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W) por qualquer outro desses aminoácido aromáticos; e metionina (M) por cisterna (C) e vice versa. Outras substituições também podem ser consideradas conservadoras, dependendo do ambiente do aminoácido em particular e de seu papel na estrutura tridimensional da proteína. Por exemplo, glicina (G) e alanina (A) podem frequentemente ser trocadas uma pela outra, assim como alanina (A) e valina (V) . Metionina (M) , que é relativamente hidrofóbica, pode frequentemente ser trocada com leucina e isoleucina, e algumas vezes com valina. Lisina (K) e arginina (R) são frequentemente passíveis de troca uma pela outra em locais nos quais a característica principal do resíduo de aminoácido é a sua carga e os diferentes pK destes dois resíduos de aminoácidos não são significativos. Ainda outras mudanças podem ser consideradas "conservadoras" em ambientes particulares (ver, por exemplo, BIOCHEMISTRY nas pp. 13-15, 2a ed. Lubert Stryer ed. (Stanford üniversity); Henikoff et ai., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA (1992) 89:10915-10919; Lei et ai., J. Biol. Chem. (1995) 270(20):11882-11886). "Polipeptideo," "peptídeo," e "proteína" são usados aqui de maneira intercambiável e significam qualquer cadeia de aminoácidos conectada por ligação peptídica, a despeito de comprimento ou modificação pós-traducional. Como descrito abaixo, os polipeptídeos descritos aqui podem ser, por exemplo, proteínas selvagens, fragmentos biologicamente ativos das proteínas selvagens, ou variantes das proteínas selvagens ou dos fragmentos. Variantes, de acordo com o pedido, podem conter substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. As substituições podem ser conservadoras ou não conservadoras.

Após expressão, as proteínas (por exemplo, anticorpos, fragmentos destes de ligação a antígenos, conjugados, conjugados de anticorpos) podem ser isoladas. Os termos "purificada" ou "isolada" aplicados a qualquer uma das proteínas descritas aqui (por exemplo, um conjugado descrito aqui, um anticorpo ou fragmento deste de ligação a antígeno descritos aqui) se refere a um polipeptídeo que foi separado ou purificado dos componentes (por exemplo, proteínas ou outras moléculas biológicas o orgânicas que ocorrem naturalmente) que naturalmente o acompanham, por exemplo, outras proteínas, lipídeos e ácido nucleico em um procarioto que expressa as proteínas. Normalmente, um polipeptídeo é purificado quando ele constitui pelo menos 60 (por exemplo, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, ou 99) %, por peso, do total de proteína em uma amostra.

Uma "marcação" ou uma "fração detectávei" é uma composição detectávei por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos, de imagem de ressonância magnética, ou outros meios físicos. Por exemplo, marcações úteis incluem 32P, corantes fluorescentes, reagentes eletronicamente densos, enzimas (por exemplo, como usado normalmente em ELISA), biotina, digoxigenina, moléculas paramagnéticas, nanopartículas paramagnéticas, gadolínio, radioisótopos, radionuclídeos (por exemplo, carbono-11, nitrogênio-13, oxigênio-15, flúor-18, rubídeo-82), fluordeoxiglicose (por exemplo, marcado com flúor-18), radionuclídeos que emitem raios gama, radionuclídeos que emitem posítrons, ouro, nanopartículas de ouro, agregados de nanopartículas de ouro, fluoróforos, fluoróforos de dois fótons, ou haptenos e proteínas ou outras entidades que podem ser se tornar detectáveis, por exemplo, pela incorporação de um radiomarcação em peptídeo ou anticorpo especificamente reativo com o peptídeo alvo. Os grupos detectáveis também incluem qualquer uma das composições acima derivadas para a ligação a ura agente de localização do alvo (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno). Qualquer método conhecido na técnica para conjugar um anticorpo à marcação pode ser empregado, por exemplo, usando métodos descritos em Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego. O termo "anticorpo" se refere a um polipeptídeo codificado por um gene de imunoglobulina ou fragmentos funcionais deste que se liga e reconhece especificamente um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante o kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon, e mu, bem como como a miríade de genes das regiões variáveis das imunoglobulinas. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, as quais por sua vez definem as classes de imunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Um exemplo de unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptidicas, cada par contendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kDa) . O N-terminal de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsável pelo reconhecimento de antígenos. As expressões "cadeia pesada variável"," "VH, " ou "VH" se referem à região variável da cadeia pesada da imunoglobulina, incluindo um Fv, scFv, dsFv ou Fab; enquanto que as expressões "cadeia leve variável·"," "VL, " ou "VL" se referem à região variável da cadeia leve da imunoglobulina, incluindo um Fv, scFv, dsFv ou Fab.

Exemplos de fragmentos funcionais de anticorpo incluem, mas não estão limitados a moléculas completas de anticorpo, fragmentos de anticorpo, como Fv, Fv de cadeia única (scFv), regiões determinantes de complementaridade (CDRs), VL (região variável de cadeia leve), VH (região variável de cadeia pesada), Fab, F(ab)2' e qualquer combinação destes ou de qualquer outra porção funcional de um peptideo de imunoglobulina capaz de se ligar ao antigeno alvo (ver, por exemplo, Fundamental Immunology (Paul ed., 4a ed. 2001) . Como percebido por alguém com habilidade na técnica, vários fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por uma variedade de métodos, por exemplo, digestão de um anticorpo intacto com uma enzima, como pepsina; ou síntese de novo. Os fragmentos de anticorpo são comumente sintetizados de novo quimicamente ou usando metodologia de DNA recombinante. Assim, o termo anticorpo, como usado aqui, inclui fragmentos de anticorpo tanto produzidos pela modificação de anticorpos inteiros, ou aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia única) ou aqueles identificados suando bibliotecas de phage dísplay (ver, por exemplo, McCafferty et ai., (1990) Nature 348:552). O termo "anticorpo" também inclui moléculas bivalentes ou biespecificas, díacorpos, triacorpos e tetracorpos Moléculas bivalentes e biespecificas são descritas em, por exemplo, Kostelny et al. (1992) J, Immunol. 148:1547, Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31: 1579, Hollinger et al. ( 1993), PNAS. USA 90:6444, Gruber et al. (1994) J Immunol. 152:5368, Zhu et al. (1997) Protein Sei. 6:781, Hu et al. (1996) Câncer Res. 56:3055, Adams et al. (1993) Câncer Res. 53:4026, e McCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8:301. Em algumas modalidades, o termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, anticorpos quimerizados ou quiméricos ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, anticorpos humanizados ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, anticorpos humanos deimunízados ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, anticorpos totalmente humanos ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, anticorpos de cadeia única, fragmentos de Fv de cadeia única (scFv), Fv, fragmentos de Fd, fragmentos de Fab, fragmentos de Fab', fragmentos de F(ah')2f diacorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, minicorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, triacorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, anticorpos de domínio ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, anticorpos de camelo ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno, anticorpos de dromedário ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antígeno, ou anticorpos biespecificos ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antigeno. "Fv de cadeia única (scFv)" ou "anticorpos de cadeia única" se referem a uma proteína na qual as regiões VH e VL de uma anticorpo scFv compreendem uma cadeia única, a qual é dobrada para criar um sitio de ligação a antigeno similar aquele encontrado em anticorpos de duas cadeias. Métodos para fazer anticorpos scFv foram descritos em, por exemplo, Ward et ai., Exp Hematol. (5):660-4 (1993); e Vaughan et al., Nat Biotechnol. 14(3):309-14 (1996). Anticorpos Fv de cadeia única (scFv) opcionalmente incluem um peptideo linker de não mais que 50 aminoácidos, geralmente não mais que 40 aminoácidos, preferivelmente não mais que 30 aminoácidos, e mais preferivelmente não mais que 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o peptideo linker é um concatâmero da sequência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, por exemplo, 2, 3, 4, 5, ou 6 dessas sequências. Contudo, deve ser percebido que algumas substituições de aminoácidos no linker podem ser realizadas. Por exemplo, uma valina pode ser substituída por uma glicina. Peptídeos linker adicionais e seus usos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Huston et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 8:5879 (1988); Bird et al., Science 242:4236 (1988); Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362 (1990); Patente ÜS N° 4.946.778, Patente US N° 5.132.405 e Stemmer et al., Bíotechniques 14:256-265 (1993).

Como usado aqui, "anticorpo quimérico" se refere a uma molécula de imunoglobulina na qual (a) a região constante, ou uma porção desta, é alterada, substituída ou trocada de maneira que o sítio de ligação a antígeno (região variável) esteja ligada a uma região constante de uma classe, função efetora e/ou espécie diferente ou alterada, ou uma molécula completamente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, droga etc.; ou (b) a região variável, ou uma porção desta, é alterada, substituída ou trocada por uma região variável, ou porção desta, que tem uma especificidade por antígeno diferente ou alterada; ou com sequências correspondentes de outra espécie ou de outra classe ou subclasse de anticorpo.

Como usado aqui, "anticorpo humanizado" se refere a uma molécula de imunoglobulina na qual as CDRS de um anticorpo doador são enxertadas em sequências de arcabouço humanas. Anticorpos humanizados também podem compreender residuos originários do doador nas sequências de arcabouço. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina humana. Anticorpos humanizados também podem compreender residuos que não são encontrados no anticorpo recipiente nem na CDR ou nas sequências de arcabouço importadas. A humanização pode ser realizada usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525; 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al. , Science 239:1534-1536, 1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992; Patente US N° 4.816.567), incluindo técnicas como "super-humanízar" anticorpos (Tan et al., J. Immunol. 169: 1119, 2002) e ”resurfacing” {e.g., Staelens et al., Mol. Immunol. 43: 1243, 2006; and Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 91 : 969, 1994) .

Em algumas modalidades, anticorpos deimunizados fragmentos dos mesmos que se ligam a antígeno são fornecidos. Anticorpos deimunizados ou fragmentos dos mesmos que se ligam a antígeno são anticorpos que foram modificados de maneira a tornar o anticorpo ou fragmentos do mesmo que se ligam a antígeno não imunogênicos, ou menos imunogênicos, a uma determinada espécie (por exemplo, para um humano). A deimunização ode ser obtida pela modificação do anticorpo ou fragmentos do mesmo que se ligam a antigeno por uma variedade de técnicas conhecidas daqueles que têm habilidade na técnica (ver, por exemplo, Publicações PCT N° WO 04/108158 e WO 00/34317). O pedido também fornece anticorpos de camelo ou de dromedário (por exemplo, anticorpos derivados de Camelus bactrianus, Camelus dromedarius, ou lama paccos). Esses anticorpos, diferentemente dos anticorpos de duas cadeias (fragmento) ou de quatro cadeias (anticorpo completo) da maioria dos mamíferos, geralmente não possuem cadeias leves. Ver Patente US N° 5.759.808; Stijlemans et ai. (2004) J Biol Chem 279:1256-1261; Dumoulin et ai. (2003) Nature 424:783-788; e Pleschberger et ai. (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448 .

Como usado aqui, "região determinante de complementaridade (CDR)" se refere a uma das tries regiões hipervariáveis em cada cadeia que interrompem as quatro regiões de "arcabouço" criadas pelas regiões variáveis das cadeias leves e pesadas. As CDRs são primariamente responsáveis por se ligarem a um epítopo de um antigeno. As CDRs de cada cadeia são normalmente chamadas de CDR1, CDR2, e CDR3, numeradas sequencialmente começando do N-terminal, e também são comumente identificadas pela cadeia na qual a CDR específica está localizada. Assim, por exemplo, uma VH CDR3 está localizada no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo no qual ela é encontrada, enquanto que uma VL CDR1 é uma CDR1 do domínio variável da cadeia leve do anticorpo no qual ele é encontrada.

As sequências das regiões de arcabouço de cadeias leves e pesadas diferentes são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região de arcabouço de um anticorpo, que é as regiões de arcabouço combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes,- serve para posicionar e alinhar as CDRs no espaço tridimensional. Assim, a posição das CDRs na região V é relativamente conservada entre os anticorpos.

As sequências de aminoácidos e posições das CDRs e regiões de arcabouço podem ser determinadas usando várias definições bem conhecidas na técnica, por exemplo, Kabat, Chothia, International ImMunoGeneTics database (IMGT), e AbM (por exemplo, Johnson et al., supra; Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. et al., 1989, Nature 342, 877-883; Chothia C. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227, 799-817;

Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol 1997, 273(4), Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); Lefranc, M.-P.

Nucleic Acids Res. Jan 1;29 (1) :207-9 (2001); MacCallum et al, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996); Martin et al, Proc.

Natl Acad. Sei. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); e Rees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).

Um "siRNA" ou "RNAi" se refere a um ácido nucleico que forma um RNA de dupla fita, cujo RNA de dupla fita tem a habilidade de reduzir ou inibir a expressão de um gene ou gene alvo quando o siRNA é expresso na mesma célula que o gene ou gene alvo (ver, por exemplo, Bass, Nature, 411, 428- 429 (2001); Elbashir et al., Nature, 411, 494-498 (2001); WO 00/44895; WO 01/36646; WO 99/32619; WO 00/01846; WO 01/29058; WO 99/07409; e WO 00/44914) . Assim, "siRNA" se refere a RNA de dupla fita formado pelas fitas complementares. As porções complementares do siRNA que se hibridizam para formar a molécula de dupla fita normalmente possuem identidade substancial ou completa. Em uma modalidade, um siRNA se refere a um ácido nucleico que possui identidade substancial ou completa com um gene alvo e forma um siRNA de dupla fita. A sequência do siRNA pode corresponder ao comprimento completo do gene alvo, ou a uma subsequência deste. Normalmente, o siRNA tem pelo menos cerca de 15-50 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, cada sequência complementar do siRNA de dupla fita tem 15-50 nucleotídeos de comprimento, e o siRNA de dupla fita tem cerca de 15-50 pares de base de comprimento, preferivelmente cerca preferivelmente cerca de 20-30 nucleotídeos, preferivelmente cerca de 20-25 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos de comprimento. "Silenciamento" ou "regulação negativa" se refere a uma diminuição detectável da transcrição e/ou tradução de uma sequência alvo, isto é, a sequência que é alvo do RNAi, ou uma diminuição na quantidade ou atividade da sequência ou proteína alvo em comparação com o nível normal que é detectado na ausência do RNA de interferência ou outra sequência de ácido nucleico. Uma diminuição detectável pode ser tão pequena quanto 5% ou 10%, ou tão grande quanto 80%, 90% ou 100%. Mais comumente, uma diminuição detectável varia entre 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, ou 70%. siRNA de dupla fita que corresponde ao gene de AXL ou de GAS6 pode ser usado para silenciar a transcrição e/ou tradução de AXL ou GAS6 induzindo a degradação dos transcritos de mRNA de AXL ou GAS6, e assim tratar ou prevenir câncer (por exemplo, câncer resistente a inibidor de EGFR) impedindo a expressão de AXL ou GAS6. O siRNA tem comumente cerca de 5 até cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, mais comumente cerca de 10 até cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, muito mais comumente cerca de 15 até cerca 30 nucleotídeos de comprimento. Uma molécula de DNA que transcreve dsRNA ou siRNA (por exemplo, fitas duplas de hairpin} também fornece RNAi. Moléculas de DNA para transcrever dsRNA são descritas em Patente ÜS N° 6.573.099, e em U.S. Patent Application Publication Nos. 2002/0160393 e 2003/0027783, e Tuschl e Borkhardt, Molecular Interventions, 2:158 (2002). siRNA pode ser entregue ao sujeito usando qualquer meio conhecido na técnica, incluindo injeção, inalação ou ingestão oral de siRNA. Outros sistema de entrega apropriado para siRNA é um sistema de dispersão coloidal, como, por exemplo, complexos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, contas, e sistemas baseados em lipideos incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas, e lipossomos. O sistema coloidal preferido desta invenção é um lipossomo. Lipossomos são vesículas de membrana artificiais que são úteis como veículos d entrega in vitro e in vivo. Ácidos nucleicos, incluindo RNA e DNA dentro de lipossomos podem ser entregues às células em uma forma biologicamente ativa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci.r 6:11, 1981). Lipossomos podem ser direcionados a tipos celulares ou tecidos específicos usando qualquer meio conhecido na técnica. 01igonucleotídeos antissenso que se hibridizam especificamente com sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos de AXL ou GAS6 também podem ser usados para silenciar a transcrição e/ou tradução de AXL ou GAS6, e assim tratar ou prevenir câncer (por exemplo, câncer resistente a inibidor de EGFR). Ácidos nucleicos antissenso são moléculas de DNA ou RNA que são complementares a pelo menos uma porção de uma molécula de mRNA específica (ver, por exemplo, Weintraub, Scientific American, 262:40 (1990)). Comumente, oligonucleotídeos antissenso sintéticos têm geralmente entre 15 e 25 bases de comprimento. Ácidos nucleicos antissenso podem compreender nucleotídeos que ocorrem naturalmente ou nucleotideos modificados, como, por exemplo, fosforotioato, metilfosfonato, e nucleotideos com o esqueleto modificado com açúcares-fosfato anomérico.

