KR101776864B1 - Npffr2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제 및 암 치료용 조성물 - Google Patents

Npffr2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제 및 암 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이 억제 방법, NPFFR2의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전이성 암 진단용 조성물, 및 NPFFR2의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 암의 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 NPFFR2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 NPFFR2 억제제를 포함하는 조성물은 암 세포의 침윤능, 이동능, 콜로니 형성능 등을 저해하여 암의 전이를 억제하고 암 세포 사멸을 유도하므로, 암의 전이 억제, 암의 예방 또는 치료용 조성물로 우수한 효과가 있다. 또한, 본 발명에서는 NPFFR2의 발현과 암 전이와의 상관관계를 확인하였는바, NPFFR2의 발현 수준을 측정함으로써 전이성 암을 진단하거나 암의 전이 억제용 제제를 개발할 수 있다.

Description

NPFFR2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제 및 암 치료용 조성물 {A composition for inhibiting metastasis and treating cancer comprising an inhibitor of NPFFR2}
본 발명은 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이 억제 방법, NPFFR2의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전이성 암 진단용 조성물, 및 NPFFR2의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 암의 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 NPFFR2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 인구의 고령화와 더불어 흡연 인구의 증가 및 대기 오염으로 인해 폐암이 증가하고 있으며, 식생활이 서구화되어 고지방식의 섭취가 일반화되고, 환경 오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다 (한국공개특허 제10-2015-0047995호).
악성 종양은 대부분의 경우 하나의 장기 (폐, 간, 신장, 위, 대장, 직장 등)에서 발생한 후 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이 (metastasis)라 한다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상으로, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 전이에 필요한 새로운 유전 형질을 획득한 후 혈관과 림프선으로 침윤하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착한 후 증식하게 된다. 최근 연구 결과에서 전이와 관련된 유전 형질들이 밝혀지고 있으며, 원발 조직의 유전자 검사를 통해 차후 타 장기로의 전이를 통한 재발 고위험군을 유추할 수 있다 (한국공개특허 제10-2015-0122786호).
악성 종양의 전이에 대한 치료는 국소 치료와 전신 치료로 나누어 볼 수 있는데, 악성 종양의 전이에 대한 치료의 원칙은 종양의 종류와 종양의 전이 부위에 따라 다르다. 전이에 의한 국소 증상이 심하거나, 전이에 대한 수술적 치료가 악성 종양의 자연 경과를 호전시킬 수 있다고 알려진 일부 악성 종양의 경우 전이에 대해 치료 수술 혹은 방사선 치료와 같은 국소 치료 방침을 고려할 수 있다. 일반적으로는 악성 종양에서 전이가 일어난 경우 국소적인 치료보다는 항암 화학 요법과 같은 전신적인 치료를 통하여 전이 부위뿐 아니라 원발 부위의 종양을 함께 치료하는 것이 도움이 된다. 하지만 림프종과 같은 극소수의 종양을 제외하고는 전이가 발생한 악성 종양의 경우 완치의 가능성은 대단히 낮다.
전이가 발생한 악성 종양에 대한 경과는 다양하며, 원발성 악성 종양의 종류와 전반적인 종양의 진행 속도에 따라 경과가 결정된다. 어떤 장기에 전이가 되었느냐에 따라 합병증은 다양하게 발생할 수 있다. 예를 들어, 뇌 전이의 경우 두통, 시야 감소, 구역, 구토 등의 증상이 발생할 수 있다. 골 전이의 경우 골의 통증이 발생할 수 있으며, 병적 골절이 발생할 수도 있다. 골 전이에 동반하여 고칼슘 혈증으로 의식 혼탁이 발생할 수도 있다. 따라서 검진을 통한 종양의 조기 발견 및 원발 종양의 유전자 검사는 전이로 인한 사망률 증가를 예방할 수 있는 방법이다.
현재까지 암 치료를 위해 개발된 약제들은 전신 치료용 주사제나 경구 투여제로서 혈류를 따라 전신에 비특이적으로 작용하여 암세포에 대한 특이성이 낮으며, 약제 투여에 따른 전신적인 부작용이 많아 수술이나 방사선 치료에 비해 부작용이 많이 나타나는 단점이 있다. 한편, 세포 독성을 띄지 않으면서 암 세포의 다른 장기로의 전이를 막을 수 있는 획기적인 신약은 아직 개발되지 않은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 인체에 부작용을 일으키지 않으면서 암의 전이를 억제할 수 있는 항암 제제를 개발하고자 예의 노력한 결과, NPFFR2 억제제가 독성이 없는 범위 내에서 암의 전이를 억제할 뿐만 아니라, 암 세포의 사멸을 유도하는 우수한 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이 억제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 전이성 암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 분리된 생물학적 조직 시료로부터 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 NPFFR2 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 생물학적 조직 시료의 NPFFR2 발현 수준이 정상 대조군의 NPFFR2 발현 수준보다 높을 경우 전이성 암으로 판정하는 단계를 포함하는, 전이성 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 대조군인 암이 발병된 실험동물의 시료로부터 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 실험동물에서 암의 전이를 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 NPFFR2 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 대조군에서 측정된 NPFFR2 발현 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것 보다도 실험군에서 측정된 것이 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 암의 전이 억제용 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2)를 발현하는 분리된 암 세포에 암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보 물질이 처리된 분리된 암 세포에서 NPFFR2 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 NPFFR2 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 암의 전이 억제용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물이다.
