CN101993852A - 乳腺干细胞的培养基、培养方法及富含乳腺干细胞的混合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乳腺干细胞的培养基、培养方法及富含乳腺干细胞的混合物。特别地，本发明为了克服现有乳腺干细胞培养方法存在繁琐、乳腺干细胞数量较少等缺点，在基础培养基的基础上通过添加0.1-10ng/ml的雌二醇和1-100ng/ml的生长激素制备了乳腺干细胞专用的培养基，经多种实验方法验证，利用该培养基可高效制备富含乳腺干细胞的细胞混合物，同时很大程度地降低了Sca-1⁺成纤维细胞的含量。本发明的培养基、培养方法为高效地获取乳腺干细胞提供了新的选择。

Description

乳腺干细胞的培养基、培养方法及富含乳腺干细胞的混合物

技术领域

本发明涉及干细胞特别是乳腺干细胞培养专用的培养基、培养方法及富含乳腺干细胞的混合物。特别地，本发明涉及添加了适量雌二醇和生长激素的乳腺干细胞培养专用的培养基、培养方法及富含乳腺干细胞的混合物。

背景技术

乳腺癌是由癌症导致女性死亡中死亡人数最多的恶性肿瘤，而且近年死亡率有持续上升的趋势。乳腺癌死亡率持续上升的原因是没有有效的临床治疗理论和方法。自从1982年Aaronson，Weinberg和Bishop的实验室发现癌基因以来，虽然对由遗传突变导致癌症发生的机制有了深入的认识[1-3]，但并未推动临床治疗肿瘤取得显著的效果。究其原因，人们逐渐认识到，深入研究任何一个细胞组分的功能，不可能对癌症细胞的增值本质有彻底的了解和产生根治癌症的效果。只有站在为什么癌细胞无限增值的这个属性上分析肿瘤，才能对癌症有本质上的认识。肿瘤干细胞正是对上述现实和理论反思的结果，其深入发展必将对肿瘤治疗产生深刻的影响。

现阶段认为肿瘤干细胞是癌症形成和复发的原因。肿瘤不是均一的群体，这些细胞在增值和形成新的肿瘤能力方面有明显的差异：大部分癌症细胞只有有限的增值能力；肿瘤干细胞能够通过自我更新生成肿瘤干细胞和发育成有限增值能力的癌症细胞，是有形成肿瘤能力的细胞。有效的治疗肿瘤，需要消除肿瘤干细胞，否则治疗结束后肿瘤又会复发。越来越多的实验表明，肿瘤干细胞是正常干细胞自我更新机制的紊乱，导致具有自我更新能力的癌细胞扩增和肿瘤的形成。乳腺癌中检测出一些调控自我更新机制的信号通路表达失常，如hedgehog信号通路，notch信号通路，wnt信号通路等[4-6]。分离和鉴定乳腺干细胞和乳腺肿瘤干细胞，分析二者自我更新机制的区别，将为阐明乳腺癌的发生机制和临床治疗奠定基础。

最近多个实验室通过不同的标记物分离出乳腺干细胞，包括有Sca-1，SP细胞，CD24，CD45^-Ter119^-CD31^-CD24⁺CD49f^hi，CD31^-CD45^-Ter119^-CD24⁺CD29^hi，CD24⁺PrP^medendoglin⁺CD49f⁺，ADLH1等[7-13]。不同的实验室在分离乳腺干细胞的过程中使用老鼠的种类，数量和年龄，酶的种类，数量和步骤，是否培养以及培养基都不同。特别是，在上述分离乳腺干细胞的过程中，无论是培养后或者直接从新鲜组织制备乳腺干细胞，均没有提到分离成纤维细胞，而成纤维细胞和乳腺干细胞又有一些共同的标志物，例如CD29、CD49、Sca-1等[8-11，14，15]。由于上述制备过程或者制备细胞的差别，一些标记物在不同的实验室分离乳腺干细胞的效果明显不同，如CD24，Sca-1[7，9-11]。

Sca-1作为筛选乳腺干细胞的标记物具有争议。虽然大量实验表明Sca-1可以在乳腺组织作为干细胞的筛选标志，但发表在nature上的2篇文献显示在老鼠4#脂肪垫种植Sca-1⁺乳腺细胞细胞后没有生长出乳腺组织，认为不是乳腺干细胞的标志[8，9]。

脂肪垫移植实验是验证乳腺干细胞最可信的实验方法[16]。该实验表明，没有经过富集的乳腺细胞至少需要2×10⁴细胞种植后才能生成乳腺组织[17]，而经过标记物筛选后的乳腺干细胞只需要一个就能发育成有功能的乳腺[8，9]。

乳腺球形成实验是近年发展的体外分析乳腺干细胞的方法[10，18]。乳腺球含有自我更新的干细胞，不过大部分细胞是已经分化的乳腺细胞。通过在无血清的培养基培养筛选的乳腺细胞7天后，根据形成的乳腺球的个数判断乳腺干细胞的数量。

分化培养实验是根据乳腺干细胞在基质胶中分化成腔上皮和肌上皮细胞的能力判断是否具有干细胞的功能。经过在基质胶中诱导培养后，乳腺腔上皮前体细胞可以生成腺泡样结构(acinus-like structure)，肌上皮前体细胞可以形成实体圆形结构(solid spherical structure)，乳腺干细胞则可以形成管泡状结构(ducatal-acinaermorphology)[18]。

如上所述，分离和鉴定乳腺干细胞和乳腺肿瘤干细胞是阐明乳腺癌的发生机制和探索有效临床治疗方法的先决条件。但截至目前现有乳腺干细胞分离、筛选方法均存在一些需要解决的问题。

