JP6626245B2 - 再構成皮膚の作製用の組成物および方法 - Google Patents

Description

本発明は、一般的に、組織工学、特に、皮膚の再構成の分野およびその使用方法に関連する。

再構成皮膚は、傷跡が少なく、美容面のアピールを強化した状態で皮膚の創部または障害を処置するのに用いることができるため、機能的な皮膚付属器を有する成人の皮膚を再構成できるようになることは、長い間、皮膚科医および外科医の臨床面での主要な目的であった(Lee et al., Tissue Engineering: Part C, 17:(4) 391-400 (2011))。皮膚の損傷および喪失は、多くの様々な理由、例えば遺伝的障害、慢性的な創傷または熱傷のような急性の外傷により起こり得る。かかる損傷は、実質的に、皮膚の再生の可能性が全くないものである場合もある。特に、熱傷による創傷は、深くて広範なものであり、処置をしなければ致死的なものになり得ることがしばしばである。現在、熱傷の被害者の最も一般的な処置方法としては、創部が閉じるのを促進する外科手術の後に、損傷を受けていない部位から表皮を回収し、全層の創部に適用する、自家性皮膚移植が挙げられる。しかし、この手法には明らかに限界があり、熱傷による全層の皮膚の損傷の修復および制御は、未だに重要な臨床面の課題である(Shevchenko et al., J Royal Soc, 7:229 (2009); Juhasz et al., Derm Res Prac, 2010:210150 (2010))。

毛髪の損失を処置するための組織工学には、標的領域に組織片または細胞を移植して、毛嚢の形成を誘導することが含まれる。毛嚢形成の誘導および成長には、上皮と間葉の間の、活発で連続的な相互作用が必要である(Stenn and Paus, Physiol Reviews, 81:449-494, (2001))。しかし、毛嚢移植片から得られる全ての細胞が、毛嚢の形成を新しく誘導できるわけではない。

ヒトの頭皮から単離した毛嚢を、免疫欠損マウスの背中に移植し、その後、正常な周期に戻すことに成功したことが、以前の研究から示されている (Hashimoto et al., J Invest Derm 115:200 (2000))。変異体 (TSCII欠損) 培養線維芽細胞を組み込んだ皮膚代替物を移植することによるヒト毛嚢の形成が報告されている (Li et al., Nat Comm, 2:235 (2010))。しかし、再生した毛嚢は、成熟した毛嚢の中心的な要素である、成長する毛幹を産生しなかった(Chuong et al., J Invest Derm, 127:2098 (2007))。上皮細胞と修飾した間葉細胞からなる皮膚代替物が、毛嚢を誘導できる移植片として使用できることも示されている(国際公開第2011/160055号)。

米国特許出願第20120095445号(Zheng, et al.)には、試験管内で、解離した表皮細胞と真皮細胞から毛嚢を生成するための方法が記載されており、ここでは、表皮細胞と真皮細胞を別々に継代した後に組み合わせて毛嚢を形成し、次にこれを移植する。ソニックヘジホッグ経路のアゴニストを用いて、解離細胞の発毛促進性を上昇させる。しかし、この方法は、毛嚢を試験管内で形成させてから移植しなければならないため、限定的なものである。

米国特許出願第2011/0321180号(Lee et al.)には、新生仔のマウスから新しく単離した、マウスの複能性(multipotent)前駆細胞からマウス毛嚢を生成することが記載されている。新しく単離される細胞の数には限りがあるため、培養して増殖させた細胞を用いて皮膚を再生させる必要がある。不運なことに、多能性(pluripotent)の細胞を培養すると、細胞の所望の細胞種への分化能の損失が引き起こされることはしばしばである。

国際公開第2011/160055号 米国特許出願第20120095445号 米国特許出願第2011/0321180号

Lee et al., Tissue Engineering: Part C, 17:(4) 391-400 (2011) Shevchenko et al., J Royal Soc, 7:229 (2009) Juhasz et al., Derm Res Prac, 2010:210150 (2010) Stenn and Paus, Physiol Reviews, 81:449-494, (2001) Hashimoto et al., J Invest Derm 115:200 (2000) Li et al., Nat Comm, 2:235 (2010) Chuong et al., J Invest Derm, 127:2098 (2007)

したがって、解離した細胞を、毛髪を望む部位に直接移植し、毛嚢をその場で形成させる場合、再構成した皮膚を作製するための組成物および作製方法ならびにその使用方法を提供することは、本発明の目的の１つである。

