CN109943520A - 汗腺细胞的分离和培养获得汗腺类器官的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种汗腺细胞的分离和培养获得汗腺类器官的方法及其应用，属于生物工程技术领域，其中所述汗腺细胞的分离方法采用消化酶的组合进行多步分离，可以实现高效分离汗腺细胞。分离获得的汗腺细胞中含有干性细胞，可用于通过本发明提供的三维培养基进行培养，获得具有高细胞活性和双向分化潜能的汗腺类器官，将其移植到足底和背部全层损伤小鼠后不仅能够促进汗腺的再生及功能的恢复，而且可以促进皮肤创面的愈合，能用于制备修复皮肤损伤并且恢复附属器官功能的细胞产品，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种汗腺细胞的分离和培养方法，特别是涉及一种汗腺细胞的分离和培养获得汗腺类器官的方法及其在汗腺损伤的皮肤修复中的应用。
背景技术
汗腺，作为人体最大器官-皮肤的附属器官，主要在调节体温、平衡体液以及物质代谢等方面发挥重要的作用。汗腺发生于胚胎时期，出生后，当汗腺结构遭遇破坏时，例如轻度烧伤，汗腺可以以其深部未受创的部分为模板完全修复受损的汗腺，而当汗腺结构遭遇完全破坏时，汗腺是无法再生的，例如在严重的深度烧伤后，创面愈合处缺乏汗腺结构，患者无法再恢复其创伤处的发汗功能。尽管随着医疗技术的发展，大面积烧伤的生存率大大提高，但是患者预后还是面临汗腺功能缺失，严重降低患者愈后的生活质量。此外，还存在多种伴有皮肤汗腺发育异常与功能障碍的遗传性疾病，目前无法通过现有治疗手段恢复汗腺的正常结构与功能。因此，促进患处汗腺功能重建已成为皮肤创面愈合过程中欲待解决的一个重要问题。
近年来，随着干细胞生物学与再生医学研究的深入，干细胞治疗显示出良好的促组织再生能力，干细胞技术为汗腺再生带来了新的希望。应用干细胞技术促进汗腺再生，需要解决两个关键问题。一是细胞的来源，所获得的细胞不但需具有较强的增殖能力，还必须具备分化为汗腺细胞、发挥汗腺功能的潜力。目前使用胚胎干细胞、表皮干细胞、间充质干细胞(骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞)以及毛囊干细胞向汗腺进行诱导分化的研究均有报道。但是这些研究均存在控制干细胞的分化方向困难、分化效率低下的问题。这些问题限制了上述干细胞作为汗腺种子细胞的应用。据报道虽然出生前汗腺的数量已经被决定，但是成体依然存在一定数量的汗腺干细胞。因此，如能短期内大量扩增这些汗腺干细胞，无疑将是促进汗腺再生最为理想的种子细胞。二是细胞的培养方式，不但需要满足细胞移植的数目，并且需要保持细胞分化为有功能的汗腺细胞的能力。近些年来，类器官的研究发展迅速，类器官被《Nature Methods》杂志评为2017年生物科学领域年度技术，具体是指包含其代表器官关键特性的三维细胞培养物。体外培养系统基于自我更新的干细胞群，分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间结构并重现对应器官的部分功能，从而提供高度生理/病理相关系统。到目前为止，大部分机体的组织和器官都有建立类器官培养体系的相关报道，如大脑、小肠、肝脏、胰腺等等。类器官培养方法的成功建立，加速了组织器官的发育与疾病研究。另一方面，在合适的条件下，类器官可以实现多代数传代，实现细胞数目的扩增，为细胞治疗提供种子细胞。但是目前为止还未有关于汗腺的体外类器官研究报道，归其原因，可能是对汗腺的发育及调控研究机制尚未明确，培养体系难以建立。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种分离汗腺细胞的方法，包括：
1)将去除皮下组织的皮肤组织用消化酶的组合进行多步消化，离心，弃上清保留沉淀；
2)重复上述消化、离心、弃上清操作至所需细胞从皮肤真皮层组织中分离出来，得到汗腺细胞；
其中所述消化酶选自组织分离酶Dispase、胶原酶A、透明质酸酶、弹性蛋白酶、Accutase酶中的一种或两种以上的组合。
上述方法具体包括以下步骤：
S1：将小鼠足底皮肤组织用PBS清洗后去除皮下组织，得到预处理的皮肤组织；
S2：将预处理的皮肤组织用第一消化酶进行消化，离心，弃上清保留沉淀，得到皮肤组织的真皮层组织；
S3：将S2中所述真皮层组织用第二消化酶进行消化，离心，弃上清保留沉淀，对该沉淀重复进行第二消化酶消化，离心和弃上清保留沉淀操作N次，得到组织沉淀，其中所述N为自然数；
S4：对S3中得到的组织沉淀再次用第二消化酶进行消化，显微镜下观察到汗腺细胞团出现；
S5：将S4中所述汗腺细胞团移出，用第三消化酶进行消化，过筛网后离心，弃上清保留沉淀，得到汗腺细胞。
上述步骤S2中，所述第一消化酶为0.5-20mg/mL的组织分离酶Dispase，优选2mg/mL的组织分离酶Dispase；所述消化的条件为：消化温度为4℃，消化时间为8-24小时，优选为12小时；所述离心的条件为：100-400g离心3-10分钟，优选200g离心5分钟。
上述步骤S3和步骤S4中，所述第二消化酶为0.5-5mg/mL的胶原酶A、0.05-3U/mL的透明质酸酶和0.1-10U/mL的弹性蛋白酶的组合，优选为2U/mL胶原酶A，0.5U/mL透明质酸酶，6U/mL弹性蛋白酶的组合；所述消化的条件为：消化温度为37℃，消化时间为15-20分钟。
上述步骤S3中，所述离心的条件为：20-100g离心3-10分钟，优选50g离心5分钟。
