CN110755689B - 一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊 - Google Patents

一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊 Download PDF

Info

Publication number
CN110755689B
CN110755689B CN201911088885.4A CN201911088885A CN110755689B CN 110755689 B CN110755689 B CN 110755689B CN 201911088885 A CN201911088885 A CN 201911088885A CN 110755689 B CN110755689 B CN 110755689B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hair follicle
children
foreskin
cells
hair
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911088885.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110755689A (zh
Inventor
肖苒
黄乐彬
宋峰
杨志岗
王黔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Plastic Surgery Hospital of CAMS and PUMC
Original Assignee
Plastic Surgery Hospital of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Plastic Surgery Hospital of CAMS and PUMC filed Critical Plastic Surgery Hospital of CAMS and PUMC
Priority to CN201911088885.4A priority Critical patent/CN110755689B/zh
Publication of CN110755689A publication Critical patent/CN110755689A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110755689B publication Critical patent/CN110755689B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3813—Epithelial cells, e.g. keratinocytes, urothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/18—Materials or treatment for tissue regeneration for hair reconstruction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明涉及关于毛囊重建的生物技术领域，具体涉及一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊。所述毛囊的三维重建方法，包括如下步骤：将儿童包皮成纤维细胞与儿童包皮表皮细胞采用毛囊三维重建模型，构建类毛囊样微组织，接种至需要毛囊重建的部位。该方法以儿童包皮成纤维细胞为种子细胞，培养后结合新鲜分离的儿童包皮表皮细胞，用毛囊三维重建模型体外构建类毛囊样微组织，移植到裸鼠背部皮下，可形成白色类毛发样结构。由于儿童包皮成纤维细胞来源广泛、取材方便、体外扩增也比较容易，细胞移植方法简单并且易于操作，因此该重建方法有很强的实际应用前景和科学研究价值。

