CN112522180B - 一种人头皮毛囊单细胞悬液及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人头皮毛囊单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：第一步，在低温环境中，通过消化酶溶液预处理新鲜离体头皮组织；第二步，在30‑37℃中进行消化酶溶液消化处理即可有效的解离出毛囊；第三步，将解离到的毛囊进行胰酶‑EDTA消化，即可得人头皮毛囊单细胞悬液。此外，本发明公开了采用上述方法制备得到的人头皮毛囊单细胞悬液及用途。本发明方法解离到的毛囊，耗时短且完整度高，后续分离到的单细胞群数量多、活力高，很好的解决了从离体头皮组织块中分离毛囊不完整、细胞提取时间长、细胞数量活力低的问题，为后续的细胞移植方面的应用奠定了一定的基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人头皮毛囊单细胞悬液及其制备方法和用途。
背景技术
白癜风是由于表皮黑色素缺失引起皮肤褪色的一种皮肤疾病，病症主要以皮肤白斑为主。本病常见，估计人群中患病率在1%~2%。因社会生活节奏加快、人们生活工作压力加重、环境污染加剧、饮食结构改变等，白癜风的发病率一直呈现上升的趋势。白癜风对患者外貌的损害较大，加之治疗困难，给患者的工作、学习、就业、择偶和社会交往活动带来很大障碍，白癜风患者往往有自卑或忧郁倾向。因此，对白癜风患者的治疗是帮助患者重拾信心，恢复社交的过程，具有重要的社会意义。
目前白癜风的治疗手段有很多种，如局部或系统使用糖皮质激素、外用钙调神经磷酸酶抑制剂或维生素D3衍生物、窄波紫外线光疗、准分子激光、中医中药等，但是由于每种方法都有其各自的局限性，比如疗效不确切，药物的副作用，紫外线的致癌风险等，最终导致白癜风无法完全复色。另一比较有效的治疗方法是自体黑素细胞移植，比较常用的是自体表皮细胞移植，但因供区易留疤、表皮黑素细胞含量少导致治疗面积受限、复色不均匀等，也无法达到令人满意的疗效。
人头皮毛囊富含黑素细胞，人毛囊里黑素细胞和上皮细胞的比率是1：5(Cichorek M et al, 2013)；而人体的皮肤黑素细胞和上皮细胞的比率是1：36 （Hoath SBand Leahy DG， 2003)。所以人体毛囊是黑素细胞一个非常好的来源。利用提取的毛囊单细胞悬液治疗白癜风可以有效的解决因黑素细胞量不足而导致治疗面积受限的问题，也可有效的解决复色不均匀的问题，另外头皮作为供区，有头发遮挡，不会在外观上产生明显疤痕，患者的接受度好。因此高效快速的制备高质量的人头皮毛囊单细胞悬液是自体黑素细胞移植治疗白癜风的一个关键环节。但是传统的实验室分离毛囊、提取细胞的技术往往需要长时间（过夜处理）处理离体头皮样本，耗时长，也极易导致细胞活力下降，限制了其临床应用。
因此，亟需研发一种新的快速、高效的制备人头皮毛囊单细胞悬液的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种高效、快速的制备人头皮毛囊单细胞悬液的方法，解决了从离体头皮组织块中分离毛囊不完整、细胞提取时间长、细胞数量活力低的问题，为后续的细胞移植方面的应用奠定了一定的基础。
本发明要解决的技术之二是采用上述方法制备得到的人头皮毛囊单细胞悬液。
本发明要解决的技术问题之三是提供该人头皮毛囊单细胞悬液的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种人头皮毛囊单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
第一步，在低温环境中，通过消化酶溶液预处理新鲜离体头皮组织；
第二步，在30-37℃中进行消化酶溶液消化处理即可有效的解离出毛囊；
第三步，将解离到的毛囊进行胰酶-EDTA消化，即可得人头皮毛囊单细胞悬液。
作为本发明优选的技术方案，在第一步中，所述低温环境为2-8℃；所述通过消化酶溶液预处理的处理时间为1-1.5小时。
作为本发明优选的技术方案，在第一步和第二步中，所述消化酶溶液的质量百分比浓度为0.5—1.5%；所述消化酶溶液按以下配方制得：将质量百分比浓度为1%-3%的分散酶溶液和质量百分比浓度为 1%-3%的胶原酶溶液等体积混合均匀即得所述消化酶溶液。