Na célula, os ácidos nucleicos antissenso se hibridizam com o mRNA correspondente, formando uma molécula de dupla fita. Os ácidos nucleicos antissenso interferem com a tradução do mRNA, já que a célula não traduzirá um mRNA que é dupla fita. Oligômeros antissenso de cerca de 15 nucleotideos são preferidos, já que eles são facilmente sintetizados e têm menos probabilidade de causar problemas do que moléculas maiores quando introduzidos nas células que produzem o nucleotideo mutante alvo. O uso de métodos antissenso para inibir tradução in vitro de genes é bem conhecido na arte (Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, (1988)). De maneira menos comum, moléculas antissenso que se ligam diretamente ao DNA podem ser usadas. A entrega de polinucleotideos antissenso específicos para o gene de AXL ou GAS6 pode ser obtida usando qualquer meio conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, injeção, inalação, ou ingestão dos polinucleotideos. Além disso, polinucleotideos antissenso podem ser entregues usando um vetor de expressão recombinante (por exemplo, uma vetor viral com base em um adenovirus, um vírus da herpes, um vírus vaccínia, ou um retrovírus) ou um sistema de dispersão coloidal (por exemplo, lipossomos) como descrito aqui.

Os termos "expressão diferencial" ou "expressado diferencialmente" usadas em referência a expressão de um marcador significam um nível elevado de expressão do marcador ou um nivel reduzido do gene marcador em relação controle padrão que é indicativo de um câncer ou célula resistente a inibidor de EGFR ou indicativo de um paciente que tem um câncer resistente a EGFR TKI (um "paciente com câncer resistente a EGFR TKI"). "Sequência alvo" se refere a uma região dentro do gene alvo (por exemplo, gene marcador) a qual uma sonda irá identificar, como conhecido na técnica. É entendido que alguém com habilidade na técnica pode, com apenas experimentação rotineira, projetar e usar sondas para identificar marcadores especificos como descrito aqui (por exemplo, AXL (por exemplo, proteína (SEQ ID NO:28) ou fragmentos da mesma e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS :26-27) que codifica a proteína, ou fragmento do mesmo) ou GAS6 (por exemplo, proteína (SEQ ID NO:31) ou fragmentos da mesma e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS:29-30) que codifica a proteína, ou fragmento do mesmo) ) . É entendido ainda que mais de uma sonda pode ser projetada para identificar um ácido nucleico ou proteína específicos, por exemplo, um marcador descrito aqui (por exemplo, AXL (por exemplo, proteína (SEQ ID NO:28) ou fragmentos da mesma e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS:26-27) que codifica a proteina, ou fragmento do mesmo) ou GAS6 (por exemplo, proteína (SEQ ID NO: 31) ou fragmentos da mesma e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS:29-30) que codifica a proteína, ou fragmento do mesmo)). Em modalidades, expressão diferencial é um nível elevado de expressão de um marcador (por exemplo, AXL (por exemplo, proteína (SEQ ID NO:28) ou fragmentos da mesma e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS:26-27) que codifica a proteína, ou fragmento do mesmo) ou GAS6 (por exemplo, proteína (SEQ ID NO:31) ou fragmentos da mesma e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS :2 9-30) que codifica a proteína, ou fragmento do mesmo)). O termo "AXL" se refere à tirosina quinase do receptor AXL humana (por exemplo, GenBank AAH32229.1, NM__Q 016 9 9.4, NP_001690.2, P30530 e homólogos deste). Em modalidades, "AXL" se refere à proteína (por exemplo, SEQ ID NO: 28 e homólogos deste) e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS:26-27) que codifica a proteína. O termo "GAS6" se refere à proteína específica de interrupção de crescimento humana (por exemplo, GenBank AAA58494.1, NM_000820.2, NP_000811.1, Q14393 e homólogos deste). Em modalidades, "GAS6" se refere à proteína (por exemplo, SEQ ID NO: 31 e homólogos deste) e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS:29-30) que codifica a proteína. O termo "EGFR" se refere ao receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, NM_005228.3, NP_005219.2, P00533). Em modalidades, "EGFR" se refere à proteína (por exemplo, SEQ ID NO:34 e homólogos deste) e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS:32-33) que codifica a proteína. O termo "marcador de EMT" se refere a um marcador (por exemplo, ácido nucleico ou proteína) que é indicativo de uma transição epitelial-para-mesenquimal ("EMT"), excluindo AXL e GAS6. Uma coleção de marcadores EMT pode ser chamada aqui de uma "assinatura EMT". Em modalidades, um marcador de EMT é um marcador identificado por símbolo do gene, nome do gene, ou é um gene alvo de uma sonda Affymetrix, tudo como identificado na Fig. 23. Ver Byers et al. Clin. Câncer Res. 2013 Janl:19(1):279-90 e WO2012/135841. O termo "câncer mesenquimal" se refere a um câncer associado com (por exemplo, derivado de ou composto de) células identificadas como mesenquimais. Uma célula mesenquimal pode ser identificada determinando-se a expressão diferencial de marcadores de EMT incluindo adicionalmente opcionalmente AXL e/ou GAS6 (por exemplo, um ou mais dos marcadores de EMT na Fig. 23, um ou mais dos 76 marcadores na tabela da segunda página da Fig. 23, um ou mais dos 35 marcadores nas tabelas na primeira página da Fig. 23, um ou mais dos 76 marcadores identificados nas páginas 3 a 10 da Fig. 23, ou os cinco marcadores 219789_at (NPR3), 219790__s_at (C5orf23), 212531_at (LCN2), 205760_s_at (OGG1), e 205301_s_at, todos identificados por sondas Affymetrix ou o nome do gene, quando fornecido aqui) . Ver Byers et al. Clin. Câncer Res. 2013 Janl:19(1):279-90 e WO2012/135841. Métodos de tratamento, detecção e identificação Em um aspecto é fornecido um método para tratar câncer resistente a inibidor de receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). O método inclui detectar um nível aumentado de AXL ou GAS6 em uma amostra de paciente em relação a uma amostra controle e administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de AXL ou de um inibidor de GAS6 ao paciente.

Em outro aspecto é fornecido um método para detectar niveis de AXL ou GAS6 em uma paciente com câncer. O método inclui fazer uma amostra do paciente com câncer entrar em contato com um agente de ligação a AXL detectável ou um agente de ligação a GAS6 detectável, permitindo ao agente de ligação a AXL detectável ou um agente de ligação a GAS6 detectável se ligar a AXL GAS6, respectivamente, permitindo que o agente de ligação a AXL detectável e AXL formem um complexo AXL ou que o um agente de ligação a GAS6 detectável e GAS6 formem um complexo GAS6.

Em outro aspecto é fornecido um método de identificar um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR incluindo as etapas de se obter uma amostra de uma pluralidade de pacientes com câncer, detectar um nivel de AXL ou um nivel de GAS6 em cada uma das amostras, comparar o nível de AXL ou o nível de GAS6 com um controle, identificar pelo menos uma amostra da pluralidade de pacientes com câncer que tenha um nível de AXL ou um nível de GAS6 maior que o do controle, e assim identificar o paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR.

Em outro aspecto é fornecido um método para tratar câncer resistente a inibidor de EGFR. O método inclui detectar um nível aumentado de atividade de AXL em uma amostra de paciente em relação a uma amostra controle e administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de AXL ao paciente.

Em outro aspecto é fornecido um método para identificar um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR incluindo as etapas de se obter amostras de uma pluralidade de pacientes com câncer, detectar um nivel de atividade de AXL em cada uma das amostras, comparar o nivel de atividade de AXL com o nivel de atividade de AXL em uma amostra controle, identificar pelo menos uma amostra que tenha um nivel de atividade de AXL maior que o do controle, e assim identificar o paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR.

Em outro aspecto é fornecido um método para detectar um nivel de AXL ou GAS6 em um sujeito (por exemplo, um paciente com câncer), o método incluindo: (i) obter uma amostra do sujeito (por exemplo, um paciente com câncer); e (ii) detectar um nivel de expressão diferencial de AXL ou GAS6 na amostra em relação a um controle. Em modalidades, o método inclui ainda correlacionar a expressão diferencial de AXL ou GAS6 com um câncer, como descrito aqui. Assim, o método pode ser usado para diagnosticar um sujeito com câncer. Em outro aspecto é fornecido um método para detectar um nivel aumentado de AXL ou GAS6 em um sujeito (por exemplo, um paciente com câncer), o método incluindo: (i) obter uma amostra de um paciente com câncer; e (ii) detectar um nivel aumentado de AXL ou GAS6 na amostra em relação a um controle. Em modalidades, o método inclui ainda correlacionar o nivel aumentado de AXL ou GAS6 com um câncer, como descrito aqui. Assim, o método pode ser usado para diagnosticar um sujeito com câncer.

Em outro aspecto é fornecido um método para identificar um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR incluindo: (i) obter uma amostra de um paciente com câncer; e (ii) detectar um nivel aumentado de AXL ou GAS6 na amostra em relação a um controle Em modalidades, o paciente com câncer tem um câncer que inclui células cancerosas com uma mutação de ativação de EGFR. Em modalidades, a mutação de ativação de EGFR é uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21. Em modalidades, o método não inclui detectar um nivel de um marcador de EMT, exceto AXL. Em modalidades, o método não inclui detectar um nivel de um marcador de EMT que não seja AXL. Em modalidades, a detecção inclui (a) contatar a amostra com um agente de ligação a AXL detectável ou agente de ligação a GAS6 detectável; (b) permitir que o dito agente de ligação a AXL detectável e AXL formem um complexo de AXL ou o dito agente de ligação a GAS6 e GAS6 formem um complexo de GAS6; e (c) detectar o dito complexo de AXL ou complexo de GAS6. Em modalidades, a detecção inclui detectar um nível de um ácido nucleico de GAS6 ou AXL ou fragmento do mesmo. Em modalidades, o uso de amplificação de ácido nucleico, um arranjo dos genes, um microarranjo, um macroarranjo, um arranjo de DNA, ou um chip de DNA. Em modalidades, a detecção inclui detectar um nivel de uma proteína de GAS6 ou AXL ou fragmento da mesma. Em modalidades, a detecção inclui o uso de um anticorpo, citometria de fluxo, ELISA, espectroscopia de massa, imunofluorescência, ou microscopia de fluorescência. Em modalidades, o anticorpo é conjugado com uma fração detectável. Em modalidades, o método inclui detectar um nível aumentado de AXL. Em modalidades, o nível de AXL é um nível de mRNA de AXL, proteína de AXL, ou atividade quínase de AXL.

Em modalidades, o paciente com câncer é um paciente com câncer resistente a EGFR TKI. Em modalidades, o paciente com câncer é um paciente com câncer resistente a EGFR TKI, em que o dito paciente com câncer resistente a EGFR TKI tem um câncer que não é um câncer mesenquimal. Em modalidades, o paciente com câncer resistente a EGFR TKI é resistente a gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-2 7 2, CP-724714, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, ARRY-380, AG-1478 , dacomitinib/PF299804 , OSI-420/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE788, pelitinib/EKB-569, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, AP26113, ou CO-1686. Em modalidades, o paciente com câncer resistente a EGFR TKI é resistente a erlotinib ou gefitinib. Em modalidades, o paciente com câncer resistente a EGFR TKI tem um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de figado, glioblastoma, e astrocitoma-glioblastoma. Em modalidades, o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Em modalidades, o câncer é câncer metastático. Em modalidades, o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas compreendendo EGFR que tem uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21; e em que ainda o câncer é resistente a erlotinib ou resistente a gefitinib em relação a um controle. Em modalidades, a detecção inclui comparar o nível aumentado de AXL ou GAS6 com um controle; identificar pelo menos uma amostra da pluralidade de pacientes com câncer que tem um nível de AXL ou um nível de GAS6 maior que o controle; e assim identificar um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR. Em modalidades, um nível maior de AXL ou GAS6 na amostra em relação ao controle é indicativo de um câncer resistente a inibidor de EGFR.

Foi descoberto que certos genes são marcadores de cânceres resistentes a inibidor de EGFR (por exemplo, AXL (por exemplo, proteína (SEQ ID NO; 28) e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS :26-27) que codifica a proteína) ou GAS6 (por exemplo, proteína (SEQ ID NO: 31) e/ou um ácido nucleico (SEQ ID NOS:29-30) que codifica a proteína)). Assim, ao se detectar o nível de expressão de um marcador em um paciente com câncer e se comparar o nível de expressão do marcador com um controle, pacientes com câncer resistente a EGFR TKI podem ser identificados. Em algumas modalidades, o nível de uma pluralidade (por exemplo, um painel) de marcadores é detectado e comparado ao nível de expressão dos marcadores em um controle para identificar pacientes com câncer resistente a EGFR TKI. Em algumas modalidades, o controle pode ser aproximadamente a quantidade média da expressão do marcador em humanos ou humanos sem câncer, ou humanos que não pacientes com câncer resistente a EGFR TKI . Em outras modalidades, o controle é um nível de expressão de um gene controle detectado em um paciente com câncer resistente a EGFR TKI.

Em algumas modalidades, os métodos incluem detectar um nível aumentado de AXL. Um nível aumentado de GAS6 também pode ser detectado. O nível aumentado de GAS6 ou AXL pode ser um nível aumentado de proteína (por exemplo, proteína de AXL, proteína de GAS6 ou fragmentos de proteína das mesmas).

Em outras modalidades, níveis aumentados de AXL (por exemplo, atividade de AXL) podem ser detectados. Em modalidades, um nível aumentado de AXL é detectado e níveis aumentados de GAS6 não são detectados.

Em algumas modalidades, os métodos incluem ainda administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva combinada de um inibidor de EGFR e um inibidor de AXL. Em algumas modalidades, a quantidade de inibidor de EGFR administrada é menor do que a quantidade terapeuticamente efetiva de inibidor de EGFR que seria administrada na ausência do inibidor de AXL. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é selecionado a partir do grupo que consiste em gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canert inib, neratinib/HKI-272, CP-724714, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, ARRY-380, AG-1478, dacomitinib/PF299804, OSI-420/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE788, pelitiníb/EKB-5 6 9, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-4 90, XL647, PD153035, BMS-S99626, zalutumumab, nímotuzumab, matuzumab, AP26113, e CO-1686. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é erlotinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é gefitinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é lapatinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é cetuximab. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é panitumumab. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é vandetanib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é afatinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é desmetil erlotinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é CO-1686. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é AP26113.

Em algumas modalidades, o inibidor de AXL é selecionado a partir do grupo que consiste em BGB324, amuvatinib, foretinib, BMS-777607, SGI-7079, bosutinib, crizotinib, YW327.6S2, AD57, AD80, AD81, anticorpo de ligação a AXL, e proteína de fusão Axl-Fc. Em algumas modalidades, o inibidor de AXL não é um anticorpo Em algumas modalidades, o inibidor de AXL não é uma proteína de fusão Axl-Fc.