본 발명에서 용어 "NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2)"는 G 단백질 결합 뉴로펩티드 수용체 (G-protein-coupled neuropeptide receptor)의 패밀리 멤버로, 뉴로펩티드인 A-18-아마이드 (NPAF) 및 F-8-아마이드 (NPFF)에 의해 활성화 되는 수용체 단백질을 말한다. 상기 NPFFR2는 통증 및 오피오이드 시스템 (opioid system)을 조절하는 것으로 보고된 바 있고, 간 질환, 심혈관계 질환, 신경계 질환 등에 관련이 있는 것으로 알려져 있으나, 암의 전이와 관련해서는 현재까지 전혀 보고된 바 없다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 간암 환자로부터 수득한 간 조직 및 간암을 포함하는 여러 암 세포에서 NPFFR2가 발현되나, 정상 조직에서는 발현되지 않는 것을 확인하였다 (도 1).
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 NPFFR2와 암 전이와의 상관관계를 확인하기 위해 암 세포에 NPFFR2의 리간드 단백질을 처리하거나 (도 2 및 도 3), NPFFR2를 과발현 시켰을 때 (도 6), 암 세포의 침윤능 및 이동능이 증가하는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 결과를 통해 NPFFR2가 발현되어 활성화되는 경우 암 전이 특성이 증가되는 것을 알 수 있었다.
본 발명에서 용어 "NPFFR2 억제제"는 NPFFR2의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 NPFFR2에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식으로, NPFFR2의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 그 활성을 방해함으로써, NPFFR2의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다.
상기 NPFFR2의 억제제는 NPFFR2을 표적으로 하여 NPFFR2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다. 상기 NPFFR2 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로 NPFFR2 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 NPFFR2 단백질 또는 NPFFR2에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 NPFFR2 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 NPFFR2 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA가 될 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 siRNA는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 올리고 뉴클레오티드 및 이의 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 이중 가닥인 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 서열은 상기 NPFFR2 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 NPFFR2 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위 (translocation), 성숙 (maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 한 가지 예는 RNA 중합효소 I을 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 디자인은 NPFFR2의 염기서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "앱타머 (aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3 차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 (modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 NPFFR2에 결합하여 NPFFR2의 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 NPFFR2의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 (knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고 뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서 (dicer)에 의해 절단되면서 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고 뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 NPFFR2에 특이적으로 작용하여 NPFFR2 mRNA 분자를 절단하여 RNA 간섭 (RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 NPFFR2를 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 (in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내 (in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR (polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트 (cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 발명의 NPFFR2에 대한 siRNA는 서열번호 9 (siNPFFR2#1), 또는 서열번호 10 (siNPFFR2#2)의 올리고 뉴클레오티드 및 이의 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 이중 가닥으로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "항체"는 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B세포가 생산해서 체액으로 흘려 보내는 단백질로 항원과 특이적으로 결합하며, 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬 (heavy chain)과 두 개의 경사슬 (light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 그의 N-터미널 말단에 가변영역을 갖고 있다. 각각의 가변영역은 3 개의 상보성 결정부위 (Complementarity determining region: CDR)와 4 개의 구조 형성부위 (framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 NPFFR2 또는 NPFFR2의 리간드 단백질과 결합하여 NPFFR2의 활성을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어 "리간드"는 생분자 (biomolecule)와 복합체를 형성하여 생물학적 반응을 가져오는 물질을 의미하며, "NPFFR2의 리간드 단백질" 또는 "NPFFR2에 대한 리간드 단백질"은 NPFFR2와 결합하여 NPFFR2를 활성화시키거나 활성을 증가시키는 단백질일 수 있다. 구체적으로 상기 NPFFR2의 리간드 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 하며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다. 상기 암은 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로는 고형암이 적합할 수 있으며, 보다 구체적으로는 간암, 폐암 또는 골육종일 수 있다.
또한, 본 발명에서 암은 NPFFR2이 정상 조직보다 과발현된 암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "전이 (metastasis)"는 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 말한다. 하나의 장기에서 시작한 악성 종양이 진행함에 따라 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이라 할 수 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상이라고 할 수 있는데, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 전이가 일어날 수 있다. 새로운 유전 형질을 획득한 종양 세포가 혈관과 림프선으로 침입하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어날 수 있다.