乳腺干细胞的分离不但和筛选的方法有关，而且和鼠的种类和年龄，乳腺细胞的制备过程，培养时间以及培养基等有关。

尽管不同的实验室通过不同的分离方法都可以成功制备乳腺干细胞，但多步骤、多种酶长时间的消化过程，影响了乳腺干细胞的研究进展。如，2003年Sleeman等人的方法[7]，2006年Shackleton等人的方法[8]，2006年Stingl等人的方法[9]。

上述制备乳腺干细胞的共同缺点是：1)没有建立一套规范的提取乳腺干细胞的实验流程，不同的实验室使用不同的方法；2)不同的实验室使用鼠龄不同，消化过程中酶的种类，浓度和时间也不同；3)各实验均是先用胶原酶消化，分离出乳腺器；4)细胞在筛选前都没有经过培养；5)实验均没有去除成纤维细胞，而文献报道成纤维细胞表达一些乳腺干细胞的标志，如CD29，Sca-1等[19，20]。上述制备乳腺干细胞的特点可能造成乳腺干细胞在数量，标志和等级性等方面存在差别。

已经有实验室建立了相对简单的制备乳腺干细胞的方法，如Liao等人[10]，Dey等人[21]公布的方法。这两种制备乳腺干细胞的方法比较简单，而且通过培养后可以去除一些悬浮的细胞，减少在标记筛选中由于抗体结合对乳腺干细胞的影响。不过，作者并没有分析培养基对培养细胞种类的影响，而据观察，乳腺类器官小体在培养过程中，使用基础培养基(the basic medium，BM)[35]和乳腺上皮培养基(mammary epithelial cell medium，MaECM)后成纤维细胞的含量差别很大，由于成纤维细胞和乳腺干细胞含有多个相同的标志物，因此，培养基可能影响乳腺干细胞筛选后的纯度，使获得的乳腺干细胞的纯度仅在12％左右[34]。

因此，迫切需要优化乳腺干细胞的培养基并建立简单、有效和快速地制备乳腺干细胞的方法。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于获取经简便的培养后纯度尽量高的乳腺干细胞，并尽量降低Sca-1⁺成纤维细胞的含量。

因此，本发明的第一方面涉及一种基于基础培养基的哺乳动物包括人乳腺干细胞专用培养基，其中基础培养基的成分为58％DMEM/F12+40％MCDB-201、2％-10％胎牛血清、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸、1×亚油酸-牛血清白蛋白，10^-4-10^-2M抗坏血酸，1-100ng/ml EGF、1-100ng/ml PDGF、500ng-1mg/ml氢化强的松、100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素，其特征在与还包含下述组分：

a)0.1-10ng/ml的雌二醇，及

b)1-100ng/ml的生长激素，

优选地，所述雌二醇的浓度为0.3-3ng/ml，生长激素的浓度为10-100ng/ml，更优选地，所述雌二醇的浓度为0.3-1.5ng/ml，生长激素的浓度为10-50ng/ml，最优选地，所述雌二醇的浓度为1.5ng/ml，生长激素的浓度为50ng/ml。

本发明的第二方面涉及一种哺乳动物包括人乳腺干细胞的培养方法，其特征在于所述培养方法包括下述步骤：

a)无菌条件下取未孕鼠乳腺脂肪垫或手术切除的未孕人乳腺脂肪垫，

b)置于含有5-10％双抗的D-hanks液中，在D-hanks液中洗涤2次，用剪刀把组织完全剪碎，加入同体积0.2％的II型胶原酶，在37℃环境中消化大约50分钟，15分钟间隔摇动一次，

c)消化完毕后加入D-hanks液，充分吹打为单细胞悬液，离心并吸取上清液中脂肪样物质，然后用权利要求1-6任一项所述的培养基重悬细胞洗涤一次，接种在组织培养皿中，48小时内切勿移动摇晃，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，在2，4和6天换液各换液一次，及

d)培养6天后，胰酶消化并吹打细胞，过滤、离心，收集细胞，用于磁珠筛选Sca-1阳性的乳腺干细胞。

本发明的第三方面涉及根据本发明第二方面所述培养方法获得的细胞混合物，其中所述细胞混合物中Scal-1⁺乳腺干细胞亚群占Scal-1⁺细胞的比例为30-55％，优选地，所述细胞混合物中Scal-1⁺乳腺干细胞亚群占Scal-1⁺细胞的比例为40-53％，最优选地，所述细胞混合物中Scal-1⁺乳腺干细胞亚群占Scal-1⁺细胞的比例为51-53％。

具体而言，由于分离和鉴定乳腺干细胞和乳腺肿瘤干细胞是分析二者自我更新机制的区别及阐明乳腺癌发生机制和临床治疗的基础，而现有的乳腺干细胞培养的方法均没有建立一套规范的提取乳腺干细胞的实验流程，不同的实验室使用不同的方法，不同鼠龄的鼠，不同的消化酶、酶浓度和消化时间，而且现有方法均是先用胶原酶消化，分离出乳腺器，细胞在筛选前都没有经过培养，也没有去除被误选的成纤维细胞，因此，造成现有方法获得的乳腺干细胞在纯度、标记等方面均存在很大变量，不利于乳腺干细胞的研究和应用。本发明人发现，在初步的乳腺器官样小体培养中，经过使用BM培养基培养后，乳腺器官样小体形成的克隆样结构很小，而克隆样结构四周有大量的呈梭状的纤维母细胞。为了克服这个问题，本发明人探索了将不同量的雌二醇和生长激素添加到所述BM培养基并用该培养基培养分离的乳腺器官样小体后，对最终获得的乳腺干细胞纯度的影响。发明人惊奇地发现，利用添加了1.5ng/ml雌二醇和50ng/ml生长激素的BM培养基培养(称为MaECM培养基)6天后形成的克隆样结构体积很大，克隆之间几乎没有成纤维细胞，适合乳腺上皮细胞的生长，Sca-1⁺乳腺细胞具有发育成乳腺结构的潜能，Sca-1⁺细胞具有分化成有分泌功能的腔上皮和肌上皮的能力，Sca-1⁺细胞形成乳腺球的能力(自我更新能力)，Sca-1⁺细胞具有干细胞抗放射的特点，乳腺干细胞的表面标志，与乳腺早期发育和干细胞自我更新有关的基因在Sca-1⁺细胞表达均升高，本发明所述方法获得的细胞混合物中Scal-1⁺乳腺干细胞亚群占Scal-1⁺细胞的比例为30-55％，优选地，所述细胞混合物中Scal-1⁺乳腺干细胞亚群占Scal-1⁺细胞的比例为40％-53％，最优选地，所述细胞混合物中Scal-1⁺乳腺干细胞亚群占Scal-1⁺细胞的比例为51％-53％。即，本发明建立的MaECM培养基能够促进乳腺干细胞的增值和抑制Sca-1⁺成纤维细胞的生长，适合乳腺干细胞的研究，系统的实验也证明了MaECM培养基培养后筛选的Sca-1⁺乳腺上皮细胞具有乳腺干细胞的潜能和特点。

本发明的乳腺干细胞专用培养基、培养方法及获得的富含乳腺干细胞的混合物可以广泛用于乳腺干细胞研究和应用领域，为高纯度乳腺干细胞的获取提供一种简单高效的系统，获得的富含乳腺干细胞的混合物在乳腺癌的治疗也存在潜在的治疗价值。

附图说明

图1：使用不同的培养基培养的各种细胞形态。a、b、c分别是使用BM培养基培养2、4和6天后的细胞形态，可以看出随着培养时间的延长，成纤维细胞增加，乳腺器官样小体形成的克隆样结构很小；d是使用MaECM培养基培养6天后的细胞形态，形成的克隆样结构很大，克隆之间几乎没有成纤维细胞。e是V型基础培养基培养的乳腺细胞，克隆结构没有平滑的边缘，细胞形态发生改变。

图2：BM培养基培养5天后成纤维细胞Sca-1的表达。可以观察到，大部分成纤维细胞都是Sca-1⁺细胞。a：Hoechst33342染色，b：anti-Scal-FITC染色，c：ab图像组合。

图3：流式细胞术分析磁珠筛选后Sca-1⁺细胞在Sca-1⁺和Sca-1^-乳腺细胞群的纯度。a：Sca-1⁺细胞在Sca-1^-乳腺群细胞中占5％；b：Sca-1⁺细胞在Sca-1⁺乳腺群细胞中占92％。Sca1-pos：Sca-1⁺细胞；Sca1-neg：Sca-1^-细胞；control：对照组。

图4：移植实验。1×10⁴Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞种植后4-6周整体染色。a是8周正常小鼠的乳腺，用于和移植实验后乳腺对比。b、c和d是Sca-1⁺细胞群移植后乳腺结构。b箭指形成的单个乳腺结构(mammary outgrowth)，可以看到在一个脂肪垫中有多个中心的乳腺结构。c箭是在高倍镜下单个的乳腺结构。d箭头指的是肌上皮细胞，箭指的是腔上皮细胞。e指Sca-1^-细胞群种植后没有形成乳腺结构。

图5：乳腺球形成实验(mammosphere-forming assay)。30,000个Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞在超低粘附板中培养6天后形成的乳腺球形态和数量。A(40×)和b(100×)是Sca-1⁺细胞群细胞形成的乳腺球，c(100×)是Sca-1^-细胞群细胞形成的乳腺球。

图6：乳腺球形成实验。30,000个Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞形成的乳腺球数量。(P＜0.01，Sca-1⁺ vs Sca-1^-)。Sca1-positive：Sca-1⁺细胞；Sca1-negative：Sca-1^-细胞；sphere：球；cell type：细胞类型。

图7：分化培养实验。1000个Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞种植在100ul基质胶中，诱导培养2周形成的细胞形态。a、b、c和d是Sca1+细胞群细胞形成的形态。a是在明场下照相，可以看出主要是腺泡状结构，偶尔有管泡状结构；b是腺泡样结构；c圆形的实体结构；d复杂的管泡状结构；e和f是Sca1-细胞群细胞培养后没有发现上述结构。b、c、d和f是HE染色。

图8：ELISA法测定分化培养实验中分泌奶中主要蛋白酪蛋白(casein)。Sca-1⁺细胞群细胞种植在基质胶中诱导培养2周，取10和14天上清，和14天的基质胶，分析酪蛋白的含量。可以看出随着培养时间的延长，分泌的酪蛋白逐渐增加。^*，P＜0.05。casein expression by Elisa：Elisa法测定酪蛋白的表达。Concentration：浓度；gel：胶。

图9：照射实验。乳腺细胞培养5天，2Gy射线照射，24小时候后流式细胞术分析Sca-1⁺细胞的比例。图a是没有照射的Sca-1⁺细胞的比例；图b是2Gy照射后Sca-1⁺细胞的比例。Control：对照。

图10：照射实验。0Gy和2Gy照射后Sca-1⁺细胞在所有细胞中的比例。(P＜0.05，0Gy vs 2Gy)。

图11：real-time PCR分析Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞基因表达的差别。a是乳腺干细胞标志CK6和K14，乳腺早期发育基因Fgf10和Tbx3在Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞的表达差别。b是乳腺干细胞自我更新因子Notch1和Notch4及下游靶基因Hes1和Hey1在Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞的表达差别。(P＜0.01，Sca-1⁺vsSca-1^-)。Sca1-positive：Sca-1⁺细胞；Sca1-negative：Sca-1^-细胞。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1乳腺器官样结构(mammary organoid)的分离与培养

本实实例及下述实施例中所使用的C57BL/6小鼠均购于中国医学科学院动物所，所有动物实验均按照中国医学科学院动物管理条例执行，在无菌条件下饲养。

取4只8-10周的C57BL/6未孕鼠，75％酒精中消毒3-5分钟，无菌条件下打开腹腔，用剪刀取出乳腺脂肪垫，置于10ml含有5-10％双抗的D-hanks液中。在D-hanks液中洗涤2次，用剪刀把组织完全剪碎，加入同体积0.2％的II型胶原酶，在37℃的环境中消化大约50分钟，15分钟间隔摇动一次。消化完毕后加入D-hanks液，用移液器把消化后的组织充分吹打为单细胞悬液，1200转/分离心10分钟后，用移液器吸取上清液中脂肪样物质，然后用培养液重悬细胞洗涤一次。接种在100mm的组织培养皿中，48小时切勿移动摇晃。在37℃，5％CO₂的培养箱中培养，在2，4和6天换液各换液一次。培养6天后，使用0.05％胰酶消化10-15分钟，使用移液器吹打细胞，40um筛网过滤，1200转/分离心10min收集细胞，用于磁珠筛选Sca-1⁺乳腺干细胞。

实施例2乳腺器官样结构培养基的选择

由于在初步的乳腺器官样小体培养中，发现经过使用BM培养基(58％DMEM/F12+40％MCDB-201、2％-10％胎牛血清(FCS)、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleicacid-bovine serum albumin，LA-BSA)，10^-4M-10^-2M抗坏血酸，1-100ng/ml EGF、1-100ng/ml PDGF、500ng-1mg/ml氢化强的松、100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素)培养后，乳腺器官样小体形成的克隆样结构很小，而克隆样结构四周有大量的呈梭状的纤维母细胞。因此如何调节培养基促进乳腺上皮的增值和抑制基质细胞的增加，是摆在面前的一个挑战。根据常识，随着青春期发展，乳腺组织中实质细胞的比例不断增加，间质组织的比例降低，因此推断雌激素可能在调节上述培养基中发挥作用。Lyon等的经典实验说明诱导乳腺导管生长的最少需要雌激素，生长激素和肾上腺皮质激素的组合[22]。所以就观察不同浓度的上述因子对乳腺细胞和基质细胞的影响，如下：

I型基础培养基(the basic medium，BM培养基)A：58％DMEM/F12+40％MCDB-201、2％胎牛血清(FCS)、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovineserum albumin，LA-BSA)，10^-4M抗坏血酸，1ng/ml EGF、1ng/ml PDGF、500ng/ml氢化强的松、100tg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素；

I型基础培养基(the basic medium，BM培养基)B：58％DMEM/F12+40％MCDB-201、10％胎牛血清(FCS)、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovineserum albumin，LA-BSA)，10^-2M抗坏血酸，100ng/ml EGF、100ng/ml PDGF、1mg/ml氢化强的松、100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素；

I型基础培养基(the basic medium，BM培养基)C：58％DMEM/F12+40％MCDB-201、2％胎牛血清(FCS)、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovineserum albumin，LA-BSA)，10^-4M抗坏血酸，10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF、500ng/ml氢化强的松、100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素；

II型基础培养基：BM培养基；Estradiol，0.3ng/ml；growth hormone，10ng/ml；

III型基础培养基：BM培养基；Estradiol，0.75ng/ml；growth hormone，25ng/ml；

IV型基础培养基：BM培养基；Estradiol，1.5ng/ml；growth hormone，50ng/ml；(即MaECM培养基：Estradiol，0.1-10ng/ml；growth hormone，1-100ng/ml)；

V型基础培养基：BM培养基；Estradiol，3ng/ml；growth hormone，100ng/ml。

乳腺器官样小体在三种类型的BM培养基培养6天后差别不大，观察到在第二天只有很少的成纤维细胞，到第六天乳腺器官样小体形成的克隆样结构周围布满大量的成纤维细胞。乳腺器官样小体形成的克隆样结构很小，形成的乳腺细胞也少(见图1)。

乳腺器官样小体在IV型基础培养基培养条件下，培养6天后观察到形成克隆样结构体积很大，克隆之间几乎没有基质细胞。由于该培养基培养的细胞几乎都是乳腺细胞，几乎不含有成纤维细胞，适合乳腺上皮细胞的生长，所以称该培养基为乳腺上皮细胞培养基(mammary epithelial cell medium，MaECM)(见图1)。

乳腺器官样小体在II型和III型基础培养基培养条件下，随着雌激素浓度的升高，成纤维细胞逐渐减少，乳腺器官样小体形成的克隆样结构逐渐增加。

乳腺器官样小体在V型基础培养基培养条件下，尽管没有观察到成纤维细胞，不过，由于形成的克隆样结构边缘模糊，没有明显的规则，细胞形态也发生了改变，所以使用IV型基础培养基作为乳腺上皮细胞培养的条件。

实施例3直接免疫荧光染色分析成纤维细胞Sca-1表达

制备的乳腺器官样小体置于6孔板中放置的盖玻片上，在BM培养基中培养6天后，做下述的免疫荧光实验。

1：PBS洗3次，每次5分钟；

2：90％乙醇-20℃固定10分钟；

3：PBS洗3次，每次5分钟；

4：用含10％正常阻断血清的PBS孵育20min；

5：PBS洗涤(去掉即可)；

6：使用直接标记的一抗FITC-Sca-1孵育60mins(溶解在含1.5％正常阻断血清或1％BSA的PBS中)，浓度是1ug/ml；

7：PBS洗3次，每次5分钟；

8：1ug/ml Hoechst3342，染色2min；

9：PBS洗3次，每次5分钟；

10：50％甘油的PBS封片；

11.荧光显微镜观察拍照。

由于在肺组织内发现有Sca-1⁺成纤维细胞[23]，分析了在BM培养基培养5天后形成的成纤维细胞是否表达乳腺干细胞的标志Sca-1。实验表明，乳腺类器官样小体在BM培养基培养5天后，在类器官样小体形成的克隆样结构周围有很多成纤维细胞，而且大部分成纤维细胞表达Sca-1。考虑到形成大量的Sca-1阳性的成纤维细胞(见图2)，认为BM培养基不适合作为乳腺干细胞的培养基。

实施例4磁珠筛选Sca-1+乳腺亚群细胞

实验步骤如下：

1：单细胞悬液以1×10⁸/ml溶解在磁珠分选推荐液(PBS+2％FBS+1mMEDTA)中，放置在5ml聚丙烯酰胺离心管中。如果样本少于1×10⁷细胞，则悬浮在100ul磁珠分选推荐液中。

2：以50ul/ml加Sca-1PE labelling reagent，充分混匀，室温放置15分钟。

#用1ml加样器吹打混匀试剂和加试剂后的样本。

3：以70ul/ml加easysep PE selection cocktail，充分混匀，室温放置15分钟。

#用1ml加样器吹打混匀试剂和加试剂后的样本。

4：用加样器充分混匀磁性纳米颗粒试剂，吹打5次，以50ul/ml加磁性纳米颗粒试剂，充分混匀，室温放置10分钟。

#用1ml加样器吹打混匀试剂和加试剂后的样本。

5：离心管中加磁珠分选推荐液至2.5ml，用移液枪上下轻轻混匀2-3次。在磁石上放置离心管(无帽)，室温5分钟。

#用加样器轻轻混匀，切勿用力。

6：手握磁石，以连续的方式倒掉离心管中的上清，保持2-3秒。

#不要晃或者倒掉离心管嘴处的液体。

7：从磁石中拿出离心管，加入磁珠分选推荐液2.5ml，用加样器上下轻轻混匀2-3次。在磁铁上放置离心管(无帽)放置5分钟。

8：重复步骤6和7两次，拿出离心管，加入使用的培养液，吹打，作为Sca-1⁺乳腺细胞群。

9：收集上清液，重复步骤6和7四次，上清液离心，作为Sca-1^-乳腺细胞群。

乳腺器官样小体在MaECM培养基中培养6天后，经过mouse Sca-1 selectioncocktail试剂盒筛选，立即在流式细胞仪FACSVantage分析Sca-1⁺细胞在Sca-1⁺和Sca-1^-乳腺群中的比例。结果显示，Sca-1⁺乳腺细胞群在Sca-1⁺细胞的比例约为92％，Sca-1^-乳腺细胞群在Scal-1⁺中的比例约是5％。在2002年报道Sca-1具有富集乳腺前体细胞作用的文献中，通过磁珠筛选分离Sca-1⁺和Sca-1^-乳腺细胞群，流式细胞术结果表明Sca-1⁺和Sca-1^-乳腺群细胞在Sca-1⁺细胞的比例分别是86％和7％，因此判断Sca-1细胞在Sca-1⁺和Sca-1^-乳腺细胞群的纯度可以用于后述的实验(见图3)。

实施例5清除脂肪垫乳腺实验

种植新的乳腺干细胞的时候，必须首先清除掉受体数的乳腺。方法如下：

1：70％酒精消毒手术台。

2：4只21天的雌性C57BL/6小鼠注射戊巴比妥钠，注射量按1ug/g(药物/老鼠体重)计算，麻醉在30-60秒内发挥作用，保持45-60分钟。

3：将麻醉好的鼠固定在手术台上，腹侧向上。

4：用70％酒精消毒小鼠双侧腹股沟区域。

5：定位4#和5#乳腺头(nipple)。

6：在4#乳腺头之间开始向下做1-1.5厘米的中线切口；刀锋呈垂直方向而不要用水平方向或者其他角度；沿胸骨方向切开，注意不要损伤腹腔肌肉系统。

7：从4#乳腺头中线点开始做有角度的侧切，在4#和5#乳腺头之间中点终止，使切口看起来像一个倒Y。

8：使用手指和辅料使皮肤和体壁分开；固定皮瓣向后露出4#和5#脂肪垫。

9：烧灼4#乳头，血管和淋巴结的结合处，4#和5#脂肪垫之间的血管(烧灼三角)。

10：使用Iris剪刀仔细清除烧灼形成的三角区。3-4周小鼠乳腺发育还没有超过淋巴结长入4#和5#脂肪垫内。清除上述三角区域，将会生成一个清除4#乳腺的脂肪垫，组织移植后，生长不会受到宿主乳腺的干扰。

11：确信乳腺脂肪垫上的切口准确，无菌。

12：重复清除对侧乳腺。

实施例6乳腺移植实验

方法如下：

1：磁珠筛选的Sca-1⁺细胞群和Sca-1^-细胞群悬浮在含0.04％台盼兰和50％血清的PBS中，浓度是1×10⁴细胞/10ul，种植在4只21天清除乳腺脂肪垫的C57BL/6雌鼠双侧4#脂肪垫上。

2：移植实验使用45度jeweler镊子移动组织；种植细胞使用100ul Hamilton注射器。

3：使用jeweler镊子轻轻剥离乳腺脂肪垫，注射10ul的细胞，对侧重复移植。

4：用缝线缝合皮肤；一般需要4针；腹壁和皮肤不要接触，所以要小心；皮肤边缘尽量要对准。

5：耳朵标记，置于清洁笼中。

6：如果老鼠过度麻醉，例如浅呼吸，置于干净笼中，用加热灯保持温度，注意灯别太靠近，用纸巾盖上。

7：醒后给水给食。

手术清除21天雌性C57BL/6受体鼠的4#乳腺，取1×10⁴磁珠筛选的Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群种植在4#乳腺脂肪垫上，各种4只，双侧种植。其中1只Sca-1^-细胞群种植的鼠死亡。4周后交配，在怀孕17天后切除脂肪垫，通过卡红和HE染色分析结果。在Sca-1^-细胞群种植的6个鼠脂肪垫中，没有发现有乳腺结构生成。在Sca-1⁺细胞群种植的8个鼠脂肪垫中，发现有6个生长出乳腺结构(表1)。这些移植生长的乳腺结构(图4b，c和d)和正常小鼠的乳腺结构(图4a)明显不同：有多个乳腺生长中心，管状结构在脂肪垫的不同位置方向不同，管状结构没有从脂肪垫的一侧生长，高倍镜下可以观察到独立的管泡状结构(图4c)，HE染色可以观察到乳腺腔上皮和肌上皮细胞(图4d箭和箭头所指)。脂肪垫移植实验是自1959年Deome发明后标准的分析乳腺干细胞的方法[24]。上述实验结果说明Sca-1⁺细胞具有发育成乳腺结构的潜能。

表1：移植试验。1×10⁴Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞种植后可以形成乳腺结构的脂肪垫数目。

实施例7麻醉实验

方法如下：

1：注射剂量：0.9％。

2：折射方式：腹腔注射。

3：捉鼠方式：轻提小鼠尾部，使其前爪置于笼上，用拇指和食指抓住颈部皮肤稳定头部，拉紧尾部，腹部向上，用小指固定尾部。

4：正确注射方式：注射器内加入准确体积麻药，在腹部左下1/4处注射；注射针应垂直进入皮肤，大约在骨盆和胸骨的一半距离，靠近中线的部位，防止刺破膀胱；轻轻回吸无血，注射。

5：补救措施：注射完毕后，放入鼠笼，观察药效。如果麻醉作用不好，补充注射。

6：观察麻醉效果：小鼠没有自主运动，使用镊子加紧鼠脚没有条件反射，表示麻醉起作用。

实施例8乳腺整体染色(whole mount staining)

方法如下：

1：小鼠种植4-6周后，手术切除4#腹股沟部乳腺，放在盖玻片上，用钝镊子使其尽量铺展，和机体位置保持一致。

2：立即放入Kahle固定液中，至少固定4小时(过夜更好)。

3：70％酒精洗涤15分钟。

4：慢慢放入蒸馏水中，洗涤15分钟。

5：使用卡红液染色30-60分钟，依据脂肪垫的厚度时间不同。

6：70％酒精洗涤15分钟。

7：95％酒精洗涤15分钟。

8：100％酒精洗涤15分钟。

9：二甲苯中浸泡去除脂肪。浸泡时间依据脂肪垫厚度时间也不同，从几个小时到几天不等，一般是1天半。

10：树胶封片，照相。

11：判断乳腺移植成功的标准：a：在脂肪垫上可以观察到生成多个乳腺结构；b：乳腺结构起源于脂肪垫中，而不是起源于脂肪垫的一侧；c：乳腺结构的管泡状结构方向不同。乳腺移植失败的标准：a：没有乳腺结构生成；b：乳腺结构起源于脂肪垫的一侧；c：乳腺管状结构来源于大的分支，方向相同。

实施例9HE染色

方法如下：

1：整体染色照相后的样本浸泡在二甲苯中5分钟，2次，去除固定液。

2：转移至二甲苯∶石蜡(1∶1，60℃)中。

3：脱蜡：依次为二甲苯两次各15分钟，100％酒精两次各5分钟，95％酒精两次各3分钟，90％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，蒸馏水。

4：麦氏苏木素染色10分钟，流水冲洗3-5分钟。

5：0.5～1.0％盐酸酒精(1ml浓盐酸，99ml 70～95％酒精)3秒，自来水冲洗3～5分钟。

6：弱碱性溶液-氨水(50ml蒸馏水加入6滴氨水)显蓝30秒，自来水冲洗3～5分钟。

7：依次70％酒精3分钟，80％酒精3分钟，90％酒精3分钟。

8：根据实际情况，伊红染色10秒～1分钟。

9：95％酒精两次，100％酒精两次各2分钟，二甲苯两次各10分钟，中性树胶封片。凉干后，显微镜下观察。

实施例10乳腺球形成实验(mammosphere-forming assay)

乳腺球形成实验是最近发展的一种体外分析乳腺干细胞功能的方法。在6孔超低粘附板中加入1.5ml浓度是20,000细胞/ml的Sca-1⁺细胞群和Sca-1^-细胞群各3孔，培养基时在无血清的MaECM培养基中加入1∶50B27，20ng/ml EGF，20ng/mlbFGF，10ug/ml heparin。3天加一次液，每次1ml。7天后，观察mammosphere数量和直径。

30,000个磁珠筛选的Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞在6孔超低粘附板中经过诱导培养基培养7天后，3孔Sca-1⁺细胞群生成乳腺球的个数分别是58，66和74，Sca-1⁺细胞有生成乳腺球能力的比例是22/10,000。3孔Sca-1^-细胞群生成乳腺球的个数分别是0、3和4，Sca-1^-细胞群有生成乳腺球能力的比例约是0.7/10,000。结果如图5和图6所示。Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞在生成乳腺球的差别说明Sca-1⁺细胞有乳腺干细胞的功能。

实施例11分化培养实验

分化培养条件是在基质胶中，通过催乳诱导培养，乳腺干细胞分化为具有分泌功能的管泡状结构，是体外模拟乳腺发育的实验。乳腺腔上皮前体细胞在基质胶诱导条件下可以发育成泡状结构，肌上皮前体细胞可以发育成圆形的实体结构[25]。乳腺细胞团和器官样小体在基质胶诱导条件下可以生成复杂的管泡状形态。最近试验表明永生的乳腺细胞系和筛选的乳腺干细胞也可以形成管泡状结构[8，26]。

分化培养实验的方法如下：

1：基质胶4℃过夜，提前预冷吸管，培养板和离心管。

2：6孔培养板置于冰上，1000个Sca-1⁺细胞群和Sca-1^-细胞群悬浮于100ul基质胶中，用预冷的吸管吹打混匀，各3孔。37℃孵育放置30分钟。

3：加含2％血清的MaECM培养基4ml一周，更换培养基，添加5ug/ml催乳素培养一周。

4：收集基质胶，冰冻切片，HE染色。

5：在0，10，14天收集Sca-1⁺细胞组的上清，在14天用1ml培养基反复吹打基质胶，1000转/分离心10分钟，收集上清用ELISA方法分析奶中主要蛋白酪蛋白含量。

磁珠筛选的1000个Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞种植在100ul基质胶中，在含有2％FCS的MaECM培养基培养一周后，加入催乳素诱导一周。Sca-1⁺细胞群细胞主要生成泡样结构和圆形的实体结构，另外偶尔还有复杂的管泡状结构(图7a，b，c，d)。在Sca-1^-细胞群细胞培养2周后，没有生成上述结构(图7e，f)。在10和14天收集上清，同时用1ml培养基反复吹打基质胶，离心后用ELISA方法分析分泌奶中的主要蛋白酪蛋白的含量，结果表明，在10、14天和基质胶中均有酪蛋白的表达，而且随着培养时间的延长，酪蛋白的表达增加(图8)。上述结果说明，和Sca-1^-细胞群细胞相比，Sca-1⁺细胞群细胞在合适的诱导条件下，能够发育腔上皮和肌上皮的结构，且能够分泌乳汁，具有多系分化的潜能。

实施例12ELISA实验分析酪蛋白(casein)的表达

方法如下：

1：取出酶标板，依照次序对应分别加入50μl的标准品于空白微孔中；

2：分别标记样品编号，加入50μl样品于空白微孔中，每个样本3个副孔；

3：在样品孔中加入10μl的生物素标记液；

4：在标准品孔和样品孔中加入100μl的酶标记溶液；

5：36±2℃孵育反应60分钟；

6：洗板机清洗5次，每次静置10-20秒；

7：每孔加入底物A、B液各50μl；

8：36±2℃下避光孵育反应15分钟；

9：每孔加入50μl终止液，终止反应；

10：在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值，以标准品的浓度绘制曲线图，分析样本的浓度。

实施例13照射实验

取8只8-10周C57BL/6鼠，手术取出乳腺，经过II型胶原酶酶消化离心，种植在6孔60毫米的组织培养皿中，加MaECM培养基培养5天，其中3孔用137Cesum Gamma cell 40照射2Gy。24小时后，使用0.05％胰酶/0.02％EDTA消化细胞10-15分钟，40um筛网过滤。以1ug/ml的浓度加入FITC Rat anti-Mouse Sca-1，加入0.5ug/ml PI排除死细胞，在流式细胞仪FACSVantage分析Sca-1⁺细胞含量的变化。流式细胞术的具体实验流程如下所述。

多种组织细胞的实验数据支持干细胞具有抗放射的观点[27-29]。Woodward等照射培养4天的乳腺细胞后，结果显示标记乳腺干细胞的多个指标如侧群细胞(sidepopulation)，CD24⁺CD29⁺等比例增加，表明乳腺干细胞比分化的乳腺细胞更能抵抗放射线的照射[30]。如果Sca-1⁺乳腺细胞具有干细胞的能力，经过照射后，Sca-1⁺细胞比例应该增加。乳腺组织经过胶原酶消化后，在MaECM培养5天后，2Gy照射，24小时候后通过流式细胞术分析Sca-1⁺细胞在整体细胞中的比例。PI用于去除已经死亡的细胞。在没有照射的乳腺组织中，Sca-1⁺细胞在整体中的比例在三次实验中分别是51％、52.5％和52.7％，平均为52％，表明Sca-1⁺乳腺干细胞的比例可以达到52％。2Gy照射后，Sca-1⁺细胞在细胞群体中的比例是60％(图9和10)。上述实验结果说明Sca-1⁺乳腺细胞在照射后比例增加，具有干细胞抗放射的特点。

实施例14实时定量(Real-time)PCR

取磁珠筛选Sca-1⁺细胞群和Sca-1^-细胞群，提取总RNA，逆转录cDNA，应用定量real-time PCR分析Sca-1⁺细胞群和Sca-1^-细胞群中自我更新因子，与乳腺发育有关的因子和乳腺干细胞标志等基因的表达差别。实验过程均按照试剂盒操作说明完成，引物用常规的引物设计软件设计，择得分高者任意选用，具体过程如下：

1：细胞总RNA提取

按Trizol总RNA分离试剂盒说明书进行：

①弃去培养基，PBS洗2次；

②加入1ml Trizol(Invitrogen)，不断振摇使细胞裂解，并用枪头反复吹打几次，吸出液体至1.5ml EP管；

③每1ml液体加0.2ml氯仿，充分颠倒混匀，静置3分钟；

④4℃，12000g离心15分钟，小心吸取上层水相，转入新的无RNA酶污染的EP管中；

⑤加0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟；

⑥4℃，12000g离心10分钟，弃上清，加1ml 75％乙醇(DEPC水配制)洗涤；

⑦4℃，8500g离心10分钟，弃上清，离心机中转动数秒，沉淀液体到管底，吸取剩余液体弃去，敞开管盖，空气中干燥；

⑧加入20μl无RNA酶和DNA酶的水，置55℃水浴中，助溶RNA10分钟；

⑨取1μl所提RNA溶液进行紫外分光光度仪分析(A260/A280≥1.8)和定量，剩余的RNA-80℃储存。

2：cDNA合成

按照M-MLV逆转录酶产品说明书推荐的条件：在无RNA酶的EP管中加入2μl500μg/ml随机引物，1μg总RNA，以无RNA酶的H₂O水补至17μl，65℃加热5分钟，立即冰浴1分钟，稍加离心去除挂壁，按顺序加入下列成分：

5×M-MLV逆转录酶缓冲液                6μl

dNTP(10mM)                2μl

Rnasin(40U/μL)           1μl

M-MLV逆转录酶(10U/μL)    1μl

0.1M DTT                  3μl

混匀后42℃反转录1小时，75℃灭活15分钟，-20℃贮存备用。

3：Real-time PCR检测

应用Takara公司

Premix Ex TaqTM试剂盒，在IQ5实时定量PCR仪上进行Real-time RT-PCR实验，引物用常规引物设计软件设计，择得分高者任意选用。

反应在20μl体系中进行，包含2μl模板cDNA，10μl 2×SYBR Green I MasterMix，0.4μl ROX校正染料，200nM上、下游引物各1μl和5.6μl无核酸酶水。条件为：95℃预变性10s；95℃变性5s；60℃退火、延伸40s；循环40次。

反应结束后，溶解曲线分析和琼脂糖电泳证实产物特异性，每对引物反应均包括一个无模板对照。以β-actin为内参，未转染的MSCs为校正器(calibrator)，采用2-[ΔΔCt]法来计算MSCs Jagged-1基因表达的相对值，公式如下：基因的相对值＝2-[ΔΔCt]，ΔΔCt＝ΔCt sample-ΔCtcalibrator；ΔCt＝Ct geneof interest-Ct β-actin。对每份模板的每个基因都设置了3个重复孔，独立实验重复至少3次。

通过定量real-time PCR实验分析一些与乳腺干细胞有关的基因在Sca-1⁺和Sca-1^-细胞群细胞表达的差别，如一些乳腺干细胞的表面标志，与乳腺早期发育和干细胞自我更新有关的因子。CK14和CK6是乳腺干细胞的标志，在乳腺干细胞和分化的乳腺中表达有明显的差别[6-8]。发现CK14和CK6在Sca1+细胞群的表达水平是其在Sca1-细胞群表达的2倍和4倍。Fgf10和Tbx3是与乳腺早期发育有关的因子，在乳腺芽(mammary bud)的形成中发挥作用。基因敲除上述2个基因后，影响乳腺芽的形成[31，32]。在小鼠孕12.5天的乳腺芽移植实验中，能够发育成具有分泌功能的乳腺结构，支持乳腺芽阶段的细胞是乳腺干细胞的观点。因此认为Fgf10和Tbx3是与乳腺干细胞有关系的因子。实验观察到Fgf10和Tbx3在Sca-1⁺细胞群的表达分别是Sca-1^-细胞群的3.5和4.2倍。Notch1和Notch4是调控乳腺干细胞自我更新的因子。在体外乳腺球形成实验中，加入Notch1和Notch4的抑制剂γ分泌酶抑制剂(gamma secretase inhibitor，GSI)，能够明显减少乳腺球形成的数量，说明Notch1和Notch4在乳腺干细胞自我更新中发挥作用[18]。Hes1和Hey1是Notch通路下游的靶基因，用来分析激活Notch通路的指标[18，33]。实验显示Notch1、Notch4、Hes1和Hey1在Sca1+细胞群的表达分别是Sca-1^-细胞群的2.5、2、2和7倍。上述结果说明和Sca-1^-细胞群相比，Sca-1⁺细胞群中与乳腺干细胞有关的基因表达均高，符合干细胞特点(图11)。

实施例15统计学分析方法

本发明所有数值均采用

表示，用SPSS 13.0软件进行成组t检验，P＜0.05有显著性差异。

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Claims (8)

1.一种基于基础培养基的哺乳动物包括人乳腺干细胞专用培养基，其中所述基础培养基的成分为58％DMEM/F12+40％MCDB-201、2％-10％胎牛血清、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸、1×亚油酸-牛血清白蛋白，10^-4-10^-2M抗坏血酸，1-100ng/ml EGF、1-100ng/ml PDGF、500ng-1mg/ml氢化强的松、100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素，其特征在于还包含下述组分：

a)0.1-10ng/ml的雌二醇，及

b)1-100ng/ml的生长激素。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述雌二醇的浓度为0.3-3ng/ml，生长激素的浓度为10-100ng/ml。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于所述雌二醇的浓度为0.3-1.5ng/ml，生长激素的浓度为10-50ng/ml。

4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于所述雌二醇的浓度为1.5ng/ml，生长激素的浓度为50ng/ml。

5.一种哺乳动物包括人乳腺干细胞的培养方法，其特征在于所述培养方法包括下述步骤：

a)无菌条件下取未孕鼠乳腺脂肪垫或手术切除的未孕人乳腺脂肪垫，

b)置于含有5-10％双抗的D-hanks液中，在D-hanks液中洗涤2次，用剪刀把组织完全剪碎，加入同体积0.2％的II型胶原酶，在37℃环境中消化大约50分钟，15分钟间隔摇动一次，

c)消化完毕后加入D-hanks液，充分吹打为单细胞悬液，离心并吸取上清液中脂肪样物质，然后用权利要求1-6任一项所述的培养基重悬细胞洗涤一次，接种在组织培养皿中，48小时内切勿移动摇晃，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，在2，4和6天换液各换液一次，及

d)培养6天后，胰酶消化并吹打细胞，过滤、离心，收集细胞，用于磁珠筛选Sca-1阳性的乳腺干细胞。

6.根据权利要求5所述培养方法获得的细胞混合物，其特征在于所述细胞混合物中Scal-1⁺细胞占细胞群体的比例为30-55％。

7.根据权利要求6所述的细胞混合物，其特征在于所述细胞混合物中Scal-1⁺细胞占细胞群体的比例为40-53％。

8.根据权利要求7所述的细胞混合物，其特征在于所述细胞混合物中Scal-1⁺细胞占细胞群体的比例为51-53％。

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