作为本发明优选的技术方案，在第一步之前增加如下步骤：步骤1，人头皮预处理：无菌环境中，将离体头皮组织块剪去多余脂肪，切成0.1-0.2cm2大小的块状，该步骤时间为3-5分钟；步骤2，进行消毒处理，消毒处理时间为9-21分钟。
作为本发明优选的技术方案，所述进行消毒处理具体为：将块状的头皮组织置于带抗生素的PBS中，洗两次，每次5min，最后用不带抗生素的PBS洗一遍，5min；所述带抗生素的PBS包含400u/ml 青霉素，400ug/ml 链霉素，10ug/ml 两性霉素B。
作为本发明优选的技术方案，第一步具体为：在洁净无菌的管中加入预冷的0.5—1.5%消化酶溶液，将离体头皮组织浸没其中，若头皮组织过多，消化酶溶液体积则以能完全浸没过组织为准，2-8℃静置1-1.5h。
作为本发明优选的技术方案，第二步具体为：在30-37℃中消化酶溶液100-180rpm震荡孵育消化30min-1h，将组织块转移至带DMEM的培养皿中解离毛囊。
作为本发明优选的技术方案，第三步中所述消化时间为15-30min，第三步具体为：将解离到的毛囊，转移至0.25%—0.5%的胰酶-EDTA中，使毛囊完全浸没其中，30-37℃中，静置消化15-30min，然后加入DMEM和人血清或胎牛血清，补齐体积至5-10ml，其中人血清或胎牛血清终浓度为5—10%，混匀后吹打，吹打次数不超过30次；去除毛发杆，将余下液体800-1200rpm室温离心5-10min，然后去掉上清，以含5—10%的人血清或胎牛血清的DMEM重悬沉淀，即得毛囊单细胞悬液。
在本发明的第二方面，提供上述方法制得的人头皮毛囊单细胞悬液。
在本发明的第三方面，提供所述人头皮毛囊单细胞悬液在制备治疗白癜风的药物中的应用。
文中术语解释如下：
所述分散酶溶液指：一定量的分散酶固体粉末溶解于一定体积的DMEM中，完全溶解后制备成一定质量百分比浓度的分散酶溶液；
所述胶原酶溶液指：一定量的胶原酶固体粉末溶解于一定体积的DMEM中，完全溶解后制备成一定质量百分比浓度的胶原酶溶液；
所述消化酶溶液指：上述两种一定体积的分散酶溶液和胶原酶溶液的混合物；
所述人头皮毛囊指：为包绕人头发毛根周围的鞘状结构，由内至外分为内毛根鞘、外毛根鞘及纤维鞘构成；毛囊位于真皮和皮下组织中，可分为毛囊漏斗部、毛囊峡部以及毛囊下部3部分；
所述单细胞悬液指：消化毛囊组织，将细胞从毛囊组织中分离成单个的、游离的细胞群；
所述胰酶-EDTA指：0.25g胰蛋白酶粉末和0.02g的EDTA完全溶于100ml PBS溶液中，即制备成含有0.25%胰酶-EDTA溶液；
所述带DMEM的培养皿指：细胞培养皿中加入一定量的DMEM；
所述人血清指：来源于人血液，是一种性状、外观 浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体，可现场制备，也有成品在售；血清中含有各种血清蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质可促进细胞生长；
所述胎牛血清指：来源于胎牛，是一种性状、外观 浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体，有成品在售；血清中含有各种血清蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质可促进细胞生长。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明对离体人头皮组织进行0.5—1.5%消化酶溶液（分散酶、胶原酶混合物，以下简称消化酶溶液）的低温（2—8℃）短时间预处理，然后0.5—1.5%消化酶溶液30-37℃消化组织，分离毛囊，再对分离到的毛囊进行胰酶-EDTA消化，制备数量多、活力高的人头皮毛囊单细胞悬液。与常规实验室分离方法相比，该发明方法解离到的毛囊，耗时短且完整度高，后续分离到的单细胞群数量多（30个毛囊，可得细胞数量＞106）、活力高（经台盼蓝染色活力在≥80%），很好的解决了从离体头皮组织块中分离毛囊不完整、细胞提取时间长、细胞数量活力低的问题，为后续的细胞移植方面的应用奠定了一定的基础。