Em algumas modalidades, os métodos incluem detectar um nível de ácido nucleico de AXL ou GAS6 ou fragmentos dos mesmos, incluindo homólogos dos mesmos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um RNA de AXL, ou fragmentos do mesmo (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% do comprimento completo da sequência de ácido nucleico de AXL, por exemplo, AXL humano representado por GenBank ΔΑΗ3222 9.1 ou NM_Q01699.4 ou SEQ ID NO:26 ou SEQ ID NO:27). Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ENA de GAS6, ou fragmentos do mesmo, incluindo homólogos do mesmo (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% do comprimento completo da sequência de ácido nucleico de GAS6, por exemplo, GAS6 humano representado por GenBank AAA58494.1 ou NM_00 0 820.2 ou SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:30) Em algumas modalidades, a detecção inclui o uso de amplificação de ácido nucleico, reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR em tempo real/PCR quantitativo em tempo real, PCR de transcrição reversa em tempo real, corante intercalante de ácido nucleico (por exemplo, verde SYBR) com PCR em tempo real ou PCR de transcrição reversa em tempo real, sondas de oligonucleotídeos (por exemplo, que se hibridizam especificamente com AXL ou GAS6) com marcação dupla fluoróforo-quencher (por exemplo, FRET) e PCR em tempo real ou PCR de transcrição reversa em tempo real, um arranjo de genes, um microarranjo, um macroarranjo, um arranjo de DNA, um arranjo tiling, northern blot, análise serial de expressão gênica (SAGE), sequenciamento de próxima geração (NGS) (por exemplo, RNA-Seq), sequenciamento Whole Transcriptome Shotgun (WTSS), sequenciamento profundo, ou um chip de DNA. Em algumas modalidades, a detecção inclui detectar um nível de uma proteína de AXL ou GAS6 ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, a proteina é uma proteina de AXL, ou um fragmento da mesma, incluindo homólogos da mesma (por exemplo, cerca dei, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% do comprimento total da sequência da proteína de AXL, por exemplo AXL humana representada por NP_001690.2 ou SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27) . Em algumas modalidades, a proteína é uma proteína de GAS6, ou um fragmento da mesma, incluindo homólogos da mesma (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% do comprimento total da sequência da proteína de GAS6, por exemplo GAS6 humana representada por NP_000811.1 ou SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:30).

Em algumas modalidades, a detecção inclui o uso de um anticorpo, western blot, chip de proteína, imunohistoquímíca, citometria de fluxo, ELISA, espectroscopia de massa (por exemplo, LC-MS, MALDl-MS, MALDI-MS/MS, ESI-MS, ESI-MS/MS, espectroscopia de massa em tandem), imunofluorescência, cromatografia (por exemplo, HPLC, FLPC, fase reversa, LC-MS), ensaios espectrofotométricos, espectroscopia UV, espectroscopia visível, eletroforese de gel, eletroforese de gel bidimensional, marcação do N-terminal, codificação isotópica combinada com etiqueta de afinidade (ICAT), marcação isobárica (por exemplo, marcação de massas em tandem, marcação isobárica para quantificação absoluta e relativa (iTRAQ)), marcação com isótopo estável, marcação com metais (MeCATs), monitoramento de reações selecionadas (SRM), ou microscopia de fluorescência.

Em algumas modalidades, o anticorpo usado para detectar AXL, GAS6, ou um fragmento de qualquer uma das mesmas, é selecionado de um grupo que consiste em um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo que se liga a antigeno, anticorpo quimerizado ou quimérico ou fragmento dos mesmos que se liga a antigeno, anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo que se liga a antigeno, anticorpo humano deimunizado ou fragmento do mesmo que se liga a antigeno, anticorpo totalmente humano ou fragmento do mesmo que se liga a antigeno, anticorpos de cadeia única, fragmento de Fv de cadeia única (scFv), Fv, fragmento de Fd, fragmento de Fab, fragmento de Fab'', fragmento de F(ab')2/ diacorpo ou fragmento do mesmo que se liga a antigeno, minicorpo ou fragmento do mesmo que se liga a antigeno, triacorpo ou fragmento do mesmo que se liga a antigeno, anticorpo de dominio ou fragmento do mesmos que se liga a antigeno, anticorpo de camelo ou fragmento do mesmo que se liga a antigeno, anticorpo de dromedário ou fragmento do mesmos que se liga a antigeno, ou um anticorpo biespecifico ou fragmento do mesmo que se liga a antigeno. Em algumas modalidades, o anticorpo é conjugado a uma fração detectável.

Em algumas modalidades, a fração detectável inclui um fluoróforo. Em algumas modalidades, a fração detectável inclui uma enzima. Em algumas modalidades, a fração detectável inclui biotina ou estreptavidina. Em algumas modalidades, o nivel aumentado de AXL ou GAS6 em relação ao controle é indicativo de um câncer resistente a inibidor de EGFR. 0 nivel aumentado de AXL ou GAS6 em relação ao controle pode ser, por exemplo, cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1.7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2.9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5.3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6.3, 6,4, 6.5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7.7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8.9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000 vezes maior. O nivel aumentado de AXL ou GAS6 em relação ao controle pode ser, por exemplo, de cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2.1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3.3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4.5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5.7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6.3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6.9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7.7, 7,8, 7,9, 8,0, 8.1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9.3, 9,4, 9, 5, 9, 6, 9,7, 9, 8, 9, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000 vezes.

Em certas modalidades, o método descrito aqui para detectar o nível de expressão de um marcador é um método in vitro. Em certas modalidades, a detecção é conduzida in vitro (por exemplo, em uma amostra biológica derivada de um paciente com câncer).

Os níveis de expressão de um marcador podem ser medidos usando qualquer método apropriado. Em algumas modalidades, a quantidade de RNA expresso pelo marcador é medida. A quantidade de RNA expresso pode ser avaliado, por exemplo, usando sondas de ácido nucleico com sequências codificadoras de marcador ou usando técnicas de PCR quantitativo. Por exemplo, um arranjo de ácido que forma um conjunto de sondas pode ser usado para detectar RNA expresso pelo gene marcador. 0 RNA expresso pelo gene marcador pode ser transcrito para cDNA (e em alguns casos para cRNA) e então sondado com um arranjo de chips gênicos usando métodos conhecidos na técnica. Assim, em algumas modalidades, o marcador também pode ser um gene incluindo uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade em uma região continua de pelo menos 10 a 20 nucleotideos (isto é, sequência) dentro de um gene marcador (por exemplo, AXL (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS :26-27) codificando a proteína ou fragmento do mesmo) ou GAS6 por exemplo, AXL (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:29-30) codificando a proteina ou fragmento do mesmo) ) . Por exemplo, a região continua pode ser de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 nucleotideos de comprimento. 0 termo "projetada para interrogar" no contexto dos genes alvo, genes marcadores e sondas se refere a uma sonda que tem complementaridade de sequencia primária suficiente com um alvo para se ligar ao alvo de maneira detectável, como é bem conhecido na técnica.

Em algumas modalidades, o marcador inclui uma sequência de ácido nucleico de AXL (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:26-27)) ou GAS6 (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:29-30)) ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% do comprimento completo da sequência de ácido nucleico ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% do comprimento completo da sequência de ácido nucleico).

A comparação dos niveis de expressão do marcador com um controle padrão pode ser realizada determinando-se se o marcador é expresso no paciente com câncer resistente a EGFR TKI em um nível elevado ou um nível reduzido (isto é, detectar a expressão diferenciada). O nível elevado de AXL e/ou GAS6 é indicativo de câncer resistente a EGFR TKI (por exemplo, que pode ser tratado com um inibidor de AXL ou inibidor de GAS6). 0 controle pode ser qualquer padrão apropriado conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o controle padrão é aproximadamente a quantidade média de expressão do gene marcador em humanos, humanos sem câncer, ou humanos com câncer sensível a EGFR TKI.

Em modalidades, o controle padrão é um nível detectável de expressão de um gene de controle padrão no paciente CIS. Como usado aqui, um gene de controle padrão é um gene humano que é expresso em níveis aproximadamente constantes fornecendo assim um leitura de linha de base da expressão gênica para um indivíduo. 0 gene de controle padrão também pode ser chamado aqui e na técnica de um gene referência. Em algumas modalidades, o gene de controle padrão é GAPDH ou a subunidade ribossômica 18s. 0 nível elevado de expressão do marcador pode ser determinado calculando-se a razão entre o nível de expressão do marcador e o nível de expressão de um controle padrão.

Em outro aspecto, é fornecido um método in vitro para determinar se um paciente é um paciente com câncer resistente a EGFR TKI. O método inclui isolar mRNA do paciente, fornecendo assim uma amostra de ácido nucleico in vitro. Opcionalmente, o método inclui ainda submeter a amostra de ácido nucleico in vitro a uma reação em cadeia da polimerase para amplificar o ácido nucleico na amostra de ácido nucleico in vitro. A amostra de ácido nucleico in vitro é posta em contato com um microarranjo, o microarranjo contendo uma pluralidade de sondas projetadas para interrogar os genes marcadores específicos. O nível de formação de fita dupla de ácido nucleico é determinado entre a amostra de ácido nucleico in vitro e o microarranjo, fornecendo assim o nível de expressão do ácido nucleico presente na amostra de ácido nucleico in vitro. 0 nível de expressão do ácido nucleico é então comparado ao nível de expressão de um controle ou controle padrão. Uma expressão diferencial do gene marcador em relação ao dito controle ou controle padrão indica que o paciente é uma paciente com câncer resistente a EGFR TKI (por exemplo, que pode ser tratado com um inibidor de AXL ou inibidor de GAS6).

Em outro aspecto, um kit é fornecido para uso na identificação de um paciente que é um paciente com câncer resistente a EGFR TKI (por exemplo, que pode ser tratado com um inibidor de AXL ou inibidor de GAS6) . O kit inclui uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% de identidade com uma região contínua de pelo menos 10 nucleotídeos (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 nucleotídeos de comprimento) de AXL (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS: 26-27) ) ou GAS6 (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:29-30); ou uma complementaridade de ácido nucleico com os ácidos nucleicos mencionados acima. Em algumas modalidades, o kit também inclui um dispositivo eletrônico ou programa de computador capaz de comparar um nível de expressão do gene marcador do paciente com um controle indicando assim se o paciente é um paciente com câncer resistente a EGFR TKI (por exemplo, que pode ser tratado com um inibidor de AXL ou inibidor de GAS6) . Em algumas modalidades, o kit contém uma pluralidade (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) de sequências de ácido nucleico tendo pelo menos 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% de identidade com uma região continua de pelo menos 10 nucleotídeos (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 , 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 nucleotideos de comprimento) de AXL (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:26-27)) ou GAS6 (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS :2 9-30) ou complementos dos mesmos.

Em algumas modalidades, o ácido nucleico fornecido no kit acima pode ser um ácido nucleico sonda para uso em uma técnica de PCR, como PCR quantitativo, para avaliar a expressão de um dado gene marcador. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico tem 100% de identidade com uma região continua de ácido nucleico (isto é, sequência) dentro de AXL (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:26-27)) ou GAS6 (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:29-30) ou é complementar aos mesmos. 0 ácido nucleico fornecido no kit também pode se hibridizar sob condições estringentes (ou condições moderadamente estringentes) com uma sequência de ácido nucleico dentro de AXL (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:26-27)) ou GAS6 (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:29-30). O ácido nucleico fornecido no kit também pode ser perfeitamente complementar à sequência de ácido nucleico dentro de AXL (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NOS:26-27)) ou GAS6 (por exemplo, ácido nucleico (SEQ ID NCS:29-30).

Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir de um grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de fígado, glioblastoma, astrocitoma-glioblastoma. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Em algumas modalidades, o câncer resistente a inibidor de EGFR é selecionado a partir de um grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de fígado, glioblastoma, astrocitoma-glioblastoma. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um adenocarcinoma. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um carcinoma de células escamosas. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um carcinoma de células grandes. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um carcinoma pleomórfico. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um tumor carcinoide. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um câncer de glândula salivar. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um carcinoma.

Em algumas modalidades, o câncer resistente a inibidor de EGFR é resistente a um inibidor de EGFR selecionado a partir de um grupo que consiste em gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-272, CP-724714, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, ARRY-380, AG-1478, dacomitinib/PF299804, OSI-420/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE788, pelitinib/EKB-5 69, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, AP26113, e CO-168 6. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é erlotinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é gefitinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é lapatinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é cetuximab. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é panitumumab. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é vandetanib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é afatinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é desmetil erlotinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é CO-1686. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é ΆΡ26113. Em algumas modalidades, o câncer resistente a inibidor de EGFR é resistente a erlotinib e gefitinib.

Em algumas modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui determinar a presença de uma mutação de EGFR na amostra (por exemplo, amostra do paciente). Em algumas modalidades dos métodos, o paciente e/ou amostra do paciente não inclui uma mutação de EGFR. Em algumas modalidades dos métodos, o paciente e/ou amostra do paciente inclui uma mutação de EGFR.

Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um EGFR não selvagem. Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um EGFR mutante. Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um EGFR contendo uma mutação de ativação ("mutação de ativação de EGFR") (por exemplo, uma mutação de ativação no domínio da quinase (por exemplo, deleção de éxon-19, mutação pontual de éxon-21, mutação de éxon-18, ou mutação em éxon-20)). Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar) , o método inclui um EGFR contendo uma mutação de ativação de EGFR (por exemplo, deleção de éxon-19, mutação pontual de éxon-21, mutação de éxon-18, ou mutação em éxon-20) e inclui um câncer, célula tumoral, ou paciente, que é resistente a inibidor de EGFR (por exemplo, em relação a um controle).

Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um mutante de deleção no éxon-19 de EGFR (numeração do EGFR humano). Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um EGFR mutante com deleção E746-A750 de éxon-19 (numeração do EGFR humano) . Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um EGFR mutante com deleção de éxon-19 (por exemplo, deleção (dei) de L747-T751, E746-A750, E746-S752, L747-K754, I744-A750, L747-A750; deleção de aminoãcidos 746- 753, 747-753, 748-753, 749-753, 750-753, 751-753, 752-753, 746-752, 747-752, 748-752, 749-752, 750-752, 751-752, 746- 751, 747-751, 748-751, 749-751, 750-751, 746-750, 747-750, 748-750, 749-750, 746-749, 747-749, 748-759, 746-748, 747- 748, 746-747, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, ou 753, todos usando numeração do EGFR humano) . Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um paciente, câncer, tumor ou célula que se tornou resistente a inibidor de EGFR após contato com um inibidor de EGFR.

Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um mutante pontual de éxon-21de EGFR. Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um mutante pontual LS58R de éxon-21 de EGFR (numeração humana) . Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar) , o método inclui um mutante pontual de éxon-21 de EGFR (por exemplo, N826S, T847I, H850N, V851A, I853T, L858R, L861Q, A864T, E866K, ou G873E, todos usando numeração do EGFR humano). Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um paciente, câncer, tumor ou célula que testa positivo para uma mutação de ativação de EGFR (por exemplo, em um teste de mutação de EGFR cobas) . Em modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui um paciente, câncer, tumor ou célula que testa negativo para uma mutação de ativação de EGFR (por exemplo, em um teste de mutação de EGFR cobas).

Em algumas modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui determinar a presença de uma mutação T790M de EGFR na amostra (por exemplo, amostra do paciente) e/ou paciente. Em algumas modalidades dos métodos, o paciente e/ou amostra do paciente não inclui uma mutação T790M de EGFR. Em algumas modalidades dos métodos, o paciente e/ou amostra do paciente inclui uma mutação T790M de EGFR.

Em algumas modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui determinar a presença de um nivel aumentado (por exemplo, mais alto, maior) de MET na amostra (por exemplo, amostra do paciente) e/ou paciente em relação a uma amostra controle ou controle. Em algumas modalidades dos métodos, o paciente e/ou amostra do paciente não inclui um nivel aumentado (por exemplo, mais alto, maior) de MET em relação ao controle. Em algumas modalidades dos métodos, o paciente e/ou amostra do paciente inclui um nivel aumentado (por exemplo, mais alto, maior) de MET em relação ao controle.

Em algumas modalidades dos métodos (por exemplo, método de tratar, diagnosticar, identificar, detectar), o método inclui determinar a presença de uma transição ou transformação endotelial para mesenquimal (EMT) na amostra por exemplo, amostra do paciente) e/ou paciente em relação a uma amostra controle ou controle. Em algumas modalidades dos métodos, o paciente e/ou amostra do paciente não inclui a presença de uma EMT em relação ao controle. Em algumas modalidades dos métodos, o paciente e/ou amostra do paciente inclui a presença de uma EMT em relação ao controle. Em algumas modalidades,· a EMT inclui perda de adesão celular, motilidade celular aumentada, e/ou redução nos niveis de E-caderina.

Composições farmacêuticas Em um sexto aspecto é fornecido uma composição farmacêutica incluindo uma quantidade terapeuticamente efetiva combinada de um inibidor de AXL e um inibidor de GAS 6.