전이가 발생하는 조직에 따라, 간암, 신장암, 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 췌장암 등 각종 암질환이 유발될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전이를 억제하여 암이 퍼지는 것을 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "억제"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암 전이를 억제시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 NPFFR2의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 제작하였고 (siRNA #1: 서열번호 9; siRNA #2: 서열번호 10), 이를 암 세포에 각각 처리하였을 때, 암 세포의 침윤능, 콜로니 형성능이 감소하는 것을 확인하였다 (도 4, 도 5, 도 7). 상기 결과로부터 NPFFR2의 억제가 암 세포의 생존 및 전이 관련 특성을 저해하는 것을 확인하였다. 따라서, NPFFR2의 억제제를 포함하는 조성물은 암의 전이 억제용 조성물로 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이 억제 방법이다.
본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 인간을 제외한 개체일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여함으로써, 간암을 비롯한 암의 전이를 억제할 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 전이성 암의 진단용 조성물이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 분리된 생물학적 조직 시료로부터 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 NPFFR2 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 생물학적 조직 시료의 NPFFR2 발현 수준이 정상 대조군의 NPFFR2 발현 수준보다 높을 경우 전이성 암으로 판정하는 단계를 포함하는, 전이성 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법이다.
본 발명에서 용어, "전이성 암"은 전이될 가능성이 있는 암을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "진단"은 생물학적 조직 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 NPFFR2의 존재 또는 부재를 측정함으로써, 전이성 암 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 또한, "마커 또는 진단 마커 (diagnosis marker)"란 전이성 암 세포 또는 전이성 암 질환을 가진 개체를 정상세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 전이성 암을 가진 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 전이성 암 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 전이성 암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 NPFFR2이다.
본 발명에서 용어, "분리된 생물학적 조직 시료"는 진단하고자 하는 개체의 조직으로부터 분리된 시료를 말하며, 구체적으로 간 조직, 폐 조직, 골 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 NPFFR2 발현 수준을 측정하는 것은 NPFFR2의 mRNA 발현 수준을 측정하거나 NPFFR2 단백질 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
상기 "mRNA 발현 수준 측정"이란 전이성 암을 진단하기 위하여 생물학적 조직 시료에서 전이성 암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 "단백질 발현 수준 측정"이란 전이성 암을 진단하기 위하여 생물학적 조직 시료에서의 전이성 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 본 발명의 NPFFR2의 mRNA에 대한 프라이머 (primer) 쌍, 프로브 (probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 (anti-sense nucleotide)일 수 있으며, 본 발명의 NPFFR2의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인할 수 있다. 다른 일 예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 항체일 수 있다.
본 발명에서는 NPFFR2의 전이성 암 진단 마커로서의 가능성을 확인함으로써, NPFFR2의 수준을 측정하여 간암을 비롯한 암을 진단할 수 있는 효과를 확인하였다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 대조군인 암이 발병된 실험동물의 시료로부터 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 실험동물에서 암의 전이를 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 NPFFR2 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 대조군에서 측정된 NPFFR2 발현 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것 보다도 실험군에서 측정된 것이 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 암의 전이 억제용 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2)를 발현하는 분리된 암 세포에 암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보 물질이 처리된 분리된 암 세포에서 NPFFR2 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 NPFFR2 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 암의 전이 억제용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법이다.
암의 전이를 억제할 수 있는 후보 물질의 부재 하에 세포에서의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 상기 후보 물질의 부재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 암의 전이 억제용 제제로 예측할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 생체 내 (in vivo) 또는 시험관 내 (in vitro)에서 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 후보 물질은 공지된 물질 또는 신규 물질일 수 있으며, 예를 들어 식물 추출물 또는 케미컬 라이브러리 (chemical library)를 통하여 대규모로 스크리닝을 수행할 수 있다. 이를 통해 NPFFR2의 발현 또는 활성을 억제하여 암의 전이를 억제할 수 있는 암의 전이 억제용 제제를 발굴할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물이다.
NPFFR2, 이의 억제제 및 약학 조성물에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 NPFFR2를 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, "예방"은 본 발명에 따른 NPFFR2를 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 NPFFR2를 발현하는 다양한 간암 세포주에서 NPFFR2의 발현 억제 결과 세포 생존이 억제되는 것을 확인하였으며 (도 8), 이러한 세포 생존 억제 현상은 NPFFR2의 억제로 인해 세포 사멸이 증가하기 때문이라는 것을 웨스턴블랏 분석으로 PARP의 분할 형태 증가를 확인함으로써 알 수 있었다 (도 9).
따라서, 본 발명의 NPFFR2 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 암 세포에서 세포 사멸을 유도함으로써 암 세포 생존을 억제하는 효과가 있으므로 암의 예방 및 치료용 조성물로 우수한 효과가 있다.