附图说明
图1 为本发明实施例1-3的人头皮毛囊单细胞悬液的制备方法的流程图。
图2 为对照试验1中采用本发明方法获取的毛囊用显微镜观察的示意图。
图3为对照试验1中采用常规方法获取的毛囊用显微镜观察的示意图。
图4为临床试验1中本发明方法制备的人头皮毛囊单细胞悬液应用于白癜风患者的结果示意图。
具体实施方式
以下内容为结合具体实施例和附图，对本发明进一步详细的说明。本发明的保护内容不局限于以下实施例。
材料：
以下实施例和试验中所用的材料，例如DMEM，PBS，消化酶溶液，胰酶-EDTA溶液，人血清，胎牛血清等均为市售产品。
消化酶溶液按以下配方可以自行配置：将1%-3%分散酶溶液和 1%-3%胶原酶溶液等体积混合均匀即可得消化酶溶液。
人血清可以使用患者自己的血清，手术当天抽血现场制备。
实施例1
如图1所示，本发明人头皮毛囊单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
1.生物安全柜紫外线照射30min灭菌，然后拉开生物安全柜前门至合适位置，紫外灯自动感应门开即关，内部无菌风循环系统感应门开自动开启，此时可以进行无菌操作；
2.取三个直径10cm的洁净培养皿，置于生物安全柜内，分别加入5ml DMEM，备用；
3.将预先准备好的洁净的手术剪刀、镊子等置于生物安全柜中，备用；
4.将新鲜的离体人头皮组织置于带DMEM的培养皿中，修块（将离体头皮组织块剪去多余脂肪，切成约0.2cm2大小的块状），该步骤时间约3分钟；
5.进行消毒处理：修好块的头皮组织置于带抗生素的PBS（400u/ml 青霉素，400ug/ml 链霉素，10ug/ml 两性霉素B）中，洗两次，每次5min，最后用不带抗生素的PBS洗一遍，5min，然后放入0.5%消化酶溶液中，使完全浸没其中（若头皮组织过多，消化酶溶液体积则以能完全浸没过组织为准），置于2℃中浸泡1.5h；
6.浸泡结束后，直接转移至37℃中，150rpm震荡孵育消化1h，然后将组织块转移至带DMEM的培养皿中，用镊子揭去表皮，拔出头发，将拔出的头发置于另一带DMEM 的培养皿中，毛囊附着在头发上，会被一起拔出来，显微镜下观察毛囊的完整性；
7.将头发（即分离到的毛囊）转移至0.25%胰酶-EDTA溶液中，使头发完全浸没在液体里，然后37℃静置孵育30min，结束后加DMEM和人血清（若不用于临床移植，可用胎牛血清替换人血清），补齐体积至5ml，其中人血清（胎牛血清）终浓度为5%，混匀后吹打， 吹打次数不超过30次；去除毛发杆，将余下液体1000rpm室温离心5min，然后去掉上清，以含5%的人血清（胎牛血清）的DMEM重悬沉淀，即得毛囊单细胞悬液。
实施例2
如图1所示，本发明人头皮毛囊单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
1.生物安全柜紫外线照射30min灭菌，然后拉开生物安全柜前门至合适位置，紫外灯自动感应门开即关，内部无菌风循环系统感应门开自动开启，此时可以进行无菌操作；
2.取三个直径10cm的洁净培养皿，置于生物安全柜内，分别加入5ml DMEM，备用；
3.将预先准备好的洁净的手术剪刀、镊子等置于生物安全柜中，备用；
4.将新鲜的离体人头皮组织置于带DMEM的培养皿中，修块（将离体头皮组织块剪去多余脂肪，切成约0.1cm2大小的块状），该步骤时间约5分钟；
5.进行消毒处理：修好块的头皮组织置于带抗生素的PBS（400u/ml 青霉素，400ug/ml 链霉素，10ug/ml 两性霉素B）中，洗两次，每次3min，最后用不带抗生素的PBS洗一遍，3min，然后放入1.5%消化酶溶液中，使完全浸没其中（若头皮组织过多，消化酶溶液体积则以能完全浸没过组织为准），置于8℃中浸泡1h；
6.浸泡结束后，直接转移至30℃中，100rpm震荡孵育消化30min，然后将组织块转移至带DMEM的培养皿中，用镊子揭去表皮，拔出头发，将拔出的头发置于另一带DMEM 的培养皿中，毛囊附着在头发上，会被一起拔出来，显微镜下观察毛囊的完整性；