Em algumas modalidades, o inibidor de AXL é selecionado a partir de um grupo que consiste em BGB324, amuvatinib, foretinib, BMS-777607, SGI-7079, bosutinib, crizotinib, YW327.6S2, AD57, AD80, AD81, anticorpo de ligação a AXL, e proteina de fusão Axl-Fc. Em algumas modalidades, o inibidor de AXL não é um anticorpo ou uma proteina de fusão Axl-Fc. Em algumas modalidades, o inibidor de AXL é selecionado a partir de um grupo que consiste em gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-272, CP-724714, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, ARRY-380, AG-1478, dacomitinib/PF299804, OSI-42G/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE788, pelitinib/EKB-569, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-4 90, XL64 7, PD153035, BMS-599626, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, AP26113, e CO-1686. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é erlotinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é gefitinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é lapatinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é cetuximab. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é panitumumab. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é vandetanib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é afatinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é desmetil erlotinib. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é CO-1686. Em algumas modalidades, o inibidor de EGFR é AP26113.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é usada para tratar um câncer resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é útil para tratar um câncer resistente a inibidor de EGFR. Em algumas modalidades da composição farmacêutica, o câncer resistente a inibidor de EGFR é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de figado, glioblastoma, astrocitoma-glioblastoma. Em algumas modalidades da composição farmacêutica, o câncer resistente a inibidor de EGFR é um câncer de pulmão de células não pequenas. Em algumas modalidades da composição farmacêutica, o câncer resistente a inibidor de EGFR é um câncer metastático. Em algumas modalidades da composição farmacêutica, o câncer resistente a inibidor de EGFR é resistente a um inibidor de EGFR selecionado a partir de um grupo que consiste em gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-272, CP-724714, TAK-285, AST- 1306, ARRY334543, ARRY-380, AG-1478, dacomitinib/PF299804, OSI-420/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE788, pelitinib/EKB- 569, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, AP26113, e CO-1686. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é útil para tratar cânceres que não incluem uma mutação T790M de EGFR, não incluem um nível aumentado de MET, e/ou não incluem a presença de uma EMT. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é útil para tratar cânceres que incluem uma mutação T790M de EGFR, um nivel aumentado de MET, e/ou a presença de uma EMT. A composição farmacêutica inclui sais farmaceuticamente aceitáveis dos moduladores descritos aqui. O composto incluído na composição farmacêutica pode estar covalentemente ligado a uma fração carreadora. Alternativamente, 0 composto incluído na composição farmacêutica não está covalentemente ligado a uma fração carreadora.

Os compostos da invenção (isto é, compostos descritos aqui, incluindo modalidades, exemplos) podem ser administrados sozinhos ou podem ser coadministrados ao paciente. A coadministração tem a intenção de incluir a administração simultânea ou sequencial dos compostos individualmente ou em combinação (mais de um composto). Assim, as preparações também podem ser combinadas, quando desejado, com outras substâncias ativas (por exemplo, para reduzir a degradação metabólica).

Os compostos da presente invenção podem ser preparados e administrados em uma ampla variedade de formas de dosagem oral, parenteral e tópica. Preparações orais incluem tabletes, pílulas, pós, drágeas, cápsulas, líquidos, pastilhas, comprimidos, géis, xaropes, misturas de suspensão etc., apropriadas para ingestão pelo paciente. Os compostos da presente invenção também podem ser administrados por injeção, isto é, intravenosamente, intramuscularmente, intracutaneamente, subcutaneamente, intraduodenalmente, ou intraperitonealmente. Além disso, os compostos descritos aqui podem ser administrados por inalação, por exemplo, intranasalmente. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser administrados transdermicamente. Também previsto que múltiplas rotas de administração (por exemplo, intramuscular, oral, transdérmica) possam ser usadas para administrar os compostos da invenção. Assim, a presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e um ou mais compostos da invenção.

Para prepara as composições farmacêuticas a partir dos compostos da presente invenção, carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser tanto sólidos como líquidos. Preparações de forma sólida incluem pós, tabletes, pílulas, cápsulas, comprimidos, supositórios, ou grânulos dispersíveis. üm carreador sólido pode ser uma ou mais substâncias, que também podem agir como diluentes, agentes flavorizantes, ligantes, preservantes, agentes de desintegração de tablete, ou um material encapsulante.

Em pós, o carreador é um sólido dividido finamente em uma mistura com o componente ativo finamente dividido (por exemplo, um composto fornecido aqui). Em tabletes, o componente ativo está misturado com o carreador que tem as propriedades de ligação necessárias em proporções apropriadas e compactador na forma e tamanho desejados.

Excipientes sólidos apropriados incluem, mas não estão limitados a carbonato de magnésio; estereato de magnésio; talco; pectína; dextrina; amido; tragacanto; uma cera com ponto de fusão baixo; manteiga de cacau; carboidratos; açúcares incluindo, mas não limitado a lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol, amido de milho, trigo, arroz, batata, ou outras plantas; celulose como metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose, ou carboximetilcelulose de sódio; e gomas incluindo arábica e tragacanto; bem como proteínas incluindo, mas não limitado a gelatina e colágeno. Se desejado, agentes desintegrantes ou solubilizantes podem ser adicionados, como polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico, ou um sal das mesmas, como alginato de sódio. São fornecidos revestimentos apropriados para os núcleos de drágeas, como soluções de açúcares, as quais também podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos ou misturas de solventes apropriados. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos dos tabletes e drágeas para identificação do produto ou para caracterizar a quantidade de composto ativo (isto é, dosagem). As preparações farmacêuticas da invenção também podem ser usadas por via oral usando, por exemplo, cápsulas duras feitas de gelatina, bem como cápsulas seladas e macias feitas de gelatina e de um revestimento como glicerol ou sorbitol.

Para preparar supositórios, uma cera com ponto d efusão baixo, como uma mistura de glicerideos de ácido graxo ou manteiga de cacau, é primeiramente derretida e o componente ativo é disperso homogeneamente na mesma por agitação. A mistura derretida homogênea é então é despejada em moldes de tamanho conveniente, permitindo que esfrie e, assim, se solidifique.

Preparações de forma liquida incluem soluções, suspensões, e emulsões, por exemplo, água ou soluções de água/propileno glicol. Para injeção parenteral, as preparações liquidas podem ser formuladas em solução em solução aquosa de polietileno glicol.

Quando aplicação parenteral é necessária ou desejada, misturas particularmente apropriadas para os compostos da invenção são soluções estéreis injetáveis, preferivelmente soluções oleosas ou aquosas, bem como suspensões, emulsões, ou implantes, incluindo supositórios. Os compostos da invenção também podem ser incorporados em lipossomos ou administrados via bombas ou adesivos transdérmicos. Misturas farmacêuticas apropriadas para uso na presente invenção são bem conhecidas daqueles com habilidade na técnica e são descritas, por exemplo, em Pharmaceutical Sciences (17a Ed. , Mack Pub. Co., Easton, PA) e WO 96/05309, os ensinamentos de ambas estão incorporados aqui por referência Soluções aquosas apropriadas para uso oral podem ser preparadas dissolvendo-se o componente ativo (por exemplo, compostos descritos aqui, incluindo modalidades, exemplos) em água e adicionando colorizantes, flavorizantes, estabilizadores e agentes espessantes apropriados como desejado. Suspensões aquosas apropriadas para uso oral podem ser feitas dispersando-se o componente ativo finamente dividido em água com material viscoso, como gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto e goma de acácia, e agentes dispersantes ou umectantes como fosfatideos que ocorrem naturalmente (por exemplo, lecitina), um produto de condensação de um óxido de alquileno com um ácido graxo (por exemplo, estearato de polioximetileno), um produto de condensação de óxido de etileno com um álcool alifático de cadeia longa (por exemplo, heptadecaetileno oxicetanol), um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um hexitol (por exemplo, monooleato de sorbitol polioximetileno), ou um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um hexitol anidrido (por exemplo monooleato de sorbitano polioximetileno). A suspensão aquosa também pode conter um ou mais preservantes como etil ou n-propil p-hidroxibenzoato, um ou mais agentes colorizantes, um ou mais agentes flavorizantes e um ou mais agentes adoçantes, como sacarose, aspartame ou sacarina. As formulações podem ser ajustadas em relação à osmolaridade.

Preparações de forma sólida cuja intenção é que sejam convertidas, pouco antes do seu uso, em formas liquidas de preparação para uso oral também estão incluídas. Essas formas liquidas incluem soluções, suspensões, e emulsões.

Essas preparações podem conter, além do componente ativo, colorizantes, flavorizantes, estabilizadores, tampões, adoçantes naturais e artificiais, dispersantes, espessantes, agentes solubilizantes, e similares.

As composições farmacêuticas fornecidas pela presente invenção incluem composições nas quais o ingrediente ativo (por exemplo, compostos descritos aqui, incluindo modalidades, exemplos) está contido em uma quantidade terapeuticamente efetiva, isto é, em uma quantidade efetiva para atingir seu propósito desejado. A quantidade efetiva real para uma aplicação especifica irá depender, inter alia, da condição sendo tratada. Quando administrada nos métodos para tratar uma doença, essas composições irão conter uma quantidade de ingrediente ativo efetiva para atingir o resultado desejado, por exemplo, modular a atividade de uma molécula alvo e/ou reduzir, eliminar, ou desacelerar o progresso de sintomas da doença (por exemplo, crescimento ou metástase do câncer). A determinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva do composto da invenção está dentro das capacidades daqueles com habilidade na técnica, especialmente dada esta descrição detalhada. A dosagem e frequência (dose única ou múltipla) administrada a um mamífero pode depender de diversos fatores, por exemplo, se o mamífero sofre de outra doença, e sua rota de administração; tamanho, idade, sexo, saúde, peso corporal, índice d eraassa corporal, e dieta do recipiente; a natureza e extensão dos sintomas da doença que está sendo tratada (por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de fígado, glioblastoma, astrocitoma-glioblastoma, ou formas resistentes a inibidor de EGFR dos mesmos), tipo de tratamento coexistente, complicações da doença que estão sendo tratadas ou outros problemas relacionados à saúde. Outros regimes ou agentes terapêuticos podem ser usados em conjunto com os métodos e compostos da invenção dos requerentes. 0 ajuste e manipulação das dosagens estabelecidas {por exemplo, frequência e duração) estão dentro da capacidade daqueles com habilidade na técnica.

Para qualquer composto descrito aqui, a quantidade terapeuticamente efetiva pode ser inicialmente determinada a partir de ensaios de cultura de células. As concentrações alvo serão aquelas concentrações de composto(s) ativo(s) que são capazes de realizar os métodos descritos aqui, como medido usando os métodos descritos aqui ou conhecidos na técnica.

Como é bem conhecido na técnica, quantidades terapeuticamente efetivas para uso em humanos também podem ser determinadas a partir de modelos animais. Por exemplo, uma dose para humanos pode ser formulada para atingir uma concentração que foi observada como sendo efetiva em animais. A dosagem em humanos pode ser ajustada monitorando-se a efetividade dos compostos e ajustando a dose para cima ou para baixo, como descrito acima. Ajustar a dose para se obter eficácia máxima em humanos com base nos métodos descritos acima e outros métodos está dentro da capacidade do técnico de habilidade média.

Dosagens podem ser variadas dependendo dos requisitos do paciente e dos compostos que estão sendo empregados. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para efetuar uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo. O tamanho da dose também será determinado pela existência, natureza e extensão de qualquer efeito colateral adverso. A determinação da dosagem apropriada para uma situação especifica está dentro da capacidade do técnico. Geralmente, o tratamento é iniciado com doses menores que são menores que a dose ótima do composto. Depois, a dosagem é aumentada em pequenos incrementos até que o efeito ótimo sob as circunstâncias é atingido. Em uma modalidade, a faixa de dosagem é de 0,001% a 10% p/v. Em outra modalidade, a faixa de dosagem é de 0,1% a 5% p/v.

As quantidades e intervalos da dosagem podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis do composto administrado que sejam efetivos para a indicação clinica específica que está sendo tratada. Isto irá fornecer um regime terapêutico que é proporcional à severidade do estado patológico do indivíduo.

Utilizando os ensinamentos fornecidos aqui, um regime de tratamento profilático ou terapêutico efetivo pode ser planejado que não cause toxicidade substancial, mas seja efetivo para tratar os sintomas clínicos demonstrados pelo paciente especifico. Este planejamento deve envolver a escolha cuidadosa do composto ativo considerando fatores como potência do composto, biodisponibilidade relativa, peso corporal do paciente, presença e severidade de efeitos colaterais adversos, modo preferido de administração e perfil de toxicidade do agente selecionado.

As composições da presente invenção podem ser entregues por via transdérmica, por uma rota tópica, formuladas como hastes aplicadoras, soluções, suspensões, emulsões, géis, cremes, línimentos, pastas, geleias, tintas, pós, e aerossóis. Para aplicações terapêuticas, os compostos ou drogas da presente invenção podem ser administrados sozinhos ou coadministrados me combinação com quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, e/ou imunoterapia convencionais.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fornecidas como um sal e podem ser formadas com muitos ácidos, incluindo, mas não limitado a clorídrico, sulfúrico, acético, látíco, tartárico, málico, succínico etc. As composições farmacêuticas descritas aqui podem ser sais de um composto ou composição que são preparados com ácido sou bases relativamente não tóxicos, dependendo dos substituintes particulares encontrados nos compostos descritos aqui. Quando os compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente ácidas, sais por adição de base podem ser obtidos colocando a forma neutra desses compostos em contato com uma quantidade suficiente da base desejada, pura ou em um solvente inerte apropriado. Exemplos de saís de adição de base farmaceuticamente aceitáveis incluem sal de sódio, potássio, cálcio, amônio, amino orgânico, ou magnésio, ou um sal similar. Quando os compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente básicas, sais por adição de ácido podem ser obtidos colocando a forma neutra desses compostos em contato com uma quantidade suficiente do ácido desejado, pura ou em um solvente inerte apropriado. Exemplos de sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, bromídrico, nítrico, carbônico, monohidrogenocarbônico, fosfórico, monohidrogenofosfórico, dihidrogenofosfórico, sulfúrico, monohidrogenosulfúrico, hidriódico, ou fosforoso e similares, bem como sais derivados de ácidos orgânicos relativamente não tóxicos como ácido acético, propriônico, ísobutírico, maleico, malônico, benzóico, succínico, subérico, fumárico, lático, mandélico, ftálico, benzenosulfônico, p-tolilsulfônico, cítrico, tartárico, metanosulfônico, e similares. Também incluídos estão os sais de aminoácidos como arginato e similares, e sais de ácidos orgânicos como ácido glicurônico ou galacturônico e similares (ver, por exemplo, Berge et al., Journal of Pharmaceutícal Science 66:1-19 (1977)). Certos compostos específicos da presente invenção contêm funcionalidades tanto básicas quanto ácidas que permitem que os compostos sejam convertidos em saís de adição de base ou de ácido. Outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis conhecidos daqueles com habilidade na técnica são apropriados para a presente invenção. Sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros protônicos que são as formas correspondentes de base livre. Em outros casos, a preparação pode ser um pó liofilizado que é combinado com um tampão antes do uso.

As formas neutras dos compostos podem ser regeneradas fazendo-se com que o sal entre em contato com uma base ou ácido e isolando-se o composto parente pela maneira convencional. A forma parente do composto difere das várias formas de sal em certas características físicas, como solubilidade em solventes polares, mas em outros quesitos são equivalentes à forma parente do composto para os propósitos da presente invenção.

Certas composições descritas aqui podem existir em formas não solvatadas como solvatadas, incluindo formas hidratadas. Em geral, as formas solvatadas são equivalentes às formas não solvatadas e tem-se a intenção de que sejam englobadas pela abrangência da presente invenção. Certas composições descritas aqui podem existir em múltiplas formas cristalinas ou amorfas. Em geral, todas as formas físicas são equivalentes para os usos contemplados pela presente invenção e tem-se a intenção de que estejam dentro abrangência da presente invenção.