正常な色素性毛幹を産生する、周期上の成熟したヒト毛嚢を含む再構成ヒト皮膚を作製した。該再構成ヒト皮膚は、全層の皮下組織とその中で生成する毛嚢とを含み、該毛嚢は、細胞が由来する皮膚で見られる特徴的なパターンで成長する。かかる皮膚は、複能性および分化上皮細胞ならびに分化真皮細胞を得て、該上皮細胞および真皮細胞／複能性細胞を別々に培養し、増殖した細胞を別々に継代し、該細胞をともに混合して細胞懸濁物を得、細胞の接着に適した不活性の生体適合性基質、例えばわずかに透過性のあるシリコン膜に該細胞懸濁物をアプライし、細胞を該基質に、典型的には約１〜２時間接着させた後、該接着細胞を小面積の全層創部に適用することにより作製する。複能性細胞と分化表皮細胞の比は、1:1〜10:1の範囲内である。培養細胞を移植して毛嚢を形成させる領域は、典型的には、１〜２mmのパンチ生検を用いて調製する。しかし、細胞を移植する領域は、0.5〜2cm²の大きさで、0.6〜0.8cmの深さであってよい。該基質は、細胞が確実に創部に留まるように、該部位に固定する。0.1〜2cm²の領域を覆う再構成皮膚は、成熟した毛嚢を１cm²あたり50〜2000個有していてよい。

細胞を置く前または後に、表面注射、マイクロニードルまたは局所的に、免疫抑制剤を局所送達することによって、移植片の生存および増殖を亢進させてもよい。

実施例に、細胞の基質上の調製、調製した部位への移植およびマウスにおける新しい機能性の毛嚢の形成を示す。このマウスモデルは、薬学および学術機関の研究室において、ヒト皮膚または毛嚢の生物学および病理学、例えば化合物スクリーニング、皮膚の発がんの研究、ヒト皮膚に対する薬剤の効果の試験および毛嚢の生理学および特定の皮膚もしくは毛嚢障害の研究に有用である。

I. 定義
「同種間」という語は、同じ種に属するか、または同じ種から得られるが、遺伝的に異なる移植組織片を指す。

「自家」という語は、ドナーとレシピエントが同一である場合に、該同一個体から得られる細胞または組織を指す。

「異種間」という語は、異なる種の個体に属する組織または細胞を指す。

「解離細胞」という語は、組織内の他の細胞から、典型的には細胞を保護して組織を形成させる細胞外マトリクスを酵素消化により崩壊させることにより、分離した細胞を指す。

「毛嚢」という語は、毛髪を生成する、管状の哺乳類の皮膚器官を指す。正常な毛嚢は、毛幹を含み、正常な毛嚢周期(成長期、退行期、休止期) を示し、脂腺を含む。

「毛幹」という語は、毛嚢の深部から成長するフィラメントを指す。

「真皮細胞」または「真皮線維芽細胞」という語は、毛嚢の周囲を囲み、毛嚢と相互作用する細胞を指す。これらの細胞は本質的に、毛嚢誘導活性を有する。他の真皮細胞は、分離細胞層を結合させ、皮膚を創傷から回復させる結合組織を得るために重要である、真皮すなわち皮膚の第二層を構成する。

「表皮細胞」という語は、皮膚の最外層を構成する細胞を指し、主としてケラチノサイトと、毛嚢を構成する上皮細胞とからなる。

「ケラチノサイト」という語は、表皮に主に存在する種類の細胞を指す。

「メラノサイト」という語は、表皮の最下層および毛嚢の最下層に位置するメラニン産生細胞であって、皮膚の色素沈着の原因となる細胞を指す。

「継代した」という語は、長期間にわたって、培養条件下で、継代培養した、または複数に分けて数を増加させ、増殖させた細胞を指す。細胞をある容器から別の容器へ１回移すことを、「１継代」とみなす。

「脂腺」という語は、毛嚢上部から生じる油腺を指す。それらは、皮脂とよばれる油性／蝋様の物質を毛嚢管へと分泌し、皮膚および毛髪を潤滑化および防水化する。

「真皮乳頭」という語は、毛嚢の基部に存在し、乳頭様の小体を形成する細胞を指す。

「真皮鞘(dermal sheath)」という語は、毛嚢を裏打ちする結合組織を指す。

「皮下組織層」という語は、真皮の最下部に結合する最深層を指す。

「単離した細胞」という語は、細胞が天然で存在するのとは異なった環境にある細胞、例えば、毛嚢から分離された真皮細胞を表す。

「凝集性（cohere）」という語は、細胞がお互いに結合し、集合体を形成する能力を指す。

「インタクトな表皮」という語は、皮膚の上皮の外層を指す。「インタクト」という語は、表皮が崩壊していないことを指す。

「真皮全層（full cutis layer）」という語は真皮を指す。

「休止期」という語は、毛髪の成長が起こらない、毛嚢の休息期間を指す。

「成長期」という語は、毛幹が成長する、毛嚢の活発な成長期間を指す。

「退行期」という語は、活発な毛髪の成長を終わらせるシグナルが伝達される、成長期の最後に起こる転換期を指す。

「周期上の毛嚢（Cycling hair follicles）」という語は、成長（成長期）、退行（退行期）および休息（休止期）の周期循環を行う毛嚢を指す。

「ROCK」という語は、細胞骨格に作用することによって、細胞形態などの様々な重要な細胞機能を媒介するセリン／スレオニンキナーゼである、Rhoキナーゼを指す。ROCK阻害剤を細胞培養培地に添加することによりアポトーシスが阻止され、それにより、そうでなければ生存できない細胞集団を特異的に選択することが可能になる(Chapman et al., J Clin Invest, 120:2619 (2010))。ROCK阻害剤の例としては、Y-27632が挙げられるが、これに限定されない。

「アルカリンホスファターゼ(AP)」は、アルカリ性の環境下において最も効果的に機能する酵素であり、かかる環境における、多種の分子の脱リン酸化の原因である。この酵素は、真皮乳頭に規則的に発現する。

「毛嚢脂腺ユニット」という語は、毛嚢およびその脂腺を指す。

「皮膚付属器」という語は、皮膚と結合している構造を指し、毛髪、汗腺および脂腺が挙げられるが、これらに限定されない。

「免疫寛容を受けている（immunoprivileged）細胞」という語は、免疫応答に対して比較的耐性を示す、非組織適合性の移植片の拒絶作用を弱める細胞を指す。

「新生児細胞」という語は、新生児の包皮由来の、複能性、未分化、および部分的に分化した細胞を指す。

II. 移植して毛嚢を形成させるための、解離細胞の調製
細胞の供給源
皮膚前駆細胞は、典型的に、ヒト真皮および表皮細胞である。

解離した複能性表皮細胞は、ヒト胎児の頭皮またはヒトの新生児の包皮より得られる。初代培養の表皮ケラチノサイト; 正常なヒトの新生児の包皮は、American Type Culture Collectionより得られる （Product ATCC（登録商標）PCS-200-010）。新生児の皮膚は、多数の種類の細胞に分化できる皮膚間質細胞（すなわち複能性細胞）を含む。Vishnubalaji, et al. BMC Developmental Biology 2012, 12:7を参照のこと。分化した表皮細胞は、典型的には、対象のレシピエントから生検により得る。

解離した複能性真皮細胞は、ヒト胎児の頭皮またはヒト新生児の包皮より得られる。ヒト新生児の真皮線維芽細胞(HDFn) はまた、Cascade Biologics（登録商標）より得られる（カタログ番号C-004-5C）。真皮細胞のさらなる供給源としては、体幹の皮膚、口腔粘膜および間葉上皮転換を起こしている間葉細胞が挙げられる。解離した分化真皮細胞は、典型的には、ヒト成人の頭皮より得る。

複能性細胞の他の供給源としては、骨髄もしくは血液由来の細胞および、メラノサイト、脂肪細胞、神経もしくは内皮の前駆細胞が挙げられる。これらの細胞はまた、ｉＰＳを供給源として作製してもよい。

複能性真皮細胞と分化した表皮細胞の比は、1:1〜10:1の範囲にある。

好ましい態様において、分化した細胞は自家性、すなわち、対象のレシピエントから生検により得たものであり、これを体外で培養して増殖させ、ドナーに再導入して、毛嚢を新しく形成させる。この方法は、生物的不適合より生じる全身性の免疫応答の危険性を低下させるため、有利なものである。該方法により、また、同種の異なる個体より生じる、同種間組織移植に伴う疾患の感染の危険性も低下する。しかし、毛嚢は、免疫寛容を受けている（immunoprivileged）細胞からなると考えられることから、必要な場合は、同種間の分化細胞を用いてもよい。移植後、時間の経過につれて、これらは、典型的にホスト自身の細胞に置き換わる。

また、同種間のメラノサイトを、構築物とともに、または別々に周囲の皮膚へ注入すること、または、メラノサイトを本来の細胞と混合することにより、皮膚に送達し、それにより毛嚢に送達することができる。

細胞の解離および培養
人工培養組織またはドナー組織から分離した真皮細胞および表皮細胞の集団を、個々の細胞または少数の細胞を含む凝集体に解離する。任意の公知の方法、例えばトリプシンおよびコラゲナーゼのような酵素による処理または、鈍器を用いるか、もしくはメスで頭皮を刻むといったような物理的な方法で解離を行い、組織から特定の種類の細胞を増殖させてよい。

解離細胞は、細胞増殖をサポートすることのできる任意の培養培地、例えば、細胞代謝に必要な補助剤、例えばグルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルおよびトランスフェリンのような有用な蛋白質を含む、MEM、DMEMおよびRPMI、F-12に入れてよい。培地はまた、酵母、細菌および真菌のコンタミネーションを防ぐための抗生物質、例えばペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを含んでいてもよい。場合によっては、培地は、ウシ、ウマまたはニワトリ由来の血清を含んでいてもよい。細胞にとって特に好ましい培地は、DMEMとF-12の混合物である。解離表皮細胞の初代培養は、Rho関連キナーゼ (ROCK) 阻害剤を補充した市販の培地で維持するのが好ましい。ROCK阻害剤の例としては、Y-27632、ROK-βおよびp160ROCKが挙げられる。該ROCK阻害剤は、10μM以下の濃度で用いることが好ましい (Rizzino, A., Regen Med., 5(5):799−807 (2010))。

培養条件は、生理的な条件に近いものでなければならない。該培養培地のpHは生理的なpHに近くなければならず、好ましくはpH6〜8であり、より好ましくはpH7に近く、さらに好ましくはpH約7.4である。細胞は、生理的な温度に近い温度、好ましくは、30℃〜40℃、より好ましくは32℃〜38℃、最も好ましくは35℃〜37℃にて培養を行わなければならない。

解離した表皮細胞および解離した真皮細胞は、典型的には、別々の培養にて維持し、増殖させる。かかる別々の培養物は、コンフルエントな細胞から、培地を除き、トリプシンを添加して細胞を細胞培養フラスコから剥がすことにより継代培養する。次に、得られた細胞／トリプシン混合物を新鮮な増殖培地で希釈し、新しいフラスコに添加する。１回目の継代は、このように構成される。その後、次の数日間の間、再びコンフルエントになるまで細胞を増殖させ、該手法を繰り返す(２回目の継代)。真皮細胞と表皮細胞の両方を、典型的には、３週間まで、３回目の継代を行うまで増殖させ、細胞数を増やす。

基質への適用
増殖させた真皮細胞と表皮細胞を、例えば１：１の比で組み合わせ、細胞スラリーを、例えばDMEM/F12 (1:1) (Gibco, カタログ番号11039)のような培養培地中で作製した。表皮細胞の真皮細胞に対する比率として、1:2〜1:10の範囲の他の比率を用いてもよい。次に、該細胞スラリーを、不活性の生体適合性基質上に移す。該基質は、ヒト皮膚が再構成すると、容易に取り除かれるのが好ましい。該基質としては、生体適合性の様々な材料、例えばポリ乳酸およびポリグリコール酸のようなポリエステル、コラーゲン、ゼラチン、フィブリンおよびアルブミンのような蛋白質を用い得る。非生体分解性の基質材料の他の例としては、カーボン、シリコンまたはポリテトラフルオロエチレンが挙げられる。好ましい基質としては、シリコン膜、ポリエチレンテレフタラート(PET) 膜 (Invitrogen)または、ポアの大きさが3.0μmの、BD Falconセルカルチャーインサートが挙げられる。

該細胞懸濁物を基質にアプライした後、細胞培養インキュベーターにて１〜2時間、好ましくは１〜１.５時間インキュベーションして、細胞を接着させて凝集性の細胞塊を形成させた。

レシピエントへの移植
培養細胞を移植して、毛嚢を形成する領域は、典型的には、１〜2 mmの生検パンチを用いて調製する。細胞を移植する領域は、０．５〜２cm²の大きさで、０．６〜０．８cmの深さであってよい。あるいは、継代培養した細胞の混合懸濁物を、毛髪を望む部位に直接注入してもよい。

真皮細胞および表皮細胞が接着した基質を、手術創の底部の損傷していない筋系の筋膜面上に、細胞が創部に接触し、基質が上になるように置いた。細胞を手術創に適用すると、細胞は、皮膚付属器を含む皮膚の形成を始める。創部に存在する場合、組み合わせた細胞は再配向して、毛嚢および結合する腺を含む、ヒト皮膚の複合体構成要素の適当な形成を促進する合図となるものを作製し得ると考えられている。態様の一において、再構成した皮膚は、0.1〜2cm²の面積を覆い、１cm²あたり50〜2000個の成熟した毛嚢を有する。

一般的に、基質は、テープ、留め金または縫合により固定されている。感染を低下させるために、無菌の包帯材を適用してもよい。

炎症および移植片の拒絶を減少させるために、免疫抑制剤、例えばTGFβ1、TGFβ2、ACTH、αMSH、シクロスポリンAまたはラパマイシンを、移植片に局所的に適用してもよい。該免疫抑制剤は、表面注射、マイクロニードルによってまたは局所的に、細胞を置く前もしくは後に送達する。免疫抑制剤の投与は、上述のように、黒色細胞の投与も行っている場合において特に好ましい。

実施例に示すように、マウスモデル上の再構成ヒト皮膚は、正常の色素性毛幹を産生する、周期上の成熟ヒト毛嚢を含む。かかるマウスモデル上の再構成ヒト皮膚は、全層の皮下組織を含み、そこで形成される毛嚢は、細胞が由来している皮膚に見られる特徴的なパターンで成長する。再構成した皮膚は、６ヶ月以上の間、その形態および挙動において、ヒトの性質を維持することができる。該再構成皮膚は、移植した皮膚組織片よりも血管が形成されており、寿命が長い。