Description

一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊
技术领域
本发明涉及关于毛囊重建的生物技术领域，具体而言，涉及一种毛囊的三维重建方法、所述重建方法制得的毛囊。
背景技术
毛囊是包绕在毛发根部的囊状结构，能够诱导毛发生长和维持毛发周期，并具有调节体温、分泌和排泄等基本功能。
现如今，快节奏的工作与生活、饮食不规律等原因，毛发脱落已经属于比较常见的一种现象，严重困扰着人们的正常生活。此外其他诸多原因也可以影响毛囊的周期性或损伤毛囊干细胞而导致毛发脱落。毛发脱落虽然不属于重症急病，但往往会给患者造成严重的心理压力，甚至影响患者的正常社交活动及日常生活。
目前治疗毛囊缺损的途径有药物治疗、物理治疗和手术治疗。药物治疗主要是口服非那雄胺及外用米诺地尔，虽可延缓脱发的进展，但并不能使羸弱的毳毛重生为硬毛，停用后反而会加快毛发脱落；非物理治疗主要为光照疗法，其效果有待商榷；手术治疗即自体毛发移植术，是现阶段临床主要的脱发治疗方法，其利用枕部非脱发区的毛囊移植到脱发区域，实现了毛囊数目的重新分布，但仅仅是对毛囊进行再分布而没有增加实际的毛囊数目，且受供区毛发数量的限制，不能从根本上解决脱发问题。伴随着再生医学和组织工程的发展，促进毛囊重建为解决毛囊缺损问题提供了契机。毛囊重建模型对于阐明毛囊生物学的很多生理特征具有重要价值。由于毛囊是由多种细胞组成的微型器官，也使它成为研究药物的药理作用的理想模型。因此，综合来看，建立一个稳定的毛囊重建模型，具有重要的实际应用价值和科研价值。
毛囊是表皮和真皮成分组成的微小型器官。近年来，各类毛囊重建研究选择不同来源的表皮和真皮细胞相互组合进行毛囊重建。利用胎鼠或新生鼠来源的种子细胞可以成功进行毛囊重建，如Gilmour SK使用新生鼠的表皮和真皮细胞产生完整的毛囊结构；Morris发现K15阳性表达的成鼠表皮细胞与新生鼠真皮细胞混合能产生毛发。而利用人来源种子细胞方面，2012年Toyoshima将人完整真皮毛乳头和毛囊干细胞注入三维胶内形成毛胚(hair germ)，然后将该毛胚移植到裸鼠皮内，成功产生毛发；但应用真皮毛乳头有来源受限、操作复杂、体外扩增困难等缺点。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种毛囊的三维重建方法，该方法以儿童包皮成纤维细胞为种子细胞，培养后结合新鲜分离的儿童包皮表皮细胞，用毛囊三维重建模型体外构建类毛囊样微组织，移植到裸鼠背部皮下，可形成白色类毛发样结构。由于儿童包皮成纤维细胞来源广泛、取材方便，体外扩增也比较容易，细胞移植方法简单并且易于操作，因此该重建方法有很强的实际应用前景和科研潜力。
本发明的第二目的在于提供上述毛囊重建方法重建得到的类毛发样结构，重建后形成的类毛发样结构为后续应用提供了可行的方法，具有很强的实际应用意义。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种以儿童包皮成纤维细胞为种子细胞的毛囊的三维重建的方法，具体包括如下步骤：
将儿童包皮成纤维细胞与儿童包皮表皮细胞采用毛囊三维重建模型，构建类毛囊样微组织，接种至需要毛囊重建的部位。
一般毛囊重建的种子细胞应包括真皮和表皮来源细胞，并具有一定的毛囊重建和毛发诱导能力，在体外扩增的时候能够维持其生物学功能，应用3D培养模式有助于维持种子细胞的毛囊重建功能。具有毛囊重建和毛发诱导能力的毛囊结构细胞的来源受限，而真皮成纤维细胞来源广泛容易获得，现有技术中不同来源的真皮成纤维细胞是否具有毛囊重建能力还未见报道，这些空白都限制了人来源非毛囊结构种子细胞在毛囊重建中的应用，本发明恰恰弥补了上述技术的空白点，提供了采用儿童包皮的成纤维细胞为种子细胞进行毛囊重建的方法，为后续实施提供了可参考的方法，值得广泛推广进行应用，而且这种成纤维细胞来源广泛、取材也比较方便，为该技术的实施提供了良好的基础。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述儿童包皮成纤维细胞来自于12周龄以下的儿童。
优选地，作为进一步可实施的方案，儿童包皮成纤维细胞预先需培养扩增；
优选地，培养扩增的方法包括：将成纤维细胞通过I型胶原酶消化、过滤离心，添加10％以上胎牛血清的DMEM培养基进行培养；
优选地，所述培养过程中，在低吸附培养皿进行3D悬浮培养。
更优选地，实际操作时按照如下步骤进行：是在37℃摇床中用胰蛋白酶消化包皮表皮组织块10min，中和过滤离心弃上清后，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬制备的。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述儿童包皮表皮细胞来源于12周龄以下的儿童。
优选地，作为进一步可实施的方案，儿童包皮表皮细胞预先采用胰蛋白酶消化进行分离纯化。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述儿童包皮成纤维细胞与所述儿童包皮表皮细胞分别采用低糖完全培养基重悬细胞后、离心弃上清液，分别制得成纤维浓缩细胞与表皮浓缩细胞后，再进行所述三维重建。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述三维重建的方法包括：将成纤维浓缩细胞与表皮浓缩细胞分别用微针注射至鼠尾胶原球，构建类毛囊样结构，然后接种至需要毛囊重建的部位。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述鼠尾胶原球的体积为20-40μl，注射量为(0.5-1.5)×106cell的儿童包皮成纤维细胞和(0.5-1.5)×106cell的儿童包皮表皮细胞。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述鼠尾胶原球的体积为40μl，注射量为1×106cell的儿童包皮成纤维细胞和1×106cell的儿童包皮表皮细胞。
在本发明的方案中，毛囊重建方法涉及的主要技术路线有：
(1)培养扩增儿童包皮成纤维细胞；
(2)分离获取儿童包皮表皮细胞；
(3)用鼠尾胶原制作胶原球；
(4)利用微针将儿童包皮成纤维细胞和儿童包皮表皮细胞分别注射入胶原球，构建类毛囊样微组织；
(5)将裸鼠背部做切口，类毛囊样微组织接种到裸鼠背部皮下；
(6)适时取材，体视显微镜下观察和照相；
(7)组织石蜡切片HE染色，显微镜下观察和照相。
按照上述步骤，最后观察可见重建形成的类毛发样结构。
此外，本发明还提供了采用上述重建方法制得的毛囊，在毛囊缺损治疗中有比较强大的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明毛囊的三维重建方法，克服了人来源非毛囊结构种子细胞无法进行体外毛囊重建的缺点，以3D悬浮培养以及构建类毛囊样结构可部分恢复或保持毛囊重建种子细胞体外培养过程的相关生物学功能为依据，用悬浮培养的儿童包皮成纤维细胞为种子细胞，结合新鲜分离的儿童包皮表皮细胞，分别用无血清的低糖完全培养基重悬细胞后得到浓缩细胞备用，再利用微针将两种细胞分别注射入鼠尾胶原球，形成彼此接触的细胞团块，移植到裸小鼠背部皮下，由于裸鼠无免疫能力，接种的细胞能继续增殖和分化，3周后取材可见白色类毛发样结构形成，整个过程操作简单；