7.将头发（即分离到的毛囊）转移至0.5%胰酶-EDTA溶液中，使头发完全浸没在液体里，然后30℃静置孵育15min，结束后加DMEM和人血清（若不用于临床移植，可用胎牛血清替换人血清），补齐体积至10ml，其中人血清（胎牛血清）终浓度为10%，混匀后吹打，吹打次数不超过30次；去除毛发杆，将余下液体800rpm室温离心10min，然后去掉上清，以含10%的人血清（胎牛血清）的DMEM重悬沉淀，即得毛囊单细胞悬液。
实施例3
如图1所示，本发明人头皮毛囊单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
1.生物安全柜紫外线照射30min灭菌，然后拉开生物安全柜前门至合适位置，紫外灯自动感应门开即关，内部无菌风循环系统感应门开自动开启，此时可以进行无菌操作；
2.取三个直径10cm的洁净培养皿，置于生物安全柜内，分别加入5ml DMEM，备用；
3.将预先准备好的洁净的手术剪刀、镊子等置于生物安全柜中，备用；
4.将新鲜的离体人头皮组织置于带DMEM的培养皿中，修块（将离体头皮组织块剪去多余脂肪，切成约0.15cm2大小的块状），该步骤时间约4分钟；
5.进行消毒处理：修好块的头皮组织置于带抗生素的PBS（400u/ml 青霉素，400ug/ml 链霉素，10ug/ml 两性霉素B）中，洗两次，每次7min，最后用不带抗生素的PBS洗一遍，7min，然后放入1.0%消化酶溶液中，使完全浸没其中（若头皮组织过多，消化酶溶液体积则以能完全浸没过组织为准），置于6℃中浸泡1.2h；
6.浸泡结束后，直接转移至35℃中，180rpm震荡孵育消化50min，然后将组织块转移至带DMEM的培养皿中，用镊子揭去表皮，拔出头发，将拔出的头发置于另一带DMEM 的培养皿中，毛囊附着在头发上，会被一起拔出来，显微镜下观察毛囊的完整性；
7.将头发（即分离到的毛囊）转移至0.4%胰酶-EDTA溶液中，使头发完全浸没在液体里，然后35℃静置孵育20min，结束后加DMEM和人血清（若不用于临床移植，可用胎牛血清替换人血清），补齐体积至8ml，其中人血清（胎牛血清）终浓度为7%，混匀后吹打，吹打次数不超过30次；去除毛发杆，将余下液体1200rpm室温离心7min，然后去掉上清，以含7%的人血清（胎牛血清）的DMEM重悬沉淀，即得毛囊单细胞悬液。
对照试验1
采用本发明方法（例如以上实施例3）获取的毛囊见图2，使用本发明方法获取的毛囊多数较完整，隆突区饱满，毛发根部细胞相对完整。
采用常规实验室制备方法获取的毛囊见图3，毛发根部的细胞丢失严重。
常规实验室制备方法的具体步骤如下：
修块、消毒处理同本发明，随后用0.5%分散酶溶液2-8℃浸泡过夜，然后再转移至30-37℃中处理1.5h、0.5%胶原酶溶液30-37℃中处理1.5h，而后分离毛囊，胰酶消化处理同本发明。
图2和图3对比可见，本发明方法获取的毛囊完整度远远高于采用常规实验室制备方法获取的毛囊，达到了现有技术所预料不到的技术效果。
对照试验2
本发明细胞制备时间短：从得到离体人头皮组织至单细胞悬液制备完成，本发明耗时约4h（见图1，图1中所有步骤加起来耗时约4h），可实现病人手术当天即可出院，而采用常规实验室制备方法（常规实验室制备方法的步骤同对照试验1）需要过夜处理，当天无法得到单细胞悬液。可见，本发明方法大大缩短了细胞制备时间，达到了现有技术所预料不到的技术效果。
对照试验3
对采用本发明方法获取的单细胞悬液和采用常规实验室制备方法（常规实验室制备方法的步骤同对照试验1）获取的单细胞悬液进行总细胞数、活细胞数及细胞活力数据的对比，具体见表1，表1是采用上述两种方法获取单细胞悬液的数据比较。
表1中常规方法独立做两次实验，本专利方法独立做两次实验，头皮块均来自临床试验白癜风受试者，面积相等，因不同人的毛囊数及毛发数不同，故毛发根数略有差异，经处理，得到的细胞悬液用伯乐TC20细胞计数仪统计数量，台盼蓝染色统计细胞活力。从实验结果可看出，相同面积的头皮块，本发明方法处理，时间短，得到的细胞数量多，活力高。从表1可以看出，采用本发明方法分离到的单细胞群数量多（30个毛囊，可得细胞数量＞106）、活力高（采用本发明方法获取的单细胞悬液的细胞活力在80%以上，远远高于采用常规实验室制备方法获取的单细胞悬液的细胞活力57%和53%），可见本发明方法获取的单细胞悬液的细胞活力达到了现有技术所预料不到的技术效果。