再構成ヒト皮膚
該再構成ヒト皮膚は、正常な色素性毛幹を産生する、周期上の成熟したヒト毛嚢を含む。特定の態様において、再構成ヒト皮膚は、全層の皮下組織を含み、そこで形成される毛嚢は、特徴的なパターンで成長する; すなわち、該毛嚢は、ランダムに形成するのではなく、お互いに明確に関連しているように見られる。

毛嚢の形態形成の顕著な現象は、以下のように概要できる: 表皮プラットフォームの形成後の、真皮凝縮→上皮陥入による毛嚢壁の形成→毛嚢の基部における真皮乳頭（ＤＰ）の形成→毛幹の構成要素の分子分化→次の周期用の幹細胞およびＤＰを維持しながらの増殖および周期循環能→再生能。

実施例に示すように、本明細書中に開示する方法により、以下の特徴を持つ毛嚢を含む再構成皮膚の産生が引き起こされる:
1. 皮膚の付属器の近位末端は、上皮フィラメントが毛嚢の遠位末端から出ており、真皮乳頭が毛嚢の基部に位置する、毛嚢の構造を示す。
2. 該移植片は、近位に増殖細胞 (TA(Transient Amplifying)細胞)、遠位に分化中の細胞が位置し、ＰＤ（近位−遠位）増殖様式が形成される。
3. 該毛嚢は、外毛根鞘および内毛根鞘、キューティクル、皮質および髄質の同心円状の層からなる。毛の種類が異なれば、基本デザインに変化がある場合もあるが、全ての毛嚢は、特徴的な内毛根鞘(ヘンレ層およびハクスリー層) およびコンパニオン層を持つ。
4. 毛嚢の産物である毛幹は、特異的な分子構成からなる。
5. 毛嚢は脂腺と結合している。
6. 毛嚢は、次の周期用の幹細胞とＤＰを保持しながら、古い毛幹を脱落させる機構を持つ。
7. 毛嚢中には、毛周期が繰り返されている間、新しく毛髪器官を再生する能力が固有に備わっている。

好ましくは、再構成皮膚は３つの主な層: 表皮、真皮（cutis）または真皮（dermis）および皮下組織を含む。表皮は主にケラチノサイトからなる。表皮を貫通しているのは汗腺および毛幹である。表皮は、真皮の上に位置し、真皮は皮下組織の上に位置する。皮下組織は、皮膚の最下層であり、脂質細胞を含み、該細胞は、筋肉、骨および内臓のクッションとなる脂肪の層を形成する皮下の組織のための脂質を産生する。それは、絶縁体およびエネルギー貯蔵部として作用する。

再構成皮膚の毛幹は、一般的に、真皮から表皮上に伸張し得る。毛嚢の真皮部分には２つの主な部分: 真皮乳頭および真皮鞘がある。定義により、成熟毛嚢は、基部または球状部に真皮乳頭を、増殖細胞を近位に、そして分化中の細胞を遠位に有し、それにより、ＰＤ増殖様式を促進する。該毛嚢は、外毛根鞘および内毛根鞘、キューティクル、皮質および髄質の同心円状の層からなる。毛嚢の産物である毛幹は、特異的な分子構成を示す。毛嚢はまた、脂腺と結合しており、成長(成長期)、退行（退行期）および休止（休止期）の周期を繰り返すことにより、毛髪器官を新しく再生することができる。

本発明は、以下の実施例によりさらに理解されるが、これらは本発明を限定するものではない。

実施例1: 生体位での毛嚢の形成のための培養細胞の移植
材料と方法
動物
「ヌード/ヌード」 (または「nu/nu」) マウスは、主にＴ細胞の数を大幅に減少させることにより、免疫系を機能しないようにする遺伝的変異についてホモ接合型である。また、この変異により、該マウスは無毛の表現型を示すが、同時に、免疫不全により、移植片の拒絶が防止されるため、様々な非自己型の組織および腫瘍移植片用のレシピエントとして適当なものとなっている。

「NOD/SCID」マウスは、自己免疫インスリン依存性糖尿病（非肥満糖尿病すなわちＮＯＤ）感受性をもたらす遺伝子および、Ｔ−リンパ球およびＢ−リンパ球の成長に影響を与える遺伝子(重症複合免疫不全すなわちSCID)についてヘテロ接合型のアルビノマウスである。これらのマウスは、免疫不全により移植片の拒絶が防止されるため、様々な種類の組織および腫瘍移植片についての適当なレシピエントである。

細胞および細胞培養
解離表皮細胞は、ヒト胎児および成人の頭皮ならびにヒト新生児の包皮より得た。真皮細胞は、ヒト胎児および成人の頭皮より得た。細胞を組織より単離した後、真皮細胞を含む初代培養細胞を培養で維持した。表皮細胞の初代培養細胞は、Rho-関連キナーゼ(ROCK)阻害剤であるY27632を添加した市販の培地中で維持した。真皮細胞および表皮細胞両方を、３週間までの期間で３回目の継代を行うまで別々に増殖させ、次に、１：１の比率で混合して、総体積 150μlのDMEM/F12 (1:1) (Gibco、カタログ番号11039)中の細胞スラリーを作製した。次に、該細胞スラリーをシリコン膜(Invitrogen)上に移し、細胞培養インキュベーター中で1〜1.5時間、３７℃にてインキュベーションし、細胞を該膜に接着させた。

皮膚移植片
全層の皮膚を免疫不全である、ヌード/ヌードまたはNOD/SCIDマウスの背中から取り除いて外科創傷を作製し、細胞が接着した上述のシリコン膜を、創部の底部の損傷を受けていない筋系の筋膜面上に、細胞が創部に接触し、膜が上になるように置いた。１つまたは２つの移植片を各マウスに置き、次いで、該膜をホストの皮膚に縫合した。創部の上に、軟膏剤とともに無菌包帯を適用し、該マウスを、無菌テープで包み、その後１２〜１４週間の間モニターした。

組織的解析
この期間の最後に、該再生組織を解剖光学顕微鏡法により検討した後、ヘマトキシリン・エオジン染色を用いて、高倍率の光学顕微鏡法用に切片を作製した。H&E染色(組織的解析)は、標準のプロトコルにしたがって行った。端的には、凍結ブロックから作製した、10μmの切片を10%ホルマリンで固定し、1xPBSで洗浄し、ヘマトキシリンとともに3分間インキュベーションし、蒸留水で洗浄した後、エオジンとともに３０秒間インキュベーションした。染色切片を洗浄し、70%、90%および100%エタノールとともにそれぞれ3分間インキュベーションすることにより脱水した。脱水切片をキシレンですすぎ、キシレンベースのマウンティング媒体を用いてマウントした後、光学顕微鏡法により試験した。

アルカリンホスファターゼ (AP) 染色
AP染色は、マニュアルにしたがって、6週間および12週間目の移植片について行った (Roche NBT/BCIPストック溶液、カタログ番号11 681 451 001)。端的には、凍結ブロックから作製した10μmの切片をPBS中ですすぎ、氷冷アセトン中で１０分間固定した。該固定切片を1x PBS溶液で、それぞれ５分間、２回洗浄し、次にAPバッファー(0.1M Tris-HCL (pH 9.5)、0.1M NaCl、0.05M MgCl₂) 中に5分間静置した。新しく調製した染色溶液(APバッファー10ml中NBT/BCIPストック溶液200μl)を、該固定切片に５〜３０分間アプライした。陽性のAP反応が起こると、濃青色の染色が見られ、これは、インキュベーション時間を決定するために、５分間毎に顕微鏡でモニターしなければならない。濃青色の染色が見られると、該染色溶液を除き、切片を洗浄した。その後、該切片をエオジンで３０秒間対比染色した後、エタノールで脱水し、キシレンベースのマウンティング媒体を用いてカバーガラスをマウントした。

ＧＦＰ発現細胞を含む移植片の解析
ＧＦＰ発現ウイルスの作製のために、８０％コンフルエントの状態で、Fugene HD遺伝子導入試薬を用いて、ＧＦＰ発現レトロウイルスベクターで２９３細胞に遺伝子導入した。該ウイルス含有培地を２４時間毎に３日間回収し、−８０℃で保存した。感染用に該凍結培地を融解し、５分間1500 rpmにて遠心分離し、次に、得られた上清をポリブレン (8μg/ml)と混合した。この混合物を用いて、T75フラスコあたりウイルス６ｍｌで、80%コンフルエントの、培養包皮ケラチノサイトまたは培養胎児頭皮の真皮細胞に感染させた。３時間インキュベーションした後、該感染培地を除き、通常の増殖培地に置きかえた。

次の日に、細胞を移植用に回収し、ＧＦＰ発現ウイルスを感染させた培養包皮ケラチノサイトを、野生型の真皮細胞と組み合わせ、ＧＦＰ発現ウイルスを感染させた培養真皮細胞は、野生型の包皮ケラチノサイトと組み合わせて細胞スラリーを作製した。該細胞スラリーをシリコンメンブレン上に移し、３７℃にて１〜１.５時間インキュベーションして、組織片構築物を形成させた。該構築物をマウスに組織移植し、該移植片をモニターし、１２週間後に回収した。薄層の皮膚を移植片から切り出し、蛍光顕微鏡法により試験した。

免疫蛍光解析
免疫蛍光解析は、標準的なプロトコルにより行った。凍結ブロックから作製した10μmの切片を4% パラホルムアルデヒド/PBSで１０分間固定し、PBSで洗浄し、ブロッキングバッファー (PBS中、10% ロバ血清+ 2% BSA) 中で、室温にて１時間インキュベーションした。基底膜マーカー (ラット抗-FITC 結合型(CD49) α6-インテグリン (Stem Cell、カタログ番号10111))、表皮細胞または基底細胞層のマーカー(マウス抗ヒト パン−サイトケラチン (BD, カタログ番号550951))または間葉(真皮) 細胞マーカー (ウサギ抗-ビメンチン(Cell Signaling、カタログ番号3932)) に対する一次抗体を添加して、４℃にて一晩インキュベーションした。次の日に、該切片をPBSで洗浄し、二次抗体で１時間インキュベーションした。該切片を、ＤＡＰＩを含有するマウンティング媒体(Vector Laboratory)を用いてマウンティングし、共焦点顕微鏡により発現を解析した。

結果
解離した組織の培養増殖させたヒト細胞由来の皮膚移植片は、毛嚢を形成する
1. 手術後、マウスをモニターした。移植の４週間後に、色素性の皮膚が形成した。12週間目には、毛幹が皮膚表面から生じている様子が、肉眼により明確に確認でき、移植後１４週間後まで成長を続けた。新しい皮膚および毛嚢は、該期間の８０％時点で形成し、形成した皮膚は、0.5〜2cm²の範囲の領域を覆い、50〜1000個の成熟した毛嚢を有していた。頑強な色素性毛髪が、移植領域に明確に見られた。NOD/SCIDホストマウスは、色素性の髪を産生せず、ヌード／ヌードマウスは毛を全く産生しないため、かかる毛髪が色素性であることは、該表皮細胞培養物がメラノサイトを含み、該再構成毛嚢が、移植ヒト細胞より生じたものであることを直接示すものである。

再生ヒト毛嚢は、周期上にあり、脂腺および真皮乳頭に結合した成熟した毛幹を有する
再構成した毛幹をさらに特徴づけるために、解剖顕微鏡にて個々の毛嚢を単離した。該再生毛嚢は、成熟した特徴、すなわち、色素性毛幹、外毛根鞘および内毛根鞘を含む様々な層を示す。該毛嚢は、脂腺および真皮乳頭と結合していた。カップ状に支持された真皮乳頭に接着した、強い色素性毛幹の毛球領域を有する成長期の毛嚢、ならびに、色素性の弱い毛幹および毛嚢の先端に位置する真皮乳頭を有する休止期様の毛嚢が観察された。同一の移植片中に成長期および休止期の細胞の両方が存在することにより、再生した毛嚢が周期上にあることが有意に示唆される。毛嚢を含む領域の切片をさらにヘマトキシリン・エオジン(H&E) 染色により解析し、これにより、周期上の毛嚢が、脂腺および成熟した真皮乳頭を形成することが示された。

毛周期のよりさらなる検討のために、毛を短く刈って毛周期を観察できるようにした。毛を刈った後の１ヶ月の毛の再成長を観察した。

再構成毛嚢における、アルカリンホスファターゼ（ＡＰ）染色による真皮乳頭の同定
アルカリンホスファターゼ (AP)は、他の真皮線維芽細胞から真皮乳頭を区別するマーカーである。再生毛髪および皮膚をさらに特徴づけるために、６週間目および１２週間目の移植片においてＡＰ染色を行った。AP陽性の青色に染色された真皮乳頭は、６週間目の移植片中の、早期ステージ（ステージ３）の毛嚢の近位先端に位置し、１２週目の移植片においては、カップ状の成熟した成長期の毛嚢に支持されていた。これらのデータを合わせると、再構成毛嚢は、脂腺および真皮乳頭と結合した、成熟した毛幹を持つことが示唆される。

再構成毛嚢は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現培養細胞を取り込む
再生毛嚢が、移植した細胞から形成したものであることを示すために、移植の前に、培養した包皮ケラチノサイトを、ＧＦＰ発現レトロウイルスベクターで感染させ、移植した細胞が蛍光顕微鏡法によってトレースできるようにした。移植の２週間後、薄層の皮膚を該移植片から切り出し、蛍光顕微鏡法により解析した。脂腺と結合した、成熟した毛嚢が、位相差像から見られた。毛嚢、脂腺および毛嚢内表皮を含む全ての表皮細胞が蛍光の緑色であり、このことから、これらの細胞がＧＦＰ発現ケラチノサイト由来であることが示唆された。対照的に、真皮乳頭を含む真皮部分は全てＧＦＰ陰性であった。

さらに、ＧＦＰを発現するレトロウイルスを感染させた胎児の頭皮真皮細胞を、野生型の表皮細胞と組み合わせて、マウスに移植した。２週間後、移植した組織を回収し、蛍光顕微鏡にてＧＦＰの発現を解析した。真皮部分は全て（真皮乳頭を含む）、ＧＦＰ陽性であり、一方、移植片の表皮領域は全てＧＦＰ陰性であった。これらのデータにより、再構成した皮膚および毛嚢が、移植した、解離培養ヒト表皮細胞および真皮細胞より形成したものであるという結論が強く支持される。

再生した毛嚢および表皮は、ヒト由来の細胞より再構成されている
成熟したヒト毛嚢に特徴的な蛋白質マーカーの有無を免疫蛍光顕微鏡法により解析し、再生した毛嚢および表皮がヒト由来のものであることを再確認した。サイトケラチンは、典型的には、上皮組織の細胞質内細胞骨格に発現する蛋白質である。具体的には、Ｐａｎ-ｃＫは、ヒト表皮細胞の同定に有用なサイトケラチンマーカーである。ビメンチンは、間葉細胞に発現する中間径フィラメントであり、ヒト真皮細胞の同定に有用なマーカーである。インテグリンは、細胞とその周辺の組織の接着を促進する受容体である。DAPIは、ＤＮＡのＡ−Ｔリッチ領域に強く結合する蛍光染色剤である。６ヶ月目の移植片由来の皮膚切片を、Pan-cKおよびビメンチンに対する抗体に曝した。抗α6-インテグリン抗体を用いて、表皮と真皮の間の境界を標識し、ＤＡＰＩは、核を標識するのに用いた。マウス移植片における２つのヒト特異的なマーカー(Pan-cK およびビメンチン) の発現により、該マウスから回収した再生毛嚢および表皮がヒト細胞由来であることが示唆された。

これらの結果から、解離、培養した胎児頭皮表皮細胞または包皮ケラチノサイトを移植することにより、再生ヒト毛嚢の再生が成功できると結論付けられる。さらに、再生した毛嚢は、脂腺および真皮乳頭と結合した、成熟した毛幹を形成することができる。

この実施例にて作製した動物は、ヒト疾患の研究および正常もしくは疾患状態の皮膚または毛髪の処置用化合物のスクリーニングに有用である。細胞を得るために用いる皮膚は、研究する、または化合物の効果をスクリーニングする疾患に罹患しているヒトから入手してよい。免疫不全動物の背中に、正常なヒト皮膚を用いて、全層のヒト皮膚を作るこの方法では、培養して継代したヒト複能性および分化した真皮細胞と表皮細胞の混合懸濁物を調製し、皮膚の創傷への適用に適当な、不活性の生体適合性の基質に接着させ、動物の、皮膚を望む部位に創傷を作製し、該細胞−基質を、細胞が創部側になるように適用する。ひとたび皮膚および／または毛嚢が形成すると、試験する化合物を、該皮膚に適用して、未処理の皮膚と比較しても、または、疾患状態の皮膚細胞から形成した領域を、正常な皮膚細胞から形成した領域と比較してもよい。

特にことわらない限り、本明細書中で使用する全ての技術的用語および科学的用語は、本発明の分野における当業者が通常理解しているのと同じ意味である。本明細書中に引用する文献およびそれらが特記されている文献は、引用により具体的に本明細書中に包含される。

通常の実験方法と同様に、本明細書に記載の特定の態様の多くの等価物を用いることは、当業者には認識または確認できることである。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims (8)

1. 創傷への適用に適した不活性の生体適合性の基質に接着された、培養して継代培養した細胞の混合懸濁物を含む、毛嚢を対象の生体上にて形成させるための組成物であって、
   該細胞の混合懸濁物はヒト成人頭皮由来の分化した表皮および真皮細胞を含み、ヒト胎児頭皮またはヒト新生児包皮由来の複能性の表皮および真皮細胞を含む、
   該組成物は毛嚢を望む部位に作成された創傷上に、細胞−基質を、細胞が創部側になるように適用される組成物。
2. 細胞が対象と異なる個体由来である、請求項１記載の組成物。
3. 基質が半透過性のポリマー性膜またはシリコン膜である、請求項１または２記載の組成物。
4. 継代培養した真皮および表皮細胞が、約１：１の比率で組み合わされている、請求項１〜３いずれかに記載の組成物。
5. 複能性細胞の、分化した表皮細胞に対する比率が、１：１〜１０：１の範囲内である、請求項１〜４いずれかに記載の組成物。
6. 基質に接着した細胞中に、継代培養した細胞とともに、黒色細胞をさらに含む、請求項１〜5いずれかに記載の組成物。
7. 基質が適用部位に固定される、請求項１〜6いずれかに記載の組成物。
8. 対象の毛嚢形成を希望する部位に適用される免疫抑制剤と組み合わせて用いられる、請求項１〜7いずれかに記載の組成物。