2)本发明所采用的儿童包皮成纤维细胞来源广泛、取材培养方便，细胞移植方法简单并且易于操作，故有很强的实际应用前景和科研潜力，是毛囊缺损治疗中重建毛囊的重要方法；
3)本发明的第二目的在于提供上述毛囊重建方法重建得到的类毛发样结构，重建后形成的类毛发样结构为后续应用提供了可行的方法，具有很强的实际应用前景和科研潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4-5的三维毛囊组织构建以及后续移植的操作步骤示意图；
其中A显示儿童包皮成纤维细胞和儿童包皮表皮细胞；B是构建后的类毛囊样微组织；C是将微组织置于培养基中培养；D是在裸鼠背部取切口；E是将微组织置于裸鼠背部皮下；
图2为本发明实施例2的儿童包皮成纤维细胞3D悬浮培养下的形态图；
其中A是40倍镜下细胞的形态，B为100倍镜下细胞的形态；
图3为本发明实施例4的类毛囊样微组织制作过程的示意图；
其中A是利用鼠尾胶原制作胶原球；B是利用微针将儿童包皮成纤维细胞注射进入胶原球；C是利用微针将儿童包皮表皮细胞注射进入胶原球；
图4为本发明实施例5的将构建的类毛囊样微结构植入裸鼠背部的操作过程示意图；
图5为本发明实施例6的显微镜观察结果图；
其中A为显微镜下观察的新生白色类毛发样结构的照片；B是该组织切片的HE染色照片，可以看到明显的毛囊和毛干。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1鼠尾胶原的制备：
(1)SD大鼠尾巴反复清水洗净，75％酒精浸泡5min；
(2)用外科手术剪将SD大鼠尾巴纵向剪开，分离皮肤弃掉；
(3)用外科手术剪将SD大鼠尾剪成小段，抽出里面白色的鼠尾肌腱；
(4)用外科手术剪将SD大鼠鼠尾肌腱剪断、剪碎成肉泥状，置于平皿中，无菌PBS浸泡；
(5)称SD大鼠鼠尾肌腱重量，按每克鼠尾肌腱50ml的比例，加入0.1％醋酸溶液，混匀；
(6)100rpm条件下，4℃摇床放置3-4d；
(7)6000rpm条件下，4℃离心30min；
(8)吸取上清，300目滤器过滤，分装备用。
实施例2儿童包皮成纤维细胞的制备：
(1)将12周龄以下的儿童包皮环切术后切取的包皮在含1％双抗的PBS中冲洗三次；
(2)用外科手术剪将包皮皮肤剪成宽度约0.2cm的长条，浸泡于0.25％中性蛋白酶溶液中，4℃消化过夜；
(3)过夜后取出PBS冲洗三次，用外科手术镊将表皮从真皮处分离；
(4)用外科手术剪将真皮剪成泥状，转移至离心管中，加入3-5倍体积0.2％I型胶原酶，37℃摇床消化约3-4h；
(5)消化后用含10％FBS的完全培养基中和，400目筛网过滤，转移至离心管中，1000rpm条件下，4℃离心5min，弃上清；
(6)上述细胞用10ml含有10％FBS的低糖DMEM培养基重悬接种于10cm培养皿，置于37℃，5％CO2培养箱中，用10ml DMEM培养基进行培养，每周换液2次；
(7)细胞融合度达到80％以上后，吸干培养液，向培养皿内加入胰蛋白酶-EDTA溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5％的CO2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml低糖DMEM培养基终止消化；
(8)用吸管反复吹打，使细胞脱落，再将细胞悬液在1000rpm条件下，离心5min，弃上清；
(9)将细胞按1:2或1:3比例传代，并用含有10％(v/v)FBS的低糖完全培养基培养。
实施例3儿童包皮表皮细胞的制备：
(1)将12周龄以下儿童包皮环切术后切取的包皮在含1％双抗的PBS中冲洗三次；
(2)用外科手术剪将包皮皮肤剪成宽度约0.2cm的长条，浸泡于0.25％中性蛋白酶溶液中，4℃消化过夜；
(3)过夜后取出PBS冲洗三次，用外科手术镊将表皮从真皮处分离；
(4)用外科手术剪将撕下的表皮剪成泥状，转移至离心管中，加入3-5倍体积预热至37℃的0.25％胰蛋白消化酶中37℃摇床消化约10min；
(5)消化后用含10％FBS的完全培养基中和，400目筛网过滤，转移至离心管中，1000rpm条件下离心5min，弃上清，完全培养基重悬细胞备用。
实施例4类毛囊3D微组织体外构建：
(1)将分离、培养的儿童包皮成纤维细胞传代至P3，用1ml完全培养基重悬后接种到低吸附6孔板中，培养24h后收集离心、弃上清；
(2)1ml培养基重悬上述细胞后置于1.5ml EP管中，1000rpm离心5min，用微针吸取上清，吸至吸不上培养基为止；
(3)将新鲜分离的表皮来源细胞用1ml完全培养基重悬，置于1.5mlEP管中，1000rpm离心5min，用微针吸取上清，吸至无法吸出培养基为止；
(4)封口膜剪成3cm×3cm大小，用75％乙醇浸泡消毒30min以上，用无菌镊夹起封口膜，在酒精灯火焰上方1cm处烘烤，待封口膜干燥后，贴附在10cm培养皿中；
(5)用200μl的移液枪吸取制备的鼠尾胶原蛋白凝胶30μl，轻轻滴在封口膜上；
(6)在体式显微镜下，用5μl微针吸取培养的真皮成纤维细胞注射入30μl的凝胶球中，推注约0.5μl的真皮成纤维细胞，推注的细胞呈一个球形的细胞团；
(7)在体式显微镜下，用5μl微针吸取培养的新鲜分离的表皮细胞注射入30μl的凝胶球中(凝胶球还可以为20μl、40μl)，在0.5μl的真皮细胞附近推注约0.5μl的表皮细胞，推注的表皮细胞呈一个球形的细胞团，注射量为1×106cell的儿童包皮成纤维细胞和1×106cell的儿童包皮表皮细胞；
(8)将凝固的含培养的真皮成纤维细胞和新鲜分离表皮来源细胞凝胶球放入培养皿中，加预热至37℃的培养基培养三天。
上述步骤中，注射量也可以为1.5×106cell的儿童包皮成纤维细胞和1.5×106cell的儿童包皮表皮细胞；
还可以为0.5×106cell的儿童包皮成纤维细胞和0.5×106cell的儿童包皮表皮细胞。
实施例5类毛囊3D微组织体内移植：
(1)实验台提前用紫外线消毒，手术器械用75％酒精消毒，裸鼠(7-8周龄，雌雄不限，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司)腹部皮肤消毒，腹腔注射经过过滤除菌的麻醉剂；
(2)待裸鼠麻醉后，碘伏消毒裸小鼠背部，铺洞巾；
(3)在裸小鼠消毒的背部区域用无菌剪刀轻轻剪开皮肤、皮下组织，到达肌肉层，剪开大约1mm的创口；
(4)将制备的凝固的含培养的各组真皮成纤维细胞和新鲜分离表皮细胞凝胶球置入制备的1mm皮肤创口，放入皮下；
(5)缝合皮肤伤口，消毒，无菌纱布包扎。
实施例6形态学观察：
(1)3周后，用颈椎脱臼法处死裸鼠，取背部皮下及附着胶球的组织,放入4％的中性多聚甲醛溶液中保存，于体视显微镜下观察大体组织。观察结果如图3所示，表明有白色类毛发样结构形成。
(2)组织经HE染色后用激光共聚焦显微镜观察。观察结果如图4所示，有类似毛囊样结构形成。
具体整个毛囊的重建方法以及所涉及成纤维细胞的培养等步骤，可见附图1-5所示。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (11)