Em outra modalidade, as composições da presente invenção são úteis para administração parenteral, como administração intravenosa (IV) ou administração em uma cavidade do corpo ou no lúmen de um órgão. As formulações para administração comumente compreendem uma solução das composições da presente invenção dissolvidas em um carreador farmaceuticamente ativo. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água e solução de Ringer, e cloreto de sódio isotônico. Além disso, óleos fixos estéreis podem convencionalmente ser empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para esse propósito, qualquer óleo fixo comum pode ser empregado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos como ácido oleico podem também ser usados na preparação de injetáveis. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria indesejada. Estas formulações podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais e bem conhecidas. As formulações podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como necessário para se aproximar de condições fisiológicas como agentes de ajuste de pH e tamponamento, agentes de ajuste de toxicidade, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e similares.

Em algumas modalidades, a coadministração inclui administrar um agente ativo com 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, ou 24 horas de diferença de um segundo agente ativo. A coadministração inclui administrar dois agentes ativos simultaneamente, aproximadamente simultaneamente (por exemplo, com cerca de 1, 5, 10, 15, 20, ou 30 minutos de diferença entre um e outro), ou sequencialmente em qualquer ordem. Em algumas modalidades, a coadministração pode se obtida por coformulação, isto é, preparar uma composição farmacêutica única incluindo ambos os agentes ativos. Em outras modalidades, os agentes ativos podem ser formulados separadamente. Em outra modalidade, os agentes ativos e/ou adjuntos podem estar ligados ou conjugados um com o outro.

Formulações apropriadas para administração oral podem compreender: (a) soluções líquidas, como uma quantidade efetiva de um composto ou droga empacotados suspensos em diluentes, por exemplo, água, solução salina, ou PEG 400; (b) cápsulas, sachês, ou tabletes, cada um contendo uma quantidade pré-determinada de modulador, composto ou droga, como líquidos, sólidos, grânulos ou gelatina; (c) suspensões em um líquido apropriado; e (d) emulsões apropriadas. As formas de tablete podem incluir um ou mais entre lactose, sacarose, manitol, sorbitol, fosfatos de cálcio, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, gelatina, dióxido de silício coloidal, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico, e outros excipientes, colorizantes, cargas, ligantes, diluentes, agentes de tamponamento, agentes umidificantes, preservantes, agentes flavorizantes, corantes, agentes desintegrantes, e carreadores farmaceuticamente compatíveis. As formas de comprimido podem compreender um modulador, composto ou droga com um sabor, por exemplo, sacarose, bem como em pastilhas compreendendo um modulador ou composto em uma base inerte, como gelatina e glicerina ou emulsões de sacarose e acácia, géis, e similares, contendo, além do modulador, carreadores conhecidos na técnica. O composto escolhido, sozinho ou em combinação com outros componentes apropriados, podem ser feito em formulações aerossólicas (isto é, elas podem ser "nebulizadas") para ser administrado via inalação. As formulações aerossólicas podem ser postas em propelentes pressurizados aceitáveis, como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio, e similares.

Formulações apropriadas para administração retal incluem, por exemplo, supositórios, os quais compreendem uma quantidade efetiva do composto ou droga com uma base supositória. Bases supositórias apropriadas incluem triglicerídeos ou hidrocarbonetos de parafina naturais ou sintéticos. Além disso, também é possível usar cápsulas de gelatina retal que contêm uma combinação do composto ou droga escolhido com uma base, incluindo, por exemplo, triglicerídeos líquidos, políetileno glicóis, e hidrocarbonetos de parafina.

Formulações apropriadas para administração parenteral, como, por exemplo, por vias intra-articular (nas juntas), intravenosa, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraperitoneal, e subcutâneas, incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções de injeção estéreis isotônicas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangre do recipiente desejado, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores, e preservantes, Soluções e suspensões de injeção também podem ser preparadas a partir de pós, grânulos, e tabletes estéreis. Na prática da presente invenção, as composições podem ser administradas, por exemplo, por infusão intravenosa, oralmente, topicamente, intraperitonealmente, intravesicalmente, ou intratecalmente. As administração parenteral, administração oral e administração intravenosa são os métodos preferidos de administração. As formulações de compostos podem ser apresentadas como recipientes selados de dose única ou múltiplas doses., como ampolas e viais.

No uso terapêutico para o tratamento de câncer, o composto utilizado nas composições farmacêuticas da presente invenção pode ser administrado em dosagens, que podem ser variadas dependendo dos requisitos do paciente, da severidade da condição que está sendo tratada, e do composto ou droga que está sendo empregado. Por exemplo, as dosagens podem ser determinadas empiricamente considerando o tipo e estágio do câncer diagnosticado no paciente específico. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para efetuar uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo. 0 tamanho da dose também será determinado pela existência, natureza, e extensão de qualquer efeito colateral adverso que acompanhe a administração de um composto em um paciente em particular. A determinação da dosagem apropriada para uma situação especifica está dentro da habilidade do indivíduo que realiza a prática. Geralmente, o tratamento é iniciado com doses menores que são menores do que a dose ótima do composto. Depois, a dosagem é aumentada em pequenos incrementos até que o efeito ótimo sob as circunstâncias seja atingido. Por conveniência, a dosagem total diária pode ser dividida e administrada em porções durante o dia, se desejado.

Os compostos descritos aqui podem ser usados em combinação uns com os outros, com outros agentes ativos conhecidos como sendo úteis no tratamento de câncer ou com agentes adjuntos que podem não ser efetivos sozinhos, mas podem contribuir par aa eficácia do agente ativo.

Modalidades adicionais 1. Um método de detecção de um nivel aumentado de AXL ou GAS6 em um paciente com câncer, o método compreendendo: (i) obter uma amostra de um paciente com câncer; e (ii) detectar um nivel aumentado de AXL ou GAS6 na dita amostra em relação a um controle. 2.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por o dito paciente com câncer ter um câncer compreendendo células cancerosas com uma mutação de ativação de EGFR. 3.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por a mutação de ativação de EGFR ser uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21. 4.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 3, caracterizado por o método não compreender detectar um nivel de um marcador de EMT exceto AXL. 5.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 4, caracterizado por a dita detecção compreender: (a) contatar a amostra com um agente de ligação a AXL detectável ou agente de ligação a GAS6 detectável; (b) permitir que o dito agente de ligação a AXL detectável e AXL formem um complexo de AXL ou o dito agente de ligação a GAS6 e GAS6 formem um complexo de GAS6; e (c) detectar o dito complexo de AXL ou complexo de GAS 6. 5.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 5, caracterizado por a dita detecção compreender detectar um nível de um ácido nucleico de GAS6 ou AXL ou fragmento do mesmo. 7.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 6, caracterizado por a dita detecção compreender o uso de amplificação de ácido nucleico, um arranjo dos genes, um microarranjo, um macroarranjo, um arranjo de DNA, ou um chip de DNA. 8.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 5, caracterizado por a dita detecção compreender detectar um nível de uma proteína de GAS6 ou AXL ou fragmento da mesma. 9.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 8, caracterizado por a dita detecção compreender o uso de um anticorpo, cítometria de fluxo, ELISA, espectroscopia de massa, imunofluorescência, ou microscopia de fluorescência. 10.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por o dito anticorpo ser conjugado com uma fração detectável. 11.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 10, caracterizado por compreender detectar um nível aumentado de AXL. 12.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 11, caracterizado por o nível de AXL ser um nível de mRNA de AXL, proteína de AXL, ou atividade quinase de AXL. 13.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 12, caracterizado por o dito paciente com câncer ser um paciente com câncer resistente a EGFR TKI, em que o dito paciente com câncer resistente a EGFR TKI tem um câncer que não é um câncer mesenquimal. 14.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a EGFR TKI ser resistente a gefitinib, erlotinib, eetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-272, CP-724714, ΤΆΚ-285, AST-1306, ARRY334543, ARRY-380, AG-1478, dacomitinib/PF299804, OSI-420/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE788, pelitiníb/EKB-569, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, AP26113, ou CO-1686. 15.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada.3 a 14, caracterizado por o paciente com câncer resistente a EGFR TKI ser resistente a erlotinib ou gefitinib. 16.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 15, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a EGFR TKI ter um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de figado, glioblastoma, e astrocitoma-glioblastoma. 17.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por o dito câncer de pulmão ser câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). 18.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 17, caracterizado por o dito câncer ser câncer metastático. 19.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades Erro! Fonte de referência não encontrada, a 18, caracterizado por o dito câncer ser câncer de pulmão de células não pequenas compreendendo EGFR que tem uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21; e em que ainda o câncer é resistente a erlotinib ou resistente a gefitinib em relação a um controle. 20. Um método de identificação de um paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR, caracterizado por compreender: (i) obter uma amostra de um paciente com câncer; (ii) detectar um nivel aumentado de AXL ou GAS6 na dita amostra em relação a um controle. 21.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ter um câncer compreendendo células cancerosas com uma mutação de ativação de EGFR. 22.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por a mutação de ativação de EGFR ser uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21. 2 3.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 22, caracterizado por o método não compreender detectar um nível de um marcador de EMT exceto AXL. 24.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 23, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ter um câncer que não é um câncer mesenquimal. 25.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 24, caracterizado por a dita detecção compreender detectar um nível de um ácido nucleico de GAS6 ou AXL ou fragmento do mesmo. 26.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por a dita detecção compreender o uso de amplificação de ácido nucleico, um arranjo dos genes, um microarranjo, um macroarranjo, um arranjo de DNA, ou um chip de DNA. 27.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 26, caracterizado por a dita detecção compreender detectar um nível de uma proteína de GAS6 ou AXL ou fragmento da mesma. 28.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por a dita detecção compreender o uso de um anticorpo, citometria de fluxo, ELISA, espectroscopia de massa, imunofluorescência, ou microscopia de fluorescência. 29.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por o dito anticorpo ser conjugado com uma fração detectável. 30.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 29, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ser resistente a gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-272, CP-724714, ΤΆΚ-285, AST-1306, ARRY334543, ARRY-3 8 0, AG-1478, dacomitinib/PF299804, OSI-420/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE7 8 8, pelitinib/EKB-569, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, AP26113, ou CO-1686. 31.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 30, caracterizado por o paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ser resistente a erlotinib ou gef itinib. 32.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 31, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ter um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de figado, glioblastoma, e astrocitoma-glioblastoma. 33.0 método de acordo com a modalidade Erro! Fonte de referência não encontrada., caracterizado por o dito câncer de pulmão ser câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). 3 4.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 33, caracterizado por o dito câncer ser câncer metastático. 35.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 34, caracterizado por o dito câncer ser câncer de pulmão de células não pequenas compreendendo EGFR que tem uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21; e em que ainda o câncer é resistente a erlotinib ou resistente a gefitinib em relação a um controle. 36.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 35, caracterizado por compreender detectar um nível aumentado de AXL. 37.0 método de acordo com qualquer uma das modalidades 20 a 36, caracterizado por o nível de AXL ser um nível de inRNA de AXL, proteína de AXL, ou atividade quinase de AXL.

EXEMPLOS AXL promove resistência in vivo e in vitro NSCLCs humanos com mutações de ativação em EGFR frequentemente respondem ao tratamento com inibidores de tirosina quinase de (TKIs) EGFR como erlotinib, mas as respostas não são duráveis porque os tumores adquirem resistência. Mutações secundárias em EGFR (T790M) ou regulação positiva de quinase de MET são encontradas em 50% dos tumores resistentes. Estão descritas aqui a ativação aumentada de AXL e evidência de transição epitelial-para-mesenquimal (EMT) em múltiplos modelos in vitro e in vivo de câncer de pulmão com EGFR mutante com resistência adquirida a erlotinib na ausência de EGFR T7 90M ou ativação de MET. A inibição genética ou farmacológica de AXL restaurou a sensibilidade a erlotinib nesses modelos tumorais. A expressão aumentada de AXL, e em alguns casos seu ligante GAS6, foi observada em cânceres de pulmão com EGFR mutante obtidos de pacientes com resistência adquirida a EGFR TKI. Estes dados identificam AXL como um alvo terapêutico promissor cuja inibição podería prevenir ou superar a resistência adquirida a EGFR TKI em pacientes com câncer de pulmão com EGFR mutante.

Para identificar novos mecanismos de resistência adquirida ao tratamento com EGFR TKI, novos modelos in vivo e in vitro (n=5) de resistência adquirida a EGFR TKI erlotinib usando mutantes de deleção de éxon 19 de EGFR (delE746-A750) em células HCC827 de NSCLC humano foram criados. As células HCC827 são inícialmente sensíveis ao tratamento com erlotinib (IC50 in vitro de ~5 nM) e elas foram usadas para desenvolver modelos in vitro de resistência adquirida EGFR TKI em estudos que levaram à identificação de mecanismos clinicamente relevantes de resistência a EGFR TKI. [Turke, A. B. et al. Câncer Cell 17, 77-88 (2010); Bivona, T. G. et al. Nature 471, 523-526 (2011)]. Para criar o modelo in vivo, coortes de 5 camundongos (2 tumores/camundongo) com tumores de HCC827 estabelecidos foram tratados com veiculo ou com 4 doses progressivas de erlotinib (de 6,25 mg/kg/dia a 50 mg/kg/dia) por ~ 5 meses para se obter tumores resistentes a erlotinib. O tratamento com erlotinib de tumores de xenoenxerto de HCC827 (10 tumores/dose, tratamento diário) resultou em uma diminuição inicial dependente de dose no volume do tumor e no desenvolvimento subsequente de resistência adquirida (>25% de recrescimento a partir da redução máxima) após 6-10 semanas de tratamento em cada tumor (Figura la, Tabela 1). O sequenciamento de EGFR em cada tumor resistente a erlotinib mostrou que nenhum deles possuía a mutação T790M de EGFR nem outras mutações secundárias de EGFR associadas à resistência a erlotinib (D761Y, L474S, T854A). Para examinar se os tumores resistentes a erlotinib possuíam expressão aumentada de causadores potenciais de resistência, conhecidos ou novos, foram conduzidos perfis de expressão usando microarranjos de 17 tumores de xenoenxerto de todos os grupos de tratamento, bem como 2 de 2 tumores tratados com veículo. Nos perguntamos quais genes eram regulados diferencialmente nos tumores resistentes a erlotinib em comparação com os tumores controle (teste T não pareado, P<0,05). A análise mostrou que 21 genes foram aumentados (mudança de >1 log2 vezes) especificamente nos tumores resistente a erlotinib. Inesperadamente, observamos que o receptor de tirosina quinase AXL foi o gene mais altamente superexpresso nos tumores com resistência adquirida a erlotinib. Consistente com estudos anteriores [Engelman, J. A. et al. Science 316, 1039-1043 (2007); Bean, J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007)], foi observado que MET estava entre os genes regulados positivamente, embora em um grau muito menor que AXL. A expressão aumentada de mRNA de MET (mudança de >1 log2 vezes) em 5/17 (29%) dos tumores com resistência adquirida a erlotinib (Figura 1b) foi observada. A análise não identificou superexpressão de IGF-1R, Ras, ou EGFR nos tumores resistentes a erlotinib. Comparada a dos tumores controles, a expressão de AXL foi aumentada (mudança de >1 log2 vezes) em 15/17 (88%) dos tumores com resistência a erlotinib (Figura 1c). Além disso, a expressão aumentada (mudança de > 1 log2 vezes) de GAS6, o ligante de AXL, em 8/17 (47%) dos tumores com resistência a erlotinib (Figura ld) foi observada. AXL foi superexpresso em cada tumor que tinha niveis aumentados de MET ou GAS6. Em 10 dos 15 tumores (66,6%) com regulação positiva de AXL, a superexpressão de MET não foi observada. Em cada tumor no qual AXL e MET estavam ambos aumentados AXL foi superexpresso em grau maior. A superexpressão de AXL e GAS6 foi unicamente em tumores resistentes ao tratamento e não foi resultado dos efeitos agudos do tratamento com erlotinib já que os seus niveis não foram aumentados em tumores sensíveis a erlotinib coletados após 48h de tratamento com erlotinib (Figura 6). A análise de aCGH mostrou que nem AXL nem GAS6 foi amplificado e o sequenciamento de AXL revelou que ele não foi mutado nos tumores resistentes a erlotinib. Com base nestes achados e dados recentes que demonstram que AXL pode promover crescimento celular em várias linhagens de células cancerosas [Linger, R. M., Keating, Ά. K. , Earp, H. S. & Graham, D. K. Expert Opin Ther Targets 14, 1073-1090 (2010); Keating, A. K. et al. Mol Câncer Ther 9, 1298-1307 (2010)], nossa hipótese é de que a superexpressão e ativação de AXL pode promover resistência adquirida a erlotinib em NSCLCs com EGFR mutante. AXL foi previamente associada com EMT e estudos recentes sugerem que a resistência terapêutica pode, em alguns casos, estar associada com mudanças histológicas incluindo EMT em NSCLCs. [Sequist, L. V. et al. Sei Transi Med 3, 75ra26 (2011); Vuoriluoto, K. et al. Oncogene 30, 1436-1448 (2011); Suda, K. et al. Journal of thoracic oncology: official publicatíon of the International Association for the Study of Lung Câncer 6, 1152-1161 (2011)] Percebemos que os xenoenxertos de tumor com resistência adquirida a erlotinib continham alterações no nível de expressão de vários genes que são biomarcadores estabelecidos de EMT. Por exemplo, observamos níveis aumentados de COL6A1 (um colágeno tipo IV) , HMGA1 e HMGA2 e níveis diminuídos de genes de queratina (incluindo KRT6A, KRT14, KRT5) nos tumores com resistência adquirida a erlotinib comparados aos tumores controle. Examinamos ainda se os tumores de xenoenxerto resistentes a erlotinib exibiam mudanças moleculares conhecidas como ocorrendo em EMT. De fato, observamos regulação negativa de E-caderina (mudança de >0,5 log2 vezes) em 8/15 (53%) (Figura le) , regulação positiva de COL6A1 (mudança de >1 log2 vezes) em 14/15 (93%) (Figura lf) e vimentina aumentada (mudança de >1 log2 vezes) em 10/15 (66%) (Figura 6) dos tumores resistentes a erlotinib com superexpressão de AXL comparado aos tumores controle tratados com veículo.

Consistente com os dados do microarranjo, observamos níveis aumentados de proteínas de AXL e de AXL fosforilada (p) em xenoenxertos de tumores HCC827 resistentes representativos em cada dose de erlotinib comparado com os tumores tratados com veículo (Figura 2a). Não observamos alterações nos níveis de IGF-lR, pIGF-lR, ou Ras nos tumores resistentes a erlotinib (Figura 2a). Em contraste, observamos níveis diminuídos de pEGFR, pErbB3, e pMET em resposta ao tratamento com erlotinib tanto em tumores sensíveis coletados com 48h de tratamento (Figura 2b) quanto em tumores resistentes em cada dose de erlotinib comparado com os tumores tratados com veículo (Figura 2a) . 0 tratamento com erlotinib por 48h diminuiu pAKT, pERK, e pRelA e aumentou a divagem de Parp em tumores sensíveis (um marcador de apoptose) (Figura 2b) , mas os níveis de pAKT, pERK, pRelA foram mantidos em cada tumor com resistência adquirida a erlotinib (Figura 2a). Além disso, observamos expressão aumentada do marcador de EMT vimentina em vários tumores resistentes a erlotinib (Figura 2a). Estes dados sugerem que a regulação positiva de AXL pode ativar a sinalização de AKT, MAPK ou NF-kB para promover resistência ao tratamento com erlotinib em NSCLCs com EGFR mutante, talvez em associação com uma EMT.

Inibição de AXL restaura sensibilidade a erlotinib Para determinar se a inibição de AXL poderia restaurar a sensibilidade a erlotinib in vivo, buscamos uma abordagem genética, porque a farmacocinética e a especificidade de muitos dos inibidores de AXL disponíveis atualmente in vivo é subótima. Produzimos tumores de xenoenxerto em camundongos imunocomprometidos usando células HCC827 parentais ou um subclone de células HCC827 resistentes a erlotinib que criamos, o qual observamos expressar níveis aumentados de AXL (sublinhagem "ER1" de HCC827, discutida mais em detalhe abaixo) . Transduzimos as células ER1 de HCC827 que superexpressavam AXL com um shRNA não específico ou um shRNA específico para AXL antes do enxerto nos camundongos e então os tratamos com veículo ou erlotinib (12,5 mg/kg/dia) . Como esperado, os tumores de HCC827 parental foram sensíveis ao tratamento com erlotinib enquanto que os tumores ER1 de HCC827 que superexpressavam AXL transduzidos com o shRNA não específico foram resistentes a erlotinib (Figura 2c) . Em contraste, o silenciamento de AXL restaurou a sensibilidade a erlotinib em tumores ER1 de HCC827 (Figura 2c-d). Os dados mostram que AXL é necessário para resistência a erlotinib neste modelo in vivo.

Para explorar ainda mais o papel de AXL na resistência adquirida a EGFR TKI, nos concentramos então nos novos modelos in vitro de resistência adquirida a erlotinib que produzimos juntos com os modelos de xenoenxerto de tumor in vivo. Cinco sublinhagens clonais de HCC827 resistente a erlotinib foram criadas ("ER" 1-5), cada uma com uma IC50 de erlotinib > 10μ M, através de exposição prolongada (>5 meses) e continua a erlotinib (Figura 3a). Cada uma dessas linhagens celulares também eram resistentes a inibidor irreversível de quinase de EGFR BIBW2992 (afatinib) (Figura 8) . Assim, a resistência nestes modelos celulares é pouco provavelmente uma consequência da mutação secundária de resistência a droga (T790M) em EGFR e é generalizável para classes distintas de EGFR TKIs. De fato, a mutação de resistência T7 90M de EGFR não foi detectada por sequenciamento de qualquer sublinhagem ER. Procuramos determinar se AXL ou outros genes previamente implicados em resistência adquirida a EGFR TKI foram regulados positivamente nas sublinhagens ER1-5 de comparado as células parentaís. Para identificar os genes que eram diferencialmente regulados (limite de mudança de 3 vezes, FDR<0,1) no contexto da resistência adquirida a erlotinib, perfilamos as sublinhagens ER1-3 comparadas às células HCC827 parentais por microarranjos de genoma completo e validamos nossos achados por Q RT PCR e western blots em todas as 5 sublinhagens. Primeiro, percebemos que a expressão de EGFR, MET, IGF-1R, pIGF-lR e Ras não foi alterada em cada sublinhagem ER (Figura 3b). Não detectamos mutações de atividade em K-Ras ou BRAF por sequenciamento das sublinhagens ER. Consistente com esses achados nos xenoenxertos de tumor resistente a erlotinib, observamos significativa regulação positiva de AXL e seu ligante GAS6 em cada uma das sublinhagens ER de HCC827 comparado às células parentais (Figura 3b, Figura 9) . Também observamos expressão aumentada de vimentina e expressão diminuída de E-caderina em cada uma das sublinhagens ER (Figura 3b, Figura 9). Não foram encontradas nas sublinhagens ER de HCC827 mutações somáticas em AXL nem a amplificação genômica deste por sequenciamento e aCHG (ou FISH), respectivamente.

Nos perguntamos então se a superexpressão e ativação de AXL eram necessários para resistência adquirida a erlotinib in vitro por meio da inibição genética ou farmacológica de AXL nas sublinhagens ER de HCC827. Primeiro, observamos que o silenciamento de AXL usando um siRNA para AXL não teve efeito sobre a sensibilidade a erlotinib nas células HCC827 parentais, mas restaurou sensibilidade a erlotinib em cada uma das sublinhagens ER (Figura 3c) . Interessantemente, observamos que o silenciamento de GAS6 restaurou sensibilidade a erlotinib nas sublinhagens ER1 e ER2, mas não nas sublinhagens ER3, ER4 ou ER5 (Figura 3c) . Esta observação é reminiscente da dados recentes que mostravam que a regulação positiva do ligante de MET HGF pode promover resistência ao tratamento com gefitinib em algumas células de NSCLC com EGFR mutante. [Turke, A. B. et al. Câncer Cell 17, 77-88 (2010)] Como observamos níveis residuais, embora diminuídos, de pMET em algumas das sublinhagens ER, nos perguntamos se o silenciamento de MET por siRNA podería restaurar sensibilidade a erlotinib neste sistema. Observamos que o silenciamento de MET não afetou significativamente a sensibilidade a erlotinib nas células parentais ou HCC827 ERl ou melhorou mais os efeitos do silenciamento de AXL sobre a resistência a erlotinib nas células ERl (Figura 10).

Foi recentemente mostrado que o tratamento com anticorpo monoclonal contra AXL sensibiliza linhagens celulares de NSCLC que expressam EGFR selvagem (WT) a erlotinib. [Ye, X. et al. Oncogene 29, 5254-5264 (2010)] Assim, nos perguntamos se o silenciamento de AXL por siRNA melhora a sensibilidade a erlotinib em 5 linhagens celulares de NSCLC com EGFR WT (A549, H460, H1573, H2009, Calu-1). Observamos que o silenciamento de AXL não teve efeito sobre a sensibilidade a erlotinib nessas linhagens celulares (Figura 11) . Nossos dados sugerem que a inibição de AXL melhora a sensibilidade a erlotinib especificamente no contexto de NSCLCs com mutações de ativação do domínio quinase de EGFR em células com resistência adquirida a EGFR TKI.

Depois, procuramos validar nossos achados genéticos usando 2 inibidores de molécula pequena de AXL disponíveis comercialmente, MP-470 e XL-880. [Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S. & Graham, D. K. Expert Opin Ther Targets 14, 1073-1090 (2010)] Como esperado, o tratamento com MP-470 (1 μΜ) ou XL-880 (1 μΜ) sozinhos não afetou significativamente a viabilidade de células HCC827 parentais ou ER (Figura 12). Em contraste, observamos que o tratamento com MP-470 (1 μΜ) ou XL-880 (1 μΜ), restaurou sensibilidade ao tratamento coexistente com erlotinib em cada sublinhagem ER (Figura 3d). Para determinar se o tratamento com um inibidor de AXL ê sinergístico com tratamento coexistente com erlotinib, conduzimos uma análise de índice de combinação (CT) em 2 das sublinhagens ER (ERl e ER4). Observamos que o tratamento com MP470 ou XL880, mas não com o inibidor de MET PHA665752, foi sinergístico com o tratamento coexistente com erlotinib (Figura 13) . Juntos, os dados genéticos e farmacológicos mostram que AXL é necessário par aa resistência adquirida a erlotinib neste sistema.

Procuramos determinar quais eventos de sinalização posterior a AXL poderíam promover a resistência adquirida a erlotinib em NSCLCs com EGFR mutante. Como foi mostrado que AXL ativa as vias de MAPK, AKT e NP-kB e regula apoptose em algumas linhagens de células cancerosas [Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S. & Graham, D. K. Expert Opin Ther Targets 14, 1073-1090 (2010); Keating, A. K. et al. Mol Câncer Ther 9, 1298-1307 (2010)], examinamos a ativação destas vias em linhagens de células HCC827 parentais ou ER tratadas com um siRNA não específico ou específico para AXL siRNA e ou veiculo ou erlotinib (100 nM) . Como esperado, observamos que o tratamento com erlotinib diminuiu pERK, pAKT e pRelA (um marcador de sinalização de NF-kB) e aumentou a divagem de Parp (um marcador de apoptose) em células HCC827 parentais (Figura 3e). O tratamento com siRNA para AXL não teve efeito nestas vias em células HCC827 parentais (Figura 3e) . O tratamento com erlotinib diminuiu pEGFR tanto nas células HCC827 parentais quanto nas sublinhagens ER1 e ER2 (Figura 3e) . Esta observação é consistente com nosso achado que as sublinhagens ER não possuem uma mutação de resistência secundária em EGFR que anularia a habilidade de erlotinib inibir EGFR. Em contraste, o tratamento com erlotinib diminuiu pERK, pAKT e pRelA e aumentou os níveis de Parp clivada apenas com o silenciamento de AXL nas linhagens celulares ER1 e ER2 (Figura 3e) . Resultados similares foram observados nas sublinhagens ER3, ER4 e ER5 de HCC827 (Figura 14 ) . Nós então procuramos validar nossos achados genéticos usando inibidores farmacológicos de AXL. Como esperado, erlotinib diminuiu pEGFR, pERK, pAKT, pRelA e aumentou os níveis de Parp clivada em células HCC827 parentais independentemente de tratamentos coexistentes com MP-470 ou XL-880 (Figura 3f-g). Em contraste, estes efeitos do tratamento com erlotinib foram observados apenas com o tratamento coexistente com MP-470 (Figura 3f) ou XL-880 (Figura 3g) nas células ER1 e ER2 de HCC827. Resultados similares foram observados nas sublinhagens ER3, ER4 e ER5 de HCC827 tratadas com erlotinib e XL-880 tanto sozinhos quanto em combinação (Figura 14) . Juntos, os dados sugerem que a ativação de AXL é necessária para a resistência adquirida a erlotinib e que as vias de ΜΑΡΚ, AKT e NF-kB podem mediar, em parte, a resistência a erlotinib posteriormente a AXL neste sistema.

Para determinar se AXL é regulado positivamente no ambiente da resistência adquirida a erlotinib em outras células que não as HCC827, usamos o mesmo protocolo de tratamento com erlotinib para criar 2 sublinhagens isogênicas resistentes a erlotinib (IC5o > 1 μΜ) derivadas de células H3255 que expressam o mutante L858R de EGFR comumente encontrado em pacientes com câncer de pulmão e que são sensíveis a erlotinib (IC50 ~15nM). Similar ao observado nas células HCC827, observamos (1) superexpressão of AXL na ausência de T790M de EGFR, pEGFR e pMET aumentada (2) superexpressão do marcador de EMT vimentina, e (3) que a inibição de AXL por siRNA, MP-470 ou XL880 restaurou a sensibilidade ao tratamento coexistente com erlotinib nas sublinhagens ER de H3255 ER (Figura 15). Juntos, estes dados mostram que a regulação positiva de ÃXL promove a resistência adquirida a erlotinib no ambiente da EMT me modelos de tumor de NSCLC com EGFR mutante e que a inibição combinada de AXL e EGFR supera a resistência adquirida a erlotinib nestes modelos. Nós então perguntamos se (1) a expressão forçada de AXL é suficiente para induzir resistência a erlotinib e (2) se a atividade quinase de AXL é necessária para a indução de resistência a erlotinib por AXL. Para abordar estas questões, geramos construções de cDNA que codificam AXL selvagem (WT) ou um mutante de AXL com falha na quinase no qual uma lisina chave conservada dentro do domínio quinase foi alterada para arginina (K567R). A superexpressão transiente de AXL WT, mas não de AXL KD (K567R), em células HCC827 aumentou os niveis de pAXL e a IC50 para XL880 (Figura 16, Figura 3h-i), sugerindo que K567R prejudica a função quinase de AXL. A superexpressão de AXL WT, mas não a de AXL KD (K567R) com falha na quinase, induziu resistência a erlotinib em células HCC827 que foi revertida com tratamento com XL-880 (1 μΜ) (Figura 3h-i). Além disso, observamos que a introdução de AXL WT foi suficiente para induzir resistência parcial a erlotinib em células PC9 que expressam um mutante de deleção de éxon 19 de EGFR e são de outra maneira sensíveis a erlotinib (IC50 ~25 nM) (Figura 17). Juntos, os dados indicam que a ativação da quinase de AXL é necessária e suficiente para promover resistência a erlotinib nestes modelos de NSCLC com EGFR mutante.

Para confirmar que o tratamento com um inibidor de AXL restaura sensibilidade a erlotinib por inibição de ALXL, e não é consequência de um efeito "fora do alvo" de tratamento com droga, identificamos o resíduo "gatekeeper" dentro do domínio quinase de AXL com base na modelagem estrutural do co-cristal de MET ligado a XL880 e da localização do resíduo gatekeeper T790M em EGFR [Qían, F. et al. Inhibition of tumor cell growth, invasion, and METastasis by EXEL-2880 (XL880, GSK1363089), a novel inhibitor of HGF and VEGF receptor tyrosine kinases. Câncer research 69, 8009-8016 (2009); Yun, C. H. et al. PNAS 105, 2070-2075 (2008)] (Figura 18). A análise indicou que seria esperado que uma mutação L620M em AXL resultaria em um conflito estérico com XL-880 e bloquearia a habilidade de XL-880 inibir AXL. Assim, geramos um cDNA que codifica este mutante gatekeeper de AXL (L620M) e o introduzimos em células HCC827 para determinar se sua expressão bloqueia a habilidade de XL-880 de restaurar a sensibilidade a erlotinib no ambiente de superexpressão de AXL. A expressão de AXL L62QM aumentou significativamente a IC50 para XL-880 (Figura 16) e bloqueou a habilidade de XL880 de diminuir pAXL em células HCC827 (Figura 3i). Em contraste à superexpressão de AXL WT, observamos que a expressão de AXL L620M anulou a habilidade de XL-880 (1 μΜ) de restaurar a sensibilidade a erlotinib em células HCC827 (Figura 3h-i). Os dados indicam que o tratamento com o inibidor de AXL XL8 8 0 restaura sensibilidade a erlotinib inibindo a ativação da quinase de AXL nestes modelos NSCLC com EGFR mutante.