본 발명의 NPFFR2 억제제를 포함하는 조성물은 암 세포의 침윤능, 이동능, 콜로니 형성능 등을 저해하여 암의 전이를 억제하고 암 세포 사멸을 유도하므로, 암의 전이 억제, 암의 예방 또는 치료용 조성물로 우수한 효과가 있다.
또한, 본 발명에서는 NPFFR2의 발현과 암 전이와의 상관관계를 확인하였는바, NPFFR2의 발현 수준을 측정함으로써 전이성 암을 진단하거나 암의 전이 억제용 제제를 개발할 수 있다.
도 1은 간암 조직 및 다양한 암세포주에서 RT-PCR을 이용하여 NPFFR2의 발현을 확인한 것이다.
도 2는 NPFFR2 리간드 단백질에 의한 간암 세포주의 침윤능을 마트리젤 (matrigel)이 코팅된 트랜스웰을 이용하여 확인한 것이다.
도 3은 NPFFR2 리간드 단백질에 의한 간암 세포주의 이동능을 트랜스웰에서 확인한 것이다.
도 4는 NPFFR2 발현 억제에 의한 간암 세포주의 침윤능을 확인한 것이다.
도 5는 NPFFR2 발현 억제 및 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 따른 간암 세포주의 침윤능을 확인한 것이다.
도 6은 NPFFR2 과발현에 의한 간암 세포주의 침윤능을 확인한 것이다.
도 7은 NPFFR2 발현 억제에 의한 간암 세포주의 생존을 확인한 것이다.
도 8은 다양한 간암 세포주에서 NPFFR2 발현 억제에 의한 생존율을 확인한 것이다.
도 9는 NPFFR2 발현 억제에 의한 간암세포주의 세포사멸 증가를 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 10은 NPFFR2의 장기간 억제가 간암 세포주에 미치는 영향을 확인한 사진이다.
도 11은 소프트 아가 분석을 통해 펩티드에 의해 부착 비의존적 세포 성장 (anchorage independent cell growth)의 증가를 확인한 것이다.
도 12는 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의한 PKC 및 ERK의 활성화를 확인한 것이다.
도 13은 NPFFR2 발현 억제 및 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 따른 MMP2 및 관련 신호전달경로의 발현 변화 확인한 것이다.
도 14는 GNAQ의 활성화에 의한 NPFFR2에 따른 침윤성 조절기능을 확인한 것이다.
도 15는 GNAQ의 활성화에 의한 PKC 활성화 기능의 상실을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 간암 세포주 및 세포배양
사람 간암 세포주는 5 % 이산화탄소와 37 ℃의 조건의 세포 배양기에서 10 % FBS (JRS, CA)와 1 % (w/v) 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, CA)이 첨가된 RPMI (Welgene, Korea) 및 MEM (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였다.
실시예 2: RNA 분리 및 RT- PCR
리보스핀 컬럼 (Ribospin columns, GeneAll, Korea)을 이용하여 RNA를 추출하였고, RNA 농도는 ND-1000 분광광도계 (spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA)를 이용하여 측정하였다. 그리고 Maxime RT PreMix kit (Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 cDNA (complementary DNA)를 합성하였고, Maxime PCR PreMix kit (i-StarTaq; Intron Biotechnology)를 이용하여 RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 수행하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머는 하기와 같다.
NPFFR2 RT-PCR 프라이머, 정방향 5′-TTTTTGTGCATGATGGGAAA-3′ (서열번호 1) 및 역방향 5′-TATTCCCTGGACCAATCCAC-3′ (서열번호 2); NPFFR2 Real time PCR 프라이머, 정방향 5′-ACTGCGAAAAGTAGCTGGAG-3' (서열번호 3) 및 역방향 5'-CTGAAGAGTTTGTGTCCCATTTC-3' (서열번호 4); B2M 프라이머, 정방향 5'-CCTGAATTGCTATGTGTCTGGG-3' (서열번호 5) 및 역방향 5'-TGATGCTGCTTACATGTCTCGA-3' (서열번호 6); β-actin 프라이머, 정방향 5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′ (서열번호 7) 및 역방향 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′ (서열번호 8).
실시예 3: 발현 조절 및 펩티드를 이용한 수용체 활성화
NPFFR2의 발현을 억제하기 위하여 NPFFR2-siRNA#1 (GGAAUAUCUGUCGCAGCUU, 서열번호 9) 및 NPFFR2-siRNA#2 (GGAAUUAGUGAUGGAAGAA, 서열번호 10)를 주문 제작하였고 대조군 siRNA를 구입하였다 (Mbiotech, Seoul, Korea). Lipofectamine RNAi MAX 시약 (Invitrogen, CA)과 Opti-MEM (Invitrogen, CA)을 이용하여 형질전환을 수행하였다.