上述步骤S5中，所述第三消化酶为Accutase酶；所述消化的条件为：消化温度为37℃，消化时间为5-10分钟；所述筛网的尺寸为40-100微米，优选70微米；所述离心的条件为50-400g离心3-10分钟，优选200g离心5分钟。
以上方法中使用到的组合消化酶也属于本发明的内容，其中所述组合消化酶包括：第一消化酶、第二消化酶和第三消化酶；其中所述第一消化酶为0.5-20mg/mL的组织分离酶Dispase，优选2mg/mL的组织分离酶Dispase；所述第二消化酶为0.5-5mg/mL的胶原酶A、0.05-3U/mL的透明质酸酶和0.1-10U/mL的弹性蛋白酶的组合，优选为2U/mL胶原酶A，0.5U/mL透明质酸酶和6U/mL弹性蛋白酶的组合；所述第三消化酶为Accutase酶。
通过上述分离汗腺细胞的方法分离获得的汗腺细胞也属于本发明的内容。
本发明的另一方面提供一种利用上述的汗腺细胞培养汗腺类器官的方法，包括以下步骤：
T1：将上述的汗腺细胞用基质胶进行重悬，得到重悬的汗腺细胞；和
T2：利用三维培养基对重悬的汗腺细胞进行培养，收集培养后的三维汗腺样结构即为培养的汗腺类器官；
其中所述三维培养基的配方包括以下组分：Advanced DMEM/F-12培养基、0.01％-1％白蛋白、0.2％-10％B-27添加剂、1-50mM HEPES、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、10-1000U/mL青霉素和0.01-1mg/mL链霉素。
优选地，上述三维培养基的配方包括以下组分：Advanced DMEM/F-12培养基、0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
上述步骤T1中，所述基质胶为Matrigel或BME，优选为BME；所述基质胶的浓度为6-9mg/mL，优选为7.2mg/mL；所述重悬的汗腺细胞中汗腺细胞的浓度为1×102个/mL-2×103个/mL，优选为1×103个/mL。
上述步骤T2中，所述培养的条件为：37℃、5％CO2培养箱中培养，培养时间为5-12天，优选为5-7天，其中每3天更换所述三维培养基一次。
上述三维培养基的配方还包括以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、EDA信号通路激动剂、Sirt1蛋白抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGFβ信号通路抑制剂、腺苷酸环化酶激动剂、BMP4信号通路激动剂。
优选地，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1mM；所述表皮细胞生长因子为EGF，浓度为5-200ng/mL，优选为50ng/mL；所述碱性成纤维细胞生长因子为bFGF，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL；所述EDA信号通路激动剂为EDA，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL；所述Sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mM，优选为10mM；所述Wnt信号通路激动剂为Wnt3a，浓度为10-1000ng/mL，优选为100ng/mL；所述TGFβ信号通路抑制剂为A83-01，浓度为0.1-10μM，优选为1μM；所述腺苷酸环化酶激动剂为佛司可林FSK，浓度为1-100μM，优选为10μM；所述BMP4信号通路激动剂为BMP4，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL。
根据上述的培养汗腺类器官的方法获得的汗腺类器官也属于本发明的内容。
用于培养上述汗腺细胞获得上述汗腺类器官的三维培养基也属于本发明的内容，所述三维培养基的配方包括以下组分：Advanced DMEM/F-12培养基、0.01％-1％白蛋白、0.2％-10％B-27添加剂、1-50mM HEPES、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、10-1000U/mL青霉素和0.01-1mg/mL链霉素；
优选地，所述培养基的配方包括以下组分：Advanced DMEM/F-12培养基、0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
上述三维培养基的配方还包括以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、EDA信号通路激动剂、Sirt1蛋白抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGFβ信号通路抑制剂、腺苷酸环化酶激动剂、BMP4信号通路激动剂；
优选地，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1mM；所述表皮细胞生长因子为EGF，浓度为5-200ng/mL，优选为50ng/mL；所述碱性成纤维细胞生长因子为bFGF，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL；所述EDA信号通路激动剂为EDA，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL；所述Sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mM，优选为10mM；所述Wnt信号通路激动剂为Wnt3a，浓度为10-1000ng/mL，优选为100ng/mL；所述TGFβ信号通路抑制剂为A83-01，浓度为0.1-10μM，优选为1μM；所述腺苷酸环化酶激动剂为佛司可林FSK，浓度为1-100μM，优选为10μM；所述BMP4信号通路激动剂为BMP4，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL。