Resistência mediada por AXL pode ocorrer com uma EMT

Observamos uma associação entre superexpressão de AXL e marcadores de EMT, incluindo a expressão aumentada de vimentina, em vários modelos de resistência adquirida a erlotinib. Dados recente sindicam que a vimentina pode promover EMT por meio de regulação epigenética de genes que são críticos para EMT em células de câncer de mama. [Vuoriluoto, K. et al. Oncogene 30, 1436-1448 (2011)] Assim, procuramos determinar se a superexpressão de vimentina era necessária para a superexpressão de AXL e resistência a erlotinib em células HCC827. Observamos que o silenciamento de vimentina tanto por siRNAs agrupados quanto por 4 individuais diminuiu, mas não aboliu por completo, a expressão de AXL (Figura 4a). O silenciamento de vimentina e a concomitante regulação negativa de AXL acentuaram a sensibilidade a erlotinib em células ER3 de HCC827 (Figura 4b) . Como foi mostrado que a vimentina promove migração e adesão em células que passaram por uma EMT [Vuoriluoto, K. et al. Oncogene 30, 1436-1448 (2011); Polyak, K. & Weinberg, R. A. Nature reviews. Câncer 9, 265-273 (2009)], examinamos se células ER de HCC827 exibiam migração e adesão aumentadas.

Observamos que as células HCC827 com resistência adquirida a erlotinib (ER3) exibiam migração e adesão aumentadas comparado com células HCC827 parentais (Figura 4c-d). Também observamos que o silenciamento de vimentina, AXL, ou tratamento com XL880 inibiram a migração e adesão em células ER3 de HCC827, mas não tiveram efeito em células HCC827 parentais (Figura 4c-d). Juntos, os dados dão suporte a um possível papel para uma EMT que é marcada por superexpressão de vimentina no desenvolvimento de resistência adquirida a EGFR TKI que é estimulada por AXL neste modelo de câncer de pulmão humano com EGFR mutante. AXL é regulado positivamente em pacientes com resistência adquirida Com base em dados pré-clínicos, elaboramos a hipótese de que a regulação positiva de AXL pode promover a resistência adquirida ao tratamento com EGFR TKI em pacientes com NSCLC com EGFR mutante. Para testar esta hipótese e para validar clinicamente nossos achados pré-clínicos, medimos a expressão de AXL por IHC (imunohistoquímica) em 35 espécimes correspondentes de NSCLC com EGFR mutante obtidos de pacientes tanto antes do tratamento com os EGFR TKIs erlotinib ou gefitinib e depois do desenvolvimento de resistência adquirida a EGFR TKI. Nos casos em que havia material suficiente para estudos adicionais, também examinamos os espécimes para a expressão de GAS6 e vimentina (como um marcador para EMT) por IHC (sistema de cálculo mostrado na Figura 19), EGFR T790M por sequenciamento, e amplificação de MET por FISH. Todos os pacientes na coorte que analisamos tinham ou uma mutação de deleção de éxon 19 ou uma mutação pontual de éxon 21 (L858R) em EGFR, foram tratados com erlotinib ou gefitinib e MET a definição clínica estabelecida de resistência adquirida a EGFR TKI (Tabela 2) . [Jackman, D. et al. Journal of clinicai oncology: official journal of the American Society of Clinicai Oncology 28, 357-360 (2010)] O grupo de amostras clinicas que analisamos continham o espectro completo de alterações principais que sabe ocorrer em paciente com câncer de pulmão com EGFR mutante com resistência adquirida a EGFR TKI. [Engelman, j. A. et al. Science 316, 1039-1043 (2007); Arcila, Μ. E. et ai. Clinicai câncer research : an official journal of the American Association for Câncer Research 17, 1169-1180 (2011); Bean, J. et al., Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007); Sequist, L. V. et al. Sei Transi Med 3, 75ra26 (2011)] De fato, detectamos a mutação EGFR T790M em 8/28 (29%) e amplificação de MET em 6/31 (19%) dos espécimes resistentes examinados (Tabelas 2-3 e Figura 5a, b) . Quando comparados aos espécimes de antes do tratamento, detectamos expressão aumentada (um aumento de 2+ ou mais) de AXL em 7/35 (20%) e GAS6 em 7/28 (25%), e vimentina em 2/10 (20%) dos espécimes resistentes a EGFR TKI avaliados (Tabelas 2-3 e Figura 5a-b). Em 3 casos (#13,14,15) nos quais AXL foi expressa no mesmo nivel nos espécime de linha de base e no correspondente de resistência, detectamos GAS6 aumentado especificamente no espécime resistente (Tabelas 2-3) . Este achado é consistente com a hipótese de que a superexpressão de GAS6 pode promover ativação de AXL no ambiente de resistência adquirida a EGFR TKI em alguns casos. Esta hipótese tem suporte dos nossos dados pré-clínicos mostrando que o silenciamento de GAS6 pode restaurar sensibilidade a erlotinib em algumas sublinhagens ER que também superexpressam AXL (Figura 3c) . De maneira a fornecer validação independente dos nossos achados de IHC de expressão aumentada de AXL e GAS6, realizamos Q-RT-PCR em uma pequena coorte de espécimes de câncer de pulmão com EGFR mutante negativo para mutação T790M com resistência adquirida a EGFR TKI comparados aos espécimes de linha de base correspondentes (η=5). Usando limites de corte estringentes (limite de mudança >3 vezes em níveis de mRNA por Q RT PCR), observamos níveis aumentados de mRNA de AXL e GAS6 quando da resistência em 20% e 60%, respectivamente, destes espécimes. Não encontramos AXL ou GAS6 aumentados no único espécime no qual detectamos expressão de MET aumentada (mudança >3 vezes em mRNA por Q RT PCR) nesta pequena coorte.

Nossa análise dos espécimes clínicos indica que alguns dos NSCLCs com EGFR mutante com resistência adquirida a EGFR TKI podem possuir múltiplos mecanismos de resistência. Consistente com estudos anteriores [Bean, J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007)], nós detectamos a mutação T7 90M de EGFR em 50% dos casos que também possuíam amplificação de MET (Tabelas 2-3). Além disso, observamos co-ocorrência de T790M de EGFR e AXL e GAS6 aumentados na menor parte dos casos (Tabelas 2-3) . Em contraste, não detectamos amplificação de MET em qualquer espécime de resistência que possuía expressão de AXL ou GAS6 aumentado (Tabelas 2-3) . Junto com os dados pré-clínicos, nossos achados sugerem que a ativação de AXL e MET pode ser mecanismos mutuamente exclusivos de resistência adquirida a EGFR TKI em NSCLCs.

Análise dos dados Nós identificamos a ativação da quinase de AXL como um novo mecanismo de resistência adquirida a EGFR TKI em NSCLCs com EGFR mutante através de uma análise integrada de modelos de tumor NSCLC humano com EGFR mutante e uma das maiores coortes de espécimes pareados de NSCLC com EGFR mutante de pacientes tratados com EGFR TKI já reportada até agora. Nossa análise dos espécimes clínicos mostra que a regulação positiva de AXL é o segundo mecanismo mais comum de resistência adquirida a EGFR TKI (depois de T790M de EGFR) em NSCLCs com EGFR mutante que já foi validado usando dados humanos primários. A frequência de T790M de EGFR amostras resistentes a TKI nesta coorte é mais baixo do que previamente reportado. [Engelman, J. A. et al. Science 316, 1039-1043 (2007); Arcila, Μ. E. et al. Clinicai câncer research: an offícial journal of the American Association for Câncer Research 17, 1169-1180 (2011); Bean, J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007); Sequist, L. V. et al. Sei Transi Med 3, 75ra26 (2011)] Dado que o ensaio de sequenciamento que usamos para detectar T790M de EGFR é padronizado e validado, isto provavelmente representa ou uma biologia distinta de resistência a EGFR TKI no ambiente de regulação positiva de AXL ou GAS6 ou que pode haver maior variabilidade na frequência de T790M de EGFR em cânceres de pulmão resistentes a EGFR TKI do que previamente descrito. Importantemente, observamos a regulação positiva de AXL em pacientes que desenvolveram resistência a ambos os EGFR TKIs (erlotinib e gefitinib) que são aprovados clinicamente no mundo inteiro para uso em pacientes com NSCLC. Nossos achados são assim relevantes para a vasta maioria de pacientes com NSCLC com EGFR mutante tratados com um EGFR TKI.

Os dados sugerem que a ativação de AXL pode ocorrer por meio de sua superexpressão bem como através da regulação positiva de seu ligante GAS6 no ambiente de resistência a EGFR TKI em NSCLCs com EGFR mutante. Esta observação é consistente com trabalho recente mostrando que tanto a regulação positiva de MET quanto de seu ligante HGF podem promover resistência a EGFR TKI em alguns NSCLCs com EGFR mutante. [Turke, A. B. et al. Câncer Cell 17, 77-88 (2010)] Nossos dados mostrando que em algumas linhagens de células ER GAS6 não é necessário para resistência a erlotinib são consistentes com trabalhos prévios demonstrando que a superexpressão de AXL pode promover sinalização posterior e induzir transformação na ausência de expressão de GAS6 expression. [Burchert, A., Attar, E. C., McCloskey, P., Fridell, Y. W. & Liu, E. T. Oncogene 16, 3177-3187 (1998)] Trabalhos adicionais serão necessários para elucidar de maneira completa os mecanismos pelos quais GAS6 pode promover resistência a EGFR TKI através da ativação de AXL e se alterações somáticas (amplificações, rearranjos, mutações pontuais) em AXL ou GAS6 ocorrem em NSCLCs humanos com EGFR mutante.

Observamos que em alguns casos a regulação positiva de AXL ocorreu no contexto de uma aparente EMT e que um programa transcricional associado a EMT envolvendo a regulação positiva de vimentina pode, em parte, conduzira superexpressão AXL em células de câncer de pulmão com EGFR mutante resistência adquirida a EGFR TKI. Os dados são consistentes com estudos anteriores nos quais a regulação positiva de vimentina foi associada com superexpressão de AXL em células de câncer de mama. [Vuoriluoto, K. et ai. Oncogene 30, 1436-1448 (2011)] Embora outros mecanismos de ativação de AXL provavelmente existam e terão que ser investigados, nossos dados são consistentes com um modelo no qual AXL pode mediar resistência adquirida a EGFR TKI no ambiente de uma EMT em NSCLCs com EGFR mutante. Células ER de HCC827 que superexpressam AXL exibiram migração e adesão aumentadas, propriedades associadas com EMT e com o comportamento metastático de células tumorais. Estes achados em células de NSCLC com EGFR mutante com resistência adquirida a erlotinib são consistentes com um trabalho anterior mostrando que a superexpressão de AXL está associada com metástase aumentada e prognósticos piores em vários cânceres. [Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S. & Graham, D. K. Expert Opin Ther Targets 14, 1073-1090 (2010)] Contudo, nossos estudos revelaram um papel distinto e especifico para a regulação positiva de AXL na resistência adquirida o tratamento com EGFR TKI em pacientes com NSCLC com EGFR mutante. Nossos dados, portanto, estende o conhecimento atual do papel de AXL como um biomarcador geral de prognóstico em câncer humano e demonstra pela primeira vez que AXL é um biomarcador de resistência adquirida à terapia direcionada para EGFR em pacientes com NSCLC.

Nossa observação de que múltiplos mecanismos de resistência podem contribuir para resistência ao tratamento com EGFR TKI em pacientes com NSCLC com EGFR mutante é consistente com outros estudos recentes. [Bean, J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007); Sequist, L. V. et al. Sei Transi Med 3, 75ra26 (2011)] Nossos dados identificando AXL como um mecanismo de resistência a EGFR TKI amplia nosso entendimento da heterogeneidade dos tumores e dos mecanismos moleculares que governam a evolução da resistência às terapias direcionadas a alvo moleculares em pacientes com câncer.

Nossos dados mostram que a atividade quinase de AXL é necessária para resistência a erlotinib em modelos de tumor NSCLC com EGFR mutante. Esta observação fornece um forte motivo para o desenvolvimento e teste de inibidores de quinase de AXL para uso clinico em pacientes com NSCLC com EGFR mutante para prevenir ou superar a resistência adquirida a EGFR TKI. Os dados pré-clinicos também sugerem que a ativação de múltiplas vias incluindo ΜΆΡΚ, AKT e NF-kB podem promover a resistência a EGFR TKI posteriormente à regulação positiva de AXL. Isto é consistente com trabalhos anteriores mostrando que AXL pode conduzir o crescimento de células cancerosas através da ativação de cada uma destas vias. [Linger, R. M. , Keating, A. K. , Earp, H. S. & Graham, D. K. Expert Opin Ther Targets 14, 1073-1090 (2010); Keating, A. K. et al. Mol Câncer Ther 9, 1298-1307 (2010); Tai, K. Y., Shieh, Y. S., Lee, C. S., Shiah, S. G. & Wu, C. W. Oncogene 27, 4044-4055 (2008)] Trabalhos adicionais serão necessários para determinar qual destas ou de outras vias de sinalização é a mais critica para resistência a EGFR TKI conduzida por AXL em NSCLCs com EGFR mutante. Esses estudos podem identificar pontos adicionais para intervenção terapêutica no ambiente de resistência adquirida a EGFR TKI conduzida por AXL em pacientes com NSCLC com EGFR mutante. Com base nos nossos dados, propomos que a inibição da sinalização de AXL possa acentuar respostas ao tratamento com EGFR TKI em pacientes com NSCLC com EGFR mutante apropriadamente selecionados.

Tabela 1. Resposta ao tratamento com erlotinib em xenoenxertos de tumor HCC827. Dados de 10 tumores por grupo de tratamento são expressos como redução média do volume do tumor, tempo mediano para redução máxima, e tempo mediano para resistência a erlotinib + SEM.

Tabela 2. AXL é regulado positivamente em espécimes de NSCLC humano com EGFR mutante de pacientes com resistência adquirida a EGFR TKI. Características clínicas e expressão dos biomarcadores indicados nos 35 espécimes pareados de NSCLC com EGFR mutante obtidos de pacientes tanto antes do tratamento quanto com resistência adquirida ao tratamento com erlotinib ou gefitinib (PFS mediana = 18 meses, faixa 7-59). NA= não havia tecido suficiente disponível para análise. ACC= adenocarcinoma. NSC= carcinoma de células não pequenas. SqCC= carcinoma de células escamosas. VIM = vímentina.

Tabela 3. Resumo da pontuação dos biomarcadores de resistência nos espécimes pareados analisados na Tabela 2.

Materiais e métodos experimentais Linhagens celulares e reagentes. As linhagens celulares de câncer de pulmão humano foram compradas da American Type Culture Collection exceto por H3255, as células PC-9 foram generosamente fornecidas. As células foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com FBS 10% FBS e Antibiótico/Antimicótico 1χ (Invitrogen) e estavam na fase de crescimento logarítmico no inicio de todos os experimentos. Erlotinib, XL880 (GSK1363089), PHA665752 e MP-470 foram comprados da Selleck Chemicals {Califórnia, EUA) . As drogas foram dissolvidas em DMSO 10 mM e armazenadas em -20 °C. A concentração final de DMSO em todos os experimentos foi de <0,1% no meio. Todos os anticorpos foram comprados da Cell Signaling (Boston, MA) exceto os anticorpos anti-AXX e anti-fosfo-AXL e anti-GASú, os quais foram comprados da R&D Systems (Minneapolis, MN).

Estabelecimento de subclones resistentes a erlotinib. As células foram expostas a concentrações crescentes de erlotinib a cada 3 semanas a partir de 1, 3, 5, 7, e assim por diante até 15 μΜ ao longo de um período de 5 meses. Clonagem de célula única foi realizada usando-se cilindros de clonagem e subclones resistentes a erlotinib foram expandidos com sucesso com meio de cultura de soro bovino fetal 10% contendo erlotinib 1 μΜ. A identidade genética de cada subclone com as células parentais foi verificada por análise de STE (repetições justapostas curtas) de acordo com protocolos estabelecidos.

Crescimento celular e ensaios de viabilidade. As células foram semeadas em uma densidade de 3.000 células/poço em placas com 96 poços em RPMX 1640 contendo FBS 10% em pernoite, e então tratadas com os respectivos agentes por mais 3 dias. Os números de células viáveis foram determinados usando kit de ensaio CellTiterGLO ou MTS, como indicado nas descrições dos desenhos, de acordo com os protocolos do fabricante (Promega, Madison, WI, EUA). Cada ensaio consistiu de 3 poços e foi repetido pelo menos duas vezes. Os dados foram expressos como a porcentagem de sobrevivência do controle calculada a partir da absorbância, e corrigida para o background.

Análise de Western blot. As células foram estarvadas em soro no pernoite e lisados de célula inteira foram preparados usando lise com TCA 10% ou tampão RIPA e clareadas por centrifugação. As proteínas foram separadas por gel de SDS-PAGE 10% e transferidas para membranas PVDF (Invitrogen) para análise de Western blot. Após incubação de anticorpos primários no pernoite, lavagem e incubação com anticorpos secundários, blots foram desenvolvidos com um sistema de quimiolumínescência (Pierce).

Perfilagem de expressão gênica. Perfilagem de expressão gênica com microarranjo foi realizada em triplicata após isolamento de RNA de células ou tumores de xenoenxertos usando o kit Qiagen RNeasy kit de acordo com as instruções do fabricante usando os arranjos AffyMETrix U1333 2.0 plus (ER1, ER2) e analisada como descrito previamente [Chitale, D. et al. Oncogene 28, 2773-2783 (2009); Tai, K. Y., Shieh, Y. S., Lee, C. S., Shiah, S. G. & Wu, C. W. Oncogene 27, 4044-4055 (2008)] ou os arranjos Illumina Human HT12-v3 (ER3) e analisada por Illumina BeadStudio Gene Expression Module v3.2. A análise de bíoinformática foi realizada e os genes foram filtrados para incluir genes com expressão diferencial com base no estabelecimento de um limite de mudança de 3 vezes e um limite de taxa de falsa descoberta (FDR) de 0,1 para a comparação da expressão gênica em linhagens celulares ER com a de células parentais {tratadas com veículo). RT-PCR quantitativo em tempo real. Para a validação dos genes identificados pela perfilagem de expressão gênica, RT-PCR quantitativo em tempo real foi realizado em RNA isolado de células NSCLC. O RNA total foi coletado de células cultivadas usando o kit de purificação de RNA PureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O cDNA foi sintetizado com transcriptase reversa SuperScript III com o uso de iniciadores oligo(dT) (Invitrogen) e RT-PCR foi realizado usando-se LightCycler com sondas Syber green (Roche) usando as seguintes variáveis: desnaturação a 95°C por 10 min, seguida por 45 ciclos de amplificação (95°C 10 s, 60°C 10 s, e 72°C 15 s), e resfriamento para 40°C em uma taxa de transição de 20°C/s. Os níveis de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase ou expressão de actina foram usadas como referência interna para normalizar o cDNA de entrada. As taxas de nível de cada gene como comparadas ao padrão de referência foram então calculadas. As sequências para os iniciadores usados para o Q RT-PCR de AXL e GAS6 são mostrados na Tabela 4. Os iniciadores e sondas usados para o sequenciamento de EGFR e MET e FISH, respectivamente, foram como os previamente publicados. [Bean, J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007); Roseli, R., Wei, J. & Taron, M. Clin Lung Câncer 10, 8-9 (2009)] Silenciamento por siRNA. O silenciamento de AXL, MET e vimentina foi realizado usando siRNAs específicos individuais ou agrupados, como indicado, tendo como alvo os genes indicados comprados da Dharmacon RNAi Technologies (Thermo Scientific, Rockford, IL). siRNAs não específicos SiGENOME serviram como controles negativos. A introdução do siRNA foi realizada com o reagente DharmaFectl de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência do silenciamento em diferentes tempos ou ponto de dose foi avaliado por Q RT PCR ou western blotting em lisados de células. cDNA de AXL e estudos de superexpressão. O gene AXL com uma marcação HA no C-terminal foi amplificado por PCR de sobreposição usando cDNA gerado a partir de células ER3 e clonados em um vetor pcDNA3.1 ( + ) . Mudanças de aminoácidos (K567R ou L620M) foram introduzidas usando o kit Strategene QuickChange Mutagenesis, de acordo com o protocolo do fabricante. A precisão das construções foi confirmada por sequenciamento de DNA. As células foram transfectadas com o vetores que expressam AXL ou vetores vazios como controles usando o reagente FuGENE HD de acordo com o protocolo do fabricante (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN, EUA) . Subclones estáveis de HCC827 resistentes ao antibiótico de seleção, G418 5G0pg/ml foram gerados 24 horas após a transfecção. Células HCC827 que expressavam vetores vazios foram geradas como controle. A expressão de proteína de AXL foi detectada usando sonda anti-HA (Santa Cruz Biotechnology).

Estudos de migração e adesão. 180.000 células foram plaqueadas em placas de cultivo celular de 3,5 cm. Com 30 minutos, as placas foram lavadas e as células foram fixadas e coradas para contagem. Números de células médios de campos de lOOx sub microscópio óptico foram apresentados com ± SEM. Migração: 10.000 células em 200 μΐ de meio sem FBS foram posicionadas na câmara superior de transwells (6,5 mm de diâmetro, membrana de policarbonato com tamanho de poro de 8 μιη, Corning), e a câmara inferior foi preenchida com 1 ml de meio com FBS 10% suplementado com ou sem os tratamentos indicados de drogas. Após incubação por 16 horas, as células que não migraram foram retiradas com hastes de algodão, e as células que migraram para a superfície inferior dos filtros foi corada com cristal violeta. As células foram contadas sob um microscópio, e resultados em triplicata foram expressos com médias ± SEM.

Silenciamento por shRNA. Para os experimentos com shRNA cada shRNA retroviral e lentiviral foi empacotado em células 293FT de acordo com as instruções do fabricante. As linhagens celulares indicadas foram infectadas por spin com brometo de hexadimetrina 1 ug/ml e 48h após a infecção foram selecionadas com 2 pg/ml de puromicina por 48h. A expressão dos genes alvo foi medida por Q RT PCR ou western blot 48-72h depois.

Ensaios de tumorigênese. Células de câncer de pulmão humano (como indicado) foram injetadas subcutaneamente nos flancos de camundongos CB17 SCID (Taconic). Camundongos com tumor (tamanho do tumor 200-500 mm3) foram aleatoriamente submetidos a tratamento com veículo (DMSO/CMC) ou erlotinib HCL 12.5 mg/kg/dia intraperitonealmente. As medidas do tumor foram feitas nos dias indicados e expressas como descrito nas descrições dos desenhos. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Centro de Recursos de Animais de Pesquisa do Memorial Sloan-Kettering Câncer Center.

Análise de índice de combinação (Cl). Os efeitos das combinações foram avaliados com o ensaio MTT com uma razão de 1:1 (erlotinib (pM):XL880 (μΜ) e erlotinib (μΜ) :PHA665752 (μΜ) ) em células ER de HCC827 . Os valores de fração afetada (Fa) (isto é, Fa de 0,25 é equivalente a 75% de células viáveis) e Cl foram processados usando o programa de computador CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, RU) . Valores de Cl de menos de 1, 1, e maiores que 1 foram interpretados como sinergismo, efeito aditivo,, e antagonismo, respectivamente.

Imunoprecipitação. Para a imunoprecipitação, 1 mg de proteína de lisados totais foi misturada 1 pg de anti-AXL (Santa Cruz, CA) , e incubada em gelo por 2 h. Protein G Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, RU) foi adicionada à mistura e incubada no pernoite a 4°C. Complexos imunes foram peletados por centrifugação a 3.000 rpm por 5 min, lavados duas vezes com tampão de lise, e ressuspensos em 70 pl de tampão de amostra SDS-PAGE. Subsequentemente, os complexos imunes foram sondados com anticorpos anti-AXi e de fosfotirosina (Santa Cruz, CA).

Sequenciamento de AXL, EGFR, K-Ras e B-Raf. O sequenciaraento do comprimento completo de AXL e EGFR foi realizado por métodos padrão usando as sequências iniciadoras listas na Tabela 5. O sequenciamento do éxon 2 de K-Ras e dos éxons 11 e 15 de BRAF foi realizado no DNA genômico usando iniciadores e protocolos validados. [Bean, J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007)] IHC em espécimes clínicos de NSCLC. Todos os espécimes foram adquiridos dos paciente sob os auspícios dos protocolos clínicos aprovados pelo IRB em cada hospital nos quais o consentimento informado foi obtido e eram tecidos de tumor embutidos em parafina e fixados em formalina (FFPE) , que foram examinados para garantir >75% de infiltração tumoral, e corados com hematoxilina/eosina e avaliados por um patologista torácico. A IHC foi realizada no Core Research IHC Laboratory em cada instituição nas seções FFPE, como previamente descrito [Brevet, M., Arcila, M. & Ladanyi, M. The Journal of molecular diagnosties: JMD 12, 169-176 (2010)], usando os anticorpos descritos: anticorpo policlonal purificado por afinidade - antígeno de AXL humano, R&D systems, catalog #AF154ÃXL; anticorpo policlonal purificado por afinidade - GAS6 humano, R&D systems, catalog #AB885, anticorpo policlonal purificado por afinidade - vimentina humana, Cell Signaling Technologies, catalog #3932. A expressão foi examinada por imunohistoquímica padrão usando seções com 4Qm de espessura de espécimenes pareados correspondentes. Seções de tecido livres de parafina foram coradas seguindo o protocolo dos fabricantes em uma diluição de 1:500 em um corador automático Ventana Dixcovery XT. Δ mutação T790M de EGFR e amplificação de MET foram analisadas usando sequenciamento e protocolos FISH previamente descritos, [Bean, J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007)] respectivamente, e expressão de vimentina por IHC usando métodos estabelecidos e critérios de pontuação clinica. [Azumi, N. & Battifora, H. American Journal of clinicai pathology 88, 286-296 (1987)] O sequenciamento do éxon 2 de K-Ras e éxons 11 e 15 de B-Raf foi realizado em DNA genômico isolado usando iniciadores e protocolos previamente publicados. [Bean, J. et al. Proc Natl Acad Sei USA 104, 20932-20937 (2007)] Tabela 4. Sequências iniciadoras de Q RT PCR de AXL e GAS6 humanos Tabela 5. Sequências iniciadoras de sequenciamento de DNA de AXL e EGFR humanos É entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui têm apenas propósitos ilustrativos e que várias modificações e mudanças à luz dos mesmos serão sugeridos às pessoas com habilidade na técnica e devem ser incluídos dentro do espírito e abrangência deste pedido e do alcance das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patentes citados aqui estão incorporados por referência em sua íntegra para todos os propósitos.

Claims

1. MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM NÍVEL AUMENTADO DE AXL OU GAS6 em um paciente com câncer, caracterizado por o método compreender: (i) obter uma amostra de um paciente com câncer; e (ii) detectar um nível aumentado de AXL ou GAS6 na dita amostra em relação a um controle.

2. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito paciente com câncer ter um câncer compreendendo células cancerosas com uma mutação de ativação de EGFR.

3. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mutação de ativação de EGFR ser uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21.

4. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método não compreender detectar um nível de um marcador de EMT exceto AXL.

5. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita detecção compreender: (a) contatar a amostra com um agente de ligação a AXL detectável ou agente de ligação a GAS6 detectável; (b) permitir que o dito agente de ligação a AXL detectável e AXL formem um complexo de AXL ou o dito agente de ligação a GAS6 e GAS6 formem um complexo de GAS6; e (c) detectar o dito complexo de AXL ou complexo de GAS 6 .

6. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita detecção compreender detectar um nível de um ácido nucleico de GAS6 ou AXL ou fragmento do mesmo.

7. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita detecção compreender o uso de amplificação de ácido nucleico, um arranjo dos genes, um microarran j o, um macroarranjo, um arranjo de DNA, ou um chip de DNA.

8. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita detecção compreender detectar um nível de uma proteína de GAS6 ou AXL ou fragmento da mesma.

9. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita detecção compreender o uso de um anticorpo, citometria de fluxo, ELISA, espectroscopia de massa, imunofluorescência, ou microscopia de fluorescência.

10. MÉTODO de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o dito anticorpo ser conjugado com uma fração detectável.

11. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender detectar um nível aumentado de AXL.

12. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o nível de AXL ser um nível de mRNA de AXL, proteína de AXL, ou atividade quinase de AXL.

13. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito paciente com câncer ser um paciente com câncer resistente a EGFR TKI, em que o dito paciente com câncer resistente a EGFR TKI tem um câncer que não é um câncer mesenquimal.

14. MÉTODO de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a EGFR TKI ser resistente a gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-272, CP-724714, TAK-285, AST-1306, ARRY334 54 3, ARRY-380, AG-1478, dacomitinib/PF299804, OSI-420/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE788, pelitinib/EKB-569, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, AP26113, ou CO-1686.

15. MÉTODO de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o paciente com câncer resistente a EGFR TKI ser resistente a erlotinib ou gefitinib.

16. MÉTODO de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a EGFR TKI ter um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de fígado, glioblastoma, e astrocitoma-glioblastoma.

17. MÉTODO de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o dito câncer de pulmão ser câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

18. MÉTODO de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o dito câncer ser câncer metastático.

19. MÉTODO de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o dito câncer ser câncer de pulmão de células não pequenas compreendendo EGFR que tem uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21; e em que ainda o câncer é resistente a erlotinib ou resistente a gefitinib em relação a um controle.

20. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UM PACIENTE COM CÂNCER RESISTENTE A INIBIDOR DE EGFR, caracterizado por compreender: (i) obter uma amostra de um paciente com câncer; (ii) detectar um nível aumentado de AXL ou GAS6 na dita amostra em relação a um controle.

21. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ter um câncer compreendendo células cancerosas com uma mutação de ativação de EGFR.

22. MÉTODO de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a mutação de ativação de EGFR ser uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21.

23. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o método não compreender detectar um nível de um marcador de EMT exceto AXL.

24. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ter um câncer que não é um câncer mesenquimal.

25. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a dita detecção compreender detectar um nível de um ácido nucleico de GAS6 ou AXL ou fragmento do mesmo.

26. MÉTODO de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a dita detecção compreender o uso de amplificação de ácido nucleico, um arranjo dos genes, um microarran j o, um macroarran j o, um arranjo de DNA, ou um chip de DNA.

27. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a dita detecção compreender detectar um nível de uma proteína de GAS6 ou AXL ou fragmento da mesma.

28. MÉTODO de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por a dita detecção compreender o uso de um anticorpo, citometria de fluxo, ELISA, espectroscopia de massa, imunofluorescência, ou microscopia de fluorescência.

29. MÉTODO de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o dito anticorpo ser conjugado com uma fração detectável.

30. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ser resistente a gefitinib, erlotinib, cetuximab, lapatinib, panitumumab, vandetanib, afatinib/BIBW2992, CI-1033/canertinib, neratinib/HKI-272, CP-724714, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, ARRY-380, AG-1478, dacomitinib/PF299804, OSI-420/desmetil erlotinib, AZD8931, AEE788, pelitinib/EKB-569, CUDC-101, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, AP26113, ou CO-1686.

31. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ser resistente a erlotinib ou gefitinib.

32. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o dito paciente com câncer resistente a inibidor de EGFR ter um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de figado, glioblastoma, e astrocitoma-glioblastoma.

33. MÉTODO de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o dito câncer de pulmão ser câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

34. MÉTODO de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o dito câncer ser câncer metastático.

35. MÉTODO de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o dito câncer ser câncer de pulmão de células não pequenas compreendendo EGFR que tem uma deleção de éxon-19 ou uma mutação pontual de éxon-21; e em que ainda o câncer é resistente a erlotinib ou resistente a gefitinib em relação a um controle.

36. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por compreender detectar um nível aumentado de AXL.

37. MÉTODO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o nível de AXL ser um nível de mRNA de AXL, proteína de AXL, ou atividade quinase de AXL.