NPFFR2을 과발현 시키기 위해 Flag이 태깅 (tagging) 되어 있는 MFG-NPFFR2를 클로닝하였다. 템플레이트로 사용할 DNA는 pcDNA3.1-NPFFR2를 기증받아 사용하였다 (Frederic Simonin, Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, France). 293T 세포에 pCMV-VSVG (1 ㎍), pGAG-Pol (2 ㎍)와 MFG 벡터 (2 ㎍)를 동시에 리포좀 (Turbofect, Thermo)을 이용하여 형질주입하고 24 시간 후 배양한 세포배지에 있는 레트로바이러스를 간암세포주에 감염시켜 과발현 세포주를 만들었다.
수용체를 활성화시키기 위한 NPFF는 NH2-Phe-Gln-Pro-Gln-Phe-Leu-Phe-Ala-Gln-Ser 서열에 대한 펩티드 (서열번호 11)를 주문 제작하여 (Peptron,Korea), 2 mM의 농도로 DMSO에 녹여 냉동고에 보관하였다.
실시예 4: 웨스턴블랏 분석
세포를 TNN 완충액 (120 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 % (w/v) NP-40, 1 mM PMSF, 포스파타제 억제제 칵테일 (phosphatase inhibitor cocktail), 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT)으로 용해시켜 원심분리하고 정량하였다. 그 다음 동량의 단백질을 10 % (w/v) SDS-PAGE 겔에서 전기영동하고, 니트로셀룰로스막 (Nitrocellulose membrane, Whatman, Maidstone, UK)에 80 V로 2 시간 이동시킨 후, 상기 니트로셀룰로스막을 TBST에 5 % (w/v) 탈지분유에 넣어 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 항체는 PARP (Cell signaling, Beverly, MA, USA), pERK (cell signaling, Beverly, MA, USA), β-actin (Santacruze, Califonia, USA), MMP2 (H-76)(Santacruze, Califonia, USA), pP38/MAPK (cell signaling, Beverly, MA, USA), pPKAα/βII (cell signaling, Beverly, MA, USA)를 사용하였고, 화학발광 키트 (chemiluminescence kit, Santa Cruz Biotechnology, Califonia, USA)를 이용하여 현상하였다.
실시예 5: 침윤 분석 (Invasion assay)
마트리젤 (matrigel) 침투 분석은 폴리카보네이트 핵공막 (polycarbonate nucleopore membrane, Corning, Corning, NY)을 이용하여, 미리 코팅된 필터 (직경 6.5 mm, 구멍 크기 8 ㎛)에 0.85 ㎍/㎕ 마트리젤을 20 ㎕씩 코팅하였다. 120 ㎕ 무혈청 RPMI로 세포를 현탁시켜 챔버 내부에 배양하고, 챔버 밖은 2 % FBS를 포함한 배지에 NPFF 펩티드나 DMSO를 첨가하여 750 ㎕씩 넣었다. 38 시간이 지난 후, Hemacolor® (Merck, Germany)로 고정 및 염색을 하였고, 침윤되지 않은 세포는 면봉으로 닦아 제거하고, 염색된 침윤된 세포는 현미경으로 구역을 나누어 개수를 세었다.
실시예 6: 상처 치유 및 이동 분석 (Wound healing assay and migration assay)
세포의 이동성은 배양접시를 이용하는 상처 치유 분석과 침윤 분석에 사용된 트랜스웰 (transwell)을 이용하는 이동 분석으로 확인하였다. 이동 분석은 폴리카보네이트 핵공막 (polycarbonate nucleopore membrane, Corning, NY)을 이용하여, 미리 코팅된 필터 (직경 6.5 mm, 구멍 크기 8 ㎛)를 24 웰 배양 접시에 넣고, 120 ㎕ 무혈청 RPMI로 SNU475를 현탁시켜 챔버 내부에 배양하고, 챔버 밖은 2 % FBS를 포함한 배지에 NPFF 펩티드나 DMSO를 750 ㎕씩 넣었다. 38 시간 후 Hemacolor® (Merck, Germany)로 고정 및 염색을 하여, 이동하지 않은 세포는 면봉으로 닦아 제거하고, 구멍을 뚫고 이동한 세포는 구역을 나누어 현미경으로 측정하였다.
실시예 7: 콜로니 형성 분석 (Colony formation assay)
간암 세포주 (SNU739, SNU475)를 1.5 × 105 개로 60 mm 배양 접시에 배양한 후 siRNA를 이용하여 유전자를 24 시간 동안 발현 억제시킨 후에, 트립신으로 세포를 떼어 60 mm 배양 접시에 2 × 103 개의 세포를 배양하였다. 1 주일 정도 지나 콜로니가 형성이 되면 이를 10 % 포름알데하이드 (formaldehyde)로 1 시간 동안 고정시킨 다음, 메탄올에 녹인 0.5 % 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색하였다
실시예 8: 소프트 아가 분석 (Soft agar assay)
노블아가 1 %와 FBS를 포함한 2x RPMI 배지를 동량으로 하여 6 웰 바닥에 1.5 ml 넣어 베이스 아가 (base agar)로 굳히고, 노블아가 0.7 %와 FBS를 포함한 2x RPMI 배지를 동량으로 하여 세포 및 펩티드를 넣어 탑 아가 (top agar)로 6 웰에 1.5 ml 넣어 굳힌 다음, 3 주 후 콜로니 수를 세었다.