临床试验1
采用本发明方法获取的人头皮毛囊单细胞悬液应用于白癜风患者，步骤如下：
1.白癜风患者手术区域常规消毒：用1%利多卡因，1%肾上腺素局部麻醉；
2.用电动皮肤磨削剂对手术区域皮肤表层磨削，直到出现微小的出血点；
3.将本发明方法获取的人头皮毛囊单细胞悬液滴加在磨削区域，然后立即覆盖聚碳酸酯透析膜；
4.用凡士林软膏纱布加压固定，防止手术部位被拉动；即完成本发明方法所获取的单细胞悬液在白癜风上的移植应用。
该移植是医生在手术室内完成的，移植手术步骤也是多数医院手术室基本都采用的步骤（比如消毒方法、磨削方法、固定方法）。
如图4所示，可见，本发明方法获取的单细胞悬液应用于白癜风患者，与治疗前相比，术后三个月（90天）、六个月（180天）试验区域复色较均匀，且持续复色，达到了现有治疗方法所预料不到的效果；治疗前后照片拍摄于患者在门诊医生处随访时，相机为佳能IXUS190数码相机，拍摄时，尽量保证前后照片的外界条件一致。
以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
Claims (7)
1.一种人头皮毛囊单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，在低温环境中，通过消化酶溶液预处理新鲜离体头皮组织；所述低温环境为2-8℃；所述通过消化酶溶液预处理的处理时间为1-1.5小时；
第二步，在30-37℃中进行消化酶溶液消化处理30min-1h即可有效的解离出毛囊；
第三步，将解离到的毛囊进行胰酶-EDTA消化15-30min，即可得人头皮毛囊单细胞悬液；
在第一步和第二步中，所述消化酶溶液的质量百分比浓度为0.5-1.5％；所述消化酶溶液按以下配方制得：将质量百分比浓度为1％-3％的分散酶溶液和质量百分比浓度为1％-3％的胶原酶溶液等体积混合均匀即得所述消化酶溶液；
在第一步之前增加如下步骤：步骤1，人头皮预处理：无菌环境中，将离体头皮组织块剪去多余脂肪，切成0.1-0.2cm2大小的块状，该步骤时间为3-5分钟；步骤2，进行消毒处理，消毒处理时间为9-21分钟。
2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述进行消毒处理具体为：将块状的头皮组织置于带抗生素的PBS中，洗两次，每次5min，最后用不带抗生素的PBS洗一遍，5min；所述带抗生素的PBS包含400U/ml青霉素，400μg/ml链霉素，10μg/m1两性霉素B。
3.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，第一步具体为：在洁净无菌的管中加入预冷的0.5-1.5％消化酶溶液，将离体头皮组织浸没其中，若头皮组织过多，消化酶溶液体积则以能完全浸没过组织为准，2-8℃静置1-1.5h。
4.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，第二步具体为：在30-37℃中消化酶溶液100-180rpm震荡孵育消化30min-1h，将组织块转移至带DMEM的培养皿中解离毛囊。
5.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，第三步具体为：将解离到的毛囊，转移至0.25％-0.5％的胰酶-EDTA中，使毛囊完全浸没其中，30-37℃中，静置消化15-30min，然后加入DMEM和人血清或胎牛血清，补齐体积至5-10ml，其中人血清或胎牛血清终浓度为5-10％，混匀后吹打，吹打次数不超过30次；去除毛发杆，将余下液体800-1200rpm室温离心5-10min，然后去掉上清，以含5-10％的人血清或胎牛血清的DMEM重悬沉淀，即得毛囊单细胞悬液。
6.如权利要求1-5任一所述的方法制得的人头皮毛囊单细胞悬液。
7.如权利要求6所述的人头皮毛囊单细胞悬液在制备治疗白癜风的药物中的应用。
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