1.一种类毛囊样微组织的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将儿童包皮成纤维细胞与儿童包皮表皮细胞采用毛囊三维重建模型，构建类毛囊样微组织；
所述三维重建的方法包括：将成纤维浓缩细胞与表皮浓缩细胞分别用微针注射至鼠尾胶原球，构建类毛囊样结构。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述儿童包皮成纤维细胞来自于12周岁龄以下的儿童。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，儿童包皮成纤维细胞预先培养扩增。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养扩增的方法包括：将成纤维细胞通过I型胶原酶消化、过滤离心，添加10％以上胎牛血清的DMEM培养基进行培养。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养的过程中，在低吸附培养皿进行3D悬浮培养。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述儿童包皮表皮细胞来源于12周岁龄以下的儿童。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，儿童包皮表皮细胞预先采用胰蛋白酶消化进行分离纯化。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述儿童包皮成纤维细胞与所述儿童包皮表皮细胞分别采用低糖完全培养基重悬细胞后、离心弃上清液，分别制得成纤维浓缩细胞与表皮浓缩细胞后，再进行所述三维重建。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鼠尾胶原球的体积为20-40μl，注射量为(0.5-1.5)×106cell的儿童包皮成纤维细胞和(0.5-1.5)×106cell的儿童包皮表皮细胞。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鼠尾胶原球的体积为40μl，注射量为1×106cell的儿童包皮成纤维细胞和1×106cell的儿童包皮表皮细胞。
11.权利要求1-10任一项所述的制备方法制得的类毛囊样结构。
CN201911088885.4A 2019-11-08 2019-11-08 一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊 Active CN110755689B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911088885.4A CN110755689B (zh) 2019-11-08 2019-11-08 一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911088885.4A CN110755689B (zh) 2019-11-08 2019-11-08 一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110755689A CN110755689A (zh) 2020-02-07
CN110755689B true CN110755689B (zh) 2022-01-25