上述三维培养基的配方选自以下配方中的任一种：
配方1：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、50ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、20ng/mL EDA、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、20ng/mL EDA、50ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、100ng/mL Wnt3a、1μM A83-01、10μM FSK、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方4：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、20ng/mL EDA、50ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、100ng/mL Wnt3a、1μM A83-01、10μM FSK、20ng/mL BMP4、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素。
本发明的又一方面还提供了上述汗腺细胞和上述汗腺类器官在制备用于修复皮肤全层损伤和/或汗腺缺损的产品中的应用。
基于以上技术方案提供的一种分离汗腺细胞的方法，可以实现高效分离汗腺细胞，分离得到的汗腺细胞能用于在在本发明提供的三维培养条件下培养获得汗腺类器官，其具有类似汗腺的形态，且保持较强的干细胞特性，能够短期内扩增得到大量的汗腺类器官，汗腺类器官具有双向分化潜能，能分化得到表皮细胞和汗腺细胞，可用于制备促进全层损伤小鼠的皮肤创面愈合以及汗腺受损小鼠的汗腺再生及功能恢复的药物或产品，应用前景广阔。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明的汗腺细胞分离方法采用胶原酶A联合透明质酸酶和弹性蛋白酶等对真皮组织进行消化，可以加快消化速度，短时间内将真皮组织及其他类型细胞去除，从而实现高效分离汗腺细胞；分离的汗腺细胞可表达干性标志物CK5、CK14、CK19、CK18和αSMA，表明分离的汗腺细胞中含有干性细胞，其中表达CK19，CK18和αSMA的细胞可向汗腺细胞方向分化，而表达CK5和CK14的细胞可作为皮肤的干/祖细胞(本发明中，“干/祖细胞”的概念为“干细胞”或“祖细胞”，所指为同一种细胞，因业内命名不统一，统称为“干/祖细胞”)，可分化为表皮细胞或汗腺细胞。
2)本发明利用分离的汗腺细胞通过三维培养获得的汗腺类器官细胞活力高，连续培养传代30天后仍然有大部分细胞存活，仅有少量细胞死亡；培养一段时间后形成的汗腺类器官可表达CK14、Ki67(细胞增殖标志物，说明汗腺类器官细胞具有较强的增殖能力)、αSMA和SOX9蛋白，可见培养获得的汗腺类器官仍具有干细胞特性；且与分离的汗腺细胞相比，干性组分表达升高，分化组分表达下降，表明通过三维培养，富集了汗腺干/祖细胞，并且可以在短期内扩增得到大量的汗腺种子细胞，建立了有效培养获得汗腺类器官的方法；
3)本发明通过三维培养获得的汗腺类器官既含有汗腺干/祖细胞又含有部分成熟汗腺细胞，其具有双向分化潜能，可分化得到汗腺细胞和表皮细胞，移植到足底和背部全层损伤小鼠后不仅能够促进汗腺的再生及功能的恢复，而且可以促进皮肤创面的愈合，能用于制备修复皮肤损伤并且恢复附属器官功能的细胞产品，应用前景广阔；
4)本发明首次提供一种用于培养汗腺细胞获得汗腺类器官的三维培养基，采用的是基质胶与细胞混合培养的方式，在Advanced DMEM/F-12培养基的基础上添加其他组分，培养得到的汗腺类器官细胞活性高，且干性组分高。传统二维培养汗腺细胞使得汗腺细胞失去了在体的生物学特性，而本发明通过三维培养生成的汗腺类器官，是由汗腺干细胞和成熟细胞构成的类器官组织，在形态结构上类似在体的汗腺组织，维持和保留了在体汗腺的生物学特性；另一方面，应用本发明筛选的三维汗腺培养体系，短期内可以得到大量的汗腺类器官，因此提供了一个理想的汗腺细胞种子资源。
附图说明
图1是相差显微镜下观察到的汗腺细胞分离过程的不同时间的明场图片；
图2是汗腺组织的免疫荧光染色图片；
图3是分离得到的汗腺细胞的免疫荧光染色检测结果；
图4是不同三维培养基配方培养形成的汗腺类器官的形态图；
图5是三维培养过程中汗腺类器官在不同时间的形态图；
图6是汗腺类器官的免疫荧光染色检测结果；
图7是汗腺类器官的相对基因表达结果；
图8是汗腺类器官对全层皮肤损伤小鼠的皮肤损伤修复效果的创口修复变化状态图；
图9是汗腺类器官对全层损伤小鼠创面修复的皮肤厚度变化状态图；
图10是汗腺类器官对汗腺损伤小鼠的汗腺功能恢复效果图。
具体实施方式
为了实现高效分离汗腺细胞，用于培养获得具有高细胞活性和较强干性，且具有双向分化潜能的汗腺类器官，本发明提供一种基于消化酶和消化酶的组合的汗腺细胞分离方法，利用分离得到的汗腺细胞采用本发明提供的基于基质胶与细胞混合培养的专用三维培养基进行培养，获得了具有高细胞活性和较强干性，且具有双向分化潜能的汗腺类器官，填补了现代医学中使汗腺干细胞培养形成汗腺类器官的空白。
以下结合附图和具体实施方式详细说明本发明。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
本发明中使用到的以下材料均可通过商购获得：Matrigel基质胶、BME基质胶可购自Corning；Advanced DMEM/F-12培养基、白蛋白(商品名Albumin)、B-27添加剂(商品名B-27supplement)、10mM HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))、谷氨酰胺添加剂(商品名GlutaMAX supplement)可购自Gibco，N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine)、尼克酰胺(Sirt1蛋白抑制剂，Nicotinamide)可购自Sigma，EGF(表皮细胞生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、Wnt3a(Wnt信号通路激动剂)、EDA(EDA信号通路激动剂)、BMP4(BMP4信号通路激动剂)可购自R&D，A83-01(TGFβ信号通路抑制剂)和佛司可林(腺苷酸环化酶激动剂，Forskolin，FSK)可购自SELLECK，青霉素、链霉素可购自华北制药。本领域技术人员应当理解，材料供应商的选择不应是对本发明的限制。
实施例1、分离获得汗腺细胞
1.1、本发明获得汗腺细胞的分离方法，包括以下步骤：
1)将小鼠足底皮肤组织用PBS清洗后，去除皮下组织，例如皮下筋膜、脂肪及肌肉等，获得预处理的皮肤组织；
2)将预处理的皮肤组织用组织分离酶Dispase进行消化，消化酶Dispase的浓度为2mg/mL，消化温度为4℃，消化时间为12小时，200g离心5分钟，弃去上清，保留沉淀，得到皮肤组织的真皮层组织；
3)将步骤2)获得的真皮层组织进一步用消化酶组合进行消化，其中消化酶组合为：2U/mL胶原酶A，0.5U/mL透明质酸酶，6U/mL弹性蛋白酶；消化温度为37℃，消化时间为15-20分钟；200g离心5分钟，弃去上清，保留沉淀；为了更有效地将汗腺细胞与真皮层组织中的其他类型细胞(主要为成纤维细胞)分离开，可以经过多次消化酶组合进行消化、离心和弃上清保留沉淀的操作；
4)向步骤3)中经离心后的沉淀中补充上述消化酶组合继续进行消化，消化条件与步骤3)相同，显微镜下观察到汗腺细胞团出现，表明已去除真皮层其他细胞，而汗腺细胞全部从皮肤组织中分离出来；
5)将汗腺细胞团在显微镜下吸出来后用Accutase酶进行消化，消化温度为37℃，消化时间为5分钟，过70微米筛网后200g离心5分钟取沉淀，获得细胞即为汗腺细胞。
图1示出了相差显微镜下观察到的汗腺细胞分离过程的不同时间的明场图片，其中A幅表示小鼠爪垫；B幅表示切取的含爪垫的足底皮肤；C幅表示Dispase消化后去除了表皮层的真皮组织；D幅表示显微镜下观察到的经消化酶组合消化真皮层及低速离心后收集的汗腺沉淀；E幅表示挑出的汗腺细胞团；F幅表示接种0天的汗腺细胞。由图1可见，本发明提供的汗腺细胞分离方法可有效实现汗腺细胞的分离。
1.2、汗腺组织的免疫荧光染色检测
用免疫荧光染色方法检测汗腺组织中的细胞类型的标志，包括汗腺干/祖细胞标志CK14(角蛋白14)、CK5(角蛋白5)、αSMA(肌成纤维蛋白)，多能性干细胞标志SOX9(转录因子SOX9)，分化标志物CK10(角蛋白10)，功能性标志物AQP5(水孔通道蛋白5)、αATP(钠钾泵)，以及汗腺特异性标志CK18(角蛋白18)、CEA(外胚层发育不全抗原)，汗腺干性标志CK19(角蛋白19)。
检测过程：取小鼠足底皮肤，4％多聚甲醛固定12小时后脱水，石蜡包埋切片，片厚4微米。石蜡切片脱蜡后进行抗原修复，然后10％山羊血清封闭1小时后，加入一抗：CK14、CK10、CK5、CK19、CK18、αSMA、SOX9、AQP5、αATP、CEA。4℃孵育10小时，清洗后加入荧光二抗Alexa488、Alexa568孵育1小时，DAPI室温孵育10分钟，封片后荧光显微镜观察采集汗腺组织的免疫荧光染色图像，结果如图2所示。
根据图2，可以看到：CK14染色结果显示，表皮层的基底层强表达CK14，而在汗腺组织，汗腺的导管部(图2中D表示的染色部分)高表达CK14，与表皮基底层类似，而在汗腺的腺体部(图2中S表示的染色部分)，则仅仅外层细胞微弱的表达CK14；CK10染色结果显示，表皮除基底层外的各层以及汗腺的导管部高表达CK10，而汗腺腺体部未观察到CK10的表达；CK5染色结果显示在表皮层各部及汗腺的导管部均观察到CK5的高表达，而在腺体部同CK14的表达相似，仅仅在外层细胞检测到CK5的微弱表达；而αSMA，SOX9，CK19，CK18以及CEA的染色结果显示，这些汗腺的标志物仅仅表达于汗腺的腺体部，而在导管部及表皮层均不表达；而汗腺的功能性标志物，αATP和AQP5仅仅表达于汗腺腺体部的内层细胞。图2结果表明汗腺组织中既含有干性细胞，又含有成熟细胞，可以通过合适的分离方法从汗腺组织中将既包含干性细胞和成熟细胞的汗腺细胞分离出来。
1.3、分离得到的汗腺细胞的免疫荧光染色检测
用免疫荧光染色方法检测该实施例分离的汗腺细胞的细胞类型的标志，包括汗腺干/祖细胞标志CK14、CK5、αSMA，多能性干细胞标志SOX9，分化标志物CK10，功能性标志物AQP5、αATP，表皮干细胞标志P63(转录因子)，以及汗腺特异性标志CK18、CEA，汗腺干性标志CK19。
检测过程：将分离得到的汗腺细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，20％蔗糖溶液脱水过夜后OCT包埋进行冰冻切片，片厚8μm，0.2％Triton X-100破膜，山羊血清封闭1小时，加入一抗：AQP5、P63、CK14、CK5、CK10、SOX9、αSMA、CK19、CK18，4℃孵育10小时，清洗后加入荧光二抗Alexa488、Alexa568孵育1小时，DAPI室温孵育10分钟，封片后荧光显微镜观察，结果如图3所示。
根据图3，可以看到分离获得的汗腺细胞能表达汗腺功能性标志AQP5(绿色荧光)、CK18(绿色荧光)、干性标志CK19(绿色荧光)、αSMA(红色荧光)、CK14(绿色荧光)、P63(红色荧光)，表明分离出的汗腺细胞为成熟功能性细胞(AQP5阳性、CK18阳性)与干性细胞(αSMA阳性、CK19阳性、CK14阳性以及P63阳性)的混合体，且包含了干细胞的多种亚型。
根据以上结果，本发明的汗腺细胞分离方法采用胶原酶A联合透明质酸酶和弹性蛋白酶等对真皮组织进行消化，可以加快消化速度，短时间内将真皮组织及其他类型细胞去除，从而实现高效分离汗腺细胞；分离的汗腺细胞可表达CK5、CK14、CK19、CK18和αSMA，可见分离的汗腺细胞中含有干性细胞，其中表达CK19，CK18和αSMA的细胞可向汗腺细胞方向分化，而表达CK5和CK14的细胞可作为皮肤的干/祖细胞，分化为表皮细胞或汗腺细胞。
实施例2、汗腺类器官的培养
2.1、该实施例对实施例1中分离获得的汗腺细胞进行三维培养，获得汗腺类器官，其包括以下步骤：
1)：将实施例1分离获得的汗腺细胞用基质胶进行重悬，得到重悬的汗腺细胞；具体方法为将实施例1分离的汗腺细胞用稀释后的基质胶(BME Type2)(浓度为7.2mg/mL)重悬，重悬后汗腺细胞的浓度为1×103个/mL；
2)：利用三维培养基对重悬的汗腺细胞进行培养，收集培养后的三维汗腺样结构即为培养的汗腺类器官，其中培养条件为在37℃、5％CO2培养箱中培养，培养时间为5-12天。
其中培养汗腺细胞使用的三维培养基的配方可以选用以下培养基配方1-4中的任一种(各组分的浓度为在培养基中的终浓度，其中％表示体积浓度)：
配方1：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素。每3天更换培养基一次。
配方2：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、50ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、20ng/mL EDA、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素。每3天更换培养基一次。
配方3：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、20ng/mL EDA、50ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、100ng/mL Wnt3a、1μM A83-01、10μM FSK、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素。每3天更换培养基一次。
配方4：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、20ng/mL EDA、50ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、100ng/mL Wnt3a、1μM A83-01、10μM FSK、20ng/mL BMP4、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素。每3天更换培养基一次。
上述用于规模化扩增培养汗腺类器官的三维(3D)培养是指将具有三维立体结构(三维是指空间维度，一般指长、宽、高，具体在细胞培养上就是基质胶滴于培养皿的底壁形成的空间立体的小丘状团块)的载体与细胞在体外共同培养，区别于二维(2D)贴壁培养(二维即指平面，具体在细胞培养上就是细胞平铺贴附于培养皿的底壁的培养方式)。本发明提供的三维培养基具体采用的是基质胶与细胞混合培养的方式，是在Advanced DMEM/F-12培养基的基础上添加白蛋白(商品Albumin，作用是提供营养，维持细胞生长)、B-27添加剂(商品B-27supplement，作用是提供营养，维持细胞生长)、HEPES缓冲液(作用是两性离子化学缓冲剂)、谷氨酰胺添加剂(商品GlutaMAX supplement，作用是氨基酸添加剂，促进生长)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(作用是抗氧化剂)、表皮细胞生长因子(作用是促进细胞增殖分化，例如EGF等)、碱性成纤维生长因子(作用是促进细胞生长，例如bFGF等)、Wnt信号通路激动剂(作用是干细胞特性的维持调控，例如Wnt3a等)、EDA信号通路激动剂(作用是促进细胞分化，维持细胞干性，例如EDA等)、沉默信息调节因子Sirt1蛋白抑制剂(作用是促进细胞增殖和分化，例如尼克酰胺等)、BMP4信号通路激动剂(作用是促进细胞分化、维持细胞干性，例如BMP4等)、TGFβ信号通路抑制剂(作用是干细胞特性的维持，例如A83-01等)、腺苷酸环化酶激动剂(作用是维持多能干细胞特性，例如佛司可林FSK等)、抗生素(作用是预防细菌污染，例如青霉素、链霉素等)及其组合。利用该实施例提供的三维培养基，可以培养实施例1获得的汗腺细胞，得到三维汗腺样结构，即为汗腺类器官。
2.2、不同三维培养基配方培养形成的汗腺类器官的形态
培养结束时，挑选三维汗腺样结构作为培养汗腺类器官用于检测。在显微镜(型号Leica DMi1，放大倍数100×)下观察3D培养5天的汗腺类器官的形态，如图4所示，其中图4中A幅表示使用三维培养基配方1培养得到的汗腺类器官的形态，图4中B幅表示使用三维培养基配方2培养得到的汗腺类器官的形态，图4中C幅表示使用三维培养基配方3培养得到的汗腺类器官的形态，图4中D幅表示使用三维培养基配方4培养得到的汗腺类器官的形态。从图4中A-D幅可以观察到，使用不同的三维培养基配方培养得到的汗腺类器官都有多种细胞形态(即由多种细胞组成的细胞群)，例如克隆样的、导管样的、腺体样的，也证实了从实施例1中分离的汗腺细胞中包含不同的汗腺干/祖细胞，其在三维培养基的培养条件下增殖分化成形态各异的汗腺类器官，其中既含有汗腺干/祖细胞，又含有部分成熟汗腺细胞。在培养增殖过程中还观察到分离的汗腺细胞的细胞活力高、增殖旺盛，一般5-7天即可长至200μm直径大小，传代周期短，增长迅速，因此表明上述用于培养汗腺细胞的三维培养基适合汗腺类器官的形成。
图5还示出了三维培养过程中汗腺类器官在不同时间的形态图，从图5中可以看到：三维培养3天后汗腺细胞增殖形成了多个克隆样或导管样的细胞球结构，且折光率强，表明细胞活力旺盛；培养至第5天可见汗腺类器官长至直径约200μm的管状或腺体状结构；培养至30天时，汗腺类器官长至囊泡状结构，表明该实施例建立的三维培养体系可以促进汗腺细胞快速增殖，短期内可形成大量的汗腺类器官，而且可以维持类器官存活至第30天。
2.3、汗腺类器官的免疫荧光染色检测
用免疫荧光染色检测该实施例培养5天的汗腺类器官的细胞类型的标志，包括汗腺干/祖细胞标志CK14、CK5、αSMA，多能性干细胞标志SOX9，分化标志物CK10，功能性标志物AQP5和αATP以及汗腺特异性标志CK18和汗腺干性标志CK19。
检测过程：将该实施例培养出来的汗腺类器官用4％多聚甲醛固定10分钟，20％蔗糖溶液脱水过夜后OCT包埋进行冰冻切片，片厚8μm，0.2％Triton X-100破膜，10％山羊血清封闭1小时，加入一抗：AQP5、αATP、CK14、CK5、CK10、SOX9、αSMA、CK19、CK18，4℃孵育10小时，清洗后加入荧光二抗Alexa488、Alexa568孵育1小时，DAPI室温孵育10分钟，封片后荧光显微镜观察，结果如图6所示。
根据图6，汗腺类器官的免疫荧光染色结果显示，汗腺类器官表达汗腺特异性标志CK18以及干性标志CK19；同时功能性的标志AQP5和αATP也少量表达，而汗腺干/祖细胞标志αSMA和多能性干细胞标志SOX9的表达较强，表明汗腺细胞生成的汗腺类器官干性较强；同样，CK14和CK5高表达而CK10不表达证明汗腺类器官的干性潜能，且未向表皮进行分化。
2.4、汗腺类器官的相对基因表达
对该实施例培养5天的汗腺类器官的相对基因表达进行分析，分析结果如图7所示，其中EPC代表原代分离出来的表皮细胞；D0代表分离出来的汗腺细胞；P0、P1、P2分别代表原代培养生成的第一、二、三代汗腺类器官。
图7结果显示，CK14、CK5、CK19的基因表达显示，通过三维培养富集了汗腺的干性细胞，且形成的汗腺类器官在不同的代次间均保持较强的干性特性，同时成熟的功能性标志显著减弱(AQP5)；而且汗腺的特异性标志CK18高表达和表皮细胞成熟标志CK10不表达证实生成的汗腺类器官保持汗腺特性未向表皮进行分化。
实施例3、汗腺类器官对全层皮肤损伤小鼠的皮肤损伤修复效果
对T、B细胞联合免疫缺陷的SCID小鼠全层皮肤切除造模，用实施例2中的三维(3D)培养的汗腺类器官覆盖创面缺损区域，修复3、7、14和21天后切取创面及周围皮肤组织，用H&E染色方法检测修复情况。
检测结果如图8和图9所示，其中图8示出了汗腺类器官对全层皮肤损伤小鼠的皮肤损伤修复效果的创口修复变化状态图。结果显示对照组(对照为单纯手术切除造模小鼠，伤口只用3M敷料贴覆盖)创面愈合面积远远小于同时期的移植组(伤口接种实施例2中培养的汗腺类器官，后3M敷料贴覆盖)，并且在对照组伤口区有大量炎症细胞，真皮胶原无明显再生。用实施例2中三维(3D)培养的汗腺类器官的移植组，显示表皮再生情况更好，表皮细胞在伤口区域迁移快，迁移距离远，炎症较清，真皮胶原再生情况更理想。
图9示出了汗腺类器官对全层损伤小鼠创面修复的皮肤厚度变化状态图。图9结果显示第14天，细胞组小鼠创面基本愈合，而对照组小鼠创面还未愈合；从此时(第14天)开始比较小鼠创面皮肤厚度及全层皮肤厚度，结果显示在第14天至第21天期间内对照组的皮肤厚度及全层皮肤厚度均远远低于细胞组。
该实施例结果表明：较对照组，用实施例2中三维(3D)培养的汗腺类器官能够明显促进全层皮肤损伤小鼠的皮肤损伤修复。
实施例4、汗腺类器官对汗腺损伤小鼠的汗腺功能恢复效果
将C57小鼠足底皮肤置于65℃金属板上放置15秒钟，造成汗腺损伤模型。第二天将实施例2中三维培养的汗腺类器官移植入受损伤的小鼠足底皮肤内，并于细胞移植后的3、7、14和21天进行碘-淀粉功能检测试验和染色试验。
结果如图10显示，与对照组(将C57小鼠足底皮肤置于65℃金属板上放置15秒钟，造成汗腺损伤，然后接种生理盐水)相比，细胞组(将C57小鼠足底皮肤置于65℃金属板上放置15秒钟，造成汗腺损伤，然后接种实施例2中三维培养的汗腺类器官)的小鼠在术后的第7天开始检测到排汗现象，并且随着时间的延长，检测到的出汗黑点数量明显增多，而对照组直到损伤后三周，也未检测到排汗现象的出现。并且H&E染色结果同样证明了这一现象，即细胞组从第14天开始就检测到黑点，且随着时间的延长，在第21天检测到的黑点的数量明显增多。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种分离汗腺细胞的方法，其特征在于，包括：
1)将去除皮下组织的皮肤组织用消化酶的组合进行多步消化，离心，弃上清保留沉淀；
2)重复上述消化、离心、弃上清操作至所需细胞从皮肤真皮层组织中分离出来，得到汗腺细胞；
其中所述消化酶选自组织分离酶Dispase、胶原酶A、透明质酸酶、弹性蛋白酶、Accutase酶中的一种或两种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
S1：将小鼠足底皮肤组织用PBS清洗后去除皮下组织，得到预处理的皮肤组织；
S2：将预处理的皮肤组织用第一消化酶进行消化，离心，弃上清保留沉淀，得到皮肤组织的真皮层组织；
S3：将S2中所述真皮层组织用第二消化酶进行消化，离心、弃上清保留沉淀，对该沉淀重复进行第二消化酶消化，离心和弃上清保留沉淀操作N次，得到组织沉淀，其中所述N为自然数；
S4：对S3中得到的组织沉淀再次用第二消化酶进行消化，显微镜下观察到汗腺细胞团出现；
S5：将S4中所述汗腺细胞团移出，用第三消化酶进行消化，过筛网后离心，弃上清保留沉淀，得到汗腺细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述第一消化酶为0.5-20mg/mL的组织分离酶Dispase，优选2mg/mL的组织分离酶Dispase；所述消化的条件为：消化温度为4℃，消化时间为8-24小时，优选为12小时；所述离心的条件为：100-400g离心3-10分钟，优选200g离心5分钟；和/或
步骤S3和步骤S4中所述第二消化酶为0.5-5mg/mL的胶原酶A、0.05-3U/mL的透明质酸酶和0.1-10U/mL的弹性蛋白酶的组合，优选为2U/mL胶原酶A，0.5U/mL透明质酸酶，6U/mL弹性蛋白酶的组合；所述消化的条件为：消化温度为37℃，消化时间为15-20分钟；和/或
步骤S3中，所述离心的条件为：20-100g离心3-10分钟，优选50g离心5分钟；和/或
步骤S5中所述第三消化酶为Accutase酶；所述消化的条件为：消化温度为37℃，消化时间为5-10分钟；所述筛网的尺寸为40-100微米，优选70微米；所述离心的条件为50-400g离心3-10分钟，优选200g离心5分钟。
4.一种汗腺细胞，其特征在于，所述汗腺细胞为根据权利要求1-3中任一项所述的方法分离获得。
5.利用权利要求4所述的汗腺细胞培养汗腺类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
T1：将权利要求4所述的汗腺细胞用基质胶进行重悬，得到重悬的汗腺细胞；和
T2：利用三维培养基对重悬的汗腺细胞进行培养，收集培养后的三维汗腺样结构即为培养的汗腺类器官；
其中所述三维培养基的配方包括以下组分：Advanced DMEM/F-12培养基、0.01％-1％白蛋白、0.2％-10％B-27添加剂、1-50mM HEPES、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、10-1000U/mL青霉素和0.01-1mg/mL链霉素；
优选地，所述三维培养基的配方包括以下组分：Advanced DMEM/F-12培养基、0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤T1中，所述基质胶为Matrigel或BME，优选为BME；所述基质胶的浓度为6-9mg/mL，优选为7.2mg/mL；所述重悬的汗腺细胞中汗腺细胞的浓度为1×102个/mL-2×103个/mL，优选为1×103个/mL；和/或
步骤T2中，所述培养的条件为：37℃、5％CO2培养箱中培养，培养时间为5-12天，优选为5-7天，其中每3天更换所述三维培养基一次。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述三维培养基的配方还包括以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、EDA信号通路激动剂、Sirt1蛋白抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGFβ信号通路抑制剂、腺苷酸环化酶激动剂、BMP4信号通路激动剂；
优选地，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1mM；所述表皮细胞生长因子为EGF，浓度为5-200ng/mL，优选为50ng/mL；所述碱性成纤维细胞生长因子为bFGF，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL；所述EDA信号通路激动剂为EDA，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL；所述Sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mM，优选为10mM；所述Wnt信号通路激动剂为Wnt3a，浓度为10-1000ng/mL，优选为100ng/mL；所述TGFβ信号通路抑制剂为A83-01，浓度为0.1-10μM，优选为1μM；所述腺苷酸环化酶激动剂为佛司可林FSK，浓度为1-100μM，优选为10μM；所述BMP4信号通路激动剂为BMP4，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL。
8.一种汗腺类器官，其特征在于，所述汗腺类器官根据权利要求5-7中任一项所述的方法培养获得。
9.培养权利要求4所述的汗腺细胞获得权利要求8所述的汗腺类器官的三维培养基，其特征在于，所述培养基的配方包括以下组分：Advanced DMEM/F-12培养基、0.01％-1％白蛋白、0.2％-10％B-27添加剂、1-50mM HEPES、0.1％-10％谷氨酰胺添加剂、10-1000U/mL青霉素和0.01-1mg/mL链霉素；
优选地，所述培养基的配方包括以下组分：Advanced DMEM/F-12培养基、0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mM HEPES、1％谷氨酰胺添加剂、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
10.根据权利要求9所述的三维培养基，其特征在于，所述三维培养基的配方还包括以下组分中的一种或多种：抗氧化剂、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、EDA信号通路激动剂、Sirt1蛋白抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGFβ信号通路抑制剂、腺苷酸环化酶激动剂、BMP4信号通路激动剂；
优选地，所述抗氧化剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸，浓度为0.1-10mM，优选为1mM；所述表皮细胞生长因子为EGF，浓度为5-200ng/mL，优选为50ng/mL；所述碱性成纤维细胞生长因子为bFGF，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL；所述EDA信号通路激动剂为EDA，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL；所述Sirt1蛋白抑制剂为尼克酰胺，浓度为1-100mM，优选为10mM；所述Wnt信号通路激动剂为Wnt3a，浓度为10-1000ng/mL，优选为100ng/mL；所述TGFβ信号通路抑制剂为A83-01，浓度为0.1-10μM，优选为1μM；所述腺苷酸环化酶激动剂为佛司可林FSK，浓度为1-100μM，优选为10μM；所述BMP4信号通路激动剂为BMP4，浓度为2-200ng/mL，优选为20ng/mL。
11.根据权利要求10所述的三维培养基，其特征在于，所述三维培养基的配方选自以下配方中的任一种：
配方1：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方2：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、50ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、20ng/mL EDA、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方3：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、20ng/mL EDA、50ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、100ng/mL Wnt3a、1μM A83-01、10μM FSK、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素；
配方4：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入0.1％白蛋白、2％B-27添加剂、10mMHEPES、1％谷氨酰胺添加剂、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10mM尼克酰胺、20ng/mL EDA、50ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、100ng/mL Wnt3a、1μM A83-01、10μM FSK、20ng/mL BMP4、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素。
12.权利要求4所述的汗腺细胞或权利要求8所述的汗腺类器官在制备用于修复皮肤全层损伤和/或汗腺缺损的产品中的应用。
13.一种用于权利要求2所述的方法的组合消化酶，其特征在于，包括：第一消化酶、第二消化酶和第三消化酶；
其中所述第一消化酶为0.5-20mg/mL的组织分离酶Dispase，优选2mg/mL的组织分离酶Dispase；
所述第二消化酶为0.5-5mg/mL的胶原酶A、0.05-3U/mL的透明质酸酶和0.1-10U/mL的弹性蛋白酶的组合，优选为2U/mL胶原酶A，0.5U/mL透明质酸酶和6U/mL弹性蛋白酶的组合；
所述第三消化酶为Accutase酶。
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