실험예 1: 암조직 및 세포주에서 NPFFR2의 발현 확인
본 발명자들은 NPFFR2가 암세포에서 특이적으로 발현되는지 확인하기 위해 정상 간조직, 및 환자의 간암 주변조직과 간암조직 16 쌍에서 NPFFR2의 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, 정상 간조직에서는 NPFFR2가 발현되지 않았고, 다 수의 환자조직에서 암 주변조직 보다는 암조직에서 NPFFR2가 더 높게 발현되는 것을 확인하였다 (도 1 좌측).
나아가, 다양한 간암 세포주 (도 1 우측 상단) 및 기타 암세포주 (도 1 우측 하단)에서 NPFFR2의 발현 수준을 확인한 결과 약 30 %정도의 빈도로 발현이 높은 세포주가 있음을 확인하였다.
실험예 2: NPFFR2의 활성 제어에 의한 암 형질 조절 기능 확인
(1) NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의한 암 형질 조절 기능 확인
NPFFR2 발현과 암의 상관관계를 더욱 규명하기 위해, NPFFR2에 대한 리간드 단백질 (서열번호 11)을 제작하고, 이를 세포에 처리하여 간암 세포주에서 암과 관련한 형질변화를 관찰하였다.
먼저, 마트리젤을 코팅한 트랜스웰 (transwell)에 간암 세포주인 SNU475, SNU449 및 SNU398 세포를 넣고 버튼 배지 (button media)에 NPFFR2 리간드 단백질을 처리하여 침윤능을 관찰한 결과, 모든 간암 세포주에서 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의한 세포 침윤이 현저히 증가하는 것을 확인하였다 (도 2).
다음으로 NPFFR2 리간드 단백질을 간암 세포주에 처리하여 세포의 이동 (migration)이 증가하는지 상처 치유 분석 (wound healing assay) 및 트랜스웰을 이용한 세포 이동 분석 (migration assay)으로 확인하였다. 그 결과 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의해 코팅하지 않은 트랜스웰에서 세포의 이동이 증가하는 것을 확인하였다 (도 3 하단). 또한, 상처 치유 분석에서도 역시 세포의 이동이 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의해 증가하는 것을 확인하였다 (도 3 상단).
(2) NPFFR2 억제에 의한 암 형질 조절 기능 확인
다음으로, NPFFR2의 발현을 억제한 간암 세포주에서 침윤능을 확인하였다. 그 결과, SNU475 세포주에 NPFFR2를 표적으로 하는 세 개의 siRNA를 각각 처리한 경우 모두 침윤이 감소하였고, 이러한 현상은 다른 세포주인 SNU739 및 SNU709에서도 동일하게 관찰되었다 (도 4).
한편, NPFFR2 리간드 단백질은 다른 기전으로 침윤을 조절할 가능성이 있으므로, 리간드 단백질에 의한 침윤능 증가가 siRNA를 이용한 NPFFR2 발현억제에 의해 저해되는지를 확인하고자 NPFFR2 리간드 단백질과 siRNA를 함께 처리하여 간암 세포주의 침윤능을 확인하였다 (도 5). 그 결과, NPFFR2 리간드 단백질에 의한 침윤증가가 siRNA 처리에 의한 NPFFR2의 발현 억제에 의해 저해되는 것을 확인하였다.
상기 NPFFR2 리간드 처리 실험 및 NPFFR2 억제 실험 결과를 종합하면, NPFFR2는 간암 세포주에서 활성화되어 있어 침윤능을 조절하고 있고, 따라서 전이 억제제를 발굴하는데 있어 NPFFR2가 중요한 표적이 될 수 있음을 알 수 있다.
(3) NPFFR2 과발현에 따른 침윤능 확인
NPFFR2를 과발현시키는 세포주를 만들기위하여 NPFFR2를 발현하는 레트로 바이러스를 제작하여 infection 하였다. 그 다음 간암 세포주인 SNU475, Huh7 및 SNU739의 침윤능을 확인하였다. 그 결과, 과발현시키지 않은 세포주에 비해 NPFFR2를 과발현시킨 세포주에서 침윤능이 증가하는 것을 확인하였다 (도 6).
(4) NPFFR2 발현 억제에 따른 세포주 생존 및 세포사멸 확인
다음으로, NPFFR2 발현과 세포 생존능과의 관계를 확인하기 위하여, 간암 세포주 SNU739 및 SNU475에 siRNA를 이용하여 NPFFR2의 발현을 억제한 뒤 (도 7 좌측), 콜로니 형성 분석 (colony forming assay)을 수행하였다 (도 7 우측). 그 결과 NPFFR2 발현이 억제된 세포주에서 세포 생존능이 감소하는 것을 확인하였다. 이 결과는 다양한 간암세포주에서 재현되었다 (도 8). 이를 통해 세포에 존재하는 NPFFR2가 간암 세포주의 생존에도 중요한 기능을 하고 있음을 알 수 있었다. 또한, 발현 억제에 의해 세포사멸 마커인 PARP의 분할 형태가 증가하는 것을 확인하였다 (도 9). 나아가, 장기간의 억제에 의한 세포영향을 보기위해 siNPFFR2#2와 동일한 서열의 shRNA를 렌티바이러스를 만드는 pLKO 벡터에 클로닝하여 세포에 감염시킨 결과 일주일 정도 후부터 세포의 성장이 급격히 느려지면서 세포주가 더 이상 자라지 않는 것을 관찰하였다 (도 10). 상기 결과들은 간암 억제제로 NPFFR2가 중요한 표적이 될 수 있음을 의미하는 것이다.
(5) NPFFR2 리간드 단백질의 부착 비의존적 세포 성장 (anchorage independent cell growth)에 미치는 효과 확인
다음으로, NPFFR2 리간드 단백질이 간암 세포주에서 침윤 외에 암의 다른 형질에도 영향을 주는 지 확인하고자 하였다. 이에, 소프트 아가 분석 (Soft agar assay)을 수행하여 부착 비의존적 세포 성장 능력을 확인한 결과, 3000 개의 Hep3B 세포와 NPFFR2 리간드 단백질을 넣고 배양한 소프트 아가에서 세포의 콜로니 형성이 리간드 단백질을 첨가하지 않은 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다 (도 11). 특히, NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의해 세포분열 속도가 증가하지 않았으나 콜로니 형성이 증가하는 것은 아노이키스 (anoikis)를 회피하는 암의 형질에 NPFFR2가 중요한 기능을 하기 때문인 것으로 파악된다.
실험예 3: NPFFR2의 암형질 관련 조절기전 분석
다음으로, 침윤과 관련한 세포 내 신호전달 기전을 확인하였다. 구체적으로, 신경세포에서 NPFFR2 리간드 단백질에 의해 ERK의 활성화 및 칼슘 유입 (calcium influx)의 증가가 보고된 바 있으므로 이를 확인하였다.
그 결과, 칼슘 신호와 관련된 G 단백질 신호전달 기전에서 PLC-β에 의해 활성화 되는 PKC-α/β의 인산화와 ERK의 인산화가 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의해 모두 증가하는 것을 확인하였다 (도 12).
다음으로 NPFFR2 억제에 따라 상기 신호전달 기전의 변화를 확인하고자 하였다. 그 결과 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의해 증가한 PKC 및 ERK의 인산화는 NPFFR2의 발현억제에 의해 저해되는 것을 확인하였다 (도 13 좌측). 또한, NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의해 MMP2가 증가하는 것을 확인하였으며 증가한 MMP2역시 NPFFR2 발현 억제에 의해 저해되는 것을 확인하였다 (도 13 우측).
실험예 4: GNAQ 활성화에 의한 NPFFR2의 침윤 조절 확인
상기 실험예 3에서 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의해 암 세포에서 칼슘 신호전달 기전이 활성화되는 것을 확인하였으므로, 16 개의 하위 G alpha 중 암과 관련한 신호전달에 작동하는 Gs, Gi, Gq/11 및 G12/13 중 관련성이 있을 것으로 생각되는 인자를 스크리닝하였다. 특히, 칼슘 신호와 가장 관련성이 높은 단백질은 G alpha q/11이므로 이를 먼저 분석하였다.
이를 위해 G alpha11 (GNAQ)이 항상 활성화되어 있는 돌연변이인 GNAQ Q209L 벡터를 확보하여 레트로바이러스 발현 벡터에 다시 클로닝하고, 상기 벡터를 이용하여 간암 세포주에 감염시켜 GNAQ Q209L을 발현시켰다. 그 다음, 상기 GNAQ가 항상 활성화된 세포에 NPFFR2 리간드 단백질을 처리하거나 NPFFR2의 발현을 억제한 뒤 세포 침윤 변화를 확인하였다 (도 14).
그 결과, GNAQ를 활성화시키지 않은 대조군에서는 상기 확인한 결과와 같이 NPFFR2 리간드 단백질 처리 및 NPFFR2의 억제에 따라 암 세포 침윤이 눈에 띄게 변화하였으나, GNAQ가 항상 활성화된 세포에서는 이러한 처리에 따른 침윤 변화가 거의 나타나지 않았다. 이러한 결과는 NPFFR2 신호전달이 GNAQ를 활성화하여 세포 내 영향을 주는 것을 의미하는 것이다.
다음으로, GNAQ가 활성화된 세포주에서 NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의한 PKC 활성화 여부를 확인하고자 하였다 (도 15).
그 결과, NPFFR2 리간드 단백질 처리시 PKC-α, β가 인산화 되었으나, GNAQ 활성화 세포주에서는 증가된 PKC-α, β의 인산화가 더 이상 증가하지는 않는 것을 확인하였다.
결론적으로, NPFFR2 리간드 단백질 처리에 의해 PKC-α/β의 인산화와 ERK의 인산화, 및 활성 MMP2의 수준이 증가하며, NPFFR2의 발현을 억제하였을 때 이들이 반대로 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, NPFFR2 발현에 의한 간암 세포의 침윤능 증가는 PKC-α/β의 인산화와 ERK의 인산화, 그리고 활성 MMP2 수준 증가 등에 의한 것이며, NPFFR2를 억제함으로써 이러한 신호전달 경로를 억제하여 침윤능을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한 이러한 NPFFR2에 의한 침윤능 조절은 GNAQ의 활성화와 관련성이 높음을 확인하였다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명에서는 NPFFR2의 억제를 통해 암 세포의 침윤, 이동, 생존능 등을 억제할 수 있음을 확인하였으므로, NPFFR2의 억제제는 암의 전이 억제, 암 예방 및 치료 용도로 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> A composition for inhibiting metastasis and treating cancer comprising an inhibitor of NPFFR2 <130> KPA151167-KR <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPFFR2 RT-PCR primer-F <400> 1 tttttgtgca tgatgggaaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPFFR2 RT-PCR primer-R <400> 2 tattccctgg accaatccac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPFFR2 Real time primer-F <400> 3 actgcgaaaa gtagctggag 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPFFR2 Real time primer-R <400> 4 ctgaagagtt tgtgtcccat ttc 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M primer-F <400> 5 cctgaattgc tatgtgtctg gg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M primer-R <400> 6 tgatgctgct tacatgtctc ga 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer-F <400> 7 agcgagcatc ccccaaagtt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin primer-R <400> 8 gggcacgaag gctcatcatt 20 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPFFR2-siRNA#1 <400> 9 ggaauaucug ucgcagcuu 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPFFR2-siRNA#2 <400> 10 ggaauuagug auggaagaa 19 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NPFFR2 peptide <400> 11 Phe Gln Pro Gln Phe Leu Phe Ala Gln Ser 1 5 10

Claims (11)

  1. NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물로서,
    상기 NPFFR2 억제제는 NPFFR2 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 NPFFR2 단백질 또는 NPFFR2에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인, 암의 전이 억제용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 NPFFR2 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 NPFFR2 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA인 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 올리고 뉴클레오티드 및 이의 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 이중 가닥으로 이루어진 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암 또는 골육종인 것인, 조성물.
  6. NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이 억제 방법으로서,
    상기 NPFFR2 억제제는 NPFFR2 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 NPFFR2 단백질 또는 NPFFR2에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인, 암의 전이 억제 방법.
  7. NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) mRNA 또는 NPFFR2 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 전이성 암의 진단용 조성물로서,
    상기 NPFFR2 mRNA 수준을 측정하는 제제는 NPFFR2 유전자에 특이적인 프라이머(primer)쌍, 프로브(probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide)이며,
    상기 NPFFR2 단백질 수준을 측정하는 제제는 NPFFR2 단백질에 특이적인 항체인 것인, 전이성 암의 진단용 조성물.
  8. (a) 분리된 생물학적 조직 시료로부터 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 NPFFR2 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 생물학적 조직 시료의 NPFFR2 발현 수준이 정상 대조군의 NPFFR2 발현 수준보다 높을 경우 전이성 암으로 판정하는 단계를 포함하는, 전이성 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. (a) 대조군인 암이 발병된 실험동물의 시료로부터 NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 실험동물에서 암의 전이를 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계;
    (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 NPFFR2 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 대조군에서 측정된 NPFFR2 발현 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것 보다도 실험군에서 측정된 것이 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 암의 전이 억제용 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법.
  10. (a) NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2)를 발현하는 분리된 암 세포에 암 치료 후보 물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보 물질이 처리된 분리된 암 세포에서 NPFFR2 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 NPFFR2 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 암의 전이 억제용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법.
  11. NPFFR2 (Neuropeptide FF receptor 2) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 NPFFR2 억제제는 NPFFR2 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 NPFFR2 단백질 또는 NPFFR2에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Title
Journal of Neurochemistry, 2006, 96, 573-584
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 289, NO. 49, pp. 33754-33766, December 5, 2014

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