Family

ID=69336883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911088885.4A Active CN110755689B (zh) 2019-11-08 2019-11-08 一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110755689B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676060A (zh) * 2017-01-09 2017-05-17 塔里木大学 一种皮肤及毛囊再生的气液界面三维培养方法
CN107164310A (zh) * 2017-06-29 2017-09-15 山东省口腔医院（山东大学口腔医院） 一种体内重建毛囊的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101082621B1 (ko) * 2003-10-06 2011-11-10 가부시키가이샤 시세이도 모유두 세포 조제품의 조제 방법
US9655930B2 (en) * 2012-10-01 2017-05-23 Aderans Research Institute, Inc. Compositions and methods for producing reconstituted skin
CN103785064B (zh) * 2013-08-26 2015-02-25 济南磐升生物技术有限公司 一种皮肤模型及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676060A (zh) * 2017-01-09 2017-05-17 塔里木大学 一种皮肤及毛囊再生的气液界面三维培养方法
CN107164310A (zh) * 2017-06-29 2017-09-15 山东省口腔医院（山东大学口腔医院） 一种体内重建毛囊的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Adult epidermal keratinocytes are endowed with pilosebaceous forming abilities》;C Ferraris等;《The International Journal of Developmental Biology》;19970630;摘要，第495-496页 *
《毛乳头细胞体外诱导毛囊上皮细胞分化的实验研究》;程波 等;《中国麻风皮肤病杂志》;20060930;第716-719页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110755689A (zh) 2020-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018201536B2 (en) Skin Substitutes And Methods For Hair Follicle Neogenesis
CN101757691B (zh) 一种组织工程角膜的制备方法
CN104087551B (zh) 一种体外分离培养人的表皮细胞的方法
US10398735B2 (en) Compositions and methods for producing reconstituted skin
US20200078492A1 (en) Process for obtaining a functional dermal substitute of decellurized amniotic membrane from the placenta combination with keratinocytes and its use as an agent for tissue regeneration of the skin
CN102335459A (zh) 一种以毛囊干细胞和成纤维细胞为基础的毛囊重建方法
CN107164310A (zh) 一种体内重建毛囊的方法
CN112870445A (zh) 一种软组织修复材料的制备方法及应用
JP5340564B2 (ja) 人工皮膚およびその製造方法
CN109771694A (zh) 自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法及应用
CN102172337B (zh) 具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤及其制备方法
CN104971382B (zh) 一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织及其构建方法
RU2428996C2 (ru) Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты) и способ коррекции дефектов мягких тканей
RU2418571C1 (ru) Биотрансплантат, способ его получения и способ лечения заболеваний пародонта
CN110755689B (zh) 一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊
CN112294849B (zh) 用于生发的脱细胞基质-细胞复合颗粒及制备方法
CN112522180B (zh) 一种人头皮毛囊单细胞悬液及其制备方法和用途
US20200255808A1 (en) Method for producing a skin equivalent, and use thereof for in vitro tests and in vivo transplants
CN109321513B (zh) 一种具有生理功能的组织工程皮肤构建方法
CN115537373A (zh) 一种可再生人工毛囊及其制备方法与应用
CN117625514A (zh) 一种人工毛囊及其体外构建方法和应用
CN106540325A (zh) 细胞培养和移植的方法和细胞移植复合材料及其应用
CN114457009A (zh) 一种干细胞提取物的制备方法及其应用
RU2526813C1 (ru) Комбинированный трансплантат дермального матрикса с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками, способ его получения и способ лечения ран с его использованием

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant